Лаборатория биохимии вирусных рнк

АТАБЕКОВ Иосиф Григорьевич

Род. 07.12.1934 г. в г. Тбилиси. Учился в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева (1951–1955) и окончил Всесоюзный с.-х. институт заочного образования (1956). Доктор биологических наук (1971), профессор (1973), академик ВАСХНИЛ (1983), академик РАН (1992). Крупный ученый в области молекулярной биологии. Работал во ВНИИ фитопатологии (1956–1965), с 1965 г. — зав. отделом биохимии вирусов растений лаборатории биоорганической химии МГУ им. М.В. Ломоносова (ныне Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского). С 1971 г. — зав. кафедрой вирусологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Является основателем молекулярной фитовирусологии. Научные исследования посвящены изучению структуры вирусного генома и механизмов его выражения в зараженной клетке; механизмов, контролирующих устойчивость растений к вирусам; негенетических взаимодействий между вирусами; процессов самосборки вирусных структур in vivo и vitro; прикладным аспектам фитовирусологии и иммунохимии. Предложена и экспериментально обоснована концепция межклеточного транспорта вирусов из зараженных клеток в здоровые как активной ( кодируемой вирусом ) функции. Разработана технология конструирования растений, устойчивых к вирусной инфекции и получен первый патент в РФ на трансгенные растения ( картофеля, устойчивого к вирусу Y ). Разработаны высокочувствительные методы массовой диагностики вирусов и вироидов, применяемые в системе безвирусного семеноводства Российской Федерации.

Лит.: Молекулярная биология вирусов / соавт.: В.И. Агол и др. — М.: Наука, 1971. — 493 с.

Реализация генетической информации вирусных РНК. — М.: Наука, 1972. — 299 с.

Новый экспрессный метод иммуноферментного анализа для диагностики растительных вирусов с использованием водорастворимых полиэлектролитов / соавт.: Н.К. Гапонова и др. // Новые методы биотехнологии растений. Пущино, 1993. С. 75.

Практикум по общей вирусологии: учеб. пособие для студентов вузов, обучающихся по биол. спец. / соавт.: А.А.Аграновский и др. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Изд-во МГУ, 2002. - 182 с.

Роль С- и N-концевых мутаций транспортного белка (ТБ) вируса табачной мозаики в активации нетранслируемых in vitro комплексов ТБ с вирусной РНК / соавт.: О.В. Карпова и др. // Докл. АН / РАН. 2004. Т.397, № 3. С. 408-411.

Новый вирус-вектор для эффективной продукции целевых белков в растениях / соавт.: Т.В. Комарова и др. // Биохимия. 2006. Т.71, № 8. С.1043-1049.

Высокочувствительные технологии молекулярной диагностики вирусных и вироидной инфекций картофеля / соавт.: Ю.Ф. Дрыгин и др. // Достижения науки и тнхники АПК. 2007. № 7. С.20-24.

Высокоэффективная экспрессия В-субъединицы термолабильного энтеротоксина Escherichia coli в растениях с помощью вируса-вектора на основе генома Х-вируса картофеля / соавт.: Н.В. Равин и др. // Биохимия. 2008. Т.73, № 10. С. 1382-1389.

Неспецифическая активация трансляции инкапсидированной РНК потексвирусов с участием транспортного белка ТБП Х-вируса картофеля / соавт.: А.А. Мухамеджанова и др. // Докл. АН / РАН. 2009. Т.428, № 2. С.266-268.

Взамодействие вируса шарки сливы с антителами, конъюгированными с коллоидным золотом, и разработка иммунохроматографической тест-системы для детекции вируса / соавт.: Н.А. Бызова и др. // Биохимия. 2010. Т.75, № 11. С. 1583-1595.

Новый способ получения биологически активных нанокомплексов путем нековалентной коньюгации белков с вирусными частицами / соавт.: А.А. Ярославов и др. // Биоорган. химия. 2011. Т.37, № 4. С. 496-503.

Испытания отечественных иммунохроматографических тест-полосок для экспресс-диагностики вируса шарки сливы / соавт.: С.Н. Чирков и др. // С.-х. биология. 2012. № 1. С. 110-116.

Еще десять лет назад расшифровка человеческого генома была сложной и дорогой процедурой. Но за последние годы в биотехнологиях не раз происходил качественный прорыв по считыванию "живой" информации. Благодаря же методу, разработанному под руководством члена-корреспондента РАН, доктора биологических наук Александра Борисовича Четверина в лаборатории биохимии вирусных РНК Института белка РАН (г. Пущино), определение нуклеотидной последовательности в самой главной молекуле может стать общедоступной медицинской процедурой.

Чтобы суть нового метода была более понятной, напомним, как проходит полимеразная цепная реакция (ПЦР), необходимая для клонирования генов или любых других участков ДНК. Выбранный фрагмент, который требуется размножить, обычно состоит из нескольких сот нуклеотидов. Главное, чтобы в рабочей матрице содержалась интересующая нас последовательность. При нагревании двухцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота разделяется на отдельные комплементарные (дополнительные) друг другу цепочки. Чтобы запустить реакцию их удвоения, помимо нуклеотидов в растворе должны присутствовать так называемые праймеры, содержащие 20-30 оснований, комплементарных некоторым кусочкам ДНК. Они играют роль своеобразных абзацев в длинном тексте и нужны, чтобы избирательно выделить из раствора только нужные нам "тексты" и присоединиться к ним. Для клонирования гена синтезируют праймеры, "стыкующиеся" с его граничными участками. Затем присутствующий в смеси фермент ДНК-полимераза удлиняет праймеры, добавляя к ним поочередно одномерные нуклеотиды. Фермент выделяют из микроорганизмов и "заставляют" его проделывать ту же работу, что и в живой клетке. Задаются лишь другие начальные условия.

После того как праймеры достраиваются до нужной длины (или больше, что вполне допустимо), раствор снова нагревают. Только что созданные новые двухцепочечные ДНК снова распадаются на отдельные цепочки. К ним опять присоединяются праймеры, и весь процесс повторяется. В каждом цикле происходит увеличение числа фрагментов ДНК в два раза. Через десять циклов их будет тысяча, через 20 - уже миллион. На это уходит от 30 минут до нескольких часов - в зависимости от того, какой длины фрагмент размножают.

Подобные реакции происходят и в живых организмах. Перед делением клетки сначала удваивается ее геном, чтобы каждая его копия оказалась в дочерних клетках. Когда новые клетки вырастают, геном снова удваивается и т.д. Важную роль здесь играет фермент полимераза, функция которого - достраивать комплементарную цепочку ДНК. Специалисты научились использовать фермент вне клетки для конструирования аналогичного процесса таким образом, чтобы он происходил непрерывно по экспоненциальному закону.

ПЦР и другие аналогичные реакции традиционно проводят в растворе. При этом синтезированные копии фрагментов матричных молекул (т.е. ДНК или РНК) перемещаются по всему объему. В результате очень трудно определить, сколько же было исходных матриц. В технологии, разработанной сотрудниками лаборатории биохимии вирусных РНК Института белка РАН под руководством члена-корреспондента РАН А.Б. Четверина, используется оригинальный метод молекулярных наноколоний. Такие колонии выращивают в иммобилизованной среде, которая представляет собой гель с нанометровыми порами.

Гель можно сравнить с трехмерной сетью-паутиной, погруженной в воду. Это сочетание твердых волокон и жидкости. Размеры ячеек примерно совпадают с размерами крупных молекул. Более мелкие частицы, такие как нуклеотиды, свободно проходят сквозь сеть, а длинные цепочки в ней застревают. Получается, что большие органические молекулы как бы заключены в клетки. Если запустить какую-нибудь полимеразную цепную реакцию, то полученные копии исходной молекулы останутся в том же самом месте. Как результат, вокруг каждой ячейки вырастает целая колония одинаковых фрагментов ДНК (или РНК). Т.е. при размножении в геле можно получить колонию чистых генов без каких-либо примесей. Причем теснота ячеек не препятствует размножению, т.к. не мешает отдельным нуклеотидам достраиваться к кусочку ДНК, но при этом не дает полученным длинным фрагментам перемещаться. Метод наноколоний позволяет решить основную проблему ПЦР и других аналогичных реакций - проблему фона.

В качестве примера рассмотрим вирус СПИДа. ПЦР часто используют для обнаружения его РНК в крови донора, чтобы определить, можно ли переливать ее другим людям. Важно уметь обнаруживать даже одиночные копии вируса. Но при ПЦР возникают и некоторые проблемы. Предположим, что в капле крови присутствует только одна (или очень мало) молекула вирусной РНК. Кроме нее там содержатся триллионы других матричных молекул. Комплементарность нуклеотидной последовательности - вещь относительная в том смысле, что иногда, хотя и редко, может давать сбои. В результате реакции помимо нужного нам фрагмента случайным образом может размножиться и что-то другое. В принципе, все полученные фрагменты можно идентифицировать,выясняя тем самым, какая именно РНК или ДНК размножилась. Для этого используют комплементарные олигонуклеотиды-зонды (как и праймеры, состоящие из 20-30 нуклеотидов), меченные флуоресцентной группой. И по наблюдению флуоресценции можно узнать, что размножился нужный фрагмент. Это дополнительная проверка полученного результата. Но когда происходит конкурирующий синтез, он не позволяет размножиться нужным фрагментам в достаточном количестве. В результате их невозможно увидеть на фоне других более многочисленных молекул. Поэтому, несмотря на все достоинства ПЦР, обнаружить единичные матричные молекулы не удается.

Если же проводить ПЦР в геле, то можно обнаружить даже одиночную молекулу вирусной РНК. В этом случае на ее основе будет построена колония в одной из ячеек сетки, в остальных же ячейках могут образоваться скопления других матричных молекул. Таких неспецифичных колоний может появиться очень много, однако это не мешает обнаружить вирус, т.к. продукты не перемешаны. Помимо ПЦР известно около десятка аналогичных процедур, работающих по схожему принципу либо для ДНК, либо для РНК. Их все можно проводить в геле и при этом вырастить столько колоний, сколько было в исходном образце (скажем, капле крови) матричных молекул. А обнаружить колонию, состоящую из миллионов молекул, не представляет труда.

Другой пример. При онкологических заболеваниях происходит активация определенных генов, которые "спят" в обычных клетках. В результате на каждом "проснувшемся" гене сначала синтезируется РНК, а потом белок. Сейчас на основе нового метода составляется список РНК, которые могли бы быть маркерами на ранних стадиях развития онкологического заболевания. И поскольку метод чрезвычайно точен, то даже по одной молекуле РНК, находящейся в крови пациента, можно будет обнаружить заболевание на самой ранней стадии, когда все остальные традиционные методы ничего не покажут - и, что самое важное, до появления метастазов. В этом случае можно будет провести терапию и избирательно уничтожить злокачественные клетки.

А вот с белками подобные процедуры проводить можно только при помощи модернизированного метода наноколоний. ДНК разрезают на две части и к обеим половинкам пришивают по одному антителу. Антитела имеют способность специфически связываться с определенным белком, тем самым создавая на нем "метку". Соединившись с одним и тем же белком, антитела сближают две половинки ДНК. Благодаря добавлению в раствор фермента лигазы концы этих половинок сшиваются. Очевидно, что вероятность такого процесса гораздо выше, если они прежде были соединены с белком, а не просто плавали в растворе. Этот способ был реализован с помощью стандартной ПЦР и позволяет обнаружить не менее сотни молекул белка. Используя ту же реакцию в геле, можно обнаружить единичное соединение.

В модернизированном виде метод наноколоний подходит для распознавания любых отдельных молекул, в том числе наркотиков и допинга. Необходимое условие - сложная поверхность соединения для связывания с двумя разными антителами. Точность метода очень высокая - можно зарегистрировать одиночную молекулу.

Новая технология значительно расширяет возможности различных научных исследований. Например, исследуется химическая реакция с участием сложных органических молекул. Известны начальное и конечное состояния. А какие процессы происходят "посередине"? Во время реакции может возникнуть несколько промежуточных соединений, которые присутствуют в очень малом количестве и живут тысячные доли секунды, поэтому их чрезвычайно трудно изучать. С помощью новой технологии можно зарегистрировать даже отдельные органические молекулы, появляющиеся в течение реакции лишь на короткое время.

Как же родилась эта довольно простая идея? Все началось с исследования Qβ-репликазы. Этот вирусный белок-фермент представляет собой полимеразу, но размножает не ДНК, а РНК: строит на нуклеотидной матрице комплементарную копию, добавляя отдельные элементы. Такую технологию используют как одну из альтернативных ПЦР для исследования РНК. При этом появилось подозрение, что Qβ-репликаза обладает странным свойством - вызывает так называемый спонтанный синтез различных РНК: молекулы рибонуклеиновой кислоты образуются не по исходной матрице, а в результате безматричного соединения различных отдельных нуклеотидов. Чтобы это проверить, выделили чистый белок-фермент, без РНК, добавили нуклеотиды, выдержали полученную смесь в течение часа. А когда стали исследовать жидкость с помощью электрофореза, обнаружили в ней довольно большое количество сложных молекул РНК неизвестного происхождения.

Немецкий ученый, нобелевский лауреат по химии Манфред Эйген (Manfred Eigen) высказал гипотезу о самопроизвольном зарождении сложных матричных молекул, которую поддержали многие ученые. Если бы спонтанный синтез РНК подтвердился, то произошел бы переворот в нашем понимании происхождения жизни. Это означало бы, что для возникновения сложных информационных молекул требуются не миллиарды лет, а часы или даже минуты. Однако в этой гипотезе засомневались пущинские исследователи. Сначала они обнаружили, что синтезированные молекулы не случайны: длинный кусок одной из них совпадал с матричной РНК кишечной палочки, внутри которой размножался исследуемый вирус, а другой, еще более длинный, совпадал с частью вирусного генома. Итак, происхождение различных молекул РНК было не спонтанно, а как-то связано с имеющимися матричными молекулами. Сотрудники лаборатории биохимии вирусных РНК Института белка РАН опирались на известное доказательство Луи Пастера о невозможности самозарождения жизни на уровне микроорганизмов.

В XIX в. многие ученые полагали, что простейшие живые существа могут самопроизвольно зарождаться в питательной среде. Их легко можно было обнаружить в прокипяченном мясном бульоне через несколько часов после того, как он остыл. Но Луи Пастер сконструировал специальный сосуд, чтобы микробы не могли попасть в него из воздуха. В этом случае остывшая питательная среда оставалась стерильной длительное время. Стало ясно, что бактерии не возникают спонтанно, а попадают в бульон из воздуха, а затем быстро размножаются в нем.

Сотрудники лаборатории решили повторить опыт Пастера, модернизировав его для данного случая. Ученые взяли две одинаковые чашки с растворами одиночных нуклеотидов и поместили в них Qβ-репликазу. При этом одну чашку оставили открытой, чтобы в нее могли попадать из воздуха матричные молекулы естественного происхождения, а другую закрытой, уменьшив таким образом количество залетающих снаружи молекул РНК до минимума.

Но как подсчитать общее число построенных ферментом разных молекул? Руководителю лаборатории А.Б. Четверину пришла в голову оригинальная мысль: проводить реакции не в водном растворе, как обычно, а в геле, в котором размеры пор примерно совпадают с размерами крупных органических молекул. В такой среде отдельные нуклеотиды будут двигаться относительно свободно, а большие РНК-молекулы - оставаться на одном месте. Если фермент не сам строит длинные молекулы, а использует уже готовые матрицы, то в тех местах геля, где случайно оказались молекулы РНК, образуются колонии их копий. В закрытой чашке таких колоний будет намного меньше, чем в открытой. Именно это и наблюдали исследователи в проведенном эксперименте, доказав тем самым, что никакого спонтанного появления сложных органических молекул не происходит.

Когда работа была закончена, стало ясно, что ученые провели не просто интересный эксперимент, проясняющий причину самопроизвольного синтеза РНК, а придумали принципиально новый метод диагностики. С его помощью можно обнаружить отдельные органические молекулы, если поместить их в гель и вырастить из них наноколонии.

Метод наноколоний можно использовать не только для диагностики, но и для секвенирования - чтения генома. В этом случае в капле исследуемой жидкости растворяют сотни различных фрагментов ДНК, взятых из одного генома. Для чтения используют флуоресцентные нуклеотиды, модифицированные так, что, соединившись с матричной молекулой, они блокируют ее дальнейший рост. Все четыре вида нуклеотидов при этом окрашивают в разные цвета. После каждого цикла каплю жидкости рассматривают под микроскопом и определяют, в какой цвет окрашена каждая колония. Затем флуоресцентные и блокирующие группы убирают и запускают следующий цикл. В результате можно одновременно проводить секвенирование тысячи генов.

Скорость чтения генома с использованием нового метода возрастает в сотни раз, а цена, соответственно, падает. Американская компания Applied Biosystems приобрела у Института белка лицензию на использование наноколоний в геле для секвенирования нуклеотидных последовательностей. В ближайшее время благодаря использованию нового метода любой желающий сможет получить полную информацию о своей наследственности, узнать, в каких генах у него "сбои", и каких болезней ему следует опасаться. Применение нового метода ускорит расшифровку ДНК различных живых организмов. А это, в свою очередь, поможет понять на генетическом уровне эволюцию животного и растительного миров: какие виды образовались раньше, какие позже, есть ли скрытые родственные связи между различными группами. Т.е. метод наноколоний - мощный инструмент не только для прикладных, но и для фундаментальных научных исследований.

Читайте также:

• Что такое химерный вирус
• Как действует гроприносин на вирусы
• Вирус у кроликов красные глаза и уши
• Как быстро вылечить вирусную кишечную инфекцию у ребенка
• Внутри человеческого тела bbc грипп

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.