Набор для выявления антител к вирусу бешенства

Сухарьков А.Ю, Назаров Н.А., Метлин А.Е. ФГБУ ВНИИЗЖ


Бешенство - острая инфекционная болезнь животных и человека, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с летальным исходом. Бешенство регистрируется во многих странах мира, в том числе и в России.

Диагностика бешенства играет важную роль для оказания своевременной постэкспозиционной лечебной помощи людям и борьбы с бешенством среди животных [7]. Она должна быть быстрой и достоверной, так как это необходимо для оценки риска, который угрожает людям.

В настоящее время базовыми методами диагностики бешенства являются реакция иммунофлуоресценции (РИФ) и биологическая проба на мышах, а также выделение вируса на культуре клеток, постепенно заменяющее биологическую пробу на мышах [6]. Несмотря на высокую надежность и чувствительность этих методов, они имеют ряд недостатков. Основным недостатком биологической пробы на мышах и выделения вируса в культуре клеток является то, что для получения результатов исследования может потребоваться длительное время [11]. Точность постановки диагноза методом РИФ во многом зависит от наличия у персонала диагностических лабораторий необходимой квалификации. Кроме этого, для проведения диагностики с использованием этих методов, как правило, не годятся пробы с признаками частичного разложения мозговой ткани, в силу возможного получения лож-ноотрицательных результатов. Эти диагностические системы также малопригодны для широкомасштабного мониторинга бешенства. Перечисленных выше недостатков метод имму-ноферментного анализа (ИФА) не имеет. Этот метод в числе других рекомендован для диагностики бешенства Всемирной Организацией Здравоохранения (В0З) и Всемирной Организацией Охраны Здоровья Животных (OIE) [5]. Иммуноферментный анализ отличается простотой и быстротой выполнения, может обходиться без применения дорогостоящего оборудования в случае визуальной оценки результатов исследований. Он отлично подходит для проведения мониторинга бешенства, при этом позволяя интерпретировать полученные результаты с высокой степенью достоверности.

Ранее нами был разработан твердофазный непрямой сэндвич-вариант иммуноферментного анализа для диагностики бешенства животных, с использованием поликлональных антител, полученных на рибонуклеопротеин вируса бешенства [2]. Прямой сэндвич-вариант ИФА более быстрый по времени и менее затратный, чем непрямой.

Целью данной работы являлась разработка прямого сэндвич-варианта ИФА для диагностики бешенства и проведение сравнительных испытаний прямого и непрямого сэндвич-варианта ИФА.

Материалы и методы. Рибонуклеопротеин вируса бешенства (далее, РНП ВБ) выделяли из клеток ВНК-21, инфицированных вирусом бешенства (далее, ВБ), штамм ВНИИЗЖ, по методике, рекомендованной ВОЗ в руководстве "Лабораторная диагностика бешенства" [8]. Вирус бешенства, штамм ВНИИЗЖ, очищали и концентрировали из культурального вирусного сырья, инактивированного димером этиленимина [3]. Концентрацию белка в очищенных препаратах вируса и РНП вируса определяли по методу Лоури [9]. Степень чистоты полученных антигенов контролировали методом вертикального электрофореза в агарозном геле с додецилсульфатом натрия в денатурирующих условиях.

В качестве улавливающих использовали поликлональ-ные антитела к РНП ВБ, которые получали иммунизацией кроликов соответствующим антигеном. Очищенный РНП ВБ вводили животным внутримышечно три раза (0, 40, 54 дни) в дозе 400 мкг на голову.

В качестве детекторных использовали антирабические антитела морской свинки, которые получали иммунизацией животных очищенным ВБ. Антиген вводили животным внутримышечно четырехкратно в дозе 200 мкг на голову с интервалами в 1 неделю, 5 и 2 недели. При иммунизации морских свинок и кроликов первую инъекцию проводили с полным, а последующие - с неполным адъювантом Фрейнда "Sigma".

Через две недели после последней инъекции в сыворотках крови иммунизированных животных определяли титры специфических антител методом твердофазного непрямого варианта иммуноферментного анализа. Титровали с шагом три, начиная с разведения 1:1000. В дальнейшей работе использовали сыворотки крови с титрами антител к ВБ и РНП ВБ не ниже 1:243000. Из отобранных сывороток выделяли фракцию IgG методом трехкратного высаливания сульфатом аммония. Концентрацию белка в конечных препаратах определяли методом спектрофотомерии при длине волны 280 нм.

Поликлональные антирабические антитела морских свинок использовали для получения антирабического перокси-дазного коньюгата по методу Накане [4].

Для отмывки лунок планшетов от компонентов реакции использовали Трис-HCl буферный раствор с добавлением Tween-20 (ТБСТ).

В качестве субстрата для пероксидазы использовали ор-тофенилендиамин.

Для учета результатов непрямого сэндвич-варианта ИФА использовали антивидовой пероксидазный конъюгат к антителам морской свинки производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи (г. Москва) в разведении 1:1000.

Положительным контролем в ИФА служила инактивиро-ванная р-пропиолактоном [10] лиофилизированная 20%-ная суспензия мозговой ткани кролика, инфицированного ВБ штамма CVS. В качестве отрицательного контроля использовалась лиофилизированная 20%-ная суспензия мозговой ткани неинфицированного кролика.

Исследуемые образцы (пробы ткани головного мозга животных) поступали в ФГБУ "ВНИИЗЖ" из разных региональных ветеринарных лабораторий. Поступивший биоматериал до использования хранили при минус 20°С. Образцы мозговой ткани для исследования готовили следующим образом. В пенициллиновый флакон с Трис - НС1 буферным раствором помещали кусочки ткани головного мозга из разных отделов (продолговатый мозг, мозжечок, аммоновы рога, кора больших полушарий) в количестве, необходимом для приготовления 30%-ной суспензии. Содержимое флакона тщательно гомогенизировали путем интенсивного встряхивания и подвергали однократному замораживанию. Далее пробу подвергали частичному размораживанию при комнатной температуре, и интенсивно встряхивали для более полной гомогенизации. Затем содержимое флакона переносили в пластиковую центрифужную пробирку с крышкой в объеме 1,5 мл и центрифугировали в течение 20 минут при 1000g. Для исследования использовали супернатант в цельном виде. Оставшийся в пенициллиновом флаконе материал хранили при минус 200С.

Кроме прямого сэндвич-варианта ИФА пробы исследовали методами РИФ [1] и непрямым сэндвич-вариантом ИФА [2]. При исследовании проб головного мозга в РИФ использовали ФИТЦ-иммуноглобулин производства ФГБУ "ВНИИЗЖ".

Результаты и обсуждение. Исследования проб в прямом сэндвич-варианте ИФА выполняли по следующей схеме.

Сенсибилизация планшетов. Для сенсибилизации планшетов в лунки вносили поликлональные кроличьи антитела к РНП ВБ по 100 мкл в лунку, разведенные в карбонатно-би-карбонатном буферном растворе (рН 9,5) до концентрации 5 мкг/мл, и инкубировали в течение 18-20 ч при 4°С. Сенсибилизированный планшет 3 раза отмывали ТБСТ.

Внесение исследуемых проб и контрольных препаратов. В лунки вертикального ряда по очереди в трех повторностях вносили положительный, отрицательный, безантигенный (промывочный буферный раствор) контроли и исследуемые пробы по 100 мкл в лунку. Планшет инкубировали 1 ч при 37°С и затем трижды отмывали промывочным буферным раствором.

Внесение пероксидазного антирабического конъюгата. Рабочее разведение антирабического конъюгата с перокси-дазой хрена готовили на ТБСТ с добавлением 5%-ной нормальной сыворотки лошади. В лунки планшета вносили по 100 мкл приготовленного коньюгата, инкубировали 1 ч при 37°С и отмывали 5 раз промывочным буферным раствором. Рабочее разведение антирабического пероксидазного конъюгата предварительно определяли в прямом сэндвич-варианте ИФА методом последовательных разведений, с использованием положительного и отрицательного контрольных препаратов, которое составило 1:1500.

Внесение субстрат-хроматогенной смеси. Раствор субстрат-хроматогена вносили по 100 мкл на лунку. Инкубировали 20 минут при комнатной температуре в темноте, реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 3н H2SO4.

Учет результатов . Результаты реакции учитывали с помощью сканирующего спектрофотометра "BioRad PR 2100" при длине волны 490 нм. Определяли среднюю оптическую плотность (ОП) безантигенного, положительного и отрицательного контролей, а также среднюю ОП тестируемых образцов. После этого рассчитывали ОП тестируемых образцов, положительного и отрицательного контролей, вычитая среднюю ОП безантигенного ряда. Согласно рекомендациям ВОЗ, расчетная ОП (ОПр) отрицательного и положительного контролей должна быть не выше 0,1 и не ниже 1,5 единиц, соответственно. Исследуемые образцы считали положительными, если их ОПр превышала ОПр отрицательного контроля на 0,1 единицы [5].

Для оценки диагностической специфичности разработанного прямого сэндвич-варианта ИФА исследовали 30 проб головного мозга от разных животных, отрицательных по бешенству в РИФ. Расчетная оптическая плотность отрицательных проб составила 0,013±0,0004, что свидетельствует о высокой специфичности разработанного ИФА, которая в данном исследовании составила 100%.

С целью измерения предела чувствительности разработанного метода провели анализ с использованием РНП ВБ известной концентрации. Проведенные исследования показали, что предел чувствительности метода находится в диапазоне 15-30 нг/мл. При этом предел чувствительности непрямого сэндвич-варианта ИФА, разработанного нами ранее [2], составил такую же величину.

Для изучения эффективности диагностики бешенства разработанным прямым сэндвич-вариантом ИФА в сравнении с другими методами, в том числе и непрямым сэндвич-вариантом ИФА, было исследовано 100 проб головного мозга животных, направленных в ФГБУ "ВНИИЗЖ" для исследования на бешенство. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты исследований мозговой ткани животных, подозреваемых в заболевании бешенством, в прямом сэндвич-варианте ИФА, в сравнении с другими методами диагностики бешенства

Участники и результаты

Организация, размещающая заказ

Государственный Комитет по Регулированию Контрактной Системы в Сфере Закупок Республики Хакасия

44-ФЗ, Электронный аукцион

ИНН 1901023044 КПП 190101001

Набор компонентов для диагностики бешенства животных в реакции диффузной преципитации (РДП)

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор для выявления геномной РНК вируса бешенства (Rabies virus: возбудитель бешенства у человека и животных), методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор антигенов и сывороток для диагностики гриппа лошадей в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор для иммунноферментной диагностики ринопневмонии лошадей (выявление антител)

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор для идентификации вируса болезни Ньюкасла методом ПЦР

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор для выявления антител к вирусу Ньюкаслской болезни (НБ) иммуноферментным методом при тестировании в одном разведении

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор для выявления антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни птиц (ИББ) иммуноферментным методом при тестировании в одном разведении

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор для идентификации вируса инфекционного бронхита кур методом ПЦР

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор для выявления антител к вирусу инфекционного бронхита кур (ИБК) иммуноферментным методом при тестировании в одном разведении

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости –76 (ССЯ-76) иммуноферментным методом при тестировании в одном разведении

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор для диагностики синдрома снижения яйценоскости (ССЯ-76) в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Тест-система "ГРИПП" для выявления и дифференциации вируса гриппа птиц методом ПЦР

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала "Рибо-сорб"

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Комплект реагентов для экстракцииРНК/ДНК из клинического материала "Ампли Прайм РИБО-преп"

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Тест-система "ХЛАП-СИТ" для выявления возбудителя хламидиозаСlamydophlila psittaci

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота иммуноферментным методом "ИРТ -СЕРОТЕСТ"

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Тест-система "РИНОКОР" для выявления возбудителя ринотрахеита крупного рогатого скота методом ПЦР

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Тест-система для обнаружения вируса парагриппа-3 методом ПЦР

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор диагностикумов парагриппа-3 КРС в реакции торможения гемагглютинации (РТГА)

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор для выявления антител к респираторно-синцитиальному вирусу КРС ИФ-методом "РСИ- СЕРОТЕСТ"

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Тест-системадля "РОТАВИР" для диагностики возбудителя ротавирусной инфекции животных методом ПЦР

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор для выявления антигенов аденовирусов плотоядных иммуноферментным анализом (ИФА)

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор для выявления антигенов парвовирусного энтерита собак, вирусного энтерита норок и панлейкопении кошек иммуноферментным анализом

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор для выявления антигенов чума плотоядных иммуноферментным анализом (ИФА)

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор диагностический для постановки реакции РСК при листериозе

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Антиген паратуберкулезный для связывания комплемента

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор диагностики лейкоза крупного рогатого скота в реакции иммунодиффузии

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор эритроцитарного диагностикума для серодиагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор специфических компонентов для диагностики болезни овец, вызываемой бруцеллой овис

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Набор для идентификации вируса болезни Гамборо (инфекционная бурсальная болезнь кур) методом ПЦР в реальном времени. В полной комплектации

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Комплект реагентов для получения к ДНК по матрице "РЕВЕВЕТА-L"

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Тест-система для обнаружения цирковируса свиней II типа (ЦВС-2)

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Тест-система "ВД" для выявления возбудителя вирусной диареи крупного рогатого скота методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки

Сыворотка паратуберкулезная для РСК

ОКПД2 20.59.52.199 Реагенты сложные диагностические или лабораторные прочие, не включенные в другие группировки



Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Усовершенствование методов идентификации вируса бешенства и выявления антирабических антител

На правах рукописи

ТИМИРГАЛЕЕВ Руслан Владимирович

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА БЕШЕНСТВА И ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКИХ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Научный руководитель: доктор биологических наук

Хисматуллина Наиля Анваровиа

Научный консультант: доктор биологических наук

Гилыиутдннов Рустам Якубович Официальные оппоненты: -доктор ветеринарных наук, профессор

Госманов Рауис Госмановнч -'доктор ветеринарных наук, профессор Фаизов Тагир Хадиевич Ведущая организация: ФГУ «Всероссийский государственный

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО "Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана".

Автореферат разослан 2,1), 1/п*

Исходный ВБ 10«4 6,0 + 0,3 128

Ацетатом цинка 10"'" 2,2 ±0,21 640

ПЭГ-6000 10,JW 2,1+0,20 640

УЦФ 10ьь 1,7 + 0,15 2560

Из данных табл. 1 следует преимущество метода УЦФ но В.01е1г5сЬо]с) (1996) с. нашими модификациями, применение которого повышало инфекционный титр в 45,7 раза, антигенную активность — в 20 раз, а содержание белка снижало в 3,5 раза. В последующих экспериментах для очистки и концентрирования вируса бешенства использовали метод УЦФ. Модификация метода заключалась в оптимизации режима УЦФ; 50 ООО % в течение 2-х ч. вместо 100 ООО ц в течение 1 ч ПО В^еЫзсЬоЫ (1996).

Рис. Электрофоретическое разделение и иммуноблоттинг ДСН-зкстрактов концентрированного культурального вируса бешенства, штамм

2.2.2. Изыскание оптимальной схемы гипериммунизации белых мышей линии ВАЬВ/с антигеном возбудителя бешенства

Важным условием для получения антителопродуцирующих гибридом является изыскание оптимальных схем иммунизации доноров спленоцитов -линейных мышей, эффективность которых определяется, в частности, активностью и специфичностью иммунизирующего антигена.

Сравнительный анализ схем иммунизации мышей линии ВАЬВ/с показал, что срок проведения иммунизации по 1-ой схеме наиболее длителен и составляет 46, по второй - 32 и по третьей - 31 суток, т.е. третья схема оказалась самой короткой. При этом активность сывороток крови была максимальной и соответствовала по НМФА 1:3200 и по ИФА 1:6400.

Таким образом, установлено преимущество иммунизации мышей по 3-ей схеме, которую и использовали в дальнейшей работе для иммунизации мышей линии ВАЬВ/с глико- и нуклеопротеиновыми компонентами вируса бешенства.

2.23. Получение гибридом, продуцирующих МКА к структурным белкам возбудителя бешенства ir изучение их свойств

При получении гибридом скрининг положительных клонов проводили методом непрямого иммуноферментного анализа. В качестве твердой фазы использовали полистироловые планшеты. Положительным считали результат, „более чем в 2,1 раза превышающий оптическую плотность в лунках с отрицательным контролем (КсП >2,1).

В результате слияния B-лимфоцитов с клетками миеломы SP 2/0-Ag 4.1 получено 27,9% и 29,2% гибридом, положительно реагирующих соответственно на гликопротеиновый и нуклепротеиновый антигены вируса бешенства.

После отбора положительных клонов гибридных клеток, было проведено клонирование и реклонирование для выделения одиночных, стабильно продуцирующих клонов. Анализ позитивных клонов повторяли трижды для большей достоверности результатов.

Параллельно отбирали позитивные клоны для криоконсервации, установления специфичности и тестирования с эпизоотическими изолятами ВБ.

Часть культуры гибридных клеток, синтезирующих МКА, замораживали в жидком азоте или в рефрижераторе при -70 °С. Замораживали 24 - 36 часовые культуры, находящиеся в логарифмической

фазе роста и выросшие до сплошного монослоя.

Для изучения стабильности гибридом при хранении их в жидком азоте, через определенные сроки клетки размораживали и исследовали в непрямом ИФА. Результаты исследований показали, что гибридомы стабильно сохраняют свою активность при хранении в жидком азоте в течение 12 мес, в тоже время репродуцирующая активность гибридом, хранившихся в жидком азоте в течении 18 мес., снижалась и требовалось проведение большего количества пассажей после размораживания. Установлена также стабильность гибридом при хранении их в замороженном виде при -70 °С в течение 6 мес. с некоторым снижением активности к 12-ому месяцу хранения.

2.2.4. Идентификация полевых штаммов возбудителя бешенства с помощью МКА к глнко- и нуклеопротеннам рабического вируса методами иммунофлуоресценции и иммуноферментного анализа Результаты испытания МКА к структурным белкам возбудителя бешенства 12 проб патматериала от различных животных, доставленных для исследования на бешенство из различных районов Республики Татарстан представлены в таблице 2.

2. Анализ эпизоотических изолятов ВБ по МФА с использованием МКА

к глико- и нуклеопротеинам рабического вируса

Изоляты Источник выделения (мозг) Анализ отпечатков мозга по НМФ А с помощью Биопроба на белых мышах, инкубационный период, сут.

МКА к Поликло-нальной сыворотки

Эксп. 3366 КРС + ++++ +++ 13. 22

Эксп. 5312 + ++++ +++ 15. 22

Эксп. 4688 + +++ ++ 14. 20

Эксп. 3518 МРС + ++-Н- +++ 10. 22

продолжение таблицы 2

Эксп. 2042 лиса отр. 1111 +++ 15. 20

Эксп. 3121 лиса отр. -Н-++ +++ 14. 20

Эксп. 4848 отр. ++++ +++ 12. 20

Эксп. Л2 отр. отр. отр. отр.

Эксп. 5262 отр. ++++ +++ 15. 23

Эксп. 5276 + ++4+ +++ 10. 22

Эксп. 4765 собака отр. +++ +++ 15. 21

Эксп. 2625 кошка отр. 1111 +++ 12. 19

Эксп. . 3500 отр. ++++ +++ 16. 21

Контроль ВБА, шт. ВГНКИ отр. отр. отр. 3. 5

Из данных табл. 2 следует более четкое выявление антигена эпизоотических штаммов вируса бешенства в мазках-отпечатках с использованием МКА к нуклеопротеину рабического вируса, оцениваемое на 3 креста (экспертиза № 4688, 4765), а также на 4 креста (эксп. №№ 3366, 5312, 3518, 2042, 3121, 4848, 5262, 2625, 3500, 5276), тогда как с помощью поликлональной антирабической сыворотки положительная реакция оценивалась на 2-3 креста. В то же время с помощью МКА к гликопротеину возбудителя бешенства специфический АГ выявлялся лишь на 1 крест или вообще не выявлялся. При этом как положительные, так и отрицательные результаты анализа с помощью МКА полностью совпали с результатами классической биопробы на белых мышах. Однако время анализа проб по МФА занимало 5-6 часов, при этом для проведения биопробы требовалось до 26 суток наблюдения за подопытными животными.

В культуре клеток NGUK-1, зараженной эпизоотическими изолятами, выделенными из мозга КРС (эксп. 3366) и лисицы (эксп. 5262) антиген вируса бешенства с помощью МКА к белку N выявляли в НМФА в виде ярких желтовато-зеленых гранул различной формы и величины - от едва заметных до имеющих 15-20 мкм диаметре. В контроле, где клетки NGUK-1 инкубировали с мозговой взвесью от интактных животных, и обработанные МКА к нуклеопротеину рабического вируса с дальнейшим окрашиванием флуоресцирующими антителами к Ig G белой мыши, специфических гранул не отмечено.

3. Результаты РН на мышах различных эпизоотических изолятов возбудителя бешенства с помощью МКА к гликопротеину вируса бешенства,

Изоляты Источник выделения Титр вируса, Ig LD5o/0,03 мл гликопротеину,

Эксп.ЗЗбб 1,73 0,75

Эксп.5312 КРС 1,83 0,82

Эксп.5264 1,24 0,74

Эксп.3518 MPC 1,10 0,41

Эксп.2042 1,65 0,85

Эксп. 3121 1,23 0,45

Эксп. 4848 лиса 1,70 0,90

Эксп. 5262 1,14 0,34

Эксп. 5276 1,54 0,84

Эксп.4765 собака МЗ L 0,23

Эксп. 2625 • кошка 1,17 0,27

Эксп.3500 1,83 0,73

ГНКИ мышь 3,80 2,70

Серией экспериментов исследована возможность применения

4. Анализ эпизоотических изолятов рабического вируса в ИФА с использо-

ванием МКА к основным структурным белкам вируса бешенства

Титры антигена ВБ в ИФА, 1/п*, с помощью

Изоляты Источник выделения (мозг) МКА к гликопротеину МКА к нуклеопротеину МКА к глико- и нуклепротеинам 1 :1 Политонального антирабического глобулина

Эксп. 3366 КРС 20 20 40 40

продолжение таблицы 4

Эксп. 5312 40 40 80 80

Эксп. 4688 10 10 20 20

Эксп. 3518 МРС 40 40 80 80

Эксп. 2042 10 10 20 20

Эксп. 3121 20 20 40 40

Эксп. 4848 лиса 40 40 80 80

Эксп. 5262 10 10 20 20

Эксп. 5276 20 20 40 40

Эксп. 4765 собака • 10 10 . 20 20

Эксп. 2625 кошка 10 10 • 20 20

Эксп. 3500 40 40 80 80

Контроль ВБА, шт. ВГНКИ отр. отр. отр. отр.

Примечание: * - обратные значения титров антител к вирусу бешенства

Из данных табл. 4 следует, что наиболее приемлемым для сенсибилизации планшета является использование смеси МКА к глико- и нуклеопротеинам возбудителя бешенства. При этом титры специфического антигена ВБ в патологическом материале определяются тождественно при использовании поликлонального глобулина в пределах 1:20 - 1:320. МКА только к гликопрогеину или нуклеопротеину позволяют обнаруживать АГ в более низких титры в пределах 1:10 - 1:160. Поэтому в последующих исследованиях для сенсибилизации планшета использовали смесь МКА. Данные результаты объясняются тем, что смесь МКА к глико- и нуклеопротеинам. выявляет больший спектр антигенов в вируссодержащей суспензии, чем МКА к глико- и нуклеопротеинам в отдельности.

В дальнейшем нами была установлена возможность применения МКА к глико- и нуклеопротеинам рабического вируса для контроля антигенности антирабических вакцин. Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии перекрестной реакции между МКА к белку-в и

Учитывая, что вируснейтрализующие антитела вырабатываются в ответ на гликопротеиновый компонент антирабической вакцины, МКА к гликопротеину вируса бешенства рекомендуем использовать для контроля антигенности вакцинных препаратов на всех стадиях технологического процесса при производстве антирабических вакцин.

2.2.5. Применение гликопротеина вируса бешенства для выявления антирабических антител методом ИФА

Целью дальнейших исследований явилось изучение возможности применения гликопротеина вируса бешенства для выявления антирабических антител в сыворотках крови иммунизированных животных, методом ИФА, а также проведение сравнительной оценки эффективности метода ИФА с РН и РДСК в лабораторных условиях.

Для сенсибилизации планшета использовали специфический антиген на основе гликопротеина вируса бешенства, штамм "Овечий" ГНКИ, активность которого в ИФА составила 1:1280 (КсП=2,1), в концентрации по белку - 5 мкг/мл. В качестве антивидовых конъюгатов использовали диагностические антитела против иммуноглобулинов барана и кроликов,

меченных пероксидазой, производства НИИЭ и М им. Н.Ф. Гамалеи, в рабочем разведении 1:4000.

Сопоставление полученных данных свидетельствует о прямой корреляции результатов титрования сывороток крови методом ИФА и РН на мышах (г = 3; Р Тимиргалеев, Руслан Владимирович :: 2006 :: Казань

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика вирусов группы бешенства.

1.2. Методы лабораторной диагностики бешенства.

1.2.1. Методы обнаружения антигена возбудителя бешенства и специфических к нему антител.

1.2.2. Методы выделения вируса бешенства.

1.2.3. Идентификация штаммов вируса бешенства с помощью мо-ноклональных антител.

1.2.4. Методы обнаружения генома возбудителя бешенства.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы исследований.

2.1.1. Материалы исследований.

2.1.2. Методы исследований.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Разработка диагностических препаратов для выявления и идентификации вируса бешенства на основе моноклональных антител (МКА).

3.1.1. Получение очищенного и концентрированного вакцинного вируса бешенства и его основных структурных белков.

3.1.2. Изыскание оптимальной схемы гипериммунизации белых мышей линии ВАЬВ/с антигеном возбудителя бешенства.

3.1.3. Получение гибридом, продуцирующих МКА к структурным белкам возбудителя бешенства и изучение их свойств.

3.1.4. Идентификация полевых штаммов возбудителя бешенства с помощью МКА к глико- и нуклеопротеинам рабического вируса.

3.2. Применение гликопротеина вируса бешенства для выявления антирабических антител методом ИФА.

4. Обсуждение результатов собственных исследований.

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Тимиргалеев, Руслан Владимирович, автореферат

Актуальность проблемы. Бешенство - острое вирусное заболевание общее для животных и человека, характеризующееся признаками полиэнцефаломиелита с летальным исходом (Авилов В.М. и соавт., 1994; Никишин И.В. и соавт., 1995; Селимов М.А., 1998; Груздев К.Н. и соавт., 2001).

Как известно, для возбудителя бешенства характерны выраженная вариабельность антигенной структуры и изменчивость (Таршис М.Г. и соавт., 1990; Селимов М.А., 1998; Груздев К.Н. и соавт., 2001; Nadin Davis et al., 1993 и др.). В работах H.A. Хисматуллиной, А.Н. Чернова, Р.Х. Юсупова и др. (1999-2006) установлено различие по степени патогенности эпизоотических изолятов, циркулирующих на территории Татарстана, индекс инвазив-ности для которых колеблется в пределах от 0,9 до 2,3. Однако до сих пор не ясно, в каких отношениях находятся антигенные структуры гликопротеида и нуклеокапсидного белка вакцинных штаммов и эпизоотических изолятов ра-бического вируса, циркулирующих на территории Республики Татарстан.

В целом применяемые в практике диагностические препараты на основе поликлональных антител, обеспечивая установление диагноза бешенства, не выявляют межштаммовые различия рабического вируса. Моноклональные антитела, обладая узкой специфичностью, позволяют идентифицировать штаммы рабического вируса, в частности, дифференцировать серотипы группы бешенства (Селимов М.А. и соавт., 1982-1998; Ботвинкин А.Д. и соавт., 1989-2004; Кузьмин И.В. и соавт., 1992; Кузьмин И.В., 1998; Wiktor Т.,

1975; Wiktor Т. et al., 1978-1981; Schneider L., et al., 1985; Lafon M., 1996; OkohA., 2000 и др.).

Не менее актуален вопрос контроля эффективности вакцинопрофилак-тики бешенства животных, в особенности диких плотоядных, при оральной иммунизации.

Традиционно используемая реакция вирусной нейтрализации (РН) для выявления антирабических антител в сыворотке крови и других биологических жидкостях (Webster L., Dawson J., 1935; Briggs D. et al., 1998) трудоемка и требует длительного наблюдения.

Имеющиеся разработки метода ИФА для ускоренного определения титра антирабических антител в сыворотках крови людей и животных (Ботвинкин А.Д. и соавт., 1986; Сазанова Э.Я. и соавт., 1991; Хисматуллина Н.А.и соавт., 1989, 2000; Barton L.D., Campbell J.B. 1988; Elmgren L.D., Wandeler A.I. 1996; Atanasiu P. et al., 1977; Nicholson K.G., Prestage H., 1982) не вышли за рамки лабораторных исследований.

В связи с вышеизложенным, перспективным направлением в диагностике бешенства является применение моноклональных антител, а для контроля эффективности вакцинопрофилактики бешенства - метод ИФА.

Цель и задачи исследований. Целью работы явилось усовершенствование методов идентификации вируса бешенства и выявления антирабических антител. Для достижения данной цели решались следующие задачи:

1. Разработать технологию получения моноклональных антител к глико-и нуклепротеинам вируса бешенства для идентификации рабического вируса в патматериале.

3. Разработать схему гипериммунизации белых мышей линии BALB/c антигеном вируса бешенства для получения спленоцитов, секретирующих специфические к нему антитела.

5. Изучить возможность применения гликопротеина вакцинного штамма вируса бешенства для выявления антирабических антител методом иммуно-ферментного анализа.

Научная новизна. На основании проведенных исследований впервые получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к возбудителю бешенства (штамм "Овечий" ГНКИ), и установлена возможность их применения в непрямом методе флуоресцирующих антител и сэндвич - варианте иммуноферментного анализа для выявления и идентификации возбудителя бешенства в патологическом материале. Показана возможность применения гликопротеина рабического вируса для выявления специфических антител в сыворотках крови животных, методом ИФА.

Практическая ценность. Установлена антигенная гомология эпизоотических изолятов, циркулирующих на территории Республики Татарстан, глико- и нуклеопротеинам вакцинного штамма вируса бешенства. Моноклональные антитела к глико- и нуклеопротеинам вируса бешенства рекомендуется использовать для идентификации возбудителя бешенства в патологическом материале. Выделенные структурные белки вируса бешенства (глико- и нук-леопротеины) могут быть применены в качестве антигенов для получения высокоспецифичных сывороток при создании более совершенных серологических тест-систем для диагностики и контроля вакцинопрофилактики бешенства.

На основании проведенных исследований разработаны и утверждены директором ФГУ "ФЦТРБ-ВНИВИ" 2 инструкции и 1 наставление по применению.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Основные положения диссертации, выдвигаемые на защиту:

1. Получение очищенного и концентрированного вируса бешенства и его основных структурных белков - глико- и нуклеопротеинов.

2. Оптимальная схема гипериммунизации белых мышей линии ВАЬВ/с антигеном вируса бешенства.

3. Идентификация эпизоотических изолятов вируса бешенства методами иммунофлуоресценции и иммуноферментного анализа на основе антинуклео-и антигликопротеиновых МКА.

4. Применение гликопротеина рабического вируса для определения специфических антител в сыворотках крови животных, вакцинированных против бешенства, методом ИФА.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 124 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы (всего 309 источников, в том числе 133 иностранных и 3 ссылки на сайты internet) и приложения. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 5 рисунками.

Читайте также:

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.

Copyright © Иммунитет и инфекции

Наименование Кол-во Цена за ед. Стоимость, ₽