Методы определения вирусов картофеля

Вирусы вызывают одни из самых экономически значимых заболеваний картофеля и являются основной причиной снижения категорий семенного картофеля. Вирусы поражают как семенной, так и товарный картофель, вызывая потери в урожайности и снижение качества продукции. Заражённые растения не поддаются лечению.

В Российской Федерации семенной картофель традиционно исследуют на наличие 6 вирусов:

Вирус переносится тлёй, а также при механическом повреждении растений. Вирус вызывает существенное снижение урожайности ряда сортов картофеля. Симптомы заболевания и степень потерь урожая находятся в прямой зависимости от штамма вируса, устойчивости сорта и продолжительности воздействия вируса на растение.

Вирус переносится тлёй. Поражение приводит к серьёзным повреждениям растений, выражающимся в скручивании листьев и некрозах ткани, и значительному снижению урожайности.

Заражение картофеля этими вирусами может протекать бессимптомно и не приводить к заметному снижению урожайности, однако, совместное заражение растений с тяжёлыми вирусами (PVY, PLRV) приводит к существенному усилению проявления симптомов заболеваний и увеличению потерь урожайности.

Диагностика вирусов картофеля

Испытательная лаборатория ООО Независимая диагностическая лаборатория оказывает услуги по диагностике семенного картофеля на наличие вирусов с учётом требований соответствующего ГОСТ.

Уровень заражения семенного картофеля вирусами, а также методы отбора проб и определения качества семенного картофеля регламентируются ГОСТ 33996-2016 “Картофель семенной. Технические условия и методы определения качества”:

• наличие растений с проявлением симптомов тяжелых форм мозаики (YBK) и скручивания листьев картофеля (ВСЛК) в исходном материале не допускается (пункт 5.1.2; таблица 1)
• в оригинальном, элитном и репродукционном семенном картофеле допускается наличие растений с проявлением симптомов тяжелых форм мозаики (YBK) и скручивания листьев картофеля (ВСЛК) (в процентах по счёту) не более 0.4, 1 и 2%, соответственно (пункт 5.1.2; таблица 1)
• по результатам лабораторного тестирования в исходном материале наличие вирусов не допускается (пункт 5.1.11; таблица 2)
• по результатам лабораторного тестирования допускается наличие вирусов в семенном картофеле категорий ПП-1 и ССЭ (в процентах по счёту) не более 5% (YВК – не более 0.5%) и 10% (YВК – не более 1%), соответственно (пункт 5.1.11; таблица 2)
• для партий суперэлитного, элитного и репродукционного семенного картофеля лабораторное тестирование проводится по заявке производителя или поставщика семенного картофеля. Предельно допустимые нормы ограничения вирусной инфекции по результатам лабораторного тестирования клубневых проб могут устанавливаться в договорах (контрактах) на поставку семенного картофеля по договоренности сторон. Для партий категории ЭС предельный уровень ограничения YВК по результатам лабораторного тестирования не должен превышать 10%
• для проведения лабораторного тестирования на заражённость вирусной инфекцией отбирают 200 клубней для оригинального семенного картофеля и 100 клубней для элитного семенного картофеля (пункт 6.3.1; таблица 6)
• полимеразная цепная реакция (ПЦР) и иммуноферментный анализ (ИФА) являются методами лабораторного тестирования исходного материала, оригинального и элитного семенного картофеля (пункты 5.1.11, 7.3.1, 7.3.2).

Диагностика вирусов картофеля подразумевает определение процента клубней, инфицированных вирусами, относительно общего количества клубней. В Независимой диагностической лаборатории применяются два основных метода диагностики – иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени с зондами Taqman, совмещённая с реакцией обратной транскрипции.

Для проведения ИФА в лаборатории используются антитела и конъюгаты антител производства компании Bioreba AG (Райнах, Швейцария; ISO 9001 и ISO 17025) и SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture; Эдинбург, Шотландия; ISO 9001). Все процедуры выполняются в строгом соответствии с рекомендациями производителя антител.

Картофель во всем мире является вторым хлебом и считается одним из важнейщих сельскохозяйственных продуктов для употребления в пищу человечеством. Среди изученных до ХХ в. из 400 видов фитопатогенных вирусов [1] около 20 видов вирусов [2, 3] поражают картофель. Исследования, проведенные в последующие годы, показали, что картофель поражается более 52 видами фитопатогенных вирусов [1, 4]. К ним относятся такие вирусы, как вирус скручивания листьев картофеля – ВСЛК (potato leaf roll virus, PLRV); Y вирус картофеля – YВК (Potato virus Y, PVY); X вирус картофеля – ХВК (Potato virus X, PVX); S вирус картофеля – SBK (Potato virus S, PVS); M вирус картофеля – МВК (Potato virus M, PVM) [5]. Каждая из них имеет своеобразный симптом поражения: ВСЛК вызывает симптом скручивания листьев картофеля, YВК – мозаичное скручивание, а ХВК – крапчатую мозаику. Признаки поражения проявляются в различных симптомах в зависимости от вида вируса, экологических условий а также от сорта картофеля [4, 6]. Из перечисленных вирусов ВСЛК снижает урожайность картофеля до 80 %, а в случае ХВК поражение, не проявляя видимых симптомов из года в год, через клубеньки передаётся следующему поколению, урожайность снижается до 10–25 %, а при смешанных инфекциях (S + X + A), снижая урожайность до 40 %, приносит большой ущерб сельскому хозяйству [7, 8].

ВСЛК относится к семейству Luteoviridae, роду Polerovirus, форма вириона сферическая, передаётся с помощью Myzus persicae, во всем мире распространена во всех хозяйствах, выращивающих картофель, и является вирусом, приносящим большой вред картофелеводству [4, 8].

ХВК относится к семейству Alphaflexiviridae, роду Potexvirus, является одним из широко распространённых вирусов во всех континентах, легко передаётся механически, контактным путём, а также почвенными грабами [1]. Является одним из фитопатогенных вирусов, приносящим большой вред картофелеводству. Основой разработки мер борьбы против этого вируса является изучение его распространения в определённых регионах и определение его естественных растений-резерваторов в этом регионе. Исследования, проведённые в последние годы, указывают на широкое распространение этих вирусных заболеваний картофеля в Узбекистане [9].

Исходя из вышеизложенного, целью исследований является изучение распространения и естественных растений-резерваторов ВСЛК и ХВК в некоторых районах Самаркандской области.

Материалы и методы исследования

Основные материалы для проведения ИФА: антитела к ХВК (IgG), конъюгат (IgG + фермент), полистироловые платы и химические реактивы, полученные из организaции Internotional Centre of Potato (CIP). Для выявления вируса методом ИФА, первоначально листья картофеля с симптомами поражения и листья индикаторных растений, зараженных с препаратом ХВК, который очищен из смещенных инфекций, были собраны в отдельные полиэтиленовые мешочки. Затем, добавляя фосфатный буфер (Ф.Б.) в соотношении 1:1 (состав для 1 литра – NaСl, KH2PO4, Na2HPO4, KCl, NaN3, рН-7,4), их гомогенизировали и приготовили гомогенат. В полистироловые платы иммобилизировали АТ вируса (IgG) в течение 5–6 ч при 37 °С, не связавшиеся антитела (АТ) смыли с помощью Ф.Б. с твином (на 1 литр Ф.Б. добавили 20 капель (0,5 мл) твина PBS-T). Затем налили гомогенат антигена (АГ), приготовленный из листьев определяемого растения, и инкубировали в течение 3–4 часов при 37 °С. Не связавшиеся АГ смыли Ф.Б. с твином. Затем в полистироловые платы налили конъюгат (IgG + фермент), поместили их в полиэтиленовые мешочки и хранили 3–4 ч при 37 °С. Не связавшиеся конъюгаты смыли Ф.Б. с твином. Затем в каждую полистироловую плату налили по 80 мкл субстрата (состав: диэтаноламин, 37 % HCl, дистиллированная вода и таблетки субстрата – р-нитрофенилфосфат) и наблюдали за проявлением реакции. Реакция проявлялась в течение 30–60 мин в виде изменения окраски. Результаты зафиксировались.

Результаты исследования и их обсуждение

Сельское хозяйство — область хозяйственной деятельности человека с наиболее быстрой отдачей прибыли. Однако в данной сфере по-прежнему остро стоит проблема высокой степени зараженности аграрных культур фитопатогенами. Исправить сложившуюся ситуацию можно различными способами, в том числе посредством массовой молекулярной диагностики вирусных и бактериальных инфекций растений при помощи специальных методов.

В растениеводстве размер прибыли зависит многих факторов. В их число входят научный, технический и организационный уровни выращивания сельскохозяйственных культур и климатические условия. Большое значение имеет эффективность борьбы с различными вредителями — животными, насекомыми и сорняками, а также микроорганизмами — грибками, бактериями, вирусами и вироидами. Обычно вирусы не беспокоят конечного потребителя, поскольку они не опасны для здоровья. Однако эти инфекционные агенты могут негативно повлиять на урожайность культур или привести к полной гибели посевов.

Вирусные и вироидные инфекции злаковых, овощных, плодовых, ягодных и декоративных культур встречаются повсеместно. Заражение обычно происходит при проникающем ранении клеточной стенки с помощью насекомых и других вредителей либо механически — инвентарем или оборудованием. При этом проводимое массово оздоровление растений через получение апикальной меристемы не гарантирует 100-процентного освобождения от вирусов и вироидов. Именно этот фактор в совокупности с отсутствием доступной диагностики привел к широкому распространению вироида на картофеле в 80-х годах прошлого века за пределами природных очагов этого заболевания в России.

Вирусные и вироидные инфекции причиняют значительный ущерб урожаю, причем наиболее вредны смешанные варианты. Например, заражение картофеля вирусом X приводит к потере урожая на 10 процентов, а совместное инфицирование агентами X и Y — на 50–70 процентов. Чаще всего от данной проблемы страдают предприятия, культивирующие многолетние растения. Так, массовое поражение кокосовых пальм, которые начинают плодоносить лишь на 7–9 годы жизни, вироидом каданг-каданг нанесло экономике Филиппин и острову Гуам катастрофический ущерб от потери 30 млн деревьев. Сегодня растения, зараженные вирусами и вироидами, не лечат, а при постановке диагноза их выбраковывают. В случае карантинной инфекции культуры подлежат уничтожению. Поэтому для предотвращения большого ущерба от распространения заболеваний необходимы решения, позволяющие точно и быстро определить, здоровое или больное растение будет выращиваться в хозяйстве.

Очевидно, что эффективность борьбы с инфекциями многократно выше на начальных стадиях их развития, поэтому окончательный и наиболее точный диагноз о наличии вирусов и вироидов должен ставиться на молекулярном уровне. Диагностика подобных заболеваний является ключевым звеном в производстве оздоровленного семенного материала. Помимо сертификации семян и посадочных растений в массовых масштабах она применяется для контроля оздоровления культур от вирусов, фитосанитарного мониторинга посевов, селекции и карантинной проверки импортируемого семенного материала. При этом методы диагностики на молекулярном уровне не зависят от природы инфицированного организма. Для анализа требуется минимальное количество клеточного сока листовой ткани или проростков.

Повсеместный мониторинг зараженности посевного и полевого материала сельскохозяйственных культур вирусами возможен только на основе простых, надежных, доступных высокоспецифичных и высокочувствительных экспресс-методов. Они должны быть применимы для определения широкого круга вирусов, значительно различающихся по морфологии, структуре и физико-химическим свойствам, и позволять проводить быструю диагностику в полевых условиях без специальных навыков и оборудования. Поэтому одним из главных коммерческих требований, предъявляемых ко всем современным способам внелабораторной иммунодиагностики в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве, является полная готовность набора к тестированию. Он должен включать все необходимые реагенты. Для проведения анализа необходимо лишь добавить анализируемый растительный экстракт образца, что инициирует иммунохимические взаимодействия и формирование регистрируемого сигнала в контрольной и аналитической областях. Идеально в подобных тест-системах использование меток, позволяющих осуществлять обнаружение инфекции путем простого визуального считывания без применения каких-либо проявляющих компонентов. В целях дальнейшего повышения чувствительности технологии могут быть использованы как флуоресцентные маркеры, так и разные усилители регистрируемого сигнала.

Данным требованиям отвечает быстро развивающаяся современная аналитическая технология иммунохроматографического анализа, или ИХА, широкого спектра биологически активных соединений различной природы на тест-полосках. В силу простоты и скорости анализа она постепенно вытесняет традиционные твердофазные методы ИФА. Быстрые и легкие в использовании аналитические иммунохроматографические тест-системы, или ИХТС, позволяют проводить высокочувствительные полуколичественные измерения без специальных навыков и оборудования в полевых условиях. Являясь эффективным средством диагностирования, подобные экспресс-тесты дают возможность в течение нескольких минут визуально определить и оценить содержание диагностически важных фитопатогенов.

Основным компонентом ИХТС является мультимембранная тест-полоска, на которую в определенных зонах нанесены иммунореагенты. Эти первичные антитела, связанные с флуоресцентным красителем или меченные окрашенными наночастицами коллоидного золота, способные связываться с определяемым вирусом. При нанесении клеточного экстракта зараженного растения инфекционный агент капиллярными силами перемещается вместе с фронтом жидкости вдоль полоски. Попав в зону первичных меченых антител, он образует с ними иммунохимические комплексы, которые продолжают мигрировать дальше. Достигнув зоны фиксированных в виде поперечной линии первичных антител, комплекс патогена и меченых антител концентрируется за счет образования тройного комплекса, включающего первичные тела. В аналитической зоне связанные с патогеном частицы коллоидного золота концентрируются, и формируется окрашенная линия. При отсутствии вируса в экстракте у здорового растения меченые первичные антитела свободно проходят через тестовую черту, и цветная полоса в аналитической области не появляется. Она возникает дальше по полоске, где в виде поперечной контрольной линии фиксированы вторичные, антивидовые антитела. Эта зона служит внутренним индикатором определения рабочего состояния иммунокомпонентов. Таким образом, при анализе зараженного растения вирусом видны две красные поперечные линии в аналитической и контрольной зонах, а при проверке здоровой культуры — одна контрольная полоса. Чувствительность определения содержания вируса находится в диапазоне 1–30 нг/мл, время анализа составляет 5–15 мин. Для подавляющего большинства вирусов этого порога вполне достаточно, однако при желании чувствительность можно увеличить с помощью реакции серебряного усиления. В этом случае время анализа будет равняться 30–40 мин.

Тест-полоски предназначены для быстрого качественного определения вирусов в экстрактах из заболевших растений в полевых условиях. Наиболее эффективно они могут быть использованы для оценки зараженности, например, при сертификации элитного и репродукционного семенного картофеля, существенно дополняя его визуальный анализ. Кроме того, полоски можно применять для экспресс-исследования импортируемого семенного и товарного картофеля на карантинные и другие особо вредоносные вирусы, а также в личных, подсобных, мелких фермерских хозяйствах, в которых сегодня сосредоточено основное производство данной культуры в России. ИХТС незаменимы в чрезвычайных обстоятельствах, когда необходимо срочно определить природу фитопатогенов, в частности при эпифитотиях и биотерроризме. К подобным текст-полоскам были разработаны технические условия и регламент, а также инструкции по их созданию и производству.

В последние годы на зарубежном рынке появились иммунохроматографические тесты для определения вирусов растений различных производителей — Adgen, Central Science Laboratory, Agdia, EnviroLogiх и других. По сравнению с перечнем коммерческих тест-систем на основе ИФА данный список пока невелик и включает наборы для диагностики около 50 инфекций — ризомании сахарной свеклы, шарки сливы, тристецы цитрусовых, Y-вируса картофеля, огуречной мозаики, бронзовости томатов и других важнейших патогенов сельскохозяйственных культур. Выпускаются мультиспецифичные тест-полоски для одновременного определения в одном образце нескольких вирусов картофеля. Энергично включились в развитие и поддержку массовой молекулярной диагностики заболеваний растений государство и частный бизнес в Индии, Китае и Бразилии. Серьезным показателем надежности диагностических тест-систем на основе ИХА является включение этого метода в диагностические протоколы ЕРРО, или Европейской организации защиты растений, для определения ряда карантинных объектов.

Использование тест-полосок полностью не решает проблему массового и постоянного контроля за семенами. Так, практика интенсивного культурного растениеводства в западных странах опирается на тотальную сертификацию исходного материала и систематический контроль его качества со стороны аккредитованных инспекций без ущерба для дисциплинированных собственников. В России система подтверждения соответствия оригинального, или предбазисного, сырья предусматривает его обязательную проверку на зараженность возбудителями наиболее вредоносных вирусных и бактериальных болезней в специальных испытательных лабораториях, аккредитованных для выполнения такого рода работ. Формирование цивилизованного рынка семенного материала в России вызвало необходимость коренного улучшения системы его сертификации. В силу этого перспективы развития безвирусного семеноводства прямо зависят от обязательного регулярного применения эффективных методов лабораторной и полевой диагностики вирусных и вироидной инфекций.

Однако основная проблема в России — отсутствие тотального систематического контроля качества сертифицированных семян и исходного посадочного материала для повсеместного культивирования со стороны аккредитованных служб. Положение усугубляется тем, что далеко не полный контроль карантинная служба РФ осуществляет даже в крупных семеноводческих хозяйствах, в то время как в производстве сельхозпродукции значительную часть занимают предприятия мелких собственников. Чтобы включить эти компании в культурное ведение агробизнеса, нужно сначала снабдить их необходимым доступным инструментом отслеживания качества покупаемого и выращиваемого растительного материала, а затем уже вести систематический контроль культуры хозяйствования.

актуальной проблемой молекулярной диагностики выступаетодновременное выявление множества патогенов вирусной и вироидной природы сельскохозяйственных растений. Мультипараметрическое исследование обычно производят на молекулярных чипах. В зависимости от плотности нанесения детекторов их классифицируют на чипы низкой концентрации для анализа единиц и десятков мишеней и высокой плотности — для выявления нескольких миллионов целей, которыми являются вирусные антигены. Для аграрной отрасли вполне подойдут иммуночипы первой категории.

Поскольку сельхозпроизводители специализированы по объектам производства и сбыта, экономически целесообразно разрабатывать диагностический иммуночип для определения местных, районированных инфекций конкретной аграрной культуры. На практике для того или иного растения в конкретной зоне или даже стране опасность представляет небольшое число патогенов различной природы — около 10–20 разновидностей. В частности, для картофеля на территории РФ максимально опасны семь вирусных, одна вироидная и две бактериальные инфекции. Для их определения уже были разработаны диагностикумы, в которых используются поликлональные антитела. Более сложная ситуация складывается с выявлением грибковых патогенов. Для их идентификации лучше применять моноклональные антитела. В этом случае более эффективно обратиться к достоинствам ДНК-чиповой технологии молекулярной диагностики или технологии ПЦР, когда в одном анализе можно получить практически полную информацию о зараженности растения грибками с учетом их штаммового разнообразия. В перспективе для каждой сельскохозяйственной культуры необходимо создать иммуночипы, позволяющие одновременно определять наиболее опасные инфекции вирусного, бактериального и грибкового происхождения. После этого станет возможной разработка макрочипа для установления всех или большей части экономически важных фитопатогенов, поражающих районированные растения, для отдельных регионов России.

На современном этапе для сокращения расходов на практическую молекулярную диагностику в процессе получения суперэлитных семян следует проводить ее в два этапа. На первом экономически выгоднее осуществить частичный скрининг семенного материала мультиплексными иммуночипами или тест-полосками. На этой стадии с меньшими убытками можно оценить долю явно зараженных семян и растений. Если их количество составляет 25 процентов и более от общего объема сырья, то необходимо всю анализируемую партию изучить с помощью тест-полосок или иммуночипа. Главная задача данного этапа — определить явно инфицированные экземпляры и убрать их из последующего размножения.

На второй стадии оставшиеся семена и растения необходимо диагностировать более мощными комбинированными технологиями: ОТ, ПЦР и дотИФА, либо ОТ и ПЦР в реальном времени, либо ДНК-чип и дотИФА. Данные методики позволяют обнаруживать одиночные молекулы РНК вирусов, вироидов и бактерий в анализируемой пробе, однако подобные исследования осуществляются только в лабораторных условиях, требуют большего количества времени, специального оборудования и наличия квалифицированного персонала.

В нашей стране исторически сложилась затратная практика овоще- и плодоводства, требующая государственных субсидий. Данный факт объясняется доступностью просторов сельскохозяйственных угодий России. Например, при меньшей в 2–5 раз урожайности картофеля отечественные сельхозпроизводители снабжают население страны данным продуктом за счет возделывания его на больших площадях, чем в Западной Европе. Экстенсивное ведение сельского хозяйства, когда потребности в сельхозпродукции удовлетворяются не с помощью увеличения урожайности, а за счет возможности использовать территории большой страны, государству экономически невыгодно. Однако переход на интенсивную схему требует повышения производительности труда и сокращения потерь урожаев от различных инфекций.

Необходимость массового внедрения и использования доступных систем диагностики инфекций растений на молекулярном уровне в нашей стране сегодня вполне очевидна. Подобные технологии помогут не только повысить урожайность культур, возделываемых сельхозпроизводителями, но и сформировать отечественный рынок качественного и безвирусного семенного материала.

Изучено 630 сортообразцов картофеля на устойчивость к основным вирусным заболеваниям в Лесостепи Украины. Установлено, что визуальная оценка заболеваний усложняется в связи с неспецифичностью некоторых симптомов вирусных болезней. С использованием иммунологических и методов были идентифицированы возбудители вирусных инфекций — М-вирус картофеля и Y-вирус картофеля. Выделены сортообразцы, устойчивые к скручиванию листьев картофеля, полосчатой и морщинистой мозаике.

Ключевые слова: картофель, вирусные болезни, вирусы, вирусная инфекция, почвенно-климатические условия, визуальная диагностика, электронная микроскопия, ИФА

Studied 630 potato varieties for resistance to the major viral diseases in the of Ukraine. Established that the visual assessment of diseases complicated by nonspecific symptoms of some viral diseases. Using immunological and electron microscopic methods were identified pathogens of viral infections — Potato virus M and Potato virus Y. Highlighted accessions resistant to potato leaf roll, leafdrop streak and wrinkled mosaic.

Keywords: potato virus diseases, viruses, viral infection, soil and climatic conditions, visual diagnostics, electron microscopy, ELISA

Введение

Актуальность изучения вирусных заболеваний растений обусловлена тем исключительным влиянием, которое испытывают живые организмы во взаимодействии с этими патогенами. Вирусы, подчиняя себе репликационную систему клетки, изменяют метаболизм растения и наносят ощутимые потери для растений, которые культивируются человеком, но с другой стороны, способствуют эволюции видов в природе. Положение вирусов в систематике до сих пор вызывает споры, но несомненно, что их исследование имеет важнейшее значение для понимания жизнедеятельности всех живых организмов. В этой связи, открытие более ста лет назад болезнетворного начала с неизвестными ранее свойствами послужило толчком к развитию новых отраслей естествознания и хозяйственной деятельности, в частности семеноводства важных сельскохозяйственных культур.

Среди культур, которым вирусные инфекции наносят значительные убытки, картофель занимает особое место, поскольку патогены передаются вместе с посадочным материалом, и таким образом, длительное время циркулируют в агроэкосистемах, вызывая высокие потери урожая — до 15–70% [5]. Важнейшим вопросом для культивирования картофеля является контроль вирусных инфекций, поэтому поиск источников устойчивости к вирусам — актуальная задача для селекции. Успешная борьба с вирусными болезнями картофеля возможна лишь в результате применения системы мероприятий, первостепенная роль в ней принадлежит селекции и семеноводству [4]. Использование естественной устойчивости к патогенам — это идеальное решение проблемы защиты растений и экологически безопасный для окружающей среды метод выращивания сельскохозяйственных культур. Изучение и установление свойств вирусов способствует созданию сортов, устойчивых к этим патогенам. Установлено, что у вида S.tuberosum, ssp andigena , который входит в родословную многих современных сортов, устойчивость к PVY контролируют два гена: R y_adg , который отвечает за крайнюю устойчивость растений картофеля, и Ny_adg , контролирующий реакцию сверхчувствительности [12, 15]. Сверхчувствительность и крайнюю устойчивость к Х -вирусу картофеля контролирует ген Nx_chc , интродуцированный в современные сорта картофеля от дикого вида S. chacoense Bitt. [14, 17].

Таким образом, исследования устойчивости сортов картофеля к вирусным заболеваниям с учетом зоны возделывания, поиск источников устойчивости растений картофеля, как к биотическим, так и абиотическим факторам, а также изучение свойств вирусов, поражающих картофель в определенной зоне перспективны для работ по созданию сортов картофеля с комплексной устойчивостью к неблагоприятным факторам.

Цель исследования

Целью исследования было установление и идентификация вирусов, вызывающих заболевания картофеля в зоне Лесостепи Украины, а также изучение коллекции сортов картофеля и выделение для дальнейшего использования в селекционной работе сортообразцов, устойчивых к вирусным заболеваниям.

Материалы и методы

Исследования проводилось в Устимовской опытной станции растениеводства Института растениеводства им. Национальной академии аграрных наук Украины и в Национальном университете имени Тараса Шевченко на протяжении

Объектом для изучения были сорта картофеля коллекции Устимовской опытной станции растениеводства в количестве 630 образцов из 32 стран ближнего и дальнего зарубежья. За биологическим статусом коллекция представлена сортами (cultivar).Изучение коллекционного материала проводилось на природном инфекционном фоне в соответствии с общепринятыми методиками в картофелеводстве [3, 6–8]. Устойчивость сортов оценивали по бальной шкале устойчивости: 1 — min, 9 — max проявление признака.

Гидротермический коэффициент для оценки условий вегетации рассчитывали по [10]. Классификации зон увлажнения, согласно , влажная — 1, 6–1, 3; слабо засушливая — 1, 3–1, 0; засушливая — 1, 0–0, 7; очень засушливая — 0, 7–0, 4; сухая —

Отдел организован в 1965 г., его первым и бессменным руководителем является академик РАН и РАСХН, действительный член Европейской Академии, профессор, И.Г. Атабеков. Отдел занимается изучением структуры и механизмов выражения генома на моделях вирусов четырех разных групп: тобамовирусы, потеквирусы, гордеивирусы и клостеровирусы. Также изучает молекулярные механизмы транспорта (внутриклеточного, межклеточного и системного) вирусов в растениях на моделях тобамо-, потекс- и гордеивирусов, механизмы регуляции трансляции вирусных РНК. В отделе конструируют вирусные векторы на основе геномов тобамовирусов, способных продуцировать в зараженном растениии два и более целевых белка для биотехнологических целей, создают трансгенные растения, устойчивые к вирусам и вироидам, на основе новых стратегий индукции устойчивости, в частности, с использованием генов клеточных белков-рецепторов. Также ведется разработка и усовершенствование иммунохимических и молекулярно-генетических методов массовой диагностики вирусов и вироидов растений.

Основные направления научных исследований

Изучение механизмов выражения генома и молекулярных механизмов транспорта (внутриклеточного, межклеточного и системного) вирусов в растениях на моделях тобамо-, потекс- и гордеивирусов. Изучение структуры вирусов, транспортных комплексов и свойств вирусных и клеточных белков, участвующих в транспорте макромолекул в растениях. Разработка стратегий суперпродукции целевых белков или эпитопов вакцинных белков в растениях с помощью вирусов-векторов на основе геномов тобамовирусов и потексвирусов. Разработка технологий создания вакцин нового поколения, несущих эпитопы возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных на поверхности вирусных наночастиц. Оптимизация высокочувствительных молекулярных технологий массовой диагностики вирусов и вироидов растений.

Основные научные достижения отдела

На основании определения первичной структуры полных геномов двух представителей потексвирусов и двух гордеивирусов, клостеровируса и тобамовируса выяснена принципиальная организация геномов вирусов этих групп [FEBS Letters, 1987; J.Mol.Biol., 1991a; J.Gen.Virol., 1991b; PNAS, 1992; FEBS Letters, 1994; Virology, 1994, 1996; Arch.Virology,1996]. Выявлены структурные элементы 5’-концевой нетранслируемой последовательности РНК ХВК (альфабета-лидера), определяющие его способность выполнять функцию трансляционного энхансера [J.Gen.Virol, 1993]. Описан новый для тобамовирусов механизм внутренней инициации трансляции для экспрессии двух вирусных генов, транспортного белка (ТБ) и белка оболочки (БО) [Virology, 1997, 1999, PNAS,2002; ДАН РАН, 2003; J.Gen.Virol. 2005, 2006]. Выявлены уникальные гены гомолога шаперонов НSP70, дивергированного дубликата БО клостеровирусов [J.Mol.Biol.,1991; PNAS, 1992; Virology, 1994] Открыта новая структура нитевидных частиц вируса желтухи свеклы, состоящая из двух БО [PNAS, 1995], исследованы функции и биохимические активности некоторых белков клостеровирусов [J.Gen.Virol., 1994, 1997, 1998, 2001, 2003]. Впервые предложена детализированная модель пространственной структуры БО потивируса [J.Virol.,2001] и БО Х-вируса картофеля (потексвирус) [J.Virol. 2001; Молекулярная биология 2004, 2007; Virology, 2008]. Изучены процессы индуцированной нагреванием или детерентами аморфной агрегации белка оболочки ВТМ и белка оболочки ХВК [ДАН РАН 2005, Intern. J. Biochem.Cell.Biol. 2006; Молекулярная биология 2007, Biophys. Chem., 2007].

Впервые сформулирована идея активного вирус-кодируемого транспорта вирусной инфекции в растениях [Virology 1983 a,b,c; Adv. Virus Res., 1984]. Впервые выделены и охарактеризованы вирус-специфические информосомо-подобные рибонуклеопротеиды (вРНП) [Virology, 1983, 1984a], которые, как предполагается, являются транспортной формой вируса табачной мозаики (ВТМ) [Virology, 1984b]. Показано, что транспортный белок (ТБ) ВТМ обладает способностью ингибировать трансляцию вирусной РНК in vitro и in vivo [Virology, 1997; 1999]. Доказано участие участка внутренней посадки рибосом для ТБ в транспорте и репродукции ВТМ [J.Gen.Virol., 2004]. Впервые изучены комплексы между ТБ ВТМ и РНК ВТМ in vitro c помощью атомной силовой микроскопии [J.Gen.Virol.,2001]. Выявлены и изучены функции клеточных пектинметилэстеразы и протеинкиназ в межклеточном транспорте ВТМ [FEBS Lett.,1999; J.Gen.Virol.,2003; ДАН РАН, 2004; FEBS Letters, 2007a,b]. Открыт новый консервативный модуль генов (тройной блок транспортных генов), ответственный за транспорт вирусных геномов в зараженных растениях [FEBS Lett., 1987, J.Mol.Evol., 1989; Virology, 1996]. Изучена субдоменная организация белка, кодируемого первым геном ТБГ, охарактеризована его РНК-связывающая, АТФазная и хеликазная активности [Virology, 1999; J.Gen.Virol.,2001; Virology, 2002; Plant J., 2005; J.Gen.Virology, 2006. 2009; Биохимия, 2010]. Открыто явление котранспорта мембранно-связанных ТБ ТБГ [Virology, 2000; J.Gen.Virol.,2003]. Изучен внутри- и межклеточный транспорт белка ТБГ1, направляемый белками ТБГ2/ТБГ3, и выявлена роль ассоциации белка ТБГ1 с микротрубочками в этих процессах [MPMI,2004; Open Virology J., 2011]. Показана роль трансмембранных сегментов белков ТБГ2 и ТБГ3 и высокомолекулярных комплексов белка ТБГ3 во внутриклеточном транспорте [J.Gen.Virol.,2005; Plant J., 2006; J.Virol.,2008; Biochemie, 2011]. Выявлены общие закономерности и особенности транспорта вирусов растений с тройным блоком транспортных генов [J.Gen.Virol., 2003; Mol. Plant Microbe Interact., 2010].

Открыты механизмы трансляционной активации вирионов ХВК:

1. с участием белка ТБГ1, основанные на линейной передаче конформационных изменений вдоль спиральной структуры, которые приводят к дестабилизации полярной спирали нуклеокапсида [Virology, 2000; J.Mol.Biol., 2003; J.Mol.Biol., 2003; Молекулярная биология, 2006];
2. путем фосфорилирования N-концевого района БО в составе вириона [Virology, 2001; Молекулярная биология, 2006].

Локализованы участки взаимодействия между белком ТБГ1 и БО ХВК [Mol. Plant Physiol. 2008] и охарактеризована структурная перестройка молекул БО в составе вириона при этих взаимодействиях [FEBS J., 2009]. Показано, трансляционная активация вирионов ТБ представляет общий механизм, характерный для потексвирусов [Доклады РАН, 2009; The Open Virology J., 2011]. Впервые охарактеризованы возможные транспортные формы ХВК и вируса розетчатости арахиса [J.Virol., 2003; J.Gen.Virol., 2006, Mol. Plant Pathol., 2007; J.Mol.Biol., 2008]. Выявлена и исследована роль цистеин-богатого белка гамма-b в супрессии посттрансляционного умолкания генов [J.Virol., 2002; J.Gen.Virol., 2005]. Выявлен новый класс малых цистеин-богатых белков, являющихся детерминантами вирусной патогенности [J.Gen.Virol., 2005; Мол. биология, 2005; J.Gen.Virol., 2009]. Впервые охарактеризованы клеточные белки (А4/1 и фибрилларин), участвующие в транспорте вирусов в растениях, установлена функция фибрилларина и охарактеризованы структурные и РНК-связывающие свойства этих клеточных белков [Mol. Plant Microbe Interact., 2006; ДАН РАН, 2006; EMBO, 2007; PNAS, 2007; ДАН РАН, 2009; Biochemie, 2011; NAR, 2011].

Разработан высокочувствительный иммунохроматографический экспресс-метод для определения нескольких вирусов растений [Прикладная биохимия и микробиология, 2009; Биохимия, 2009,2010].

Участие в научно-исследовательских проектах и грантовая поддержка

Федеральные программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения", "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы", проект "Молекулярно-биологические основы диагностики и профилактики особо опасных болезней сельскохозяйственных животных и растений"; программа "Развитие новых направлений биотехнологии и биобезопасности", проект "Создание трансгенных растений - суперпродуцентов гетерологичных белков (в том числе медицинского назначения)"; программа "Фитобиотехнология", проект "Изучение роли протеинкиназ в межклеточном транпорте и путей их использования в создании вирусоустойчивых растений", "Интеграция", "Международные проекты" Минпромнауки РФ, "Университеты России".

Совместные проекты. В России: совместно с Центром "Биоинженерия" РАН, Институтом цитологии СО РАН, ИБХ РАН, Физическим факультетом МГУ, ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, ВНИИ картофельного хозяйства РАСХН, Всероссийским селекционно-технологическим институтом садоводства и питомниководства РАСХН. За рубежом: с Институтом Фридриха Мишера г. Базель, Швейцария; Университетом Стони Брук г. Нью-Йорк, США; Биотехнологическим центром Университета г. Хельсинки и Университетом г. Турку, Финляндия; Институтом биохимии, вирусов растений и биозащиты г. Брауншвейг и Федеральным центром биологических исследований г. Доссельхейм, Германия; Шотландским институтом растениеводства, Великобритания.

Научные премии

Достижения отдела отмечены Государственной премией (1994 г. - И.Г. Атабеков, Ю.Л. Дорохов, М.Э. Тальянский, С.И. Малышенко; 2009 г. - И.Г. Атабеков), премией им. Д.А. Сабинина биологического факультета МГУ (И.Г. Атабеков, А.А. Аграновский; ), премиями Европейской академии наук для молодых ученых (А.Г. Соловьев, Е.Н. Савенков), Государственной премией РФ для молодых ученых (А.Г. Соловьев, О.Н. Федоркин, Е.Н. Савенков). Ломоносовской премией МГУ (И.Г. Атабеков), дипломами 1 ой степени 3 ей Международной выставки "Инновации-2000. Технологии живых систем", сотрудники отдела награждены медалями ВВЦ. И.Г. Атабеков - лауреат премии им. М.В. Ломоносова 1-ой степени (МГУ, 1998г.), премии им. R. Francki (Международное общество вирусологов, 2000г.). Работы по диагностике вирусов и вироидов отмечены 4-мя золотыми и 1-ой серебряной медалями ВВЦ.

Педагогическая деятельность

Подразделения отдела

• Лаборатория нуклеиново-белковых взаимодействий Заведующий: доктор химических наук, , Дрыгин Юрий Федорович

В лаборатории ведется поиск клеточных ковалентных соединений РНК-белок, структурно подобных вирусным в химическом связывании друг с другом. Ведется также разработка методов молекулярной диагностики вирусных инфекций и получение антител к вирусным РНК.

В лаборатории ведется изучение межклеточного и внутриклеточного транспорта вирусов растений. Основными направлениями научной работы отдела является изучение участия в транспорте вирусного генома по растению тройного блока гена гордеивирусов и потексвирусов, а также изучения роли отдельных внутриклеточных органелл и клеточных белков в процессе развития вирусной инфекции в растениях. Отдельной задачей стоит изучение функций и роли в развитии клеточной инфекции цистеин-богатых белков различных групп растительных вирусов.