Медленные вирусные инфекции человека и животных зуев в а

Виктор Моисеевич Ройхель, д. м. н., ведущий научный сотрудник
Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова РАМН.

Головной мозг человека, погибшего от болезни Крейтцфельдта-Якоба. Видны явные патоморфологические изменения: уменьшение объема и массы мозга, истончение извилин полушарий большого мозга, преимущественно лобных и теменных долей со значительным расширением борозд в этих областях. (В.А.Зуев, И.А.Завалишин, В.М.Ройхель, 1999.)

Горизонтальный срез головного мозга человека, умершего от спорадической формы болезни Крейтцфельдта-Якоба. Заболевание привело к сужению коры мозга в лобной, теменной, височной и затылочной долях, а также произошло некоторое уменьшение объема базальных ядер и таламуса и умеренное расширение желудочков мозга. (В.А.Зуев, И.А.Завалишин, В.М.Ройхель, 1999.)

Микрофотография губкообразных изменений в коре большого мозга, вызванных прионами (болезнь Крейтцфельдта-Якоба).

1- микровакуоли, 2 - погибающие нейроны с глиальными узелками, 3 - гипертрофия астроцитов, 4 - сморщенный нейрон, в котором уменьшились по объему цитоплазма и ядро, 5 - нейрон, в котором скопилось много липофусцина и произошло смещение ядра. Увел. ґ 400. (В.А.Зуев, И.А.Завалишин, В.М.Ройхель, 1999.)

Микрофотография конечной фазы губкообразных изменений в коре большого мозга: некоторые вакуоли слились и образовали более крупные полости, нейроны уже погибли. Увел. ґ 100.

Поскольку уже ни у кого не вызывает сомнений, что возбудителями ТГЭ могут быть только прионы, такие заболевания принято называть прионными [7]. Практический интерес к этим смертельно опасным инфекциям безусловно связан с событиями последнего времени и увеличивающейся вероятностью встречи с этими болезнями. Теоретический же интерес к проблеме обусловлен результатами молекулярно-биологических исследований прионов - новых и необычных возбудителей тяжелых заболеваний человека и животных, которые, как выяснилось, могут возникать не только в результате инфекции, но и спорадически и даже передаваться по наследству.

Структура прионных белков

Над выяснением структуры и химической природы возбудителей ТГЭ трудилось немало специалистов в течение, по крайней мере, полувека. В результате появилось большое количество разнообразных гипотез, многие из которых теперь имеют лишь историческое значение. Удача улыбнулась группе исследователей из Калифорнийского университета (США), работающих под руководством Прузинера. Главная их заслуга в том, что им удалось выяснить белковую природу прионов. Разработанная американскими учеными многоступенчатая система выделения исходного инфекционного материала позволила получить препараты, очищенные в 100-1000 раз. Агент оставался устойчивым к воздействию реагентов, инактивирующих нуклеиновые кислоты, что указывало на их отсутствие в его составе. Изучение очищенного препарата показало, что он обладает молекулярной массой около или меньше 50 кДа. В результате дальнейшей очистки приона выяснилось, что его основной компонент - мажорный белок с молекулярной массой 27-30 кДа, обозначаемый как РrР 27-30.

По физико-химической характеристике РrР 27-30 - сиалогликопротеин (олигосахаридсодержащий мембранный белок с остатками сиаловой кислоты, которые придают молекуле отрицательный заряд) и первый идентифицированный структурный компонент приона. Обнаружение РrР 27-30 на этапе развития инфекции, т.е. до появления патологических изменений в тканях, - свидетельство того, что этот белок не может быть вторичным продуктом патологической реакции. Так стало очевидным, что РrР 27-30 играет центральную роль в патогенезе заболевания.

При дальнейшем изучении прионов, выделенных из головного мозга зараженных скрепи животных, были обнаружены частицы в виде стержней диаметром 10-20 нм и длиной 100-200 нм. По ультраструктуре они напоминали амилоид (аномальный белок, который обычно образуется при хронических заболеваниях, например туберкулезе легких, костей и т.д.) и, видимо, представляли собой полимерную форму приона: каждый стержень содержал около тысячи молекул приона.

Важным шагом, имеющим как теоретическое, так и методическое значение, было получение антител при использовании в качестве антигена высокоочищенных прионов скрепи. В сыворотках кроликов, которым вводили РrР 27-30, обнаружены антитела не только к нему, но и к другим белкам, отличающимся более низкой молекулярной массой. Очевидно, эти белки либо обладают одинаковой антигенной детерминантой (областью антигена, комплементарной антителу) с РrР 27-30, либо они - продукт его расщепления. При помощи изготовленной антисыворотки с пероксидазной меткой удалось выявить локализацию прионов в определенных отделах головного мозга зараженных животных (табл.2). Согласно ранее полученным данным, структуры, связанные с меченой антисывороткой, обладали характеристикой амилоидных бляшек. Использование антисыворотки к синтетическому пептиду, соответствующему N-концевой части приона, позволило провести индикацию белка скрепи-ассоциированных фибрилл в головном мозге, селезенке и лимфатических узлах зараженных животных. При этом положительные результаты были получены на ранних этапах инкубационного периода.

Определение аминокислотной последовательности РrР 27-30 позволило в 1985 г. идентифицировать кодирующий его ген Prnp. Оказалось, что этот ген содержится в геномах не только инфицированных скрепи животных, но и здоровых. Соответственно мРНК для РrРС была выявлена в головном мозге и в других тканях как инфицированных, так и контрольных животных. Используя соответствующую антисыворотку, удалось показать, что в тканях незараженных животных содержится белок, родственный РrР 27-30, но отличающийся от него чувствительностью к обработке протеазой К.

Были изучены также некоторые другие характеристики прионов скрепи и болезни Крейтцфельдта-Якоба. В частности, было подтверждено предположение о том, что инфекционная частица агента содержит две молекулы РrР и что так называемые семейные формы (т.е. с наследственной предрасположенностью) прионных заболеваний связаны с конкретными мутациями в гене Prnp. Например, мутация, вызывающая замену пролина на лейцин в 102-м положении РrР, оказалась связана с развитием синдрома Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, а замена аспарагиновой кислоты на аспарагин (мутация в 178-м кодоне) может быть связана как с болезнью Крейтцфельдта-Якоба, так и со смертельной семейной бессонницей. К сегодняшнему дню известно уже о 20 мутациях в гене Prnp человека, связанных с семейными формами прионных заболеваний.

Во второй половине 90-х годов, когда уже была определена аминокислотная последовательность РrР и выявлен ген Prnp, начались интенсивные поиски причин патогенности прионов. С помощью современных методов молекулярно-генетического анализа были получены новые данные о возможных вариантах состава и конформации (укладки) полипептидной цепи РrР. В частности, было установлено, что конверсия нормального прионного белка в его инфекционную изоформу - посттрансляционный процесс [8]. Анализ вторичной структуры РrРSc показал, что этот переход характеризуется большими структурными изменениями самого приона. Клеточный белок содержит 42% a -спиралей и почти не содержит b -тяжей (всего около 3%), в то время как в его инфекционной форме выявляется 30% a-спиралей и 43% b -тяжей [9]. В экспериментальных исследованиях было подтверждено, что обработка неинфекционного белка реагентами, снижающими образование b -тяжей, также приводила к уменьшению инфекционности перерожденного приона. Одновременно снижалась и устойчивость РrРSc к действию протеазы К, чувствительность к которой считается маркером, отличающим РrРC от РrРSc.

Таким образом, в результате разносторонних исследований были получены и систематизированы имеющие принципиальное значение данные о структуре и физико-химических свойствах прионных белков. Анализ этих сведений создал необходимые предпосылки для дальнейшего углубленного изучения биологических особенностей прионных белков и механизма развития вызываемых ими заболеваний людей и животных.

Несмотря на обилие результатов в изучении прионных белков, роль PrPC в живом организме до конца не известна. Ясно одно – этот белок жизненно необходим и эволюционно консервативен, поскольку обнаружен у многих млекопитающих, птиц и даже у низших эвкариот. Так, при анализе первичной структуры РrРС было выявлено, что 80% последовательностей РrРС у разных видов животных идентичны, исключение составлял лишь куриный РrРС, где идентичность последовательностей по отношению к другим видам составляла всего 30%. Тем не менее 24 аминокислотные последовательности, располагающиеся между 112-м и 135-м аминокислотными остатками, содержатся в геномах всех млекопитающих, а также кур.

В последние годы появились данные, свидетельствующие о роли клеточного белка в регуляции сна, и более того - возникновение смертельной семейной бессонницы связывают с нарушением нормальной функции этого белка [12]. В исследованиях in vitro было показано, что PrPC вовлекается в процессы регуляции содержания внутриклеточного Са 2+ в нейронах [13]. Уже доказанным можно считать и значение нормального клеточного приона в сохранении резистентности нейронов и астроцитов к окислительному стрессу, и участие этого белка в метаболизме меди в головном мозге [14]. А совсем недавно были получены данные об участии PrPC в трансдукции сигналов в нервной ткани [15]. Этот список можно было бы продолжить, но и так ясно, что представления о биологической значимости PrPC в последние годы существенно расширились.

Теперь стало известно, что PrPC синтезируется в эндоплазматической сети и довольно быстро деградирует (всего за 5-6 часов). Синтезированный PrPC, проходя через аппарат Гольджи, транспортируется на поверхность клетки, где он связывается с гликофосфатидилинозитолом и в дальнейшем переносится вдоль аксона при помощи быстрого и активного (антероградного) транспорта. В отличие от PrPC инфекционный прионный белок первично аккумулируется в клетках, накапливаясь в цитоплазматических везикулах. Дальнейшее его накопление в синаптических структурах и связанная с этим дезорганизация синапсов, очевидно, становится причиной глубоких неврологических дефектов и деменции.

Получение новых данных позволило заключить, что прионные болезни - нейродегенеративные, в возникновении которых фундаментальную роль играют конформационные изменения прионов, а сам механизм развития болезни беспрецедентен.

1. Кемпбелл П.Н. // Вопр. биол., мед. и фармац. химии. 1998. №4. С.34-40.

2. Hill A., Debruslais M., Joiner M. et al. // Nature. 1997. V.389. P.448-450.

3. Calza L., Manfredi R., Chiodo F. // Recenti Prog. Med. 2001. V.92. P.140-149.

4. Sigurdsson P. // British Veterinary J. 1954. V.110. P.341-354.

5. Зуев В.А. Медленные вирусные инфекции человека и животных. М., 1988.

6. Prion Biology and Diseases / Ed. S.B.Prusiner. N.Y., 1999.

7. Зуев В.А., Завалишин И.А., Ройхель В.М. Прионные болезни человека и животных. М., 1999.

8. Pan K., Baldwin M., Nguyen J. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. V.90. P.10926-10966.

9. Smith C., Collinge J. // Essay Biochem. 1995. V.29. P.157-174.

10. Cohen F.E., Pan K.M., Huang Z. et al. // Science. 1994. V.264. P.530-531.

11. Jarrett J.T., Lansbury P.T. // Cell. 1993. V.73. P.1055-1058.

12. Tobler I., Deboer Т., Fisher M. // J. Neurosci. 1997. V.17. P.1869-1879.

13. Herms J., Tings Т., Dunker S. et al. // J. Neurobiol. Dis. 2001. V.8. P.324-330.

14. Brown D. // J. Brain Res. Bull. 2001. V.55. P.165-173.

15. Martins V., Mercadante A., Cabral A. et al. // Braz. J. Med. Biol. Res. 2001. V.34. P.585-595.

16. Ройхель В.М. Патогенез и диагностика некоторых медленных прионовых нейроинфекций: Автореферат на соискание ученой степени доктора медицинских наук. М., 1997.

17. Brown P. // J. Microsci Res. Tech. 2001. V.54. P.71-80.

• 
  

Вирусолог Виктор Абрамович Зуев

Фото: Светлана Мишина

— С точки зрения современной вирусологии, что такое вирусы — это жизнь или все-таки не-жизнь?

— Этот вопрос задавался на протяжении многих десятилетий, с тех пор как вирусы были открыты в 1892 году усилиями нашего соотечественника Дмитрия Ивановского. Сейчас вирус считается все-таки живым, это организм. Как ни крутите, вирус имеет способность наследовать свои свойства, имеет способность к изменчивости, имеет способность к штаммовой разновидности (то штамм вируса гриппа со свиным оттенком, то — с птичьим оттенком, уж мы-то с вами это хорошо знаем). Поэтому сейчас уже твердо считается, и никто с этим не спорит, что это существо, а не вещество. У него особый вид размножения, он облигатный паразит. Живет только в клетке — размножается ли он в ней или переживает (а такая ситуация даже чаще складывается), вирус использует только обменные процессы клетки, своего обмена у него нет. Репродукция вируса — процесс довольно сложный. Он останавливает клеточный метаболизм, переключает клетку на свой метаболизм, в котором начинается репликация нуклеиновых кислот в одном участке клетки, биосинтез белковых чехлов вируса — в другом участке, в третьем происходит сборка, и после этого клетка погибает и вирус выходит. Вот как он живет. Сейчас помимо инфекционных агентов вирусной природы открыты инфекционные агенты прионной природы.

— Что это такое?

— Вы сказали, что прионы открыли недавно. Почему так получилось, что раньше на них никто внимания не обращал?

— Не обращали внимания на ту патологию, которую они вызывают. Или обращали внимание, но никто не вникал в причины этого заболевания. Что такое прионные болезни? Они есть у человека, есть у животных. У человека это болезнь Крейтцфельдта-Якоба — редкое нейродегенеративное заболевание, которое встречается с частотой один случай на миллион человек в год. (Болезнь Крейтцфельдта-Якоба поначалу проявляется в виде кратких потерь памяти, изменений настроения, потери интереса к происходящему вокруг. Больной постепенно перестает справляться и с текущими делами, связанными с повседневной жизнью. В конечной фазе наблюдаются расстройство зрения, галлюцинации и расстройство речи (особенная медленная речь), затем глобально выраженные когнитивные нарушения и смерть. — РР). У нас в России примерно 140 млн человек. Каждый год у нас должно объявляться 140 человек с этим заболеванием. Эти заболевания имеют место быть, конечно. Но у нас они почему-то не регистрируются.

Прионных заболеваний вообще немало. Есть различные синдромы — синдром Герстмана-Штраусслера-Шейнкера, например. В 1986 году итальянцы открыли еще одну болезнь — семейную смертельную бессонницу. (Человек начинает страдать от все более тяжелых бессонниц, сопровождающихся паническими атаками, фобиями, позже — галлюцинациями и потерей веса. На последней стадии заболевания человек перестает реагировать на окружающих и в конце концов умирает. Болезнь имеет наследственную природу, выявлено только 40 семей, в которых встречается мутантный ген. В результате мутации в гене нормального прионного белка этот белок превращается в свою изоформу — патогенный прион. Под действием приона другие нормальные белковые молекулы тоже превращаются в прионы. Это приводит к накоплению амилоидных бляшек в таламусе — отделе мозга, отвечающем за сон. — РР). Они обнаружили это заболевание у людей, у которых синтез нормального прионного белка или резко падает, или вообще прекращается, и они погибают.

— Если прионные инфекции так сложно обнаружить, то как они были открыты?

— Интерес к этим заболеваниям возник после открытия медленных инфекций, которое состоялось в 1954 году. В то время исландский исследователь Бьёрн Сигурдсон занимался болезнями овец каракулевых пород, которых из Германии привезли в Исландию. На остров — эпидемиологически это очень показательно. Спустя несколько лет — не дней, не месяцев, а лет — в различных участках, на различных фермах этого острова у овец начались заболевания, носящие массовый характер. Сигурдсон просиживал над микроскопом буквально дни и ночи и никак не мог понять, в чем дело. Потому что болезни были очень разные по симптоматике. В одних случаях это было поражение центральной нервной системы — головного или спинного мозга, в других случаях это была одышка, какая-то необычная атипичная пневмония. Но он был настойчив, во-первых, и, во-вторых, достаточно умен. И он увидел: несмотря на то что болезни все разные, у них есть четыре одинаковых свойства. Какие? Инкубационный период — годы. Это была неслыханная вещь. Второе — медленный характер процесса. Но уж если он начался, то его уже не остановишь. Третье — необычность поражения органов и тканей. Представляете, в головном мозге гибнут нейроны и разрастается соединительная ткань мозга — дырки в голове образуются, о которых мы любим шутить. С чего? И четвертый признак, самый печальный: они все абсолютно смертельны. Ни одно животное, ни один человек с медленной инфекцией не выжил.

— Какие человеческие вирусы обладают способностью формировать механизм медленной инфекции?

— Как это произошло?

— Мышка, выжившая после заражения гриппом, то есть после перенесения легкой формы гриппа, содержит в себе вирус в течение трех месяцев. И вот эти мыши, вирусоносительницы, вдруг начали у нас рожать. А у нас как раз прошли лекции Гайдушека и его фильмы: он снял два фильма — куру у человека и куру у обезьян. Привез к нам в институт и показывал на двух экранах — эффект был ошеломляющий. Так что медленные инфекции у нас висели в воздухе. И я как-то интуитивно сказал тогда сотруднице: сохрани только потомство. Родились мышата. Через три недели мы видим, как некоторые из них начинают отставать в массе тела и росте, по сравнению с остальными — карлики просто. В три месяца все они умерли — как оказалось, от врожденной гриппозной инфекции. У мышей, как у людей, инкубационный период при гриппе от нескольких часов до трех дней, а тут выходит не три дня — три недели.

Если они живут всего два года, три недели в пересчете на наш возраст — это много лет. Затем — медленное протекание процесса. Обычный грипп проходит за неделю, а тут в течение трех месяцев все хуже и хуже. Далее — необычность поражения органов и тканей, где воспаление? У меня работала доктор наук, крупный патанатом, известная в Москве. И вот она посмотрела, что у этих мышей внутри делалось — у них не было воспаления. Не было характерной для вируса гриппа реакции. Вирус гриппа — это что? Слезы, слюни, сопли. Воспаление слизистых оболочек. В горле, в бронхах — неважно, слизистая оболочка воспаляется. Ничего этого не было у мышат, которые получили вирус гриппа в ходе внутриутробного развития. У них был первичный дегенеративный процесс, то есть ткани распадались везде. Нервная ткань — вообще, казалось бы, для вируса гриппа чужеродная ткань. Так вот в головном мозге у них развивалась губкообразная энцефалопатия, как при всех типичных прионных инфекциях. И, наконец, четвертое — они все были смертники. Ни один не выжил. Медленная гриппозная инфекция — за это мы получили диплом на открытие еще в советское время.

— И с человеком такое может произойти?

(В данное время не исключается возможность длительной персистенции вируса гриппа в ЦНС человека по типу медленной инфекции с развитием впоследствии такого патологического состояния, как паркинсонизм. Это изменяет представление о гриппе как только об острой инфекции. Установлено, что в 50% случаев антиген вируса гриппа сохраняется в периферических лимфоидных клетках и в крови до 120–200 и более дней. — РР).

— Они там прячутся от иммунной системы?

Похожие данные публиковали другие специалисты, занимавшиеся прионными болезнями. Но дальше констатации фактов дело не шло. Всех интересовали связи или намеки на связи с другими нервными, точнее сказать, неврологическими, заболеваниями неясной этиологии. Рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона — интересовала связь в эту сторону, а что касается нормальной ситуации, нормального старения, то как-то об этом никто и не думал. А меня это заинтересовало.

— И вам удалось найти связь со старением?

— Когда я увидел, что и там и сям два одинаковых процесса, и когда я стал выяснять, какие вообще показатели старения, то оказалась вообще феноменальная штука: для того чтобы определить биологический возраст, нет одного признака. Их порядка трехсот. И среди них такой смешной — хорошо, что вы сидите, а то упали бы от хохота — время стояния на одной ноге. Можете себе представить такое? Но мы же все разные. У одного к концу жизни розовые щеки, прямо смотреть приятно. Другой, как говорится, полная развалина. Но стареют все, и этим процесс старения уникален. Этот процесс — он абсолютный, он очень надежный. А что такое надежный процесс? Простой. А в организме, если говорить о простоте, не впадая в простоватость, простой — это значит немногоступенчатый.

Есть два кардинальных признака старения. Это гибель нейронов и пролиферация глии. В этом старение схоже с медленной инфекцией. Но болезнь — это одно, а физиологический процесс — это другое. С какой радости вдруг начнут гибнуть нервные клетки у внешне здорового человека? Нервная клетка у нас защищена так, как никакая другая. У нас все клетки нашего организма питаются кровью путем плотного прилегания к кровеносным капиллярам. А нервная клетка не прилегает к мозговому капилляру, между ними есть посредник — звездчатая клетка. Это и есть морфологическое выражение гематоэнцефалического барьера (так называется физиологический барьер между кровеносной и центральной нервной системой. Главная функция гематоэнцефалического барьера — поддержание гомеостаза мозга, защита нервной ткани от токсинов и микроорганизмов, клеточных и гуморальных факторов иммунной системы, которые воспринимают ткань мозга как чужеродную. ГЭБ выполняет функцию высокоселективного фильтра, через который из кровеносного русла в мозг поступают питательные вещества, а в обратном направлении выводятся продукты жизнедеятельности нервной ткани. — РР). Известно, что эта связь очень хрупкая. И если вдруг представить себе, что в замкнутом пространстве, в головном мозге, вдруг появляется много-много новых клеток, то связь нервной клетки (нейрона с мозговым капилляром) может нарушиться. В этом случае неравная клетка оказывается обречена на голодную смерть. Но надо еще найти причину размножения этой глии, не может же все быть просто так. Значит, должен быть какой-то фактор, который эту пролиферацию вызывает. И мы нашли этот фактор.

Я большой сторонник простых аргументов, простых шагов, простых подходов. Простых доказательств. Потому что, когда просят что-то домыслить, а что-то такое допустить, вы начинаете просто путаться в этой системе доказательств. Мы получили взвесь клеток глии, разделили ее на три части, поместили в питательную среду. В первую часть мы ничего не добавили, во вторую добавили экстракт мозга молодых мышей. А в третью группу клеток мы добавили экстракт мозга старых мышей. И оказалось, что там, где мы добавили экстракт молодого мозга, рост числа клеток был такой, как в контроле, то есть ничто, кроме питательной среды, размножаться клеткам не помогает. Их количество даже не удвоилось за две недели. А там, где мы добавили экстракт старого мозга, число клеток учетверилось! Значит, в старом мозге есть то, чего нет в молодом, то, что подталкивает глиальные клетки к размножению. Когда мы исследовали мозговые экстракты мышей разных возрастов, оказалось, что это вещество, вот этот подталкивающий эффект, наблюдается примерно с 10 месяцев. Это конец первой трети средней продолжительности мышиной жизни. У человека этому возрасту соответствует 25 лет. И тогда мы провели опыт искусственного старения. Мы взяли молодых мышей и ввели им экстракт старого мозга. Получили быстрое старение этих мышей, быстрое накопление у них глии и быструю гибель нейронов, причем сокрушительно быструю. Значительно более выраженную, чем у двухлетних мышей.

— И что это оказался за фактор?

— Очень маленький белок весом 10 кДа. Значительно меньше, чем прионный белок. Когда мы обнаружили его у мышей в крови, обратились к исследованию людей. Стали проверять кровь людей разных возрастов, начиная с 10 лет. И оказалось, что фактор начинает накапливаться с 25-летнего возраста. Что такое 25 лет? Это то же самое, что у мышей 10-месячный возраст, то есть конец первой трети средней продолжительности жизни. А почему 25? Очень просто. К 25 годам мы перестаем с вами расти. У нас кончается программа роста и включается программа старения.

— А белок удалось выделить?