Моноклональные антитела к ротавирусу

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Тест-кассета iCHECK–Rotavirus/Adenovirus - это одностадийный иммунохроматографический экспресс тест для качественного определения ротавируса и /или аденовируса в фекалиях человека.

КРАТКАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Ротавирус и аденовирус являются главной причиной, вызывающей инфекционные гастроэнтериты у новорожденных и детей младшего возраста, кроме того они встречаются и у взрослых. Способ передачи инфекции фекально-оральный. Главными симптомами вирусного гастроэнтерита являются водянистая диарея и рвота. Заболевший также может жаловаться на головную боль, жар и абдоминальные спазмы (боль в желудке). Чаще всего, симптомы появляются в 1-2 день инфицирования и могут длиться от 1 до 10 дней, в зависимости от вируса (Ротавирус – 3 дня, аденовирус – 5-8 дней).

ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ ТЕСТА
Тест iCHECK – Rotavirus/Adenovirus - это качественный иммунохроматографический тест для выявления ротавируса и аденовируса в фекалиях человека. В зоне появления тестовой линии мембрана покрыта моноклональными антителами мыши против вирусных антигенов.
Во время проведения тестирования образец реагирует с окрашенным коньюгатом (анти – ротавирус моноклональные мышиные антитела, коньюгированые с красными микросферами, анти-аденовирус моноклонольные антитела мыши, коньюгированные с голубыми микросферами) предварительно высушенным на тест-полоске. Затем смесь под действием капиллярных сил продвигается вдоль по мембране. Поскольку образец продвигается по мембране, окрашенные частицы тоже мигрируют. В случае положительного результата специфические антитела, находящиеся на мембране, захватят коньюгат. В результате тестирования будут видны тестовые линии разного цвета, в зависимости от того, какой вирус присутствует в образце. Данные линии позволяю интерпретировать результат тестирования.
Смесь продолжит свое движение до зоны иммобилизации антител, расположенной в месте появления контрольной полосы, зеленая контрольная линия появляется всегда. Наличие этой зеленой линии расценивается как то, что 1) был добавлен правильный объем образца 2) получен хороший ток 3) данная линия является внутренним контролем реагентов.

ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ
Хранить в запечатанном виде при температуре 2-300С. Тест стабилен до истечения срока годности, указанного на запечатанном пакетике. Тест должен оставаться в запечатанной упаковке до момента использования. НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ!

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Только для профессионального использования в целях диагностики in vitro
Не использовать по истечении срока годности
Все образцы, взятые на анализ, должны расцениваться, как потенциально опасные и храниться как инфекционные агенты
После проведения тестирования тест должен быть помещен в специальный контейнер для биологически опасных материалов

СБОР И ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ
Образцы фекалий должны быть собраны в чистый контейнер, а исследование должно проводиться сразу после сбора образцов. Перед проведением тестирования образцы могут храниться в холодильнике при температуре 2-40С в течение 1-2 дней. Для длительного хранения, максимум 1 год, образцы должны замораживаться при температуре –200С. В этом случае образцы должны быть полностью разморожены и перед тестированием их температура должна быть доведена до комнатной.

ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦА (см. иллюстрацию):

Снимите колпачок с флакона, предназначенного для сбора образцов. Используйте палочку для забора небольшого количества образца. Закройте флакон вместе с образцом фекалий и растворителем.
Встряхните флакон, чтобы добиться хорошего растворения фекалий.

ПРЕДОСТАВЛЕННЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Тест – кассеты
Инструкция по применению
Флаконы для сбора образцов с растворителем.

НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПРЕДОСТАВЛЕННЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Контейнер для сбора образцов
Одноразовые перчатки
Часы

ПРОЦЕДУРА ТЕСТИРОВАНИЯ
Перед тестированием необходимо довести температуру тест устройства, образцов фекалий и контролей до комнатной температуры (15-300С). Не вскрывайте упаковку теста, пока не будете полностью готовы к проведению тестирования.

Продолжайте встряхивать флакон для сбора образцов фекалий, чтобы добиться хорошего растворения образца. Отрежьте кончик колпачка.
Извлеките тест-устройство iCHECK–Rotavirus/Adenovirus непосредственно перед началом тестирования.
Используйте отдельный флакон для сбора образцов для каждого нового образца или контроля. Нанесите ровно 5 капель или 150 μl в круглое окошечко S, помеченное стрелкой, избегайте попадания вместе с жидкостью твердых частиц.
Прочитайте результат тестирования через 10 минут (появление окрашенных полос).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТИРОВАНИЯ

Отрицательный:
Только одна зеленая полоса появилась в центральном окошке в секторе, отмеченном буквой С (контрольная линия);

Ротавирус-Положительный:
В дополнение к зеленой контрольной линии, другая красная линия (тестовая линия на ротавирус) также появилась в секторе, отмеченном буквой Т (линия результата);

Аденовирус-Положительный:
В дополнение к зеленой контрольной линии, другая голубая линия (тестовая линия на аденовирус) также появилась в секторе, отмеченном буквой Т (линия результата);

Ротавирус-Аденовирус Положительный:
В результате тестирования все вышеописанные линии (зеленая контрольная линия в контрольной зоне, красная тестовая линия и голубая тестовая линия в тестовой зоне) могут появиться одновременно, это говорит об одновременном инфицировании ротавирусом и аденовирусом.

Недействительный:
Отсутствие окрашенной контрольной линии (зеленой) вне зависимости от наличия или отсутствия линий результата (красной/голубой). Неправильный объем пробы, несоблюдение техники проведения процедуры тестирования или порча реагентов – наиболее частые причины отсутствия контрольной линии. Проанализируйте процедуру тестирования и повторите ее с использованием нового теста. Если проблема остается, прекратите тестирование и свяжитесь с вашим местным дистрибьютором.

ЗАМЕЧАНИЯ ПО ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ
Интенсивность окраски красной или голубой тестовых линий будет варьироваться в зависимости от концентрации антигенов в образце. Однако ни количественное содержание антигенов, ни степень возрастания их количества с помощью данного качественного теста не могут быть установлены.

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Внутренний процедуральный контроль уже включен в тест-устройство. Зеленая линия, появляющаяся в контрольной зоне (С) является внутренним процедуральным контролем. Она подтверждает, что был добавлен нужный объем образца, и процедура тестирования была проведена правильно.

ОГРАНИЧЕНИЯ

Тестирование должно проводиться в течение двух часов с момента вскрытия запечатанной упаковки.
Превышение количества образца может обуславливать получение неправильного результата тестирования (появляются коричневые линии). Разведите образец с помощью буфера и повторите тестирование.
Через неделю с момента заражения число паразитов в фекалиях снижается, делая образцы менее реактивными. Образцы фекалий для анализа должны быть собраны в течение одной недели с момента появления симптомов.
Данный тест позволяет поставить только предположительный диагноз наличия Рота- и/или Аденовирусной инфекции. Подтвержденный диагноз может быть поставлен врачом только после проведения всего комплекса клинических и лабораторных изысканий.

ОЖИДАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
У здоровых новорожденных, детей младшего возраста, а также у здоровых взрослых результат тестирования отрицателен.

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Исследование чувствительности включало сравнение результатов анализов, полученных с помощью iCHECK–Rotavirus/Adenovirus теста и других коммерчески доступных мембранных исследований на рота- и аденовирус.

Чувствительность
Результаты определения ротавируса с помощью iCHECK–Rotavirus/Adenovirus в >99% случаев совпадали с другими коммерчески доступными тестами.
Результаты определения аденовируса с помощью iCHECK–Rotavirus/Adenovirus в 90% случаев совпадали с результатами других коммерчески доступных тестов.

Специфичность
Результаты определения ротавируса с помощью iCHECK–Rotavirus/Adenovirus в 98% случаев совпадали с другими коммерчески доступными тестами.
Результаты определения аденовируса с помощью iCHECK–Rotavirus/Adenovirus в >99% случаев совпадали с результатами других коммерчески доступных тестов.

Использование при разработке тест-устройства iCHECK–Rotavirus/Adenovirus моноклональных антител мыши гарантирует высокую степень специфичности при определении этих вирусов.

Москва, Кулакова ул., 20, Телефоны: , 757-99-15, 757-96-96, 8 (800) 600-54-27, e-mail: tender@bioworld.ru

Форма выпуска: набор / 10 исследований
Назначение: тест иммунохроматографический для выявления антигенов ротавируса в кале

Инструкция по применению

Тест иммунохроматографический для выявления ротавируса в кале

Регистрационное удостоверение: №ФСР 2012/13624 от 29.06.2012

Ротавирус вызывает гастроэнтерит у детей и подростков, реже – у взрослых. Ротавирус передается фекально-оральным путем. Основные симптомы вирусного гастроэнтерита – водянистая диарея, рвота, головная боль, повышение температуры, боли в желудке. Как правило, симптомы проявляются на 1-2 день после инфицирования и продолжаются 3 дня.

Определение основано на принципе иммунохроматографического анализа. Анализируемый образец жидкого биологического материала абсорбируется поглощающим участком тест-полоски. При наличии в образце ротавируса он вступает в реакцию с нанесенными на стартовую зону специфическими моноклональными антителами против ротавируса, меченными окрашенными частицами, и продолжает движение с током жидкости. В аналитической зоне тест-полоски происходит взаимодействие со специфическими моноклональными антителами, иммобилизованными на поверхности мембраны, с образованием окрашенного иммунного комплекса.
В контрольной зоне тест-полоски специфический окрашенный иммунный комплекс образуется независимо от наличия в тестируемом биологическом материале ротавируса.
В том случае, если в анализируемом образце присутствует ротавирус, на тест-полоске образуются две параллельные окрашенные линии (красная аналитическая, обозначенная буквой Т, и зеленая контрольная, обозначенная буквой С), что указывает на положительный результат анализа. В случае отсутствия в анализируемом образце ротавируса на тест-полоске образуется одна зеленая контрольная линия (С), что указывает на отрицательный результат анализа.

контейнеры для сбора образцов кала;
одноразовые резиновые или пластиковые перчатки;
часы или таймер.

Свежесобранный биологический материал (кал), не содержащий консерванты.
Образцы кала должны быть собраны в чистый контейнер. Следует отбирать образцы кала для анализа в первые 1-2 дня после появления симптомов, т.к. спустя 5-7 дней после инфицирования количество ротавируса значительно уменьшается.
Образцы кала до определения можно хранить при температуре 2–4°С не более 2 сут., при необходимости более длительного (до 1 года) хранения – при температуре –20°С и ниже.
Перед анализом образцы кала должны быть полностью разморожены и доведены до комнатной температуры.
Повторное замораживание и оттаивание образцов недопустимо.

1. Снять крышку-капельницу с пробирки и с помощью стержня на крышке взять небольшое количество анализируемого образца. Для этого ввести стержень в 2 разные зоны образца, собрав примерно 100 мг кала (рис. 1-1). Если образец жидкий, отобрать 100 мкл с помощью пипетки. Ввести стержень с образцом в пробирку с буфером для растворения образца и плотно завинтить крышку-капельницу (рис. 1-2).

2. Несколько раз встряхнуть пробирку, чтобы облегчить растворение образца (рис. 2-1).

3. Встряхнуть пробирку с раствором образца (рис. 2-1). Отрезать или отломить кончик крышки-капельницы.

6. Через 10 мин визуально оценить результат реакции.

Мифы о вакцинации

В последние годы в мире складывается неоднозначное отношение к прививкам. Несмотря на то, что поголовная вакцинация против некоторых заболеваний привела к практически полному их исчезновению, ряды противников обязательных прививок растут. Этому способствует широкое распространение заблуждений, касающихся вакцинации.

Неизвестная инфекция — главная опасность

Кишечные инфекции, вал клещевых энцефалитов и южные инфекции, привезенные россиянами из отпусков,— таковы медицинские итоги лета.

Один из самых именитых инфекционистов России академик Виктор Малеев рассказал о наших самых маленьких, но от этого не менее опасных врагах.

Прививки для детей от рождения до 7 лет: рекомендации на 2017 год

Национальный календарь профилактических прививок включает в себя далеко не самый полный перечень вакцин, существующих в мире. При его составлении учитывается великое множество факторов, и далеко не последнюю роль.

Антипрививочники меняют свои убеждения

Большая часть студентов-антипрививочников, интервьюировавших людей с заболеваниями, которые можно было предупредить вакцинацией, изменила свою позицию на провакцинаторскую. В целом, 75% учащихся, выступавших против прививок, поменяли свое отношение к вакцинации, причем 50% полностью перешли в лагерь ее сторонников.

Комплексный ответ простуде и гриппу

С наступлением холодного сезона ежегодно повышается заболеваемость острыми респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ), гриппом и другими инфекциями дыхательных путей, на пике холодов приобретая масштабы эпидемии.

Биофармацевтическая компания осуществила успешное производство вирусоподобных частиц коронавируса всего за 20 дней, использовав запатентованную технологию на основе растительного сырья

Квебек, пр. Квебек, Канада – 12 марта BUSINESS WIRE – Medicago, биофармацевтическая компания со штаб-квартирой в Квебеке, сегодня объявила об успешном производстве вирусоподобной частицы коронавируса всего через 20 дней после выделения гена SARS-CoV-2 (штамма вируса, вызывающего коронавирусную инфекцию COVID-19). Получение вирусоподобной частицы – это первый шаг к разработке вакцины против COVID-19, которая должна пройти доклинические испытания на безопасность и эффективность. По их завершении Medicago планирует обсудить с организациями здравоохранения начало испытаний вакцины на людях к лету (июль/август) 2020 года.

Medicago также использует свою технологическую платформу для разработки антител к SARS-CoV-2 в сотрудничестве с Научно-исследовательским центром инфекционных заболеваний при Университете Лаваля, возглавляемым доктором Гари Кобингером (Dr. Gary Kobinger), который помог разработать вакцину и лечение от лихорадки Эбола. Эти антитела к SARS-CoV-2 потенциально могут быть использованы для лечения людей, инфицированных вирусом. Данное исследование частично финансируется Канадским институтом исследований в области здравоохранения (CIHR).

Medicago является лидером в области технологий на основе растительного сырья, ранее уже продемонстрировавших свою способность первыми отреагировать на пандемию гриппа. В 2009 году компания выпустила вакцину-кандидата против вируса гриппа H1N1 всего за 19 дней. В 2012 году Medicago произвела 10 миллионов доз моновалентной вакцины против гриппа в течение одного месяца для Управления перспективных исследовательских проектов Министерства обороны США (DARPA). В 2015 году компания Medicago также быстро произвела моноклональные антитела к лихорадке Эбола для Управления перспективных исследований и разработок в области биомедицины (BARDA), являющегося частью Министерства здравоохранения и социальных служб США.

Первый продукт Medicago, сезонная рекомбинантная четырёхвалентная вакцина с вирусоподобными частицами для активной иммунизации против гриппа, в настоящее время находится на рассмотрении Министерства здравоохранения Канады после завершения клинической программы по её безопасности и эффективности, в которой участвуют более 25 000 пациентов.

Уникальная платформа Medicago на основе растительного сырья

Компания использует запатентованную технологию на основе растительного сырья для разработки терапевтических средств на основе белков. В отличие от традиционной разработки вакцин, компания Medicago не использует продукты животного происхождения или живые вирусы для создания своих продуктов. Вместо этого она использует вирусоподобные частицы, имитирующие форму и размеры вируса, что позволяет организму распознать их и давать иммунный ответ неинфекционным путём. Данные клинических испытаний позволяют предположить, что вирусоподобные частицы обладают мультимодальным механизмом действия, отличным от такового у вакцин, активирующих обе стороны иммунной системы – антитела и клеточно-опосредованные реакции.

Запатентованная технология Medicago является быстрой, универсальной и масштабируемой. Как только генетическая последовательность вируса стала доступной, Medicago смогла разработать вакцину-кандидата клинического уровня всего за несколько недель. Её рекомбинантная технология позволяет произвести вакцину, точно соответствующую актуальным штаммам, к примеру, в случае сезонного гриппа. Технология легко масштабируется, что позволяет компании увеличивать объёмы производства лишь при увеличении количества используемых производственных точек.

Портфель продуктов и процесс производства

Первый продукт Medicago, вакцина против сезонного гриппа на основе рекомбинантного четырёхвалентного вируса с вирусоподобными частицами, в настоящее время находится на рассмотрении Министерства здравоохранения Канады. Вакцины-кандидаты против пандемического гриппа, ротавируса и норовируса проходят доклинические и клинические испытания второй фазы. Medicago также разрабатывает антитела против метапневмовируса человека, респираторно-синцитиального вируса человека и опиоиды.

Производство

Штаб-квартира Medicago находится в Квебеке, Канада. Компания планирует выпускать вакцины и антитела против COVID-19 на своём главном производстве в Квебеке, чтобы удовлетворить актуальный краткосрочный спрос. Medicago также владеет предприятием в Дареме, шт. Северная Каролина, США, которое в настоящее время занимается производством вакцин и антител для клинических испытаний и, как ожидается, поддержит запуск четырёхвалентной вакцины с вирусоподобными частицами против гриппа после её одобрения. В Квебеке строится новый современный завод-изготовитель, который к 2023 году начнёт работать на полную мощность и сможет поставлять до 50 миллионов доз рекомбинантной четырёхвалентной вакцины против гриппа в год.

О Medicago

Medicago – это биофармацевтическая компания с более чем 450 сотрудниками в Канаде и США. Миссия Medicago заключается в улучшении глобального состояния здоровья путём использования инновационных технологий на основе растительного сырья для быстрого реагирования на возникающие проблемы в области здравоохранения. Medicago продвигает лекарственные средства от опасных для жизни заболеваний во всём мире.

Контакты:

Для английских СМИ:
Алиса фон Барген (Alissa Von Bargen)
+1-647-234-5975
Alissa.VonBargen@gcicanada.com

Для французских СМИ:
Мари-Пьер Коте (Marie-Pier Côté)
+1-418-999-4847
mpcote@tactconseil.ca

Оригинальный текст данного сообщения на языке источника является официальной, аутентичной версией. Перевод предоставляется исключительно для удобства и должен рассматриваться в привязке к тексту на языке источника, который является единственной версией, имеющей правовое значение.

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Амосова Ирина Викторовна, Соминина А. А., Смирнова Т. Д., Суховецкая В. Ф., Бузицкая Ж. В.

New monoclonal kits for the diagnosis of the adenoviral infection

Diagnostic properties of new monoclonal antibodies (MAbs) to hexon adenovirus antigen (AB) monoclonal ELISA kit for early diagnosis of adenoviral infection were tested. Developed ELISA kit and FITC-conjugate of new monoclonal antibodies for immunofluorescent analysis were used for detection of different types of adenoviruses in clinical materials. The availability of their use in clinical and epidemiological practice was validated.

• эффективность детекции ВКЭ обоими методами не зависит от пола, вида и степени насыщенности зараженного клеща;

• метод ИФА менее чувствительный, чем ПЦР-РВ;

• отмечена зависимость чувствительности ИФА от субтипа ВКЭ;

Исследования, представленные в работе, поддержаны грантом РФФИ № 14-04-31716-мол_а.

2. Kozlovskaya L.I., Osolodkin D.I., Shevtsova A.S., Romanova L.Iu., Rogova Y.V., Dzhivanian T.I. et al. GAG-binding variants of tickborne encephalitis virus. Virology. 2010; 398: 262-72.

3. Romanova L.Iu., Gmyl A.P., Dzhivanian T.I., Bakhmutov D.V., Lukashev A.N., Gmyl L.V. et al. Microevolution of tick-borne encephalitis virus in course of host alternation. Virology. 2007; 362: 75-84.

4. Belova O.A., Burenkova L.A., Karganova G.G. Different tick-borne encephalitis virus (TBEV) prevalences in unfed versus partially en-

gorged ixodid ticks - Evidence of virus replication and changes in tick behavior. Ticks Tick Borne Dis. 2012; 3(4): 240-6.

5. Белова О.А., Козловская Л.И., Романова Л.Ю., Шевцова А.С., Буренкова Л.А. Сравнительный анализ эффективности различных методов заражения иксодовых клещей вирусом клещевого энцефалита. В кн.: Медицинская вирусология. Труды ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН. М.; 2008; т. 25: 47-52.

2. Kozlovskaya L.I., Osolodkin D.I., Shevtsova A.S., Romanova L.Iu., Rogova Y.V., Dzhivanian T.I. et al. GAG-binding variants of tickborne encephalitis virus. Virology. 2010; 398: 262-72.

4. Belova O.A., Burenkova L.A., Karganova G.G. Different tick-borne encephalitis virus (TBEV) prevalences in unfed versus partially engorged ixodid ticks - Evidence of virus replication and changes in tick behavior. Ticks Tick Borne Dis. 2012; 3: 240-6.

5. Belova O.A., Kozlovskaya L.I., Romanova L.Yu., Shevtsova A.S., Burenkova L.A. Comparative analysis of the effectiveness of different ixodid ticks' infection methods with TBEV. In: Meditsinskaya virusologiya: Trudy IPVE imeni M.P. Chumakova. Moscow; 2008; vol. 25: 47-52. (in Russian)

В ПОМОЩЬ ВИРУСОЛОГУ

АмосоваИ.В., Соминина А.А., Смирнова Т.Д., СуховецкаяВ.Ф., БузицкаяЖ.В., Войцеховская Е.М.,

Новые моноклональные тест-системы для диагностики

Ключевые слова: аденовирус; моноклональные антитела; диагностические тест-системы.

New monoclonal kits for the diagnosis of the adenoviral infection

Amosova I. V., Sominina A. A., Smirnova T. D., Sukhovetskaya V. F., Buzitskaya Zh. V., Voitsehovskaya E. M.,| Sirotkin A. K. |

Research Institute of Influenza, Ministry of Health of the Russian Federation, 197376, St. Petersburg, Russia

Diagnostic properties of new monoclonal antibodies (MAbs) to hexon adenovirus antigen (AB) monoclonal ELisA kit for early diagnosis of adenoviral infection were tested. developed ELIsA kit and FiTc-conjugate of new monoclonal antibodies for immunofluorescent analysis were used for detection of different types of adenoviruses in clinical materials. The availability of their use in clinical and epidemiological practice was validated.

Key words: adenovirus; monoclonal antibodies; diagnostic kits.

Аденовирусы (АВ) представляют собой обширное семейство вирусов (Adenoviridae), патогенных для человека, млекопитающих и птиц. По своей распространенности они занимают третье место после гриппа и респираторно-синцитиальной инфекции. В отличие от эпидемий гриппа, имеющих выраженную сезонность, АВ-инфекции регистрируются на протяжении всего года, вызывая подъем уровня заболеваемости в основном среди детских групп населения [1, 2]. АВ провоцируют тяжелые поражения не только верхних, но и нижних отделов дыхательного тракта в виде пневмоний, бронхитов и бронхиолитов, являются причиной вспышек кератоконъюнктивитов и нозокомиальных заболеваний. Они являются также причиной лимфоаденопатий, острых и хронических тонзиллитов, отитов, фарингитов, протекающих с явлениями интоксикации и гипертермии, поражений печени и миокарда. Отдельные серотипы (31, 40, 41) АВ вызывают вспышки гастроэнтеритов [3]. Тяжелое генерализованное течение АВ-инфекций нередко развивается у пациентов с иммуносупрессией, которым осуществляется трансплантация органов или костного мозга [4]. Создание современных средств химиотерапии определяет необходимость разработки эффективных средств ранней диагностики АВ-инфекции. При создании высокоспецифичных иммунологических тестов, как правило, используют антивирусные моноклональные антитела (МКА), способные обеспечить необходимый уровень стандартизации полученных препаратов [5].

Материалы и методы

Клеточные культуры и вирусы. В работе использовали АВ серотипов 3, 4, 6, 7, 14, 19 и 21. Для контроля специфичности реагирования полученных МКА использовали вирусы гриппа А и В, парагриппа и респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), а также лизаты клеток HeLa. Накопление биомассы вирусов, очистку и концентрацию вирусов проводили ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы согласно [6].

Гексонный антиген (ГА) АВ. АВ 6-го типа осаждали из осветленной вируссодержащей жидкости одновременным добавлением 10% раствора сернокислой меди и 10% раствора бикарбоната натрия. Очистку от солей производили с помощью гель-фильтрации с использованием сефадекса G-25 (Sigma, США). Полученный раствор антигена диализовали против 0,5 моль/л ацетатного буфера (рН 4,6), после чего переносили в колбу и оставляли при температуре 4°С на 2 нед до образования кристаллов ГА в форме тетраэдров, отчетливо видимых при малом увеличении микроскопа (х100).

Выделение аденовирусов в культуре клеток. Для изоляции АВ использовали культуры клеток Hep2 и Vero, которые на 1-2-е сутки роста в среде Игла с добавлением 5% фетальной сыворотки инфицировали материалами от больных ОРВИ, взятыми не позднее 4 сут от начала заболевания. Зараженные клеточные культуры инкубировали при 36±1°С. Образцы ежедневно просматривали в течение 2 нед для выявления цитопатического эффекта с еженедельной заменой поддерживающей среды. Серотип изолята определяли в реакции нейтрализации с использованием типоспецифических сывороток к АВ.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Для определения специфической активности МКА и их пероксидазных конъ-югатов (МКА-ПХ) планшеты сенсибилизировали очищенными вирусными концентратами АВ 3, 6 и 21-го типов, а также ГА в концентрации 2,5-5 мкг/мл. Для контроля специфичности взаимодействия использовали лизат нормальных,

не инфицированных клеток HeLa и гетерологичные вирусы (грипп, парагрипп, РСВ). Исследуемые МКА (или МКА-ПХ) разводили в 0,01 М ФСБ-Т (рН 7,2) с 10"1 до 10"7 и вносили по 100 мкл в планшеты, трижды отмытые от несвязавшегося антигена с помощью ФСБ-Т, содержащего 5% желатина. По завершении инкубации (2 ч для МКА и 45 мин для МКА-ПХ при 37°С) и отмывания ФСБ-Т в лунки вносили по 100 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в концентрации 0,1 мг/мл на ацетат-цитратном буфере (рН 5,5), содержащем 0,005 % Н2О2. Реакцию останавливали через 10-15 мин добавлением 50 мкл 1М H2SO4. Результаты ИФА учитывали на иммуно-ферментном анализаторе фирмы Anthos (Австрия) при длине волны 450 нм. Титром антител считали последнее разведение, при котором сигнал ОП 450 МКА в 2,5 раза превышал ОП 450 контрольных образцов (ФСБ-Т).

Для индикации вирусных антигенов и определения лимита чувствительности иммуноферментных тест-систем (ИФТС) планшеты сенсибилизировали МКА, разведенными на 0,01 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,5) до концентрации (2,5-5 мкг/мл). После инкубации 18 ч при 4°С в отмытые планшеты вносили разведения исследуемых вирусов, контрольные образцы или материалы от больных. После инкубации в течение ночи при 4°С и 4-кратного отмывания ФСБ-Т связанные вирусные антигены выявляли с помощью МКА-ПХ.

Электронно-микроскопический (ЭМ) анализ. В работе использовали метод просвечивающей электронной микроскопии (микроскоп JEM-10-11, Япония).

Подготовка клинических образцов. Взятие носоглоточных мазков и подготовку препаратов для МИФ проводили согласно [10], образцы фекалий подготавливали, как описано [11].

Определение чувствительности и специфичности разработанных тест-систем. Оценку показателей качества разработанных препаратов проводили в сравнении с методами выделения вируса в культуре клеток, МИФ, ПЦР, а также определяли прирост специфических антител в сыворотках переболевших с помощью ИФА. Расчет показателей чувствительности и специфичности проводили, как описано [12].

Характеристика МКА к гексонному антигену АВ. С учетом имеющихся литературных данных о высоком консерватизме ГА АВ, общего для разных подродов АВ [13], этот антиген избрали в качестве иммуногена при получении МКА. В работе использовали гибридных мышей линии SJL/J, у которых отмечают ослабленный контроль экспансии В-лимфоцитов, что предполагает синтез более широкого репертуара антител, чем у животных других инбредных линий [14].

Для иммунизации мышей в целях получения гибридом использовали кристаллический ГА АВ 6-го типа, который содержал антигенные детерминанты, общие для разных серо-типов аденовирусов. В результате слияния клеток миеломы мышей Рх8Ag.653 с иммунными спленоцитами и их последующего клонирования отобрали семь стабильных клонов гибридом (№ 2, 3, 6, 9, 10, 11, 14), секретирующих антитела к ГА. По показателям специфической активности, оцененной в ИФА и МИФ, из панели МКА для последующих работ по

результатами других методов)

Группа обследованных с симптомами ОРВИ Кол-во обследованных больных Частота выявления, % Диагностические параметры ИФТС "Аденовир" в сравнении с результатами комплекса методов, %*

ИФТС "Аденовир" МИФ чувствительность | специфичность

Госпитализированные взрослые Госпитализированные дети Вспышка ОРВИ

Примечание. * - МИФ, выделение вирусов в культуре клеток, ИФТС-IgG-АД.

конструированию диагностических тест-систем выбрали МКА 6, которые выгодно отличались от других МКА более широким спектром реагирования в отношении различных серотипов АВ (типы 3, 6, 14, 19, 21), а также высоким уровнем специфической активности в ИФА (титр -10-6) и МИФ (титр в непрямом МИФ 10-3).

Специфическую направленность МКА 6 и МКА 7F1 оценивали в конкурентном ИФА. При исследовании систем МКА 6 - конъюгат ПХ-МКА 7F1 и МКА 7F1 - конъюгат ПХ-МКА 6 показано, что немеченые МКА 6 не влияли на связывание с антигеном конъюгатов ПХ-МКА 7F1, а реакцию конъюгатов ПХ-МКА 6 не подавляли МКА 7F1, т.е. они имели разную эпитопную направленность. Показано, что МКА 6 не обладали перекрестной реактивностью с другими возбудителями ОРВИ (вирусами гриппа А и В, РС-вирусом, парагриппа) и антигенами клеток хозяина, хорошо выдерживали процедуры конъюгации с пероксидазой хрена и ФИТЦ, а также лио-филизации.

Характеристика спектра реагирования препарата ФИТЦ-МКА 6. Опытные серии ФИТЦ-конъюгатов МКА 6 исследовали на модели клеточных культур, зараженных АВ 6, 3 и 21-го серотипов, а также клеточных культур, инфицированных материалами от больных, среди которых выявлены современные штаммы АВ 2 типа и эпидемически значимых 3, 4 и 7-го типов, принадлежащих, как известно, к различным группам АВ (В, С, Е). Все перечисленные се-ротипы АВ выявляли при окраске ФИТЦ-МКА 6 в виде яркой флюоресценции в ядрах и цитоплазме инфицированных клеток. Клинико-лабораторную апробацию ФИТЦ-МКА 6 провели в сравнении с поликлональным препаратом ИДФАГ (ООО ППДП, Санкт-Петербург) с использованием клинических материалов от 120 детей, госпитализированных по поводу ОРВИ. Чувствительность и специфичность МИФ при использовании ФИТЦ-МКА 6 в сравнении с препаратом ИДФАГ составили 96,7 и 90% соответственно, общее совпадение результатов 95%.

Актуальность простых и быстрых тестов лабораторной диагностики АВ-заболеваний определяется необходимостью назначения ранней этиотропной противовирусной терапии и профилактики АВ-инфекций. Разработка современных диагностических подходов осуществляется по двум основным направлениям, первое из которых связано с совершенствованием иммунологических тестов детекции вирусных антигенов или антител, а другое - с выявлением специфических последовательностей вирусного генома в материале от больных. К перспективным иммунологическим тестам относятся ИФА и МИФ, базирующиеся на использовании высокоспецифичной и стандартизованной реагентики моноклонально-го типа [3].

Разработаны моноклональные тест-системы для диагностики АВ-инфекций, базирующиеся на использовании им-мунофлюоресцентного анализа и ИФА, которые обладали достаточно высокой чувствительностью и специфичностью, сопоставимой с зарубежными аналогами.

Достоинством разработанных МКА и тест-систем на их основе оказалась возможность выявления АВ, принадлежащих к различным подгруппам семейства Adenoviridae.

1. Амосова И.В. Разработка и усовершенствование средств и методов иммунодиагностики аденовирусной инфекции: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. СПб; 2009.

2. Соминина А.А., Киселев О.И., Маринич И.Г., Карпова Л.С., Смородинцева Е.А., Коновалова Н.И. и др. Этиологический мониторинг за гриппом и другими ОРЗ в России в сезон 2003-2004 годов. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2004; 6: 5-11.

3. Киселев О.И., Жилинская И.Н., ред. Вопросы общей вирусологии: учебное пособие. СПб: СПбГМА им. И.И. Мечникова; 2007.

4. Zheng X. Identification of adenoviruses in specimens from high-risk pediatric stem cell transplant recipients and controls. J. Clin. Microbiol. 2008; 46: 317-20.

5. Qijek C., Gulen F. Comparison of the assay with the combination of shell vial cell culture and immunofluorescence antibody test for the detection of respiratory viruses. J. Virol. Methods. 2007; 143: 161-8.

6. Монаенков А.О., Сологуб В.К., Соминина А.А., Амосова И.В., Липина Н.В., Милькинт К.К. и др. Получение и характеристика моноклональных антител к аденовирусу в иммуноферментных и иммунофлуоресцентных реакциях. Вопросы вирусологии. 2000; 5: 30-3.

7. Фридляндская И.И. Получение моноклональных антител (гибри-домная клеточная технология): сборник научных трудов. Л.; 1988.

8. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase labeled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22: 1084-91.

9. Mc Kinney P.M. Fluorecein diacetate as a reference color standard fluorescent antibody stadies. Anal. Biochem. 1964; 9 (4): 474-6.

10. Соминина А.А., Милькинт К.К., Амосова И.В. Быстрая диагностика гриппа и других ОРВИ иммунофлуоресцентным методом: методические рекомендации. СПб: ГУ НИИ гриппа РАМН; 2006.

11. Doane F.W. Electron microscopy for the detection of gastroenteritis viruses. In: Kapikian A.Z., ed. Viral infections of the gastrointestinal tract. 2nd ed New York: Marcel Dekker; 1994: 101-30.

12. Chomel J.J., Remilleux M.F., Marchand P., Aymard M. Rapid diagnosis of influenza A. Comparison with ELISA immunocapture and culture. J. Virol. Methods. 1992; 37: 337-44.

13. Echavarria M. Adenoviruses in immunocompromised hosts. Clin. Microbiol. 2008; 21: 704-15.

14. Климович В.Б. Моноклональные антитела против иммуноглобулинов человека: Автореф. дисс. . д-ра мед. наук. СПб; 1996.

1. Amosova I.V. Development andimprovement of means andmethods of immunoassay adenovirusinfection [Razrabotka i usovershenstvovanie sredstv i metodov immunodiagnostiki adenovirusnoy infektsii]. Diss. boil. sci. St Petersburg; 2009. (in Russian)

2. Sominina A.A., Kiselev O.I., Marinich I.G., Karpova L.S., Smorodintseva E.A., Konovalova N.I. et al. Etiological monitoring of influenza and other acute respiratory infections in Russia in 20032004 season. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika. 2004; 6: 5-11. (in Russian)

3. Kiselev O.I., Zhilinskaya I.N., ed. Questions of general virology: a training manual (Voprosy obshchey virusologii: uchebnoe posobie). St Petersburg: SPbGMA im. I.I. Mechnikova; 2007. (in Russian)

4. Zheng X. Identification of adenoviruses in specimens from high-risk pediatric stem cell transplant recipients and controls. J. Clin. Microbiol. 2008; 46: 317-20.

6. Monaenkov A.O., Sologub V.K., Sominina A.A., Amosova I.V., Lipina N.V., Mil'kint K.K. et al. Preparation and characterization of monoclonal antibodies to adenovirus in immunoassays and immunofluorescence reactions. Voprosy virusologii. 2000; 5: 30-3. (in Russian)

7. Fridlyandskaya I.I. Preparation of monoclonal antibody (hybridoma cell technology) [Polychenie monoklonal'nykh antitel (gibridomnaya kletochnaya tekhnologiya]. Leningrad; 1988. (in Russian)

8. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase labeled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22: 1084-91.

9. Mc Kinney P.M. Fluorecein diacetate as a reference color standard fluorescent antibody stadies. Anal. Biochem. 1964; 9 (4): 474-6.

10. Sominina A.A., Mil'kint K.K., Amosova I.V. Rapid diagnosis of influenza and other acute respiratory viral infection by immunofluo-rescence: methodological recommendations [Bystraya diagnostika grippa i drugikh ORVI immynofluorectsentnym metodom: metodi-cheskie rekomendatsii]. St Petersburg: GU NII grippa RAMN; 2006. (in Russian)

11. Doane F.W. Electron microscopy for the detection of gastroenteritis viruses. In: Kapikian A.Z. ed Viral infections of the gastrointestinal tract. 2nd ed New York: Marcel Dekker; 1994: 101-30.

12. Chomel J.J., Remilleux M.F., Marchand P., Aymard M. Rapid diagnosis of influenza A. Comparison with ELISA immunocapture and culture. J. Virol. Methods. 1992; 37: 337-44.

13. Echavarria M. Adenoviruses in immunocompromised hosts. Clin. Microbiol. 2008; 21: 704-15.

14. Klimovich V.B. Monoclonal antibodies against human immunoglobulins [Monoklonal'nye antitela protiv immunoglobulinov]. Diss. St Petersburg; 1996. (in Russian)

Подписные индексы на журнал "Вопросы вирусологии"

Индекс 71416 Индекс 27875

для индивидуальных подписчиков, для индивидуальных подписчиков,

предприятий и организаций предприятий и организаций

Читайте также: