Молекулярно-генетический метод исследования вирусов

Что такое молекулярно-генетическая диагностика

Итак, молекулярно-генетическая диагностика — сравнительно новый метод обследования организма, позволяющий точно и быстро выявить вирусы и инфекции, мутации генов, вызывающих патологию, оценить риски наследственных и иных заболеваний. И это далеко не полный спектр возможностей исследования ДНК.

Важнейшим достоинством молекулярно-генетической диагностики является минимальная степень медицинского вмешательства, поскольку исследование проводят in vitro. Метод успешно применяют даже для диагностики заболеваний у эмбрионов, а также у ослабленных и тяжелобольных пациентов. Самый распространенный материал для исследования — кровь из вены, однако возможно выделение ДНК/РНК из других жидкостей и тканей: слюны, соскоба слизистой рта, выделений из половых органов, околоплодной жидкости, волос, ногтей и т.д.

Молекулярная диагностика — значительный шаг к персонализированной медицине, она позволяет учитывать все особенности конкретного пациента при обследовании и терапии.

Итак, исследование ДНК/РНК используется во многих разделах медицины. Давайте рассмотрим задачи и области, в которых активно применяют молекулярную диагностику:

• Выявление существующих патологий. Например, к молекулярной диагностике прибегают в тех случаях, когда инфекционное или вирусное заболевание не может быть определено обычными методами. Она позволяет обнаружить болезнь даже на ранней стадии, когда внешних проявлений нет.
• Исследование аллергических реакций. Молекулярная диагностика успешно применяется для определения аллергии: в отличие от традиционных методов, она более точна и при этом безопасна для пациента, так как отсутствует непосредственный контакт с аллергеном.
• Индивидуальная оценка рисков развития наследственных заболеваний. Молекулярная диагностика помогает выявить у взрослых и детей опасность в будущем подвергнуться различным патологиям. Нужно отметить, что есть болезни, которые вызваны исключительно мутацией гена (моногенные) и те, которые обусловлены в том числе генетическими особенностями (мультифакторные). Информация о первых позволяет, к примеру, оценить риски передачи наследственных заболеваний от родителей к ребенку. Знание о предрасположенности к мультифакторной патологии необходимо еще и для профилактики болезней с помощью изменения образа жизни.
• Перинатальная медицина. Как уже было сказано, молекулярная диагностика способна дать информацию о состоянии здоровья и генетических предрасположенностях человека. Это относится и к эмбрионам: анализ ДНК еще не родившегося ребенка позволяет распознать синдромы Дауна, Эдвардса, Патау, Тернера, Клайнфельтера. Также молекулярная диагностика применяется в области вспомогательных репродуктивных технологий: она позволяет установить генетические причины бесплодия и невынашивания беременности.
• Фармакогенетика. Молекулярная диагностика объясняет, почему на некоторых действуют одни препараты, а на других — иные: все дело в генетических особенностях пациентов. Возможность определения эффективности веществ имеет особое значение при лечении тяжелых заболеваний, например, онкологических.
• Спортивная медицина. Настоящие чудеса исследования ДНК и РНК творят и в области оценки спортивных перспектив. Например, родители малышей могут узнать о том, какой вид занятий принесет ребенку наибольшую пользу для здоровья или позволит достичь спортивных результатов.

Итак, обращение к генетическим исследованиям актуально в тех случаях, когда пациент стремится получить сведения о состоянии своего организма. Обычно это необходимо в следующих ситуациях:

Отдельной группой стоит выделить исследования ДНК, которые проводят в связи с планированием или рождением ребенка. Чаще всего родители обращаются в лабораторию, чтобы:

• изучить свою генетическую совместимость, оценить риски наследственных заболеваний потомства;
• исследовать состояние плода, выявить синдромы и опасные патологии;
• диагностировать заболевания (и оценить риски) и аллергические реакции у малыша;
• определить, какие спортивные занятия, какое питание и образ жизни будут наиболее полезны для ребенка, а чего стоит избегать;
• установить отцовство или материнство.

Независимо от выбранного метода молекулярно-генетического исследования, оно будет включать в себя следующие этапы:

• взятие биоматериала. Как уже было сказано, чаще для исследования используют кровь пациента. Полученный материал маркируют и транспортируют в лабораторию;
• выделение ДНК/РНК;
• проведение исследований в соответствии с выбранным методом;
• изучение и интерпретацию результатов;
• выдачу заключения.

Цитогенетический анализ позволяет выявить наследственные заболевания, психические отклонения, врожденные пороки развития. Суть метода — в изучении хромосом с помощью специальных микроматриц, нанесенных на ДНК-чипы. Для этого из образца крови выделяют лимфоциты, которые затем помещают на 48–72 часа в питательную среду и по истечении этого времени исследуют. Назначают такой анализ нечасто, в основном для изучения причин бесплодия и невынашивания беременности, для уточнения диагноза у детей при подозрении на врожденные заболевания. Анализ очень точен, но достаточно трудоемок и длителен (результат можно получить лишь через 20–30 дней после сдачи).

Достоинство и в то же время недостаток метода — в его специфичности: цитогенетика может выявить лишь небольшое количество патологий (например, аутизм), однако делает это практически без погрешностей.

Полимеразная цепная реакция — метод, изобретенный в 1983 году, по сей день самый популярный и фундаментальный в молекулярной диагностике. Характеризуется высочайшей точностью и чувствительностью, а также скоростью проведения исследования. Молекулярная диагностика ДНК/РНК методом ПЦР позволяет выявить такие патологии, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие.

Для анализа выбирают участок ДНК и многократно дублируют его в лаборатории с помощью специальных веществ. Для диагностики подходит большой перечень биоматериалов: кровь, слюна, моча, выделения из половых органов, плевральная и спинномозговая жидкость, ткани плаценты и т.д.

В данном молекулярном методе объектом исследования становятся уникальные нуклеотидные соединения отдельно взятой хромосомы или ее участок. Для этого используются меченые флуоресцентными маркерами короткие ДНК-последовательности (зонды), которые позволяют выявить фрагменты с атипичными генами. Биоматериал для анализа может быть любой: кровь, костный мозг, плацента, ткани эмбриона, биопсия и т.д. Важно, чтобы образец был доставлен в лабораторию сразу после его изъятия.

Метод особенно активно используют в онкологии (например, для наблюдения за остаточными злокачественными клетками после химиотерапии), а также в пренатальной диагностике (для определения риска развития у плода врожденных пороков), гематологии. FISH-метод очень чувствителен и точен для выявления поврежденных фрагментов ДНК (погрешность около 0,5%), при этом достаточно быстр: результат придется ждать не более 72-х часов. Однако у него есть и недостатки: FISH еще более специфичен, чем микроматричный цитогенетический анализ, и может служить лишь для подтверждения или опровержения предполагаемого диагноза.

Этот метод похож на предыдущий — здесь так же используются меченные флуоресцентом последовательности ДНК. Однако эти зонды сначала выделяют из проб, полученных от пациента, и затем сравнивают с образцами, нанесенными на микрочипы. ДНК-микрочип представляет собой основание (стеклянное, пластиковое, гелевое), на которое может быть нанесено до нескольких тысяч микротестов длиной от 25 до 1000 нуклеотидов. Полученные после очистки биоматериала пробы (зонды) совмещают с микротестами на чипе и наблюдают за реакцией маркёров. Результаты исследования готовы через 4–6 дней после забора материала.

Для анализа используется любой биоматериал, из которого можно получить образец ДНК/РНК. Используют такой метод в онкологии и кардиологии (в том числе для изучения генетической предрасположенности), он точен и чувствителен, однако в России его применяют редко — в этом его главный минус.

Итак, молекулярная диагностика — неинвазивный и точный метод обследования организма с широким спектром применения в разных областях медицины. Если на Западе исследования ДНК/РНК уже распространены повсеместно, то в России подобную услугу предлагают далеко не все клиники.

Се­год­ня ме­ди­ци­на по­зво­ля­ет уже во вре­мя пла­ни­ро­ва­ния бе­ре­мен­нос­ти узнать о воз­мож­ных рис­ках для бу­ду­ще­го ма­лы­ша, по­это­му не по­жа­лей­те вре­ме­ни и средств — прой­ди­те ге­не­ти­чес­кое ис­сле­до­ва­ние еще до за­ча­тия ре­бен­ка или, если бе­ре­мен­ность ста­ла для вас сюр­п­ри­зом, во вре­мя вы­на­ши­ва­ния. Так вы смо­же­те из­бе­жать мно­жест­ва про­блем для се­бя и для ма­лы­ша в бу­ду­щем.

Молекулярно-генетические методы. Эти методы позволяют анализировать фрагменты ДНК, находить и изолировать отдельные гены и их сегменты и устанавливать в них последовательность нуклеотидов.

Методы гибридизации нуклеиновых кислот. После разрезания ДНК на фрагменты рестриктазами проводится их электрофорез на агарозном или полиакриламидном геле с целью разделения этих фрагментов. Далее осуществляется идентификация фрагментов ДНК.

Для выявления специфических фрагментов ДНК используется метод блот-гибридизации по Саузерну. Эта методика состоит из следующих этапов:

1) после окончания электрофореза гели помещают в щелочной раствор для денатурации фрагментов ДНК — получают одноцепочечные ДНК;

2) одноцепочечные ДНК вымывают из геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтры перпендикулярным поверхности геля током буфера; одноцепочечные фрагменты ДНК фиксируют на фильтре;

3) для визуального выявления нужных фрагментов проводят гибридизацию исследуемого образца со специфическим по нуклеотид-ной последовательности меченным радиоактивно или флюоресцентной меткой олигонуклеотидным синтетическим зондом; радиоактивно меченные участки выявляют путем экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография); флюоресцентные метки выявляют в люминесцентном микроскопе.

Этот метод позволяет обнаружить единственный ген среди десятков тысяч. Гомологичные последовательности можно идентифицировать как полностью, так и частично. Различные модификации этого метода позволяют в клинике анализировать очень малые количества ДНК, взятые у больного.

Для успешного применения в практическом здравоохранении молекулярно-генетических методов необходимо создание библиотек радиоактивных зондов всех последовательностей ДНК генома человека, и в этом направлении уже немало сделано.

Методы генетики соматических клеток. Наибольший интерес для генетики человека представляет метод гибридизации клеток. В 1960 г. французский ученый Ж. Барский, выращивая в культуре клетки двух линий мышей, обнаружил, что некоторые из них по своим морфологическим и биохимическим свойствам оказались промежуточными между исходными родительскими клетками. Это были гибридные клетки. Такое спонтанное слияние соматических клеток в культуре ткани происходит довольно редко. В дальнейшем было установлено, что при введении в культуру клеток РНК-содержащего вируса парагриппа Сендай, инактивированного ультрафиолетом, частота гибридизации клеток значительно повышается. В смешанной культуре разных типов клеток образуются гетерокарионы — клетки, содержащие два ядра разных клеток в одной цитоплазме. Часть таких клеток способна размножаться митозом. После митоза из двуядерного гетерокариона образуются две одноядерные клетки, каждая из которых представляет собой синкарион — настоящую гибридную клетку, содержащую хромосомы обеих родительских клеток, то есть происходит объединение двух геномов.

Гибридизация возможна между клетками не только организмов разных видов (человек — мышь), но и разных типов (человек — комар). Синкарионы обычно удается получать при гибридизации в пределах класса. Например, гибридные клетки человека и мыши имеют 43 пары хромосом: 23 — от человека и 20 — от мыши. В дальнейшем происходит постепенное удаление хромосом того организма, клетки которого имеют более медленный темп размножения. У гибридных клеток человека — мыши удаляются хромосомы человека.

В гибридных клетках функционируют хромосомы как человека, так и мыши, гены которых детерминируют синтез соответствующих белков. Морфологически можно отличить каждую из хромосом (дифференциальное окрашивание). Если в гибридной клетке отсутствует какая-либо хромосома и не происходит синтез каких-то белков, то можно предположить, что гены, детерминирующие синтез этих белков, локализованы в ней. Таким образом, этот метод позволяет устанавливать группы сцепления у человека, а используя нехватки и транслокации, — выяснять и последовательность расположения генов, то есть строить генетические карты хромосом человека.

Экспресс-методы — это быстрые предварительные методы изучения генетики человека. Они часто используются для исследования больших контингентов людей с целью выявления наследственной патологии как скрининг-методы, применяемые при проведении просеивающих программ. Например, скрининг новорожденных на фенилкетонурию, гипотиреоз, беременных

на альфа-фетопротеин, при помощи которого можно пренаталь-но определить у плода некоторые пороки развития (например, анэнцефалию, открытые формы спинномозговых грыж, синдром Дауна).

К этим методам предъявляются определенные требования:

1) метод должен быть диагностически значимым, то есть положительные и отрицательные результаты должны соответствовать наличию или отсутствию заболевания;

2) метод должен быть надежным: один и тот же образец при независимой двукратной проверке должен одинаково оцениваться;

3) исследованию должен подвергаться легкодоступный материал (кровь, моча) в малых количествах (например, пятна капиллярной крови, высушенной на фильтровальной бумаге);

4) метод должен быть приемлемым для обследуемых, исполнителей и врачей;

5) метод должен быть экономичным.

Микробиологический ингибиторный тест Гатри позволяет выявлять некоторые биохимические нарушения у новорожденных. Из пятки новорожденного берут кашпо крови на диски фильтровальной бумаги, которые помещают на агаровую культуру В. subtillis. Последнюю выращивают на минимальной питательной среде, содержащей антиметаболит искомой аминокислоты (например, фенилаланина). Антиметаболит должен одновременно тормозить рост микроба. При наличии в крови младенца большого количества фенилаланина антиметаболит разрушается и микробы начинают бурно расти. Меняя антиметаболиты, можно диагностировать наличие в крови определенных аминокислот и углеводов (лейцина, гистидина, фруктозы, галактозы и др.).

Биохимические и микробиологические экспресс-методы (флюорометрические, хроматографические, радиоиммунологические и др.) широко используются для быстрой предварительной диагностики наследственных болезней обмена веществ. Выявление Х- и Y-хроматина чаще осуществляется посредством соскоба клеток слизистой оболочки щеки (буквальный эпителий). Для выявления Х-хроматина мазки окрашивают ацеторсеином (или любой другой ядерной краской) и препараты просматривают в обычном световом микроскопе. Этот метод позволяет определить количество Х-хромосом в кариотипе по количеству телец Барра (их на одну больше, чем количество глыбок Х-хроматина).

Для выявления Y-хроматина мазки окрашивают 0,005 % раствором акрихин-иприта и просматривают в люминесцентный микроскоп — Y-хромосома дает яркое зеленое свечение. Этот метод позволяет установить количество Y-хромосом в кариотипе.

Методы пренаталъной диагностики наследственных болезней. Пренатальная диагностика связана с решением ряда биологических и этических проблем до рождения ребенка, так как при этом речь идет не об излечении болезни, а о предупреждении рождения ребенка с патологией, не поддающейся лечению (обычно путем прерывания беременности с согласия женщины). При современном уровне развития пренатальной диагностики можно установить диагноз всех хромосомных болезней, большинства врожденных пороков развития, энзимопатий, при которых известен биохимический дефект. Часть из них можно установить практически в любом сроке беременности (хромосомные болезни), часть — после 12-й недели (редукционные пороки конечностей, атрезии, анэнцефалию), часть — только во второй половине беременности (пороки сердца, почек).

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Основным направлением деятельности онкологическое отделение (вирусологии) является проведение молекулярно-биологических исследований с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени и иммуноферментного анализа для выявления вирусного и бактериального инфицирования.

Диагностика вирусных и бактериальных инфекций позволяет:

1. Выявить вирусное и бактериальное инфицирование на ранней стадии;
2. Провести эффективное лечение на раннем этапе;
3. Осуществлять мониторинг проводимого лечения;
4. Оценивать эффективность проведённого лечения.

Молекулярно-генетические исследования с использованием методов полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяют диагностировать ДНК/РНК вирусных и бактериальных агентов, которые имеют немаловажное значение в преобразовании нормальной клетки в злокачественную.

Внедрение опухолеродного вируса в геном клетки, приводящее к нарушению контроля клеточного деления, является одним из инициирующих шагов многоступенчатого процесса канцерогенеза. При этом заражение онкогенным вирусом не означает однозначно, что в последующем образуется злокачественная опухоль, но сформируется вероятность ее появления.

В настоящее время можно считать установленным, что на долю опухолей, ассоциированных с вирусами, приходится около 20% всех опухолей человека. Онкогенные вирусы, принадлежащие к разным семействам, используют во многом сходную стратегию для инициации канцерогенеза.

Среди этих общих свойств можно назвать нарушения работы клеточных сигнальных путей, контролирующих пролиферацию, дифференцировку, целостность генома, миграцию клеток, апоптоз, иммунный ответ.

Механизмы реализации онкогенного потенциала вирусов включают:

1. взаимодействие вирусных белков с клеточными белками – компонентами сигнальных путей;
2. встраивание генома вируса в геном клетки (интеграция);
3. влияние на эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов.

Исследования последних лет позволяют предположить, что все онкогенные вирусы успешно используют ограничение транскрипции своих генов, накладываемые метилированием ДНК, репрессивными модификациями гистонов и клеточными микроРНК, для ухода от иммунологического контроля, что способствует персистенции вирусного генома в клетке хозяина.

В настоящее время выявлено несколько групп вирусов, предрасполагающих к развитию опухолей у человека.

Вирус	Опухоль
Вирусы папиллом (HPV) типов 3, 6, 11, 32, 72, 73	Доброкачественные: папилломы, кондиломы кожи и слизистых
Вирусы папиллом (HPV) типов 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 70	Злокачественные: рак шейки матки, рак анального канала
Вирус гепатита В (HBV)	Первичный рак печени
Вирус гепатита С (HСV)	Первичный рак печени
Вирус Т-клеточной лейкемии человека (HTLV-1)	Т-клеточный лейкоз у взрослых
Вирусы герпеса: вирус Эпштейна-Барр (EBV) вирус герпеса 8 типа (HSV-8)	Лимфомы, рак носоглотки, рак желудка Саркома Капоши (на фоне иммуносупрессии)

Рак шейки матки (РШМ) – одно из наиболее распространенных онкологических заболеваний, занимающее второе место по частоте встречаемости среди женщин в мире. Ежегодно регистрируется около 600 тыс. новых случаев РШМ и свыше 95% РШМ ассоциировано с вирусами папилломы человека (HPV) высокого онкогенного риска.

Эпидемиологические исследования показали, что заболевание могут вызывать 18 типов вируса, из которых наиболее часто (в 94 % случаев) встречаются двенадцать: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66.

Инфицированность HPV достаточно высока: геном вируса определяется у 46% женщин и 33% мужчин. Максимальный риск заражения отмечен в возрасте от 16 до 25 лет. Однако не у всех женщин развиваются дисплазия и рак шейки матки – примерно у 80% иммунная система организма в течение 2 лет после инфицирования сама избавляется от вируса. Таким образом, носительство этих вирусов свидетельствует не о злокачественном процессе как таковом, а многократном повышении риска его возникновения. Диагностика HPV-инфекции необходима для отбора пациенток, которым показано проведение комплексных мероприятий, направленных на профилактику и раннюю диагностику рака шейки матки.

Заболеваемость раком анального канала также тесно связано с инфицированием HPV – геном вируса определяется в 80-85% случаев.

В настоящее время доказано участие и других вирусных агентов (вирусов гепатита В и С, вируса Т-клеточной лейкемии человека, вируса Эпштейна-Барр, вируса герпеса 8 типа) в развитии злокачественных опухолей различных локализаций.

Инфицирование вирусными гепатитами ведет к увеличению риска развития первичного рака печени. Во всем мире хронические вирусные гепатиты В и С, зачастую имея бессимптомное течение, являются самыми значимыми факторами риска развития цирроза и рака печени.

Своевременная диагностика вирусных гепатитов позволяет не только выявить заболевание на ранней стадии, тем самым предотвратив возникновение осложнений, но и исключить возможное инфицирование окружающих Вас людей. Кроме печени вирусы гепатитов способны поражать лимфатическую ткань, вызывая развитие неходжкинских лимфом, селезенку, почки, слюнные железы и др.

Большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций (повреждений) в структуре участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов лежат генно-инженерные манипуляции с ДНК и РНК.

ПРЕИМУЩЕСТВА МЕТОДА

Исходным этапом всех молекулярно-генетических методов является получение образцов ДНК. Источником геномной ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки. На практике чаще используют лейкоциты, хорион, амниотические клетки, культуры фибробластов. Возможность проведения молекулярно-генетического анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом методов данной группы. Выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения различных исследований и может долго сохраняться в замороженном виде. Во многих случаях для успешной диагностики болезни достаточно исследовать небольшой фрагмент генома. Выделение таких фрагментов стало возможным благодаря открытию ферментов — рестриктаз, которые разрезают молекулу ДНК на фрагменты в строго определенных местах.

КЛАССИФИКАЦИЯ

1. Прямая ДНК-диагностика моногенных наследственных болезней -предметом анализа являются мутации гена.

2. Косвенная - применяется в тех случаях, когда нуклеотидная последовательность гена еще не известна, но имеется представление о положении гена на генетической карте и сводится к анализу полиморфных генетических маркеров у больных и здоровых членов семьи

В ДНК-диагностике в настоящее время используются разнообразные прямые методы. Наиболее просто обнаруживаются мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов ДНК, которые выявляются при электрофоретическом анализе. Для выявления точковых мутаций, небольших делеций и инверсий в исследуемых генах используют методы, при помощи которых можно проанализировать уникальную последовательность ДНК. Примером может служить метод секвенирования — определение нуклеотидной последовательности ДНК. Любые типы мутаций могут быть обнаружены путем прямого секвенирования мутантной ДНК. Для некоторых генов, имеющих небольшие размеры, этот метод с успехом применяется как основной метод сканирования мутаций. Главное преимущество прямых методов диагностики — почти 100 % эффективность.

Косвенная ДНК-диагностика сводится к анализу полиморфных генетических маркеров у больных и здоровых членов семьи. Маркеры должны быть расположены в том хромосомном регионе, где и ген болезни. Такими маркерами могут быть участки ДНК, существующие в популяции в нескольких аллельных вариантах. Отличия могут быть по составу нуклеотидов, по числу динуклеотидных повторов. На основе вариабельности маркерных участков ДНК можно дифференцировать материнское или отцовское происхождение конкретного варианта маркера, сцепленного с геном болезни. Благодаря анализу полиморфных генетических маркеров можно определить и проследить в поколениях хромосому, несущую патологический ген. Технические приемы в косвенной диагностике те же, что и в прямой диагностике (получение ДНК, электрофорез и другие). Главный недостаток косвенных методов диагностики — обязательное предварительное изучение генотипа как минимум одного пораженного родственника.

ЧТО ПОЗВОЛЯЮТ ВЫЯВИТЬ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ?

СЕРПОВИДНОКЛЕТОЧНАЯ АНЕМИЯ

С помощью данного метода возможно идентифицировать мутации в гене. Примером выявления мутантного гена является диагностика серповидно-клеточной анемии в эмбриональном периоде. Фрагменты ДНК, полученные при действии рестриктаз у здорового и больного, сравниваются с помощью метода гибридизации по Саузерну, при этом в качестве зонда используется радиоактивно меченая ДНК гена Рглобина

РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА

Диагностика моногенного наследственного заболевания путем определения нуклеотидной последовательности генов (гемофилия, гемоглобинопатия) и выявления мутантных генов (фенилкетонурия, муковисцидоз)

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ДНК РОДИТЕЛЕЙ И ДЕТЕЙ;

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ДНК ЧЕЛОВЕКА ПО ВАРИАБЕЛЬНЫМ ТОЧКАМ ДНК, МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ КОТОРЫХ ПО-ЗВОЛЯЕТ ПРОВОДИТЬ ИДЕНТИФИКАЦИЮ ЛИЧНОСТИ ЧЕЛОВЕКА

ВЫДЕЛЕНИЕ И СИНТЕЗ ГЕНОВ

Выделение, синтез и клонирование генов является одним из этапов генной инженерии: а) Выделение генов: получение определенных фрагментов ДНК с помощью рестриктаз б) Синтез генов: 1)Химический синтез — синтез определенных последовательностей нуклеотидов, соответствующих данному гену 2Ферментативный синтез — с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы) на матрице мРНК синтезируют комплементарную ДНК.

Заведующий лабораторией — к. м. н. Грудинин Михаил Павлович

Телефон зав. лабораторией: +7 (812) 499–15–21
Телефон лаборатории: +7 (812) 499–15–20

Лаборатория молекулярной вирусологии и генной инженерии была организована в 1987 году. В лаборатории, в рамках системы глобального надзора за гриппом, с помощью современных методов молекулярной вирусологии ежегодно проводится исследование генетического разнообразия и молекулярно-биологических свойств вирусов гриппа А и В, а также изучение эволюции вирусов гриппа, циркулирующих на территории РФ.

Лаборатория имеет лицензию №001262 на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний и выполнение работ с микроорганизмами III — IV групп патогенности (Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 20.02.2006).

• Изучение структуры геномных сегментов, кодирующих как поверхностные, так и внутренние белки вирусов гриппа; анализ мутаций, ответственных за развитие лекарственной устойчивости; выявление изменений в антигенных сайтах и функциональных участках генома вируса гриппа.
• Изучение молекулярных механизмов патогенеза гриппа на моделях экспериментальной гриппозной инфекции.
• Разработка олигонуклеотидных и белковых микрочипов (microarray) для экспериментальных и клинических исследований.
• Изучение молекулярных механизмов самосборки белковых комплексов и конструирование наноматериалов на их основе.
• Разработка и изучение противогриппозных вакцин нового поколения и рекомбинантных гриппозных векторов, экспрессирующих вирусные, бактериальные антигены и биологически активные вещества.
• Изучение генетического разнообразия вирусных и бактериальных инфекций.

Установлено, что отдельные белки вируса гриппа (HA, NA и M) способны вызывать патологические нарушения, характерные для гриппозной инфекции как in vitro, так и in vivo. При этом, HA, NA и M белки способны модулировать фибринолитическую и антикоагулянтную активность плазмы крови, изменять активность эритроцитов (HA) и тромбоцитов (HA, NA и M), усиливать частоту сокращения лимфатических сосудов (HA, NA и M), блокировать CD-4 рецептор Т-клеток (HA и M белки, на 20% и 70%, соответственно), вызывать пролиферацию лейкоцитов периферической крови и экспрессию CD25-рецепторов (ИЛ 2). Механизм действия вирусных белков на все эти процессы в организме хозяина можно объяснить наличием в структуре вирусных белков аминокислотных последовательностей, мимикрирующих аминокислотные последовательности ряда регуляторных белков и пептидов хозяина таких, как тканевой активатор плазминогена человека, инсулин, соматостатин, опиоидные, гастроинтестинальные пептиды и др. Начаты исследования о повреждающем действии вируса гриппа на эндотелий сосудов. Получены данные, свидетельствующие о том, что вирусы гриппа А: H5N1, H3N2, H1N1 могут полноценно репродуцироваться в культуре эндотелиальных клеток и оказывать на них повреждающее действие, которое выражается в апоптозе данной культуры.

Разработан опытный образец олигонуклеотидного микрочипа для выявления вирусов гриппа типа А подтипа H5N1 в клиническом материале.

Разработаны оригинальные подходы для регулирования самосборки полипептидов.

С помощью методов обратной генетики получены 6 вакцинных кандидатов, являющихся 5:3 и 6:2 реассортантами высокоурожайного вируса PR/8/34 (H1N1) и вирусов гриппа A/Kurgan/5/05 (H5N1), A/Texas/04/09 (H1N1).

Созданы рекомбинантные гриппозные векторы, экспрессирующие микобактериальный антиген ESAT-6. Показана профилактическая и терапевтическая эффективность рекомбинантных гриппозных векторов на моделях экспериментальной туберкулезной инфекции.

Впервые получена оригинальная бактериальная система экспрессии рекомбинантного гена антигена Дельта, в которой осуществляется одновременный синтез малой и большой форм антигена ВГД по эукариотическому типу экспрессии, на основе штамма E.coli XL1-Blue, несущего Sup E мутацию, содержащего плазмиды рUC-D или pGEX-D.

Амплифицированы, секвенированы и клонированы гены, кодирующие структурную часть белков 14.3.3 и приона человека (эмбриональный мозг), полноразмерный ген антигена ВГД (сыворотка больного).

Определение первичной нуклеотидной последовательности полноразмерных геномов двух изолятов вируса гриппа H5N1 из г. Кургана и двух крымских изолятов, выделенных во время вспышки заболевания среди домашней птицы в 2005 году. Все полученные последовательности были депонированы в Международную базу данных GenBank с кодами доступа DQ449632–DQ449647; DQ650659–DQ650670. Филогенетический анализ первичных нуклеотидных последовательностей всех генов данных изолятов выявил высокий уровень гомологии гемагглютининов западносибирских штаммов со штаммами, изолированными весной того же года в северо-западной провинции Цинхай (КНР). Было показано, что данные изоляты кластеризуются со штаммами так называемой Цинхайской группы и относятся ко 2 субклайду 2 клайда вируса гриппа А H5N1 по классификации ВОЗ и близки к рекомендованному ВОЗ вакцинному кандидату An A/Bar headed goose/Quinghai/1A/2005-like virus, полученному методом обратной генетики (2006).

Впервые выявлена циркуляция генотипа II вируса гепатита Дельта в Якутии. Ранее данный генотип выявлялся только в Тайване и Японии. Филогенетический анализ с применением компьютерных программ CLUTAL W (1.8), PHILIP и PAUP показал, что российский ВГД генотипа II формирует отдельную ветвь между тайваньскими и японскими изолятами. Филогенетический анализ полноразмерных последовательностей генома вируса гепатита В (ВГВ), полученных из GenBank/EMBL, что позволил выявить высокую частоту рекомбинантных событий в эволюционной истории ВГВ. Для 9 мозаичных геномов картированы предполагаемые точки рекомбинации. Шесть мозаичных геномов образовались в результате рекомбинации между генотипами В и С и были изолированы в Юго–Восточной Азии, где данные генотипы циркулируют совместно. Три мозаичных генома представляли А/D рекомбинанты. Все они были выделены в Италии, где А и D генотипы составляют 90% популяции ВГВ. Среди ВГВ, циркулирующих в Санкт-Петербурге, выявлен вариант, образовавшийся в результате рекомбинации генотипов А и D. В трех образцах, полученных от пациентов, выходцев из Юго-Восточной Азии, был обнаружен генотип С. Таким образом, было показано, что в Санкт-Петербурге, как и в Западной Европе происходит расширение спектра генотипов ВГВ за счет миграции населения.

ПЦР, ОТ-ПЦР, Real-Time ПЦР, RFLP-анализ, высокоэффективная жидкостная хроматография, спектрофотометрия, спектрофлуориметрия, метод динамического светорассеивания, микробиочипы, комплекс компьютерных программ для анализа нуклеотидных и белковых последовательностей, моделирования пространственной структуры полипептидов и образования белковых комплексов и др.