Отношении аденовирусов вирусов гриппа
Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А., Бондарев В. П., Небольсин В. Е.
Экспериментальное изучение противовирусной эффективности Ингавирина® свидетельствует, что в концентрациях 200 и 100 мкг/мл препарат полностью защищает клетки от цитопатического действия вируса при внесении его до заражения культуры клеток HeLa. При 10-кратном снижении инфицирующей дозы вируса до 0,001 ЦПД 50/клетку подавление цитопатического эффекта вируса Ингавирином® составило 100% во всех изученных концентрациях (в том числе и низких) как при внесении препарата до, так и после инфицирования. Ингавирин® эффективно подавляет репродукцию аденовируса 5 типа в культуре клеток HeLa.
Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А., Бондарев В. П., Небольсин В. Е.
In vitro Ingavirin® Efficacy Against Adenoviral Infection Pathogen
The experimental investigation of the Ingavirin® antiviral effect showed that in concentrations of 200 and 100 mcg/ml it totally protected the cells from the cytopathic action of the virus, when added before the inoculation of the HeLa cell culture . After a tenfold decrease of the infective dose (up to 0.001 CPD 50/cell), the inhibition of the virus cytopathic effect by Ingavirin® amounted to 100% in all the tested concentrations (including the low ones) added either before or after the culture contamination. Ingavirin® was efficient in inhibition of the adenovirus type 5 reproduction in the HeLa cell culture .
Эффективность Ингавирина® in vitro в отношении возбудителя аденовирусной инфекции
С. Я. ЛОГИНОВА1, С. В. БОРИСЕВИЧ1, В. А. МАКСИМОВ1, В. П. БОНДАРЕВ1, В. Е. НЕБОЛЬСИН2
In vitro Ingavirin® Efficacy Against Adenoviral Infection Pathogen
S. YA. LOGINOVA, S. V. BORISEVICH, V. A. MAKSIMOV, V. P. BONDAREV, V. E. NEBOLSIN
Branch of Central Research Institute No. 48, Ministry of Defense of the Russian Federation, Virological Centre, Sergiev Posad Valenta Farmacevtica, Moscow
Экспериментальное изучение противовирусной эффективности Ингавирина® свидетельствует, что в концентрациях 200 и 100 мкг/мл препарат полностью защищает клетки от цитопатического действия вируса при внесении его до заражения культуры клеток HeLa. При 10-кратном снижении инфицирующей дозы вируса до 0,001 ЦПД50/клетку подавление цитопатического эффекта вируса Ингавирином® составило 100% во всех изученных концентрациях (в том числе и низких) как при внесении препарата до, так и после инфицирования. Ингавирин® эффективно подавляет репродукцию аденовируса 5 типа в культуре клеток HeLa.
Ключевые слова: Ингавирт®, аденовирус, культура клеток, противовирусная эффективность.
The experimental Investigation of the Ingavirin® antiviral effect showed that In concentrations of 200 and 100 mcg/ml It totally protected the cells from the cytopathic action of the virus, when added before the inoculation of the HeLa cell culture. After a tenfold decrease of the infective dose (up to 0.001 CPD50/cell), the inhibition of the virus cytopathic effect by Ingavirin® amounted to 100% in all the tested concentrations (including the low ones) added either before or after the culture contamination. Ingavirin® was efficient in inhibition of the adenovirus type 5 reproduction in the HeLa cell culture.
Key words: Ingavirin®, adenovirus, cell culture, antiviral effect.
Изучение острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) в последние годы свидетельствует, что в их этиологии, помимо вируса гриппа, важную роль играют аденовирусы человека. Они относятся к роду Ма81аёепоу1ги8, который разделен на шесть групп А, В, С, Б, Е и Б, включающие 51 серотип [1].
Аденовирусные заболевания распространены повсеместно и регистрируются в течение всего года с сезонным подъёмом в зимне-весенний период. Известны крупные вспышки фарингоконъюнкти-вальной лихорадки в летнее время при передаче возбудителя через воду. Причём болеют преимущественно дети и лица молодого возраста, особенно военнослужащие. Спорадические случаи, нозокомиальные и локальные вспышки часто наблюдаются в закрытых коллективах детей и взрослых. Механизм заражения в закрытых коллективах — воздушно-капельный и/или алиментарный.
Для аденовирусной инфекции характерны медленное развитие эпидемического процесса и высокий процент латентных форм, которые определяются серотипом вируса. В детских коллективах, где восприимчивость к инфекции наиболее высокая, чаще наблюдаются вспышки фарингоконъюнктивальной лихорадки (сероти-пы 3, 7, 14), у детей младшего возраста — острый фарингит (серотипы 1, 2, 3, 5, 6, 7). У детей раннего возраста 5-й серотип аденовируса вызывает коклюшеподобный синдром. В развитии тяжёлых пневмоний, бронхитов и бронхиолитов у больных с хроническими заболеваниями и им-мунодефицитным состоянием играют серотипы 1, 2 и 5 [2].
В настоящее время доказана эффективность ганцикловира, цидофирма и рибавирина в отношении аденовирусной инфекции in vitro [3, 4]. Однако их применение ограничивается токсичностью, в том числе нефротоксичностью. В этой связи актуальным является поиск эффективных и нетоксичных химиопрепаратов в отношении
Таблица 1. Эффективность Ингавирина® в отношении аденовируса 5-го типа в монослойной культуре клеток HeLa
Схема внесения препарата Доза препарата, мкг/мл Частота обнаружения ЦПД Подавление цитопатического действия, %
За 24 ч до инфицирования 200,0 0/10 100,0
Через 2 ч после инфицирования 200,0 3/10 70,0
Контроль (без препарата) — 10/10 —
Контроль среды — 0/10 —
Контроль препарата 200,0 0/10 —
Примечание. Инфицирующая доза - 0,01 ЦПД50/клетку.
Таблица 2. Эффективность Ингавирина® в отношении аденовируса 5-го типа в монослойной культуре клеток HeLa
Схема внесения препарата Доза препарата, мкг/мл Частота обнаружения ЦПД Подавление цитопатического действия, %
За 2 ч до инфицирования 200,0 0/10 100,0
Через 2 ч после инфицирования 200,0 0/10 100,0
Контроль (без препарата) — 10/10 —
Контроль среды — 0/5 —
Примечание. Инфицирующая доза - 0,001 ЦПД50/клетку. Срок наблюдения после инфицирования - 96 ч.
эпидемически значимого возбудителя аденовирусной инфекции.
Целью настоящей работы было изучение противовирусной эффективности нового отечественного химиопрепарата Ингавирин® в отношении аденовируса 5-го типа.
Материал и методы
Культура клеток. Использована постоянная культура клеток карциномы шейки матки — HeLa с плотностью 200250 тыс./мл. В качестве ростовой среды и среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на растворе Хенкса, содержащую 7,5 и 2% сыворотки крупного рогатого скота соответственно.
Приготовление инфицирующего препарата. Двухсуточный монослой культуры клеток HeLa инфицировали аденовирусом 5-го типа в дозе 0,01 ЦПД50 на клетку. Затем монослой культуры клеток инкубировали при (37±0,5)°С в течение 96 ч. По окончании инкубации проводили криодеструкцию клеток, вируссодержащую суспензию осветляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин.
Противовирусную эффективность препарата оценивали по подавлению цитопатической активности вируса в культуре клеток HeLa. Оценку эффективности препарата в отношении аденовируса проводили при внесении его на сформированный монослой и в суспензию культуры клеток HeLa.
Критериями эффективности исследуемого препарата являлись: подавление ЦПД вируса и коэффициент ингибирования (Ки, %).
Коэффициент ингибирования рассчитывали по формуле: Ku=100X(CK—Co)/CK,
где CK и Co — инфекционный титр вируса в контрольной и опытной пробе соответственно [5, 6].
Результаты и обсуждение
При внесении Ингавирина® за 24 ч до заражения монослоя клеток аденовирусом в дозе 0,01 ЦПД50 на клетку в концентрациях 200 и 100 мкг/мл препарат полностью защищал клетки от цитопатического действия патогена (табл. 1). В концентрации 22,4 мкг/мл защитная эффективность препарата составила 60,0%. При внесении Ингавирина® в поддерживающую среду за 2 ч до инфицирования монослоя вирусом в дозе 0,001 ЦПД50 на клетку защитная эффективность Ингавирина® увеличилась на 20% (табл. 2).
Показатели подавления цитопатического действия при применении Ингавирина® в концентрациях 200, 100 и 22,4 мкг/мл после инфицирования монослоя клеток (доза инфицирования 0,01 ЦПД50/клетку) были несколько ниже (на 30—40%), чем при внесении препарата до заражения монослоя клеток (см. табл. 1). При 10-кратном снижении инфицирующей дозы вируса до 0,001 ЦПД50/клетку подавление цитопатического
Таблица 3. Эффективность Ингавирина® в отношении аденовируса 5-го типа в суспензионной культуре клеток HeLa
Схема внесения препарата Доза препарата, мкг/мл Частота обнаружения ЦПД Подавление цитопатического действия,%
За 1 ч до инфицирования 200,0 0/10 100
Через 2 часа до инфицирования 200,0 2/8 75
Контроль (без препарата) — 10/10 —
Контроль среды — 0/10 —
Примечание. Инфицирующая доза - 0,01 ЦПД50/клетку. Срок наблюдения после инфицирования - 72 ч.
эффекта вируса составило 100% при всех изучен- Ингавирином® в дозе 200 мкг/мл при внесении в ных концентрациях препарата (см. табл. 2). поддерживающую среду за 1 ч до инфицирования
При внесении Ингавирина® в суспензию и 75% — при внесении препарата через 2 часа по-клеток более выраженная защитная эффектив- сле инфицирования культуры клеток ИеЬа. ность препарата выявлена при применении его за Таким образом, Ингавирин® эффективно по-1 час до инфицирования (табл. 3). Отмечено 100% давляет репродукцию аденовируса 5-го типа в мо-подавление цитопатической активности вируса нослойной и суспензионной культуре клеток ИеЬа.
Virus taxonomy: The classification and nomenclature of viruses. The seventh report of the International Committee on Taxonomy ofViruses. Eds. by M. H. V. Regenmortel, C. M. Fauquet, D. H. L. Bishop et al.
Acad. Press., San Diego, 2000.
Колобухина Л. В., Львов Д. К. Вирусные инфекции дыхательных путей / Медицинская вирусология. Под ред. академика РАМН Д. К. Львова. М.: 2008; 408—411.
De Oliveira C. B, Stevenson D., La Bree et al. Evolution of cidofirm (HPMPC, GS-504) against adenovirus type 5 infection in a New Zealand rabbit ocular model. Antiviral Res 1996; 31: 165—172.
Duggan J. M., Farrehi J., Duderstadt S. et al. Treatment with ganciclovir of adenovirus pneumonia in cardiac transplant patient. Am J Med 1997; 103: 5: 439—440.
Галабов А. С., Галегов Г. А. Методические аспекты химиотерапии вирусных инфекций. Acta virol 1978; 22: 4: 343—351.
Чижов Н. П. Методические вопросы научной разработки противовирусных препаратов. Минск, 1977: 36—41.
В. В. Зарубаев 1 , А. В. Слита 1 , А. К. Сироткин 1 , В. Е. Небольсин 2 , О. И. Киселев 1
Изучены противовирусные свойства препарата Ингавирин ® в отношении респираторного вируса человека — аденовируса 5 типа при использовании культуры клеток НЕр-2. При концентрации Ингавирина ® 1000, 100 и 10 мкг/мл формируется вирусное потомство с пониженной инфекционной способностью (в 250, 100 и 10 раз соответственно). Электронно-микроскопический анализ инфицированных клеток подтвердил способность Ингавирина ® нарушать нормальный морфогенез аденовируса.
Ключевые слова: Ингавирин, аденовирус человека 5 типа, противовирусная активность, электронно-микроскопический анализ, культура клеток Нер-2.
V. V. Zarubaev, A. V. Slita, A. K. Sirotkin, V. E. Nebolsin, O. I. Kiselev
Research Institute of Influenza, North-West Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, St.Petersburg Valenta Farm, Moscow
Antiviral properties of Ingavirin ® were investigated in the Hep-2 cell culture with respect to the human respiratory tract virus (type 5 adenovirus). In concentrations of Ingavirin ® of 1000, 100 and 10 mcg/ml the generated posterity showed lower infective capacity (by 250, 100 and 10 times respectivelly). The electron microscopy of the infected cells confirmed the Ingavirin ® ability to disturb the adenovirus normal morphogenesis.
Key words: Ingavirin ® , human type 5 adenovirus, antiviral activity, electron microscopy, Hep-2 cell culture.
Введение
Несмотря на успехи в области вакцинации, химиопрофилактики и химиотерапии респираторных вирусных инфекций человека, эти заболевания по-прежнему занимают ведущее место в структуре инфекционной патологии человека. Помимо гриппа, существенную долю респираторных инфекций составляют заболевания, вызванные вирусами других семейств: корона-, адено- и парамиксовирусами (респираторно-синцитиальный вирус и вирус парагриппа). В этиологической структуре острых респираторных вирусных заболеваний (ОРВЗ) аденовирусы человека занимают значимую позицию. Аденовирусные заболевания (АВЗ) распространены повсеместно и регистрируются в течение всего года с подъемом в зимне-весенний период, вызывая фарингиты, рино - фаринготонзиллиты, фарингоконъюнктивальную лихорадку, эпидемический керато-конъюнктивит, бронхиты и пневмонию. Отдельные случаи, нозокомиальные и локальные вспышки заболевания часто наблюдаются в закрытых детских и взрослых коллективах. АВЗ вызываются большой группой аденовирусов, из которых в патологии человека наибольшее значение имеют типы 3, 4, 5, 7, 8, 14, 21. Аденовирус 5 типа относится к латентным вирусам, который персистируя в лимфоидной ткани миндалин и аденоид в течение длительного времени, вызывает ОРВЗ у взрослых.
Активность в отношении аденовируса была показана in vitro для аналогов нуклеотидов [1, 2]. Рибавирин, используемый для терапии РС-вирусной инфекции, оказался эффективен [3, 4], частично эффективен [5] или не имел эффективности [6, 7] в отношении аденовирусной инфекции. Препарат Ганцикловир, эффективный при цитомегаловирусной инфекции, проявляет эффективность в отношении аденовируса как in vitro, так и in vivo [8, 9]. На основе (S)-1-(3-гидрокси-2-фосфонилметоксипропил) цитозина компанией Gilead Sciences был разработан препарат Цидофовир с широким спектром противовирусной активности [10—15]. Рибавирин, ганцикловир и цидофовир были с большим или меньшим успехом использованы для терапии аденовирусных патологий человека, включая гепатиты, циститы и пневмонии при иммунодефицитных состояниях у реципиентов органов [3, 4, 6, 9]. При этом выраженные побочные действия и способность аденовируса к формированию устойчивых штаммов ограничивают использование этих препаратов [13, 16, 17].
Ряд соединений других классов, таких как липиды [18], акридоны [19], имидазохинолинамины [20], как и другие аналоги нуклеозидов [1, 2, 21—24] также проявляют антиаденовирусную активность. Рост вируса в клеточной культуре может быть ингибирован катехинами зеленого чая, хотя и в высоких концентрациях [25].
Препараты интерферона, применяемые для лечения респираторных инфекций, эффективны в основном при профилактическом применении и не могут считаться основным средством терапии при тяжёлых случаях инфекции. Аденовирусы обладают эффективными механизмами подавления интерферон-индуцированного противовирусного каскада реакций, вследствие чего устойчивы к действию интерферона и его индукторов [26].
Таким образом, весьма актуальной является проблема поиска и разработки новых противовирусных препаратов, не обладающих побочными эффектами и возможно более широкого спектра действия, включая эффективность в отношении аденовируса. Ранее была показана активность препарата Ингавирин ® (2-(имидазол-4-ил) этанамид пентандиовой-1,5 кислоты) в отношении вируса гриппа. Ингавирин ® является низкомолекулярным аналогом эндогенного пептидоамина, выделяемого из морского моллюска Aplysia californica. Как в опытах in vitro [27], так и in vivo на модели гриппозной инфекции [28] было показано, что препарат способен ограничивать репликацию вируса в культуре клеток, а также обладает высокой протективной активностью при экспериментальном гриппе у мышей.
Цель настоящего исследования — оценка противовирусных свойств препарата Ингавирин ® в отношении другого респираторного вируса человека — аденовируса 5 типа.
Материал и методы
Препараты. В работе использовали субстанцию препарата Ингавирин ® в виде белого кристаллического порошка. Аликвоты препарата разводили в среде для клеточных культур Игла MEM (БиолоТ, Санкт-Петербург, кат.# 1.3.3).
Вирусы и клетки. В работе был использован аденовирус человека 5 типа из коллекции вирусных штаммов НИИ гриппа. Вирус культивировали в клетках HEp-2.
Изучение противовирусной активности препаратов. Для изучения инфекционности вирусного потомства клетки инкубировали с исследуемым препаратом в течение 1 ч, после чего в культуральную жидкость добавляли вирус (1000 CTD50 на клетку) и инкубировали в течение 1 ч. Несвязавшийся вирус отмывали 2 раза по 5 мин средой MEM и добавляли в лунки культуральную среду с препаратом в тех же концентрациях. Вирус культивировали в течение 24 ч, клетки соскабливали из лунок и титровали инфекционность вирусного потомства. Для этого из вируссодержащего материала готовили серию десятикратных разведений от 10 -1 до 10 -6 на среде MEM. Заражённые клетки культивировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 в газопроточном инкубаторе Sanyo-175. Срок культивирования составлял 72 ч, после чего клетки использовали для микротетразолиевого теста (см. ниже).
Количество жизнеспособных клеток оценивали при помощи микротетразолиевого теста. Для этого клетки промывали 2 раза по 5 мин фосфатно-солевым буфером, и в лунки планшетов добавляли по 100 мкл раствора (0,5 мг/мл) 3-(4,5-диметилтиазолил-2) 2,5-дифенилтетразолия бромида (ICN Biochemicals Inc., Aurora, Ohio) на физиологическом растворе. Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 2 ч и промывали в течение 5 мин фосфатно-солевым буфером. Осадок растворяли в 100 мкл на лунку ДMСО, после чего оптическую плотность в лунках планшетов измеряли на многофункциональном ридере Victor 1420 (Perkin Elmer, Finland) при длине волны 535 нм. По результатам теста оценивали долю погибших клеток в контрольных лунках и лунках с препаратами.
Электронно-микроскопические исследования. Опытные культуры обрабатывали Ингавирином ® в концентрации 1000 мкг/ мл за 1 ч до заражения вирусом(1000 CTD50 на клетку). Через 18 и 36 ч после заражения контрольные и опытные культуры клеток фиксировали 1,5% раствором глутаральдегида на среде DMEM (рН 7,2), центрифугировали 20 мин при 2000 об./мин и фиксировали 2,5% раствором OSO4. Клетки обезвоживали ацетоном в возрастающей концентрации и заливали в смесь эпон/аралдит. Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме Ultracut (Reichert, Austria), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали на электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Japan) при инструментальном увеличении 5000—50000. Фотосъёмку производили на пленку ФТ-4ШД.
На полученных фотографиях проводили подсчёт вирионов, имеющих полноценную электронноплотную сердцевину и не имеющих её. Подсчитывали количество внутриядерных вирионов в пересчёте на одну клетку, а также процентное содержание полноценных и неполноценных вирионов в каждом случае. В каждой пробе исследовали 15—20 клеток.
Результаты и обсуждение
Влияние Ингавирина ® на репликацию аденовируса в культуре клеток. В проведённых экспериментах было оценено влияние Ингавирина ® на инфекционность вирусной популяции, сформированной в клетках. С этой целью вирус культивировали в течение 24 ч в присутствии Ингавирина ® в различных концентрациях, после чего проводили титрование инфекционности вирусного потомства во втором пассаже. Данные по влиянию Ингавирина ® на инфекционность аденовируса приведены в табл. 1.
Таблица 1.
Репликация аденовируса в клетках HEp-2 в присутствии Ингавирина ®
| Разведение вируса | Оптическая плотность (1000XOD535) при концентрации Ингавирина ® , мкг/мл | |||
| 1000 | 100 | 10 | 0 (контроль вируса) | |
| 10 -1 | 52±1 | 48±1 | 53±3 | 58±2 |
| 10 -2 | 67±8 | 65±9 | 61±4 | 58±2 |
| 10 -3 | 459±9 | 464±17 | 126±7 | 63±3 |
| 10 -4 | 461±5 | 514±14 | 406±11 | 82±4 |
| 10 -5 | 441±3 | 506±11 | 513±10 | 390±41 |
| 10 -6 | 441±9 | 471±13 | 441±9 | 393±27 |
| 10 -7 | 416±6 | 436±12 | 457±15 | 316±19 |
| Титр вируса, lgEID50 | 2,3 | 2,7 | 3,7 | 4,7 |
| Контроль клеток | 356±6 | |||
Как следует из представленных данных, культивирование аденовируса в присутствии Ингавирина ® приводило к формированию вирусного потомства, обладающего пониженной инфекционной активностью. Степень подавления этой активности напрямую зависела от использованной концентрации препарата, и при концентрации Ингавирина ® 1000, 100 и 10 мкг/мл составляла 2,4; 2,0 и 1,0 порядка (250, 100 и 10 раз) соответственно.
Ультраструктурные исследования. Как было показано в ходе ультраструктурных исследований, клетки HEp-2, инфицированные Ad5, через 18 ч после инфицирования были увеличены в размерах. Клеточные органеллы в цитоплазме выглядели интактными. В самой цитоплазме начинались процессы вакуолизации, типичные для цитодеструктивного действия аденовируса. Ядерный хроматин располагался вдоль внутреннего слоя ядерной мембраны, в кариоплазме наблюдалось формирование специфических аденовирусных включений, находящихся на ранних стадиях развития. В составе включений отчётливо различались центральные зоны умеренной электронной плотности, зоны межхроматиновых гранул, имеющие мелкоглыбчатую гранулированную структуру, и электронноплотные компактные кольца по периферии включений (рис. 1). В ядрах клеток отмечались вирионы характерной икосаэдрической формы.
Рис. 1. Вакуолизация цитоплазмы и специфические аденовирусные включения в ядре клетки HEp-2 через 18 ч после инфицирования аденовирусом 5 типа.
C — центральные зоны; ig — интерхроматиновые гранулы; cr — компактные кольца. Вирионы аденовируса указаны стрелками. Ув. 6 000.
В клетках, инфицированных аденовирусом в присутствии Ингавирина ® , признаки ранних стадий вирусной репликации были сходными с таковыми в клетках контрольной культуры, не отличаясь от них ни качественно, ни количественно. Как и в контрольных клетках, в кариоплазме наблюдалось формирование специфических аденовирусных включений, в которых отчетливо различались центральные зоны умеренной электронной плотности, зоны межхроматиновых гранул и электронноплотные компактные кольца по периферии включений (рис. 2). В ядрах клеток отмечались немногочисленные вирионы аденовируса.
Рис. 2. Аденовирусные включения в ядре клетки HEp-2 через 18 ч после инфицирования аденовирусом 5 типа в присутствии Ингавирина ® .
C - центральные зоны; ig - интерхроматиновые гранулы; cr — компактные кольца. Вирионы аденовируса указаны стрелками. Ув. 6 000.
Таким образом, морфогенез собственно аденовирусной инфекции в присутствии Ингавирина ® не отличался принципиально от контрольных показателей. Для более полной характеристики репродукции вируса был проведён подсчёт количества вирионов в пересчёте на одну клетку, а также подсчитана доля морфологически неполноценных вирусных частиц (табл. 2).
Таблица 2.
Морфологический состав популяции аденовируса человека 5 типа, сформировавшейся в условиях применения Ингавирина ®
| Группа опыта | Количество вирусных частиц в пересчёте на клетку | |||
| с сердцевиной | без сердцевины | |||
| шт. | % | шт. | % | |
| Ингавирин ® | 12±2 | 45±9* | 16±3 | 55±9* |
| Контроль без препаратов | 18±3 | 68±4 | 9±2 | 32±4 |
Как видно из представленных результатов, при подсчёте доли морфологически полноценных и дефектных вирионов были обнаружены статистически значимые различия. Так, через 18 ч после инфицирования клеток использование Ингавирина ® повышало процент морфологически неполноценных вирионов с 32 до 55%.
Те же тенденции сохранялись и на более позднем сроке после инфицирования (36 ч). Количество вирусных частиц в ядрах клеток многократно возрастало, и его подсчёт, учитывая выраженное цитодеструктивное действие вируса на этой стадии, не отражал адекватно динамику вирусной репродукции. Качественно состав вирусной популяции на этой стадии представлен на рис. 3. На рисунке видно, что применение Ингавирина ® существенно повышает долю незрелых вирионов, не содержащих сердцевины (рис. 3).
Рис. 3. Структура популяции вирионов аденовируса в клетках HEp-2 в контрольной (а) и обработанной Ингавирином ® (b) культуре через 36 ч после инфицирования. Ув. 30000.
Полученные результаты можно трактовать, как способность Ингавирина ® влиять, прямо или опосредованно, на процессы упаковки вирусного генома в капсиды [29—31].
Главное отличие клеток, заражённых аденовирусом в присутствии Ингавирина ® от контрольной культуры без препарата, заключалось в отсутствии признаков вирусиндуцированной деградации клеток даже на дальних сроках эксперимента. Несмотря на наличие развитых внутриядерных включений и морфологически полноценных вирионов в этих клетках, цитоплазма их не содержала повышенного количества вакуолей и других цитопатогенных проявлений. На рис. 4 для наглядности представлены клетки через 36 ч после инфицирования в присутствии и без Ингавирина ® . Полученные нами данные согласуются, таким образом, с ранее опубликованными результатами об активности Ингавирина ® в отношении аденовируса [32].
Рис. 4. Клетки HEp-2 через 36 ч после инфицирования аденовирусом 5 типа в отсутствии (а) и в присутствии (b) Ингавирина ® .
а — деградация ядра и цитоплазмы, многочисленные вакуоли в цитоплазме, нарушение целостности ядерной мембраны и вирионы потомства в ядре; b — интактная цитоплазма и вирусные включения в клеточном ядре. Ув. 10 000 (a), 5000 (b).
В целом полученные данные позволяют говорить о наличии у Ингавирина ® эффективного механизма защиты клеток от аденовирусной инфекции, заключающегося в способности нарушать нормальный морфогенез аденовируса, снижая тем самым инфекционность вирусного потомства.
Сезонный грипп — это острая респираторная инфекция, вызываемая вирусами гриппа, которые циркулируют во всем мире.
Патоген
Существует 4 типа вирусов сезонного гриппа – типы A , B , C и D . Вирусы гриппа A и B циркулируют и вызывают сезонные эпидемии болезни.
Вирусы гриппа А подразделяются на подтипы в соответствии с комбинациями гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) , белков на поверхности вируса. В настоящее время среди людей циркулируют вирусы гриппа подтипов A(H1N1) и A(H3N2) . A(H1N1) также обозначается как A(H1N1)pdm09 , поскольку он вызвал пандемию 2009 г. и впоследствии сменил вирус сезонного гриппа A(H1N1) , циркулировавший до 2009 года. Известно, что пандемии вызывали только вирусы гриппа типа А.
Вирусы гриппа В не подразделяются на подтипы, но могут подразделяться на линии. В настоящее время циркулирующие вирусы гриппа типа В принадлежат к линиям В/Ямагата и В/Виктория.
Вирус гриппа С выявляется реже и обычно приводит к легким инфекциям. Поэтому он не представляет проблемы для общественного здравоохранения.
Вирусы группы D , в основном, инфицируют крупный рогатый скот. По имеющимся данным, они не инфицируют людей и не вызывают у них заболеваний.
Признаки и симптомы
Для сезонного гриппа характерно внезапное появление высокой температуры, кашель (обычно сухой), головная боль, мышечные боли и боли в суставах, тяжелое недомогание, боль в горле и насморк. Кашель может быть тяжелым и длиться 2 недели и более. У большинства людей температура нормализуется и симптомы проходят в течение недели без какой-либо медицинской помощи. Но грипп может приводить к развитию тяжелой болезни и к смерти, особенно у людей из групп высокого риска (см. ниже).
Болезнь может протекать как в легкой, так и в тяжелой форме и даже заканчиваться смертельным исходом. Случаи госпитализации и смерти происходят, в основном, в группах высокого риска. По оценкам, ежегодные эпидемии гриппа приводят к 3-5 миллионам случаев тяжелой болезни и к 290 000 – 650 000 случаев смерти от респираторных заболеваний.
В промышленно развитых странах большинство случаев смерти, связанных с гриппом, происходят среди людей в возрасте 65 лет и старше (1). Эпидемии могут приводить к высоким уровням отсутствия на работе/в школе и к потерям производительности. Во время пиковых периодов заболеваемости клиники и больницы могут быть переполнены.
Последствия эпидемий сезонного гриппа в развивающихся странах недостаточно известны, но по результатам научных исследований 99% случаев смерти детей в возрасте до 5 лет с инфекциями нижних дыхательных путей, связанных с гриппом, происходят в развивающихся странах (2).
Эпидемиология
Люди болеют гриппом в любом возрасте, но есть группы населения, подверженные повышенному риску.
- Повышенному риску развития тяжелой болезни или осложнений в результате инфицирования подвергаются беременные женщины, дети в возрасте до 59 месяцев, пожилые люди, люди с хроническими нарушениями здоровья (такими как хронические болезни сердца, легких и почек, нарушения метаболизма, нарушения неврологического развития, болезни печени и крови) и люди с ослабленным иммунитетом (в результате ВИЧ/СПИДа, химиотерапии или лечения стероидами, а также в связи со злокачественными новообразованиями).
- Работники здравоохранения подвергаются высокому риску инфицирования вирусом гриппа во время контактов с пациентами и могут способствовать дальнейшей передаче инфекции, особенно людям из групп риска.
В районах с умеренным климатом сезонные эпидемии происходят, в основном, в зимнее время года, тогда как в тропических районах вирусы гриппа циркулируют круглый год, приводя к менее регулярным эпидемиям. Сезонные эпидемии и бремя болезни
Период времени с момента инфицирования до развития болезни, известный как инкубационный период, длится около 2 дней, но может варьироваться от 1 до 4 дней.
Диагностика
В большинстве случаев грипп человека клинически диагностируется. Однако в периоды низкой активности вирусов гриппа и при отсутствии эпидемий инфекция, вызванная другими респираторными вирусами, такими как риновирус, респираторный синцитиальный вирус, вирус парагриппа и аденовирус, может также протекать как гриппоподобное заболевание, что затрудняет клинически дифференцировать грипп от других патогенов.
Для постановки окончательного диагноза необходимо собрать надлежащие респираторные образцы и выполнить лабораторный диагностический тест. Первым важнейшим шагом для лабораторного выявления вирусных инфекций гриппа является надлежащий сбор, хранение и транспортировка респираторных образцов. Обычно лабораторное подтверждение вирусов гриппа в выделениях из горла, носа и носоглотки или в аспиратах или смывах из трахеи осуществляется путем прямого выявления антигенов, изоляции вирусов или выявления специфичной для гриппа РНК методом полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР). Имеется целый ряд руководств по лабораторным методикам, опубликованных и обновленных ВОЗ (3).
В клиниках для выявления гриппа применяются диагностические экспресс-тесты, но по сравнению с методами ОТ-ПЦР они имеют низкую чувствительность, и надежность их результатов в значительной мере зависит от условий, в которых они используются.
Лечение
Пациенты, не входящие в группы повышенного риска, должны получать симптоматическое лечение. При наличии симптомов им рекомендуется оставаться дома с тем, чтобы минимизировать риск инфицирования других людей в сообществе. Лечение направлено на смягчение симптомов гриппа, таких как высокая температура. Пациенты должны следить за своим состоянием и в случае его ухудшения обращаться за медицинской помощью. Если известно, что пациентам угрожает высокий риск развития тяжелой болезни или осложнений (см. выше), они, помимо симптоматического лечения, должны как можно скорее получать противовирусные препараты.
Пациенты с тяжелым или прогрессирующим клиническим заболеванием, связанным с предполагаемой или подтвержденной вирусной инфекцией гриппа (например, с клиническими синдромами пневмонии, сепсиса или обострения сопутствующих хронических заболеваний), должны как можно скорее получать противовирусные препараты.
- Для получения максимального терапевтического эффекта следует как можно скорее (в идеале, в течение 48 часов после появления симптомов) назначать ингибиторы нейраминидазы (например, озельтамивир). Для пациентов на более поздней стадии болезни следует также предусматривать прием лекарственных препаратов.
- Лечение рекомендуется проводить не менее 5 дней, но можно продлевать до получения удовлетворительных клинических результатов.
- Использование кортикостероидов следует предусматривать только при наличии других показаний (таких как астма и другие конкретные нарушения здоровья), поскольку оно связано с более длительным выведением вирусов из организма и ослаблением иммунитета, что приводит к бактериальной или грибковой суперинфекции.
- Все циркулирующие в настоящее время вирусы гриппа устойчивы к противовирусным препаратам класса адамантанов (таким как амантадин и римантадин), поэтому эти препараты не рекомендуется применять в качестве монотерапии.
Профилактика
Наиболее эффективным способом профилактики болезни является вакцинация. Вот уже более 60 лет имеются и используются безопасные и эффективные вакцины. Через некоторое время после вакцинации иммунитет ослабевает, поэтому для защиты от гриппа рекомендуется ежегодная вакцинация. Наиболее широко в мире используются инъекционные инактивированные противогриппозные вакцины.
Среди здоровых взрослых людей противогриппозная вакцина обеспечивает защиту даже в том случае, если циркулирующие вирусы не соответствуют в точности вакцинным вирусам. Однако для пожилых людей вакцинация против гриппа может быть менее эффективной с точки зрения предотвращения болезни, но ослабляет ее тяжесть и уменьшает вероятность развития осложнений и смертельного исхода. Вакцинация особенно важна для людей, подвергающихся высокому риску развития осложнений, а также для людей, живущих с людьми из группы высокого риска или осуществляющих уход за ними.
ВОЗ рекомендует ежегодную вакцинацию для следующих групп населения:
- беременные женщины на любом сроке беременности
- дети в возрасте от 6 месяцев до 5 лет
- пожилые люди (старше 65 лет)
- люди с хроническими нарушениями здоровья
- работники здравоохранения.
Эффективность противогриппозной вакцины зависит от того, насколько циркулирующие вирусы совпадают с вирусами, содержащимися в вакцине. Из-за постоянно изменяющейся природы вирусов гриппа Глобальная система эпиднадзора за гриппом и ответных мер ВОЗ (ГСЭГО) – система национальных центров по гриппу и сотрудничающих центров ВОЗ во всем мире – осуществляет непрерывный мониторинг за вирусами гриппа, циркулирующими среди людей, и дважды в год обновляет состав противогриппозных вакцин.
На протяжении многих лет ВОЗ обновляет свои рекомендации в отношении состава вакцины (трехвалентной), нацеленной на 3 наиболее представленных циркулирующих типа вируса (два подтипа вируса гриппа А и один подтип вируса гриппа В). Начиная с сезона гриппа 2013-2014 г. в северном полушарии для содействия разработке четырехвалентной вакцины рекомендуется вводить четвертый компонент. Четырехвалентные вакцины в дополнение к вирусам, входящим в состав трехвалентной вакцины, включают второй вирус гриппа типа В, и ожидается, что они обеспечат более широкую защиту против инфекций, вызванных вирусом гриппа типа В. Многие инактивированные и рекомбинантные противогриппозные вакцины доступны в инъекционной форме. Живая аттенуированная противогриппозная вакцина доступна в форме назального спрея.
Предэкспозиционная и постэкспозиционная профилактика с помощью противовирусных препаратов возможна, но ее эффективность зависит от ряда факторов, таких как индивидуальные особенности, тип воздействия и риск, связанный с воздействием.
Помимо вакцинации и противовирусного лечения мероприятия общественного здравоохранения включают меры индивидуальной защиты, такие как:
- регулярное мытье и надлежащее высушивание рук;
- надлежащая респираторная гигиена – прикрытие рта и носа при кашле и чихании салфетками с их последующим надлежащим удалением;
- своевременная самоизоляция людей, почувствовавших себя нездоровыми, с высокой температурой и другими симптомами гриппа;
- предотвращение тесных контактов с больными людьми;
- предотвращение прикасаний к глазам, носу и рту.
Деятельность ВОЗ
ВОЗ через систему ГСЭГО ВОЗ и в сотрудничестве с другими партнерами проводит мониторинг за активностью гриппа в глобальных масштабах, дает рекомендации по составам вакцины против сезонного гриппа дважды в год для северного и южного полушарий, помогает странам с тропическим и субтропическим климатом в выборе вакцинных препаратов (для северного и южного полушарий) и принятии решений в отношении времени проведения кампаний вакцинации и оказывает поддержку государствам-членам в разработке стратегий профилактики и контроля.
ВОЗ работает в целях усиления национального, регионального и глобального потенциала для принятия мер в связи с гриппом (включая диагностику, мониторинг чувствительности к противовирусным препаратам, эпиднадзор за болезнью и реагирование на вспышки болезни), расширения охвата вакцинацией в группах населения высокого риска и обеспечения готовности к следующей пандемии гриппа.
(1) Estimates of US influenza-associated deaths made using four different methods.
Thompson WW, Weintraub E, Dhankhar P, Cheng OY, Brammer L, Meltzer MI, et al. Influenza Other Respi Viruses. 2009;3:37-49
В 20-м и начале 21-го столетия мировое население пострадало от нескольких пандемий гриппа, в наши дни угроза новой пандемии по прежнему существует.
Читайте также:
