Особенности биотехнологии культивирования вирусов

Хемостатная, или непрерывная, культура представляет собой проч­ную культуру тех или иных микроорганизмов. В таком случае воз­можность продления жизни микробной популяции поддерживается с помощью непрерывной подачи свежей среды и постоянного отбора микробной биомассы или образовавшихся продуктов метаболизма, т.е. можно культуру микроорганизма как бы зафиксировать в одной, например стационарной, фазе роста и получать нужные продукты об­мена или биомассу во времени столько, сколько требуется. Таким об­разом, максимальная производительность в хемостатной культуре все­гда выше, чем максимальная производительность в периодической культуре.

Нужно сказать, что до 50-х годов для культивирования микроорга­низмов с целью их всестороннего изучения служила простая периоди­ческая культура. Только с переходом к методу хемостатного культи­вирования обнаружился недостаток периодической культуры, которая не даёт полного представления обо всех изменениях, происходящих в клетке, и о влиянии внешних факторов на протекающие в ней процес­сы.

Развитие хемостатного культивирования открыло возможность управлять процессом, контролируя рост и поведение микроорганиз­мов, а при необходимости вмешиваться в этот процесс, изменяя ско­рость роста до задаваемых пределов путём воздействия на такую куль­туру внешними факторами. В настоящее время интерес к непрерывно­му культивированию растёт как в нашей стране, так и за рубежом. Од­нако, несмотря на преимущества хемостатных культур, в биологиче­ской промышленности при производстве вакцин они не получили ещё достаточного применения по следующим причинам:

1. Технические трудности, в первую очередь связанные с создани­ем асептических условий.

2. Не во всех случаях непрерывный процесс предпочтительнее пе­риодического, поскольку при низкой удельной скорости роста биомас­сы периодический процесс по эффективности не уступает непрерыв­ному и более выгоден, т. к. его проще осуществить.

3. Интенсивный биосинтез многих продуктов метаболизма проис­ходит при медленном росте биомассы, поэтому в периодических про­цессах концентрация целевого продукта в культуральной жидкости обычно выше, чем в непрерывных, что существенно повышает эффек­тивность стадий выделения и очистки продукта. Всё это свидетельствует о том, что периодические процессы в бу­дущем будут применяться.

2. Особенности биотехнологии культивирования вирусов

Вирусы являются облигатными внутриклеточными микроорганиз­мами, поэтому на искусственных питательных средах они не растут. Для культивирования вирусов используют 3 живые системы:

1. Восприимчивые животные.

2. Куриные эмбрионы.

3. Культуры клеток.

При лабораторном культивировании вирусов используют культу­ры клеток, растущие на поверхности стенок тех или других емкостей (матрасах).

В крупномасштабном производстве используют метод выращива­ния суспензионных клеточных культур. Этот метод впервые описал в 1953 г. Оуенс. Он показал способность клеток размножаться в жидкой среде в свободном суспендированном состоянии. Клетки перевивае­мых линий могут длительно культивироваться во взвешенном состоя­нии. В таких условиях клетки размножаются, не прикрепляясь к стен­кам культурального сосуда, благодаря постоянному перемешиванию среды. Перемешивание суспензионных культур проводят лопастными и магнитными мешалками, а также круговыми качалками.

Суспензионные культуры готовят из однослойных клеточных культур. Клетки снимают со стекла с помощью растворов Версена и трипсина. Осадок клеток после центрифугирования ресуспендируют в свежей ростовой питательной среде. Приготовленную суспензию по­мещают в культуральные сосуды, реакторы, ферментеры и выращива­ют при постоянном и интенсивном перемешивании. Это делается для того, чтобы поддерживать клетки во взвешенном состоянии, препятст­вовать их осаждению и прикреплению к стенкам сосуда и в то же вре­мя не вызывать их механического повреждения. Способ суспензионного выращивания клеток в биологической про­мышленности стал применяться сравнительно недавно.

Даже за короткий срок получены впечатляющие результаты. Боль­шие успехи достигнуты при получении суспензионных постоянных культур клеток ВНК-21 для выращивания вируса ящура, вируса бе­шенства клеток почки поросят JBRS-2 для размножения вируса ящура, вируса везикулярной болезни свиней и др.

Выращивание клеточных культур осуществляют в специальных ре­акторах емкостью 1000 и более литров при температуре 36-37° С, рН 7,4 и непрерывном перемешивании суспензии клеток при 300-350 об/мин.

Несмотря на достижения по выращиванию суспензионных клеточ­ных культур, на многих предприятиях биологической промышленно­сти чаще используются методы получения клеточных линий в состоя­нии покоя или роллерным (динамичным) способом.

Культивирование вирусов человека и живот­ных проводят с целью лабораторной диагнос­тики вирусных инфекций, для изучения пато­генеза и иммунитета при вирусных инфекци­ях, а также для получения диагностических и вакцинных препаратов. Вирусы культивируют на трех биологических моделях: в организ­ме лабораторных животных, в развивающихся эмбрионах птиц (чаще на куриных эмбрионах) и культурах клеток (тканей).

Лабораторных животных (взрослых или новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян и др.) заражают иссле­дуемым вируссодержащим материалом раз­личными способами (подкожно, внутримы­шечно, интраназально, интрацеребрально и т. д.) в зависимости от тропизма вирусов. Использование животных для культивирова­ния вирусов в диагностических целях весьма ограничено из-за видовой невосприимчи­вости животных ко многим вирусам челове­ка, контаминации животных посторонними микробами, а также по экономическим и этическим соображениям.

О репродукции вирусов в организме жи­вотных судят по развитию у них видимых клинических проявлений заболевания, па-томорфологическим изменениям органов и тканей, а также на основании реакции гемаг-глютинации (РГА) с суспензией из органов, содержащих вирусы. РГА основана на способ­ности многих вирусов вызывать склеивание (агглютинацию) эритроцитов человека, птиц и млекопитающих в результате взаимодейс­твия вирусных белков (гемагглютининов) с рецепторами эритроцитов.

Куриные эмбрионы (5—12-дневные) зара­жают путем введения исследуемого матери-

ала в различные полости и ткани зародыша. Таким образом можно культивировать виру­сы гриппа, герпеса, натуральной оспы и др. Достоинствами модели являются: возмож­ность накопления вирусов в больших коли­чествах; отсутствие скрытых вирусных ин­фекций; доступность для любой лаборатории. О репродукции вирусов в куриных эмбрионах свидетельствуют: специфические поражения оболочек и тела эмбриона (оспины, крово­излияния); гибель эмбриона; положительная РГА с вируссодержащей жидкостью, получен­ной из полостей зараженного зародыша.

Методику культивирования вирусов в раз­вивающихся эмбрионах птиц используют при промышленном выращивании вирусов. Однако многие вирусы не размножаются в эм­брионах птиц; почти неограниченные возмож­ности для культивирования вирусов появились после открытия метода культур клеток.

Культуру клеток (тканей) наиболее часто применяют для культивирования вирусов. Метод культур клеток разработан в 50-х годах XX века Дж. Эндерсом и соавт., получивши­ми за это открытие Нобелевскую премию. Клетки, полученные из различных органов и тканей человека, животных, птиц и дру­гих биологических объектов, размножают вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде. Большое распространение получили культу­ры клеток из эмбриональных и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих, по сравнению с нормальными клетками взрослого организма, более актив­ной способностью к росту и размножению.

При выращивании культур клеток необхо­димо выполнение ряда условий:

1) соблюдение правил асептики: 2) исполь­зование лабораторной посуды из нейтрально­го стекла (пробирки, флаконы, матрасы) или специальных реакторов для получения био­технологической продукции; 3) использование сложных по составу питательных сред (среда 199, Игла), содержащих минеральные соли, аминокислоты, витамины, глюкозу, сыворотку крови животных или человека, буферные рас­творы для поддержания стабильного рН; 4) до­бавление антибиотиков к питательной среде для подавления роста посторонних микробов;

5) соблюдение оптимальной температуры (36— 38,5 °С) роста клеток.

В зависимости от техники приготовления различают однослойные, суспензионные и органные культуры клеток:

Однослойные культуры клеток — клетки спо­собны прикрепляться и размножаться на повер­хности химически нейтрального стекла лабора­торной посуды в виде монослоя. Они получили наибольшее применение в вирусологии.

Суспензионные культуры клеток — клетки размножаются во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании с помощью магнитной мешалки или во враща­ющемся барабане. Их используют для получе­ния большого количества клеток, например, при промышленном получении вирусных вакцин.

Органные культуры — цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применяются огра­ниченно).

Культуры клеток в процессе их культиви­рования способны проходить десятки гене­раций. По числу жизнеспособных генераций культуры клеток подразделяют на: 1) пер­вичные, или первично-трипсинизированные; 2) перевиваемые, или стабильные; 3) полупе­ревиваемые.

Первичные культуры способны размножать­ся только в первых генерациях, т. е. выдержи­вают не более 5— 10 пассажей после выделения из тканей. В основе получения первичных культур лежит обработка кусочков тканей (эм­бриональных, опухолевых или нормальных) протеолитическими ферментами, например трипсином, который разрушает межклеточ­ные связи в тканях и органах с образованием изолированных клеток.

Перевиваемые, или стабильные, культуры клеток способны размножаться в лаборатор­ных условиях неопределенно длительный срок (десятки лет), т. е. выдерживают мно­гочисленные пассажи. Их получают преиму­щественно из опухолевых или эмбриональ­ных тканей, обладающих большой потенцией роста. Перевиваемые культуры клеток имеют преимущества перед первичными культура­ми. К ним относятся: продолжительность их культивирования, высокая скорость размно-

жения опухолевых и эмбриональных клеток, меньшая трудоемкость, способность культур сохранять свои свойства в замороженном со­стоянии в течение многих лет, возможность использования международных линий культур во многих лабораториях мира. Однако злока­чественный характер клеток и соматические мутации, претерпеваемые нормальными клет­ками в гпоцессе многочисленных генераций, ограничивают использование этого вида куль­тур, в частности невозможно их применение в производстве вирусных вакцин.

Полуперевиваемые культуры клеток имеют ограниченную продолжительность жизни и выдерживают 40—50 пассажей. Их обычно по­лучают из диплоидных клеток эмбриона че­ловека. В процессе пассажей эти культуры сохраняют диплоидный набор хромосом, ха­рактерный для соматических клеток исходной ткани, и не претерпевают злокачественной трансформации. Поэтому полуперевиваемые культуры клеток могут быть использованы как в диагностике, так и в производстве вакцин.

Внедрение в вирусологию метода культур клеток позволило выделить и идентифициро­вать многочисленные ранее неизвестные ви­русы, так как почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие чувствительные клетки, в которых он способен репродуциро­ваться. Метод дал возможность изучать взаи­модействие вирусов с клеткой на молекуляр­ном уровне, получать высококачественные вакцинные и диагностические препараты, проводить вирусологические исследования в стандартных условиях.

ЦПД — патологические изменения морфо­логии клеток, вплоть до их гибели, возника­ющие в результате репродукции вирусов, и наблюдаемые под микроскопом (рис. 3.11). В зависимости от особенностей репродуци­рующихся вирусов ЦПД может отличаться. В одних случаях быстро вакуолизируется ци-

топлазма, разрушаются митохондрии, округ­ляются и гибнут клетки, а в других — фор­мируются гигантские многоядерные клетки (так называемые симпласты) или наблюдает­ся явление клеточной пролиферации, которое в итоге заканчивается деструкцией клеток. Таким образом, характер ЦПД позволяет ис­пользовать этот феномен не только для инди­кации вирусов, но и для их ориентировочной идентификации в культуре клеток.

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по внутриклеточным вклю-

чениям, которые образуются в ядре или цитоп­лазме зараженных клеток (рис. 3.12). Часто включения представляют собой скопления вирусных частиц или отдельных компонентов вирусов, иногда могут содержать клеточный материал. Выявляют включения с помощью светового или люминесцентного микроско­па после окрашивания зараженных клеток соответственно анилиновыми красителями или флюорохромами. Включения могут отли­чаться по величине (от 0,2 до 25 мкм), форме (округлые или неправильные) и численности (одиночные и множественные). Характерные цитоплазматические включения формируют­ся в клетках, инфицированных вирусом нату­ральной оспы (тельца Гварниери), бешенства (тельца Бабеша—Негри), а внутриядерные включения — при заражении аденовирусами или вирусами герпеса.

В основе реакции гемадсорбции лежит спо­собность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. Целый ряд вирусов (гриппа, па­рагриппа и др.) обладают гемадсорбирующими свойствами, что позволяет использовать реак­цию гемадсорбции для индикации этих виру­сов даже при отсутствии выраженного ЦПД в культуре клеток. Механизмы реакции гемад­сорбции и гемагглютинации сходны. Поэтому для обнаружения репродукции некоторых ви­русов в культуре клеток можно использовать

реакцию гемагглютинации с культуральной жидкостью, т. е. с питательной средой, содер­жащей размножившиеся вирусы.

Презентация на тему: " Особенности технологии промышленного культивирования микроорганизмов. Методы культивирования бактерий и вирусов. Непрерывное и периодическое культивирование." — Транскрипт:

1 Особенности технологии промышленного культивирования микроорганизмов. Методы культивирования бактерий и вирусов. Непрерывное и периодическое культивирование. Аппаратурное обеспечение. 1

2 Содержание В ведение. 1. Классификация методов культивирования. 2. Технология глубинног способа культивирования микроорганизмов. 3. Периодические и хемостатные системы культивирования микроорганизмов. 4. Особенности биотехнологии культивиро- вания вирусов. 5. Заключение. 2

4 Биотехнологический процесс Культура микроорганизмов Питательная среда Аппаратура для культивирования и проведения вспомогательных операций Средства контроля и управления 4

5 - это создание искусственных условий для обеспечения процессов жизнедеятельности и размножения микроорганизмов 5

6 Культивирование Периодическое Непрерывное Глубинное Поверхностное Аэробное Анаэробное Объемно-доливное 6

7 Позволяет получить большое количество бактериальной массы за короткое время. 1. Позволяет получить большое количество бактериальной массы за короткое время. Процесс легко управляем. 2. Процесс легко управляем. Максимальная технологичность. 3. Максимальная технологичность. 7

8 1. Отбор штаммов микроорганизмов. 2. Приготовление посевной микробной культуры. 3. Приготовление и стерилизация питательных сред. 4. Подготовка биореактора к посеву. 5. Выращивание микроорганизмов в биореакторе и контроль над процессом культивирования. Вспомогательные операции: стерилизация оборудования и коммуникаций; приготовление и стерилизация пеногасителей, растворов и др. Этапы технологического процесса глубинного культивирования микроорганизмов 8

9 Штаммы, применяемые в биотехнологии Эталонный штамм - это чистая культура генетически однородных микроорганизмов, изученная и охарактеризованная по морфологическим, биохимическим и культуральным свойствам (паспортизированная). Производственный штамм - это штамм, который используется для промышленного производства биопрепаратов: вакцин, диагностикумов, антибиотиков, ферментов и др. Контрольный штамм – это штамм, который используется для оценки качества вакцинных препаратов на животных. 9

10 Лаборатория Щелковского биокомбината, в которой проводят контроль качества производственных штаммов 10

11 Деминерализаторы воды для приготовления питательных сред на Щелковском биокомбинате 11

12 Аппарат для приготовления и стерилизации питательных основ 12

13 Биореакторы. Внешний вид 13

14 Общий вид биореактора с рабочим объемом 10 литров

15 Общий вид биореактора с рабочим объемом 100 л

16 Общий вид биореактора с рабочим объемом 1000 л

17 Схема биореактора 14

18 Пульт управления работой биореатора 15

19 Система управления биореактором, объемом 1000 л

20 Графики культивирования в биореакторе объемом 1000 л

21 Аппаратурное обеспечение работы био- реактора 16

22 Верхняя часть биореактора с системой ввода различных добавок

24 Культивирование продуцента инсулина E.coli

25 Цех глубинного культивирования микроорганизмов 18

26 КЛАССИФИКАЦИЯ БИОРЕАКТОРОВ (по способу подвода энергии в аппарат) Подвод энергии в газовую фазу Подвод энергии в жидкую фазу Комбинированный подвод энергии Барботажные Барботажно- эрлифтные Колонные Форсуночные Эжекторные С самовсасывающей мешалкой С внешним управлением Барботажные с механичес- ким переме- шиванием 19

27 Эрлифтный биореактор с внутренней рециркуляцией 20

28 Эрлифтный биореактор с внешней системой рециркуляции 21

29 Биореактор с механическим перемешиванием 22

30 Барботажная колонна 23

33 Цех глубинного культивирования Щелковского биокомбината. Биореакторы объемом 630 л 26

34 Конструктивное (коэффициент заполнения биореактора Vпс\Vмах) Химическое (органические масла, жиры, кремний органический, минеральные масла) Механическое Комбинированное 27

35 КЖ Многоступенчатая система культивирования микроорганизмов 28

36 Системы культивирования микроорганизмов Закрытая система культивирования - это такая система, когда хотя бы один из компонентов питательной среды или она вся не может ни поступать в систему, ни покидать её. В такой системе скорость роста микроорганизмов должна после ускорения стремиться к нулю из-за гибели микробных клеток вследствие накопления продуктов метаболизма и недостатка питательных веществ. Открытая (хемостатная) система культивирования - это система, когда все питательные компоненты могут поступать в биореактор и удаляться из него в виде продуктов синтеза микроорганизмов (антибиотики, витамины, ферменты био- масса микроорганизмов и т.д.). При этом скорость поступ- ления питательной среды в биореактор и удаление из него продуктов синтеза или биомассы можно регулировать автоматически. 29

38 СИСТЕМЫ НЕПРЕРЫВНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Открытые системыЗамкнутые системы Гомогенные Гетерогенные Одноступен- чатые Многоступен- чатые Многоступен- чатые Трубчатые Проточные С 100 %-ной рециркуляцией С механическим отделением биомассы С ростом в промежуточной фазе 31

40 1. СТАЦИОНАРНЫЙ 2. ДИНАМИЧНЫЙ (РОЛЛЕРНЫЙ) 3. СУСПЕНЗИОННЫЙ Способы репродукции вирусных частиц 33

41 Роллеры и матрацы (многоразового и одноразового использования) для культивирования вирусов в монослое культур клеток 34

42 Контроль качества монослоя культур клеток. Подготовка культур клеток для культивирования вирусов 35

43 Культивирование вирусов в матрацах с использованием термостата 36

44 Подготовка роллеров для культивирования вирусов в монослое клеток 37

45 Роллерная установка 38

46 Биореактор для суспензионного культивирова- ния культур клеток при производстве противовирус- ных препаратов 39

47 Развивающийся куриный эмбрион 1.Скорлупа 2.Подскорлуповая оболочка 3.Воздушная камера 4.Аллантоисная полость 5.Желточный мешок 6.Амниотическая полость 7.Хорионаллантоис- ная оболочка 40

48 Использование мышей как биологических моделей при производстве противовирусных препаратов 41

49 Содержание лабораторных животных, зараженных вирусами, при производстве противовирусных биопрепаратов 42

50 1. Культивирование является основной стадией технологического процесса. 2. При производстве биопрепаратов наиболее широко применятся глубинное культивирование микроорганизмов. 3. Технологический процесс глубинного культивирования является многоэтапным и требует тщательного контроля. 4. При периодическом культивировании развитие микробной культуры происходит в виде последовательных фаз, характер и продолжительность которых зависит от многих параметров. 5. Применение непрерывного культивирования позволяет управлять процессом, а при необходимости вмешиваться в этот процесс. 6. Промышленное культивирование вирусов основывается на использовании культур клеток и куриных эмбрионов.

Значимым достижением генетики и микробиологии является открытие биотехнологии – промышленного способа производства биологических объектов на основе управляемого метаболизма живых организмов.

Биотехнология (от греч. bios - жизнь, tecen - искусство, logos - наука) представляет собой область знаний, которая возникла и сформировалась на стыке микробиологии, молекулярной биологии, генной инженерии, иммунологии, химической технологии и ряда других наук. Рождение биотехнологии обусловлено потребностями общества в новых, более дешевых продуктах для сельского хозяйства, для медицины и ветеринарии, а также принципиально новых технологий.

Целью биотехнологии являются получение продуктов из биологических объектов или с их применением, а также их воспроизводство. В качестве биологических объектов чаще всего используются одноклеточные микроорганизмы, животные и растительные клетки, а также организмы животных, человека или растений.

Биотехнология возникла в древности, примерно 6000- 5000 лет до н.э., когда люди научились выпекать хлеб, варить пиво, приготовлять сыр и вино. Этот первый этап биотехнологии был сугубо эмпирический и продолжал оставаться таким, несмотря на совершенствование технологических процессов и расширение сфер использования биотехнологических приемов, вплоть до открытия Л. Пастером в XIX в. ферментативной природы брожения. С этого момента начался второй, научный, этап традиционной биотехнологии.

В этот период получены и выделены ферменты, открыты многие микроорганизмы, разработаны способы их выращивания и получения в массовых количествах. Созданы культуры животных и растительных клеток и разработаны способы искусственного культивирования. В результате изучения физиологии, биохимии и генетики микробных и животных клеток намечены пути получения многих продуктов микробного синтеза, необходимых для медицины, сельского хозяйства и промышленности. Вначале сформировалась техническая микробиология, а затем - биотехнология. Однако промышленное производство сводилось в основном к получению на основе природных штаммов биомассы бактерий, дрожжей, грибов, вирусов, из которых затем получали или выделяли необходимый продукт (ферменты, антибиотики, антигены, белок и т.д.).

Рождение новой биотехнологии обусловлено рядом принципиальных открытий и достижений в науке: доказательство двунитевой структуры ДНК, расшифровка генетического кода и доказательство его универсальности для человека, животных, растений, бактерий, искусственный синтез биологически активных веществ. Произошло открытие ферментов обмена нуклеиновых кислот, получение рекомбинантных ДНК, а также рекомбинантных вирусов, бактерий, способных синтезировать несвойственные им продукты.

Биотехнология проникает во все сферы производства. Она делает первые шаги в космос, осваивая специфические неземные условия.

С самых первых шагов было очевидно, что космос создает для биотехнологических процессов не только большие трудности, но и большие преимущества. Они обусловлены, главным образом, невесомостью, существенно изменяющей течение физико-химических процессов, на которых основаны многие биотехнологии. Это, прежде всего, относится к производственным процессам электрофоретического или хроматографического разделения белков и других биоматериалов. Другая особенность состоит в том, что жидкости из-за повышенной (в сравнении с земными условиями) величины поверхностного натяжения и понижения сил гравитации обретают сферические формы, не нуждающиеся в сосудах, емкостях, минимизируется энтропия жидкостей. Это создает благоприятные условия для процессов кристаллизации белков – важного для многих биотехнологий процесса получения высококачественных белковых продуктов и для рентгеноструктурного анализа белков.

Первые работы в области космической биотехнологии возникли в начале 70-х годов. В настоящее время считается, что примерно 4 % рынка биотехнологических продуктов может быть обеспечено космосом.

В условиях невесомости уже получены кристаллы ферментов – лизоцима, галактозидазы. Получен ценный медицинский препарат эритропоэтин – гормон, стимулирующий образование красных кровяных телец.

Условия невесомости более благоприятны также для такого процесса, как инкапсулирование клеток в полупроницаемые мембраны. Инкапсулированные клетки, например, клетки поджелудочной железы животных, можно имплантировать (вживлять) в тело больных сахарным диабетом, где они могут продуцировать инсулин. Инкапсулированные клетки печени, например, можно использовать также для создания искусственных органов с целью очищения крови.

Огромный вклад в развитие биотехнологии вносит Институт медико-биологических проблем, которому 20 лет назад присвоили звание государственного научного центра (ГНЦ) России. Именно здесь изучают молекулярно-клеточные механизмы действия экстремальных факторов, внутриклеточные процессы в условиях космического полета. С этой целью был разработан уникальный бортовой прибор микрофлуориметр. Специалисты этого института доказали, что кратковременная невесомость на эффективность взаимодействия иммунных клеток не влияет.

Помимо этого биотехнология играет большую роль в оздоровлении окружающей среды: с помощью биотехнологических процессов проводят очистку от загрязняющих веществ почвы, водоемов, воздушной среды путем их биоконверсии и биодеградации.

Однако биотехнология не ограничивается получением только вышеперечисленных продуктов. Новейший раздел биотехнологии - генная и белковая инженерия - позволяет получать совершенно уникальные биотехнологические эффекты, открывать способы диагностики, профилактики и лечения врожденных болезней, влиять на свойства генома человека, животных и растений.

На Земле существует около 100 тыс. видов бактерий, не считая многочисленных грибов (250 тыс. видов), вирусов, простейших. Микробы способны синтезировать продукты или осуществлять реакции, полезные для биотехнологии. Однако в практике используют не более 100 видов микроорганизмов, так как остальные мало изучены.

Так, например, дрожжи используют в хлебопечении, пивоварении, виноделии, получении соков, кормового белка, питательных сред для выращивания бактерий и культур животных клеток. Из бактерий в биотехнологии чаще всего используют псевдомонады, например РР. denitrificans, - для получения витамина В12; Corynebacterium gentamicum - для получения аминокислот и др. Из грибов в биотехнологии для получения разнообразных антибиотиков применяют род Streptomyces, Penicilium chrysogenium, Cefalosporum acremonium.

Многие микроорганизмы - бактерии, дрожжи, вирусы - используются в качестве реципиентов чужеродного генетического материала с целью получения рекомбинантных штаммов - продуцентов биотехнологической продукции. Так получены рекомбинантные штаммы E. coli, продуцирующие интерфероны, инсулин, гормоны роста, разнообразные антигены; штаммы B. subtilis, вырабатывающие интерферон; дрожжи, продуцирующие интерлейкины, антигены вируса гепатита В; рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антигены вируса гепатита В, вируса клещевого энцефалита и др.

Таким образом, биотехнология открывают перед человечеством огромные перспективы. В то же время следует помнить, что эксперименты в этой области могут быть опасными, так как при переносе генов могут возникнуть организмы с непредсказуемыми свойствами. Именно поэтому работы в области биотехнологии должны производиться и производятся в соответствии со строгими международными правилами.

Белоусова Р. В., Ярыгина Е. И., Третьякова И. В., Калмыкова М. С

Характеристики

Описание товара

Рассмотрены вопросы общей вирусологии и биотехнологии. Дана характеристика и описаны особенности вирусов, бактериофагов и прионов. Изложены особенности противовирусного иммунитета, специфической профилактики и диагностики вирусных болезней. Даны основы биотехнологии и генной инженерии в области вирусологии.

Введение

Вирусология — это наука о вирусах и вызываемых ими болезнях. Она имеет два основных раздела: общая вирусология (природа вирусов‚ эволюция‚ свойства и т. д.) и частная вирусология (болезни‚ вызываемые вирусами).

Заболевания растений‚ животных и человека‚ вирусная природа которых в настоящее время установлена‚ в течение многих столетий наносили ущерб сельскому хозяйству и вред здоровью человека.

Многие из вирусных заболеваний были описаны очень давно‚ но попытки установить их причину и обнаружить возбудителя оставались безуспешными. Однако первая вакцина для предупреждения вирусной инфекции — оспы — была предложена английским врачом Э. Дженнером в 1796 г.‚ почти за 100 лет до открытия вирусов. Он впервые осуществил древнюю мечту человечества: обуздать одну из самых страшных болезней человека — натуральную оспу. Сделал он это с помощью вакцинации (искусственных прививок возбудителя коровьей оспы). Вторая вакцина — против бешенства — была предложена основателем микробиологии Л. Пастером в 1885 г.‚ за семь лет до открытия вирусов.

Принято считать‚ что становление вирусологии как самостоятельной науки происходило в 1892–1950 гг. В 1897 г. Ф. Леффлер и П. Фрош‚ используя принцип фильтруемости‚ примененный Д. И. Ивановским‚ показали‚ что возбудителем ящура — болезни животных — также является вирус. Затем последовало открытие возбудителей чумы крупного рогатого скота (Николь и Адиль-Бем‚ 1902)‚ чумы собак (Kappa, 1905), саркомы Рауса (Раус‚ 1911) и других болезней животных.

В 1915 и 1917 гг. Ф. Туорт и Ф. д’Эррель открыли вирусы бактерий (бактериофаги). Появлялись многочисленные сообщения о вирусной природе кори‚ полиомиелита‚ гриппа‚ энцефалита и т. д.

Таким образом, уже во втором десятилетии ХХ в. стали известны вирусы растений‚ животных‚ бактерий и человека.

В этом потоке новостей о вирусах были и затишья‚ продолжавшиеся до появления новых методов их выделения‚ культивирования и идентификации.

В процессе изучения вирусов можно отметить несколько уровней познания — от уровня организма до субмолекулярного.

В 30–40 гг. ХХ в. в качестве основной экспериментальной модели использовали лабораторных животных‚ которые были чувствительны к ограниченному количеству вирусов. В 40-е гг. ХХ в. благодаря исследованиям австралийского вирусолога-иммунолога Ф. М. Бернета и американского вирусолога Дж. Херста в вирусологию в качестве экспериментальной модели вошли развивающиеся куриные эмбрионы. Использование этой модели позволило исследователям открыть и культивировать много новых вирусов: кори‚ инфекционного ларинготрахеита птиц‚ оспы птиц‚ ньюкаслской болезни и др.

Подлинно революционным событием для вирусологии было открытие возможности культивировать клетки в искусственных условиях. В 1952 г. Д. Эндерс, Т. Уэллер и Ф. Роббинс получили Нобелевскую премию за разработку метода культуры клеток. Использование культур клеток позволило повысить эффективность выделения и клонирования многочисленных новых вирусов, изучения их взаимодействия с клеткой и получения культуральных вакцин.

Применение новых методов исследования позволило расширить представление о мире вирусов, их природе, характере взаимодействия с чувствительными клетками организма, выявить особенности противовирусного иммунитета, заострить проблемы экологии вирусов, уточнить роль вирусов в онкогенных процессах, проследить эволюцию ряда вирусных болезней человека и животных.

С момента открытия вирусов до настоящего времени представления об их природе претерпели значительные изменения.

По мере изучения природы вирусов за первые пятьдесят лет после их открытия сформировались представления о вирусах как мельчайших организмах на основании наличия у них свойств, характерных для других организмов:

— способности к размножению;

— наследственности (вирусы воспроизводят себе подобных, наследственные признаки вирусов можно учитывать по спектру поражаемых ими хозяев, симптомов заболеваний и специфичности иммунных реакций);

— приспособляемости к условиям внешней среды — через организм хозяина;

— способности эволюционировать под действием естественного отбора (главным фактором естественного отбора для вирусов стал искусственный отбор вакцинных штаммов, которые в организме вакцинированных животных или человека взаимодействуют с дикими штаммами, что приводит к возникновению и распространению гибридных вариантов).

В середине ХХ в. выход естественных наук на молекулярный уровень стимулировал дальнейшее развитие вирусологии, иммунологии, генетики.

Создание электронного микроскопа сделало видимым мир вирусов и макромолекулярных соединений. Использование молекулярных методов в вирусологии позволило установить принципы строения (архитектуру) вирусных индивидуумов — вирионов (термин, введенный французским микробиологом А. Львовым)‚ изучить способы проникновения вирусов в клетку и их репродукцию.

Исследования показали, что генетическим веществом у вирусов может быть ДНК или РНК. Нуклеиновые кислоты вирусов заключены в футляр — капсид из белковых молекул, y сложных вирусов могут быть внешние оболочки (суперкапсидные)‚ состоящие из белков, углеводов и липидов.

С развитием исследований по молекулярной биологии вирусов стали накапливаться сведения об уникальных свойствах вирусов, отличающих их от всех других микроорганизмов:

— генетический материал вирионов может быть представлен одним из двух видов нуклеиновых кислот — ДНК или РНК в различных формах (линейные, кольцевые, одно- или двуцепочечные‚ фрагментированные‚ разобщенные молекулы);

— вирусы не имеют собственных белоксинтезирующих (рибосомы) и энергетических систем;

— у вирусов нет обмена веществ;

— вирусы размножаются только в живых клетках (в клетках животных, человека, растений, прокариот‚ культурах клеток);

— от всех клеток и организмов (которым свойственны бинарное деление, почкование и др.) вирусы отличает уникальный способ размножения — дизъюнктивный, или разобщенный‚ т. е. синтез вирусных компонентов (нуклеиновых кислот и белков) и последующее формирование вирионов разобщены в пространстве (внутри клетки) и времени.

К вирусам примыкают вироиды — патогены растений и, возможно, животных, способные передаваться как обычные инфекционные вирусы. Вироиды представляют собой короткие фрагменты (несколько сотен нуклеотидов) вы сококомплементарной кольцевой одноцепочечной РНК, лишенные белковой оболочки, характерной для вирусов. Они были открыты и названы в 1971 г. Т. О. Динером. Механизм репликации вироидов не вполне ясен.

Многие годы считали, что некоторые медленные инфекции у человека (куру, болезнь Крейтцфельдта — Якоба, синдром Герстманна — Штрейусслера — Шейнкера и др.) и животных (энцефалопатия у крупного рогатого скота, норок и др.) вызывают вирусы. Однако оказалось, что причиной этих болезней являются новые патогенные агенты — прионы, открытые в начале 1980-х гг. американским биохимиком С. Прузинером и представляющие собой белки с аномальной третичной структурой. Прионы не содержат нуклеиновых кислот.

По-видимому, вирусы можно рассматривать как биологические образования, несущие генетическую информацию, которую они реализуют только в живых клетках.

Значение вирусов в жизни человека очень велико. С одной стороны, вирусы — это этиологические агенты большинства инфекционных болезней человека, животных и растений. С другой стороны, вирусы, благодаря относительной простоте их строения, служат прекрасной биологической моделью для изучения фундаментальных проблем биологии, генетики, биохимии, иммунологии, генной инженерии. По словам У. Стенли и Э. Вэленса (1964), вирусы дают науке единственный ключ к пониманию функции нуклеиновых кислот, а возможно, и природы самой жизни.

В 1974 г. В. М. Жданов высказал гипотезу, согласно которой вирусы — важный фактор эволюции органического мира. Преодолевая видовые барьеры, вирусы могут переносить отдельные гены или группы генов, а интеграция вирусной ДНК с хромосомами клеток может приводить к тому, что вирусные гены становятся клеточными генами, выполняющими важные функции. Вирусы представляют собой закономерные продукты живой материи, участвующие в ее эволюции от древнейших примитивных форм до высших растений и животных, включая человека.

Почему вирусология, которая зародилась в недрах микробиологии, сделала за несколько десятилетии таков стремительный скачок, став одной из ведущих и профилирующих дисциплин медико-биологических и ветеринарных наук?

Этому способствовал ряд обстоятельств.

Во-вторых, использование вирусов в качестве биологической модели позволило сделать многие фундаментальные открытия в области биологии (изучены механизмы репликации ДНК, синтеза белка и др.).

В-третьих, установлено, что широкому распространению респираторно-кишечных болезней молодняка, приносящих огромный экономический ущерб, способствует тесное взаимодействие по фону стрессовых факторов бактерий, хламидий и вирусов различных таксономических групп (аденовирусы, ротавирусы, коронавирусы, па-рамиксовирусы, вирусы диареи и др.).

В-четвертых, отдельные виды патологии (врожденные уродства, пороки развития и др.), в которых роль вирусов даже не подозревалась, оказались уделом вирусологов. В медицине известно, что вирусы являются одной из причин внутриутробной патологии человека (вирус краснухи, аденовирусы, вирус гриппа и др.). К сожалению, в ветеринарной вирусологии эта проблема не привлекла должного внимания. Тератогенное действие вирусов наблюдается и в инфекционной патологии животных: вирус чумы свиней часто вызывает мертворождение и мумификацию плодов; вирус диареи крупного рогатого скота — гипоплазию мозжечка новорожденных телят; вирус инфекционного бронхита кур — патологическую форму яиц; вирус инфекционного ринотрахеита — пороки развития и слепоту у телят.

Накапливаются сведения о роли вирусов в возникновении ряда хронических патологий, острых сердечно-сосудистых заболеваний, заболеваний почек, поджелудочной железы, глаз и т. д. Только разносторонние исследования могут служить основой для выяснения роли вирусов в возникновении болезней с неясной этиологией, еще изучаемых врачами-неинфекционистами.

И, наконец, собраны неоспоримые доказательства того, что вирусы вызывают образование опухолей (лейкоз птиц, лейкоз крупного рогатого скота, болезнь Марека и др.). Выяснение причин возникновения злокачественных заболеваний человека, от которых во всем мире ежедневно погибают миллионы людей, остается одной из важнейших проблем современной биологии и медицины.

В конце ХХ — начале ХХI в. стало известно о вирусах, инфицирующих фито- и зоопланктон океанов. Считается, что этих вирусов в океане в 10 млн раз больше, чем звезд во Вселенной — порядка 1030 (Д. К. Львов, 2012). Из выделенных в океане вирусов 90% раньше не были известны, но есть и близкие родственники известных, включая вирус гриппа. Вирусы гриппа широко распространены в биосфере среди птиц и млекопитающих, выделен вирус и от китов, отловленных у берегов Антарктиды. На примере вируса гриппа А можно проследить эволюцию, темпы которой измеряются не миллионами и даже не тысячами лет, а немногими годами. Незначительные изменения антигенной структуры вируса гриппа А происходят ежегодно, а резкие смены антигенов — один раз в 10–15 лет. Наиболее опасными могут быть новые пандемические штаммы вируса гриппа, возникающие в результате реассортации вирусов гриппа человека и птиц. Вирусы гриппа ускользают от действия иммунной системы организма за счет быстрого изменения своих антигенных детерминант. Это затрудняет проведение своевременных эффективных специфических профилактических мероприятии.

Особую угрозу национальной и глобальной безопасности представляют новые и вновь возвращающиеся, или эмерджентные (англ. eme r ging и r eeme r ging), инфекции, возникающие в результате природных катаклизмов или криминальных действий. Считают, что они непредсказуемы и способны вызывать чрезвычайные эпидемиологические и эпизоотические ситуации, борьба с которыми на этапе их возникновения трудна. Эти ситуации возникают в мире все чаще и становятся все более грозными.

К началу ХХI в. зарегистрировано около 40 новых эмерджентных болезней, в том числе СПИД, геморрагические лихорадки, вирусные гепатиты, прионные болезни и др. Кроме того, стали вновь распространяться давно известные, ранее поставленные под контроль заболевания — корь, малярия, сифилис, туберкулез.

Среди множества инфекционных болезней животных есть группа болезней, которые именуются особо опасными, или конвенционными. Международное эпизоотическое бюро в своей классификации поместило их в группу А, имея в виду, что они могут вызывать массовые поражения животных, наносить большой экономический ущерб животноводству, некоторые из них поражают человека. Болезней, состоящих в группе А, насчитывается 16, в том числе 14 — вирусной этиологии (ящур, вирусный стоматит, везикулярная болезнь свиней, чума крупного рогатого скота, чума мелких жвачных, нодулярный дерматит, лихорадка долины Рифт, блютанг, оспа овец и коз, африканская чума свиней, классическая чума свиней, африканская чума лошадей, грипп птиц и болезнь Ньюкасла), одна вызываемая микоплазмами (контагиозная плевропневмония крупного рогатого скота) и одна прионная (губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота).

Учитывая все выше изложенное, следует признать, что изучение архитектуры вирионов, этапов репродукции вирусов, патогенеза вирусных болезней на клеточном и органном уровне, так же, как и создание эффективных противовирусных препаратов, без участия таких наук, как молекулярная биология, генетика, иммунология, биохимия и биофизика вирусов, невозможно. Совокупность же методов, применяемых в перечисленных и некоторых других смежных науках, изучающих биологию клетки, позволило развиться такой науке, как биотехнология.