Метод выявления генетического материала вируса называется

ОРВИ и грипп имеют респираторные симптомы и общие. Их можно распознать по катаральным признакам со стороны дыхательных путей и общей симптоматике, характерной для большинства заболеваний.

Современные методы диагностики данной группы заболеваний

Различают несколько видов диагностики, которые различаются по особенностям проведения и методу выявления возбудителя. Это:

• экспресс-методы;
• серологическая диагностика;
• вирусологическая диагностика.

Первая группа - экспресс-методики. Это быстрый способ подтвердить или исключить наличие болезни. Используется метод флюоресценции и ПЦР. Рассмотрим их подробнее.

Изучение флюоресцирующих антител - МФА. Способ основан на определении антигенов к вирусу в эпителиальных клетках носовой слизистой, на конъюнктиве (если есть глазные поражения). Антитела при действии антигена реагируют специфическим свечением, которое легко заметить при микроскопическом исследовании. Этот параметр считается маркером диагностики и является основой для подтверждения результата. Способ имеет диагностическую ценность начиная с 3 и заканчивая 5 днем заболевания. Чувствителен к таким антигенам: вирус гриппа типа А, В, вирус парагриппа, аденовирусы и возбудитель РС-инфекции. Это удобный и быстрый метод, не требующий особых ресурсов, который часто применяется в ходе диагностики.

Метод полимеразно-цепной реакции базируется на основе обнаружения участков нуклеиновых кислот генетического материала вируса и определении их групповой принадлежности по этому критерию. Методика имеет высокую диагностическую ценность, является современным и качественным способом подтверждения заболевания. Считается “золотым стандартом” диагностики, так как не дает ложных результатов и является специфическим для определения конкретных патогенов, широко применяется в стационарных и амбулаторных условиях.

Вирусологические методики основаны на чистом выделении вирусных микроорганизмов и их конкретных штаммов, за чем следует их прикрепление к клеточным культурам в лабораторных условиях. Далее следует определение вида вируса с помощью ПЦР или других реакций. Метод требует значительных ресурсов, довольно длительный и трудоемкий. Его ценность заключается в получении эпидемиологических данных и основе для научных работ. То есть, детальное изучение вируса, частоты его распространения позволяет прогнозировать эпидемическую картину, создавать вакцины. Для исследования берется мазок из носа и носоглотки. Материал пригоден в течении 3-5 дня заболевания. С помощью вирусологических методов можно определить такие возбудители:

Серологические методы диагностики - это ретроспективное исследование, которое дает точные данные относительно стадии процесса, степени активности и типа возбудителя. Используется для эпидемиологических целей.

Для анализа используется сыворотка крови, в которой необходимо определить количество и виды антител. Используется известный антиген вируса. При возникновении реакции с материалом пациента формируются иммунные комплексы антиген-антитело, что подтверждает диагноз. Для диагностики также важен прирост титра антител, для чего используются парные сыворотки.

Результат имеет высокую точность и может определиться даже если все другие методы не дали результата, так как имеет высокую чувствительность. особенно важно использование метода для стертых форм с минимальными клиническими проявлениями. Сыворотки для анализа берутся в начале болезни, а также через 10-14 дней после её завершения. Используется метод для подтверждения наличия в организме таких возбудителей: вирусы гриппа А, В, возбудители парагриппа, аденовирусы и РС-вирусы.

Наличие вируса гриппа можно подтвердить с помощью РТГА - реакции торможения геммааглютинации. Метод основан на свойстве снижения гемагглютинирующих способностях вируса, если в крови есть антитела к нему. Для этого используется кровь с эритроцитами, антиген. Препараты крови берутся парными, в начале болезни, и в период выздоровления. Метод имеет высокую диагностическую ценность, точный и чувствительный.

Виды исследуемого материала и особенности сдачи

Для диагностики используются смывы из носа, мазки из носовых ходов, носоглотки, а также препараты крови.

Забор мазка и смыва проводит медицинский персонал. Он следит за тем, чтобы препараты строго соответствовали должной локализации. Забор проходит в чистых условиях, стерильными инструментами и в стерильную тару. До того, как взять мазки пациента просят высморкаться, чтобы очистить носовые ходы от слизи. Зонд вводится легко, на глубину 2-3 см. Проводится стандартное движение по нижней части носового хода и под раковиной носа. Необходимо, чтобы забор происходит в современной клинике, где есть возможность правильно хранить и транспортировать собранный материал в короткий срок до лаборатории.

Мазок из глотки берется по похожей методике, чтобы затронуть те участки слизистой, на которой скапливается возбудитель. Перед забором необходимо легко прополоскать рот, чтобы взятый материал был чистым. Желательно забирать материал на 3-й день после начал болезни.

Нормы и отклонения от них, расшифровка результатов

Экспресс-тест дает результаты сразу после диагностики, его расшифровка не вызывает трудностей, так как определяет наличие вируса или его отсутствие в организме.

Серологические реакции более сложные и могут расшифровываться по разному: наличие антител класса М говорит об острой стадии процесса, антитела G формируются при хроническом течении.

Сроки готовности результатов

Результаты исследования готовы на 1-2 день после сдачи. Экспресс-тест дает результат сразу. Серологические методы требуют больше затрат времени для сравнения титров антител. Более быстрые методы важны для диагностического процесса, а те, что более затратны - для эпидемиологического и научного исследования.

Скорость диагностики зависит от правильности сдачи препаратов, условий лаборатории, качества реактивов.

Вовремя сданный анализ позволяет точно и быстро определить диагноз. Это - залог правильного и эффективного лечения. Если болезнь запустить, она грозит осложнениями, которые особенно опасны, если у человека грипп. Это актуально для детей, пожилых людей, беременных женщин и лиц с дефицитом иммунной системы, ведь осложнения чаще всего проявляются у них.

Лаборатория АО "СЗЦДМ" предлагает услуги, обеспечивающие комплексное и преемственное лабораторное обследование пациента

Диагностика В медицинских центрах АО "СЗЦДМ" проводят качественные диагностические исследования всего организма

Лечение Наши медицинские центры ориентированы на обслуживание пациентов в амбулаторном режиме и объединены единым подходом к обследованию и лечению пациентов.

Реабилитация Реабилитация - это действия, направленные на всестороннюю помощь больному человеку или инвалиду для достижения им максимально возможной полноценности, в том числе и социальной или экономической.

Выезд на дом Внимание! Действует акция "Выезд на дом - 0 рублей"

Профосмотры АО "СЗЦДМ" проводит профилактические осмотры работников, которые включают в себя - комплексы лечебных и профилактических мероприятий, проводимых для выявления отклонений в состоянии здоровья, профилактики развития и распространения заболеваний.

Многие вирусы могут очень долго присутствовать в организме и циркулировать в крови, до поры до времени не вызывая никаких неприятностей. Однако это вовсе не значит, что они безопасны. Лабораторные анализы на вирусы позволяют выявить наличие последних, даже если никаких симптомов нет.

Анализы на вирусы: какие инфекции они выявляют

Для выявления вирусов лаборатории проводят исследования крови несколькими методами. Наибольшее распространение на сегодня получили ПЦР и иммуноферментный (ИФА) анализы.

Иммуноферментный анализ крови определяет наличие антител к вирусам (или антигенов к ним) в крови — иммуноглобулины (lgA, lgG, lgM) вырабатываются при заражении вирусами и являются своеобразными маркёрами инфекции.

Анализ на ДНК вируса, или ПЦР-исследование, позволяет выявить тип инфицирующего агента.

В качестве биоматериала для исследования обычно берут кровь. Анализ крови может подтвердить гепатит, герпес и вирус Эпштейна-Барра, аденовирус, различные половые инфекции (в том числе и сифилис), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и другие инфекции. Однако кровь не единственный биоматериал, пригодный для выявления вирусных поражений. В зависимости от заболевания и симптомов, для анализа на вирусы сдают соскоб слизистой оболочки, кал, мочу, мазок, слюну.

Как мы уже отмечали, исследование крови на вирусы можно проводить двумя разными способами. Расскажем о них подробнее.

Иммуноферментный метод анализа на вирусы позволяет установить форму болезни, вызванной вирусом (хроническая, острая или бессимптомная), а также оценить эффективность противовирусной терапии. Это один из самых распространенных и точных методов для выявления половых инфекций, в частности ВИЧ и ВПЧ, гепатита В.

Для анализа на вирусы чаще всего сдается кровь. Обязательно предупредите врача, если вы недавно проводили вакцинацию, — этот факт может отразиться на точности анализов. Рекомендуется не принимать пищу на протяжении 8-ми часов перед забором биоматериала, а также воздержаться от употребления алкоголя и от курения.

Время ожидания результатов зависит от типа вируса, на который проводится анализ, и от методики работы лаборатории. Обычно результаты готовы через 1–3 дня, но иногда приходится ждать и 2 недели.

Рассказать о том, каким образом следует трактовать результаты анализов на все виды вирусов, в рамках одной статьи невозможно. Далее мы поговорим лишь о наиболее известных заболеваниях и о часто назначаемых исследованиях.

В случае проведения анализа методом ИФА наличие IgG в крови на гепатит говорит о том, что этот вирус в организме присутствовал, но иммунная система выработала к нему антитела. Присутствие одновременно антител класса IgM и IgG говорит о заболевании в острой форме. Иммуноглобулины только класса IgM — признак первичного инфицирования.

При проведении исследования методом ПЦР определяется РНК вируса. Результаты могут быть приведены в следующем формате:

• РНК вируса не выявлена.
• РНК вируса выявлена в концентрации ниже предела количественного определения (менее15 МЕ/мл). Сомнительный результат.
• РНК вируса гепатита С выявлена (от 15 и выше 100000000 МЕ/мл).

Для выявления этого вируса гепатита чаще всего назначается ИФА. Если в крови присутствуют антитела IgG и IgM, это значит, что вирус очень активен или же заражение произошло недавно.

В случае проведения ПЦР-анализа определяется концентрация фрагментов ДНК вируса гепатита В. Пациент получает результат с одной из приведенных трактовок:

• Не обнаружено.
• Сомнительный результат (результат положительный с концентрацией ДНК вируса гепатита В на границе точности метода).
• Обнаружено.

Если говорить о трактовке ИФА, то наличие антител, обозначаемых как Anti-HSV-IgG, говорит не об иммунитете к вирусу, а о том, что вы уже были когда-то инфицированы. Этот маркёр наблюдается у большинства пациентов. Если показатель anti-HSV-IgG в пробах, взятых в динамике за 2-недельный период, заметно растет, это значит, что заражение произошло недавно. О рецидиве говорит высокий показатель IgG.

Расшифровка анализа крови на ВИЧ очень проста — если результат отрицательный, это значит, что вирус не обнаружен, если положительный — увы, вирус в крови есть. Но следует знать, что сегодня даже самые надежные методы точны лишь на 98–99%, то есть всегда остается шанс, что результат будет, например, ложноположительным.

При анализе на аденовирус, вызывающий респираторные заболевания, применяется в основном ИФА. В ходе анализа подсчитываются IgG-антитела. Если показатель менее 0,8 условных единиц — результат отрицательный, более 0,8 — положительный.

Не пре­не­бре­гай­те про­фи­лак­ти­чес­ки­ми ана­ли­за­ми на ви­ру­сы. Ран­нее вы­яв­ле­ние ин­фек­ции по­зво­ля­ет от­сро­чить или по­да­вить раз­ви­тие за­бо­ле­ва­ния. В слу­чае же бе­ре­мен­нос­ти сда­ча био­ма­те­ри­а­ла на ана­лиз с целью вы­яв­ле­ния ви­рус­ных ин­фек­ций яв­ля­ет­ся обя­за­тель­ной про­це­ду­рой. По­во­дом для про­хож­де­ния ис­сле­до­ва­ния так­же мо­жет стать по­вы­шен­ный уро­вень лей­ко­ци­тов в кро­ви, сдвиг лей­ко­ци­тар­ной фор­му­лы, уве­ли­че­ние ко­ли­чест­ва нейтро­фи­лов (па­лоч­ко­ядер­ных), ми­е­ло­ци­тов и ме­та­ми­е­ло­ци­тов, сни­же­ние чис­ла лим­фо­ци­тов при вы­со­кой СОЭ в ре­зуль­та­тах кли­ни­чес­ко­го ана­ли­за кро­ви.

Россия готовится к тотальному тестированию, новые тест-системы позволяют быстро провести масштабную проверку на вирус. К массовому выпуску приступил один из разработчиков нового продукта, два других начинают производство. Олег Гусев, ведущий научный сотрудник Научно-клинического центра прецизионной и регенеративной медицины Казанского федерального университета и института физико-химических исследований RIKEN (Япония) помог РБК Тренды разобраться в том, как устроено тестирование на коронавирус в России и в мире.

Что предлагает ВОЗ

Глава Всемирной организации здравоохранения Тедрос Гебреисус еще в середине марта призвал страны проводить как можно больше тестов на вирус, который вызывает заболевание SARS-CoV-2, даже людям без симптомов. Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Как говорится в рекомендациях, на сегодня это самый точный и надежный метод диагностики вирусной инфекции. Он позволяет определить даже очень небольшое количество РНК вируса в биологическом материале человека. Это помогает выявить болезнь в инкубационном периоде.

Изобретенный в 1983 году метод и сейчас считается фундаментальным в молекулярной диагностике. Американский ученый, который придумал способ значительного увеличения малых концентраций фрагментов ДНК в биологической пробе, получил за него Нобелевскую премию. Выявление ДНК/РНК методом ПЦР позволяет диагностировать такие заболевания, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие. Метод используют в археологии, криминалистике, генетике.

Как работает ПЦР-тест

Для анализа из физиологических жидкостей извлекают одноцепочечную РНК, моделируют на ее основе двуцепочечную ДНК и многократно дублируют с помощью специального фермента (полимеразы). Увеличение числа копий ДНК называется амплификацией. В результате концентрация определенных фрагментов ДНК/РНК в биологическом образце, изначально минимальная, значительно увеличивается. При исследовании копируется только необходимый для теста участок ДНК. И, конечно, дублирование происходит только в том случае, если искомый участок вирусной ДНК или РНК присутствует в исследуемом биоматериале. В случае с коронавирусом мазок для анализа берут из ротоглотки или носоглотки, поскольку в крови или в кале вирус появляется на более продвинутой стадии болезни.

Тест-система EMG — продукт совместной разработки российских и японских разработчиков, проводившейся с 2016 года, рассказывает Олег Гусев. На данный момент эти тесты включены в систему обязательного медицинского страхования в Японии.

В ближайшее время планируется производить до 2,5 млн. тестов и 1 тыс. портативных лабораторий в неделю. Сами тесты, как и многие реагенты производятся в России. Планируется, что цена на тесты EMG будет в среднем в пять раз меньше, чем на стандартные ПЦР-тесты в Европе.

Российско-японские тесты основаны на методе изотермальной молекулярной диагностики SmartAmp, превосходящем метод ПЦР по скорости работы в восемь раз, а переносная лаборатория позволяет тестировать до 20 пациентов в час, говорит Гусев.

Ключевое отличие теста EMG в том, что многие тесты, которые производятся сейчас, это тесты ИФА (имунноферментный анализ), а не ПЦР. Данные системы определяют антитела, которые организм начинает вырабатывать не ранее, чем через неделю после заражения. Российско-японская разработка позволяет получать результат уже за 30 минут, с точностью, равной почти 100%. Кроме того, тест EMG позволяет определить наличие вируса уже на самых ранних стадиях, в то время как другие системы диагностики короновируса обладают меньшей чувствительностью и не могут выявлять вирус на ранней стадии инфицирования.

Принцип технологии российско-японского теста, по сути, не отличается от классической ПЦР — это наращивание количества целевых фрагментов ДНК и их детекция. Однако в изотермической амплификации, в отличие от классической ПЦР, где необходимы циклы нагрева и охлаждения, все происходит при одной температуре. Это позволяет многократно увеличивать скорость реакции. Метод SmartAmp был изобретен более 15 лет назад (как и LAMP — другая популярная технология изотермальной амплификации, предшествующая SmartAmp). Впервые для инфекционных заболеваний эту технологию применили в 2009 году для быстрого выявления пандемического гриппа (H1N1) в Японии.

Повторные тесты необходимы при любом методе. Отрицательный тест на COVID-19 не гарантирует, что человек не заразится этим вирусом на следующий день. Поэтому, например, в японских лабораториях персонал тестируют каждые несколько дней. Повторный тест нужен и для того, чтобы подтвердить, что человек излечился.

Эта тест-система будет использоваться для диагностики COVID-19 не только в России и Японии. 40 тыс. тестов закупила Австрия, поступили заказы из других стран Европы, Ближнего Востока, и Латинской Америки. Подана заявка в Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) для поставок в эту страну.

На данный момент в России прошли регистрацию еще три теста на коронавирус.

По некоторым данным, в Москве проводится около 700 тестов на коронавирус в сутки. В планах у московских властей увеличить этот показатель до 10 тыс. тестов в сутки, а затем довести его до 25—28 тыс. тестов ежедневно.

Новые разработки за рубежом

Компания Bosch выводит на рынок свой тест на коронавирус, который сначала будет доступен в Германии, а вскоре появится в других странах. В его основе лежит диагностический аппарат Vivalytic, который, по словам изготовителей, станет первым автоматизированным тестом на COVID-19. Тест распознает не только коронавирус, но еще шесть респираторных заболеваний, например, вирусы гриппа А и B. Во время лабораторных испытаний аппарата его точность составила 95%.

Как пишет издание ZME Science, анализ может проводиться прямо в стационаре или медицинском центре — не нужно отправлять образцы в лабораторию и ждать, пока придет ответ. Врачи смогут быстрее идентифицировать и изолировать зараженных, а пациентам не придется пребывать в неизвестности несколько дней. Тест прост в обслуживании и не требует специальной подготовки. Медперсоналу нужно только взять мазок из носа или горла пациента, нанести его на картридж, содержащий реагент, и вставить картридж в анализатор. Каждый аппарат может выполнять до десяти анализов за 24 часа.

Еще более оперативный тест на COVID-19 разработали в Великобритании. Он позволяет выявить COVID-19 всего за 30 минут. Чтобы провести его, достаточно портативного оборудования стоимостью около $120 и набора полосок для мазков из носа и горла по $5 каждая. Одновременно проходить тест могут до шести человек.

FDA в экстренном порядке одобрило сверхбыстрый тест на коронавирус, разработанный калифорнийской компанией Cepheid. С его помощью диагноз можно будет поставить всего за 45 минут. Как отмечает Business Insider, для обработки результатов теста не требуется специальное обучение. Нужен лишь доступ к системе Cepheid GeneXpert — в США их 5 тыс., а по всему миру — 23 тыс.

Начало тотального тестирования людей на COVID-19 во всем мире — хорошая новость как для людей, так и для национальных органов здравоохранения. До сих пор в мире нет четкого представления о том, сколько людей заражены коронавирусом и выявление тех, у кого он уже есть: их госпитализация или отправка на домашний карантин позволит быстрее оценить масштаб угрозы и вовремя принять правильные меры.

Хотите узнать больше о деятельности МАГАТЭ? Подпишитесь на нашу ежемесячную электронную рассылку, чтобы быть в курсе самых важных новостей, получать аудио- и видеоматериалы и многое другое.

Один из наиболее широко используемых и точных лабораторных методов выявления нового коронавируса — ОТ-ПЦР в реальном времени. (Фото: МАГАТЭ)

В связи с распространением по всему миру вируса, вызывающего инфекцию COVID-19, МАГАТЭ в партнерстве с Продовольственной и сельскохозяйственной организацией Объединенных Наций (ФАО) предлагает странам свою поддержку и экспертные знания, чтобы помочь им использовать один из наиболее точных лабораторных методов обнаружения, отслеживания и изучения коронавируса — полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР в реальном времени).

Но что такое ОТ-ПЦР в реальном времени? Как это работает? И как это связано с ядерными технологиями? Ниже мы представим общий обзор этого метода, расскажем о принципах его работы и кратко поговорим о вирусах и генетике.

Что такое ОТ-ПЦР в реальном времени?

ОТ-ПЦР в реальном времени — это основанный на ядерных технологиях метод выявления присутствия определенного генетического материала любого патогена, в том числе вируса. Первоначально для обнаружения искомого генетического материала использовались радиоактивные изотопные маркеры, но в результате последующего усовершенствования этого метода изотопные метки были заменены специальными маркерами, чаще всего флуоресцентными красителями. С помощью этого метода ученые могут увидеть результаты практически сразу, еще в процессе исследования; при применении обычной ОТ-ПЦР результаты доступны только после его завершения.

При том, что сейчас ОТ-ПЦР в реальном времени является наиболее широко используемым методом для выявления коронавирусов, многие страны все еще нуждаются в поддержке при внедрении и использовании этого метода.

Что такое вирус? Что такое генетический материал?

Вирус — это микроскопическая совокупность генетического материала, окруженного молекулярной оболочкой. Генетический материал может быть представлен либо ДНК, либо РНК.

ДНК — это состоящая из двух цепей молекула, которая встречается во всех организмах, таких как животные, растения и вирусы, и содержит генетический код или алгоритм того, как эти организмы строятся и развиваются.

РНК обычно представляет собой состоящую из одной цепи молекулу, которая копирует, транскрибирует и передает части генетического кода белкам, чтобы они могли синтезировать и выполнять функции, которые поддерживают жизнь и развитие организмов. Существуют различные типы РНК, которые выполняют копирование, транскрибирование и передачу.

Ученые амплифицируют определенную часть транскрибируемой вирусной ДНК в сотни тысяч раз. Амплификация важна, поскольку вместо того, чтобы пытаться найти ничтожное количество вируса среди миллионов цепей генетической информации, ученые имеют достаточно большое количество заданных участков вирусной ДНК, чтобы точно подтвердить, что вирус присутствует.

Как работает ОТ-ПЦР в реальном времени применительно к коронавирусу?

Из тех частей тела, где скапливается коронавирус, например из носа или горла человека, берется образец для проведения исследования. Образец обрабатывают несколькими химическими растворами, которые удаляют вещества, такие как белки и жиры, и извлекают только присутствующую в нем РНК. Эта извлеченная РНК представляет собой смесь собственного генетического материала человека и РНК коронавируса, если она присутствует в образце.

C помощью определенного фермента в реакции обратной транскрипции РНК превращают в ДНК. Затем ученые добавляют дополнительные короткие фрагменты ДНК, которые комплементарны определенным частям транскрибированной вирусной ДНК. Эти фрагменты прикрепляются к заданным участкам вирусной ДНК, если вирус присутствует в образце. Некоторые из добавленных генетических фрагментов предназначены для построения цепей ДНК во время амплификации, в то время как другие предназначены для построения ДНК и добавления к цепям маркерных меток, которые затем используются для выявления вируса.

После этого смесь помещается в прибор для проведения ОТ-ПЦР. Прибор выполняет циклы изменения температуры, во время которых смесь нагревается и охлаждается для того, чтобы запустить определенные химические реакции, которые создают новые точные копии заданных участков вирусной ДНК. Цикл многократно повторяется, чтобы продолжить копирование заданных участков вирусной ДНК. После каждого цикла происходит удвоение количества по сравнению с предыдущим: две копии превращаются в четыре, четыре — в восемь и так далее. Обычно при проведении ОТ-ПЦР в реальном времени выполняется 35 циклов; это означает, что к концу процесса из каждой цепи вируса, присутствующей в образце, создается около 35 миллиардов новых копий участков вирусной ДНК.

По мере того как создаются новые копии вирусных участков ДНК, маркерные метки прикрепляются к цепям ДНК, а затем высвобождают флуоресцентный краситель, уровень которого измеряется вычислительным устройством прибора с выводом показателя в режиме реального времени на экран. Вычислительное устройство отслеживает уровень флуоресцентного сигнала в образце после каждого цикла. Превышение этим показателем определенного уровня флуоресценции является подтверждением присутствия вируса. Ученые также смотрят, сколько циклов требуется для достижения этого уровня для того, чтобы оценить тяжесть инфекции: чем меньше циклов, тем тяжелее вирусная инфекция.

Зачем использовать ОТ-ПЦР?

Метод ОТ-ПЦР в реальном времени имеет высокую чувствительность и точность, с его помощью можно поставить надежный диагноз всего за три часа, при том, что лабораториям для этого обычно требуется в среднем от 6 до 8 часов. По сравнению с другими имеющимися методами изоляции вирусов ОТ-ПЦР в реальном времени значительно быстрее и имеет меньшую вероятность контаминации образца или ошибок, поскольку весь процесс может быть выполнен в одной закрытой пробирке. Это по-прежнему самый точный имеющийся метод для выявления коронавируса.

Поскольку вирусы присутствуют в теле только в течение определенного временного отрезка, ОТ-ПЦР в реальном времени нельзя использовать для выявления инфекций, появлявшихся в прошлом, что важно для понимания развития и распространения вирусов. Для выявления, отслеживания и изучения инфекций, появлявшихся в прошлом, особенно тех, которые могли развиваться и распространяться без симптомов, необходимо использовать другие методы.

МАГАТЭ в партнерстве с ФАО уже более 20 лет обучает специалистов во всем мире использованию метода ОТ-ПЦР в реальном времени и предоставляет им соответствующее оборудование, в частности через свою Сеть лабораторий ветеринарной диагностики VETLAB. В последнее время этот метод также используется для диагностики других заболеваний, таких как Эбола, Зика, MERS-Cov, SARS-Cov-1 и других серьезных зоонозных инфекций и болезней животных. Зоонозные инфекции — это болезни животных, которые также могут передаваться человеку.

Фоновое изображение: Realstock | Shutterstock.com

Что должен включать набор для выявления РНК коронавируса в образцах? Три компонента: реагенты для экстракции РНК, реагенты для обратной транскрипции, то есть перевода РНК в ДНК, и реагенты для ПЦР. Последний компонент состоит из ферментов, буфера и праймеров — олигонуклеотидов, комплементарных каким-либо последовательностям генома коронавируса.

Однако обычно тест-системы включают еще и внутренний контрольный образец — молекулу РНК, защищенную от действия нуклеаз, которую при анализе добавляют в образец на первой стадии — стадии выделения, чтобы она вместе с мишенью проходила все этапы лабораторного исследования и в конце дала свой собственный сигнал, который покажет, что на всех этапах все было хорошо.

У уже зарегистрированного набора ЦСП чувствительность как раз 10 3 в мазках со слизистой (так указано в инструкции к набору, которая имеется в распоряжении редакции). По нашей информации, примерно такой же чувствительности добиваются в разработке НИЦ им. Н.Ф. Гамалеи.

Чем плоха низкая чувствительность? Возможна ситуация, когда пациент явно инфицирован, но концентрация вируса в пробе у него ниже, чем 10 5 . В этом случае результат тестирования будет отрицательным. Тест не выявит начало заболевания, либо слишком рано будет принято решение о том, что выздоравливающий пациент больше не выделяет вирусы и не может никого инфицировать. А он ходит по улице, и он заразен. (По данным китайских исследователей, выделение вируса может продолжаться до 37 дней.)

С ложноотрицательными результатами теста разобрались. Теперь о ложноположительных срабатываниях, то есть о специфичности. Любой тест может показывать у некоторого числа здоровых людей заболевание. В спокойной обстановке в этом нет ничего страшного, поскольку можно десять раз перепроверить анализы у каждого пациента. Совсем другое дело — ситуация эпидемии. В этом случае диагностика опять выдает управленческим структурам недостоверную информацию о количестве инфицированных, принимается решение о проведении клинических и лечебных мероприятий в отношении пациентов, которые вообще не болеют. Ресурсы здравоохранения направляются на ложные цели.

Однако это вопрос про праймеры для реакции амплификации. Если праймеры специфичны именно к этому вирусу, то все хорошо, если же праймеры могут отжигаться на нецелевую мишень, то получим ложнопозитивный результат. К сожалению, саму последовательность праймеров многие разработчики — не все — держат в секрете, поэтому редакция не располагает информацией, на гены каких именно белков и на какие участки этих генов они созданы.

С другой стороны, ВОЗ пишет, что в настоящее время известно о циркуляции среди населения четырех сезонных коронавирусов (HCoV-229E, -OC43, -NL63 и -HKU1), которые, как правило, вызывают заболевания верхних дыхательных путей — от легких до средней тяжести. Поэтому испытания теста должны проводиться на как можно более широкой панели, чтобы отсечь ложные срабатывания. Желательно, чтобы образцы были от пациентов, либо в панель должны быть включены вирусы, генетически наиболее близкие этому коронавирусу и достаточно широко распространенные.

Сколько именно неспецифичных срабатываний дает тест, сказать нельзя, но из общих соображений эксперты называют цифру до 10%.

По тест-системам, разрабатываемым другими группами, у редакции достоверной информации нет.

Теперь самый болезненный для общества вопрос: какие структуры могут диагностировать коронавирус SARS-CoV-2 в России? И вопрос, который следует из первого: будут ли использованы разработки тех организаций, которые мы перечислили выше?

Что это значит? Это значит, что СанПин позволяет работать с вирусами из II группы методом ПЦР в условиях III–IV группы. Так, например, работают по всей стране с ВИЧ, который тоже отнесен ко II группе. В том случае, если опасный патоген не собираются наращивать в культуре или инфицировать им лабораторных животных, а исследуют его генетический материал, пробирку с образцом открывают в ламинарном шкафу и добавляют в нее вещество, разрушающее вирус (например, гуанидинизотиоцианат). После этого фактически речь идет не о вирусе, а о его белках, ДНК или РНК.

Тем не менее сейчас круг лабораторий, которые могут диагностировать инфекцию SARS-CoV-2, ограничен Роспотребнадзором.

Понятно, что если коммерческие лаборатории в России захотят проводить тестирование на SARS-CoV-2, то они смогут воспользоваться любой тест-системой, которая получит регистрационное удостоверение. Однако неясно, как в этом случае будет выстраиваться взаимодействие с системой Роспотребнадзора.

Отсутствие конкуренции — это рай?

Когда в мире произошла вспышка атипичной пневмонии, в 2003 году четыре организации в России разработали ПЦР-тесты на выявление возбудителя — коронавируса SARS-CoV. Роспотребнадзор издал приказ о сравнительных испытаниях. Был очень быстро получен вирус, и все разработчики могли испытывать на нем свои системы. Сравнительные испытания проводились в 48 ЦНИИ МО РФ, панели контрольных образцов были зашифрованы. Затем результаты всех тестов вскрыли и сравнили.

Довольно большая разница с тем, что происходит сейчас, не так ли?

Все наши источники сходятся в том, что нужно дать возможность работать с клиническим материалом и применять свои тест-системы и государственным и коммерческим игрокам этого рынка. Но сейчас в условиях распространяющейся эпидемии только структуры Роспотребнадзора (и то не все) имеют эксклюзивное право на получение всех федеральных денег по этой тематике на исследования, разработку вакцин и тестирование препаратов, диагностику всех инфекционных материалов в сети своих организаций.

Как мы написали выше, мы не получили ответа от Роспотребнадзора на наш официальный запрос на информацию. В таком же положении находятся все СМИ в стране. Но мы открыты к сотрудничеству и с удовольствием опубликуем ответы на наши вопросы. Предварительно проверив, разумеется.