Культивирование вирусов в ветеринарии

При изучении темы необходимо обратить внимание на то, что для репродукции вирусов нужна живая клетка, поэтому используют три основные модели: культуру клеток, организм чувствительных животных, ткани развивающихся эмбрионов птиц. Для успешного культивирования вирусов в лабораторных условиях необходимо освоить эти методы.

Культивирование вирусов в организме естественно-восприимчивых животных.

Данный метод имеет ограниченное применение; он используется в случаях, когда для изучаемого вируса нет биологической системы, на которой данный вирус успешно бы репродуцировался, минуя стадию адаптации, и когда есть заинтересованность сократить у выделенного вируса все исходные свойства (преимущественно патогенность и антигенные свойства).

Культивирование вирусов в организме лабораторных животных.

Многие виды лабораторных животных часто невосприимчивы в естественных условиях к определенному вирусу, однако при серийном пассировании и последующей адаптации он изменяет свои первоначальные свойства впроцессе репродукции в организме лабораторного животного. Этот метод до сих пор широко используется при диагностике и изучении ряда заболеванийживотных и человека, вызванных вирусами.

Однако надо иметь в виду, что пассирование ряда эпизоотических штаммов вирусов на лабораторных животных ведет к изменению исходных биологических свойств и в первую очередь к утрате исходной патогенности и иммуногенности для естественного хозяина. Кроме того, этот метод требуетзначительных материальных затрат и создания специальных условий для организации опытов и поддержания эпизоотической безопасности.

Культивирование вирусов в развивающихся эмбрионах птиц.

Использование эмбрионов птиц (главным образом куриных) для изоляции и культивирования вирусов - наиболее доступный и удобныйметод. В эмбрионах способны размножаться многие вирусы, а для некоторых эта система может быть единственной. Эта система содержит четыре субстрата (амнион, аллантоис, хорион-аллантоисная мембрана, желточный мешок), способные обеспечить репродукцию вирусов с различным тропизмом.

На размножение вирусов в эмбрионе оказывают влияние ряд факторов, из которых наиболее существенное значение имеют температура инкубации яиц, возраст эмбрионов, метод заражения, величина заражающей дозы вируса.

Для размножения большинства вирусов температура от+35до + 37 0 С является оптимальной.

Для культивирования вирусов используют эмбрионы в возрасте 8-13 дней. Эмбрионы более старшего возраста менее пригодны, так как они менее чувствительны к вирусам, что связано с большим содержанием в их жидкостях и тканях неспецифических ингибиторов, чем в более молодых эмбрионах.

Заражающая доза вируса оказывает существенное влияние на его размножение. Наиболее активное его накопление происходит при введении 1000 - 10000 ЭИД 50/мл.

Культивирование вирусов в культуре клеток.

Для выделения вирусов, их идентификации, накопления в качестве антигенов при изготовлении диагностикумов и противовирусных вакцин в вирусологических лабораториях и на биофабриках широко используют культуры клеток.

Культуры клеток применяются в исследованиях по генетике вирусов, при клонировании, получении ts - мутантов вирусов, селекции, контроле живых противовирусных вакцин, изучении проблемы вирус — клетка. Внедрение метода культур клеток в вирусологическую практику отодвинуло на задний план преимущественное использование лабораторных животных и эмбрионов птиц.

Культура тканей - понятие более широкое, включающее и понятие культура клеток, но главным образом отражающее методики культивирования переживающих тканей, т. е. не подвергнутых ферментативной обработке.

Наиболее широко распространено культивирование клеток в монослое, состоящее в том, что с помощью ферментативной обработке (раствором трипсина) выделяют живые клетки из свежих тканей (почечной, легочной,тестикулярной и др.), переносят их в специальные сосуды для культивирования в условиях подкормки этих клеток соответствующей питательной средой. Метод монослойной культуры позволяет выращивать клетки на стенках сосудов. Существует также метод культивирования разъединенных клеток всуспензии.

О наличии вирусных агентов в культуре клеток можно судить по цитопатическому действию, вызываемому этим или другим вирусом.

Вопросы для самоконтроля

Правила подбора естественно-восприимчивых и лабораторных животных для проведения биопробы.

Правила отбора, получения, транспортировки, хранения вируссодержащего материала.

Техника заражения, методы введения инфекционного материала.

Патологические изменения в тканях лабораторных животных под воздействием вирусного агента.

Условия инкубации яиц.

Методы заражения эмбрионов птиц.

Результаты воздействия вирусов на различные ткани эмбрионов птиц.

Условия для культивирования клеток, изолированных из организма.

9.Растворы и питательные среды для приготовления культуры клеток.

10.Виды монослойных культур клеток:

а) первично-трипсинизированные культуры клеток;

в) перевиваемые культуры клеток;

г) диплоидные культуры клеток;

д) суспензионные перевиваемые клетки

11. Хранение культур клеток.

Цитопатическое действие вирусов на клетки, виды цитопатического действия.

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Балышева В.И., Живодеров С.П., Пивова Е.Ю., Бобровская Н.К., Живодерова А.В.

Нодулярный дерматит крупного рогатого скота (НД, заразный узелковый дерматит, кожная бугорчатка, узелковая экзантема, dermatitis nodulares, lumpy skin disease) трансмиссивная вирусная высококонтагиозная трансграничная эмерджентная болезнь. В 2015 году она была занесена в Республику Дагестан из Азербайджана. В 2016 году заболевание обнаружили в Краснодарском крае, затем еще в 6 областях Российской Федерации. Болезнь приводит к снижению молочной продуктивности до 50 %, потере живой массы тела, абортам и мертворождения, повреждению шкуры, нарушению воспроизводительной функции у больных особей (вплоть до полной потери фертильности у быков) и гибели животных от секундарных инфекций. Нодулярный дерматит вызывает ДНК-содержащий вирус рода Capripoxvirus (подсемейство Chordopoxvirinae, семейства Poxviridae ). Выделение и идентификация вируса, изготовление вакцинных и диагностических препаратов во многом зависят от удачного выбора системы культивирования. Целью нашей работы было изучение культуральных свойств изолята вируса нодулярного дерматита и оптимизация условий получения вирусосодержащего материала в наиболее перспективных клеточных культурах. Вирус выделяли из проб органов (печень, легкие, селезенка, лимфатические узлы и пораженная подкожная клетчатка) от вынужденно убитых быков калмыцкой породы (хозяйства Волгоградской области, 2016 год) с характерными проявлениями клинических признаков НД. Для выделения вируса готовили 10 % суспензию образцов и вносили в культуральные флаконы (по 3 флакона для каждой культуры) со сформировавшимся монослоем клеток тестикул козленка (ТК), перевиваемыми линиями клеток почек теленка ( MDBK ) и кролика (RК-13/2-03). В третьем пассаже титр вируса, полученного в клетках MDBK и RК-13/2-03, составлял 4,67-5,00 lg ТЦД50/см3. В вирусосодержащем культуральном материале выявляли геном вируса НД методом ПЦР. Полученный штамм вируса НД был депонирован в Государственную коллекцию микроорганизмов Всероссийского НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии под номером 3161. В работе с этим штаммом вируса НД также определяли пермиссивность культур клеток кожи эмбриона лося (КЭЛ/07), почки африканской зеленной мартышки ( CV-1 , VERO ), гибридной линии клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ ТК-) × спленоцитов селезенки свиньи (А4С2/9к), почек овцы (ПО), кролика (RК-13/2-03) и теленка ( Taurus-1 ). Установлено, что к вирусу чувствительны перевиваемые клеточные линии гомологичного ( MDBK , Taurus-1 , КЭЛ/07, ПО) и гетерологичного происхождения (RК-13/2-03, VERO , CV-1 , А4С2/9к, СПЭВ). Впервые выявлено, что вирус НД размножается в клетках диких животных (лося), а также установлена возможность его культивирования в перевиваемых гетерологичных клеточных культурах RК-13/2-03 и А4С2/9к. Длительность культивирования вируса до проявления 95-100 % ЦПД зависела от клеточного субстрата и множественности заражения. В культурах клеток МDBK и VERO она составляла 48 ч, в Taurus-1 , ПО, RК-13/2-03, CV-1 максимальные деструктивные изменения клеточного монослоя наблюдали через 48-96 ч после инфицирования. При оптимальной множественности заражения, составляющей 0,001-0,00001 ТЦД50/кл и культивировании в поддерживающей среде, содержащей 2-5 % сыворотки крупного рогатого скота, титр вируса, полученного в культурах клеток ПО и VERO , составлял 6,0-6,8 lg ТЦД50/см3, в клетках RК-13/2-03 5,8-6,6 lg ТЦД50/см3. Таким образом, наиболее перспективным представляется использование для накопления вируса НД клональной перевиваемой линии клеток почки кролика RК-13/2-03.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Балышева В.И., Живодеров С.П., Пивова Е.Ю., Бобровская Н.К., Живодерова А.В.

PERMISSIVITY OF VARIOUS CELL CULTURES TO LUMPY SKIN DISEASE VIRUS

Lumpy skin disease (LSD) is a transmissible and highly contagious transboundary emergent bovine viral disease that has become especially important for the Russian Federation since 2015 when it entered the Republic of Dagestan from Azerbaijan. In 2016, the infection was found in the Krasnodar Territory and later on in six more regions of the Russian Federation. The infection causes up to 50 % drops in milk productivity, body weight loss, abortions or stillbirths, skin damage, and reproductive disorders in affected livestock up to including a complete loss of bovine fertility and animal deaths due to secondary infections. LSD is caused by a DNA virus of family Poxviridae, genus Capripoxvirus. The virus isolation, identification and vaccine or diagnostic preparation construction largely depends on the adequate culture system used. This research was aimed at characterization of the cultural properties of an LSD virus isolate detected in internal organ (lung, spleen and lymph nodes) or affected subcutaneous tissue samples from Volgograd region of Russia. In order to isolate the virus, a goatling testicle primary culture (GT), a calf kidney ( MDBK ) and a rabbit kidney (RK-13/2-03) continuous cell lines were used. In passage 3, the virus titer obtained in cells MDBK and RK-13/2-03 was 4.67 to 5.00 lg TCID50/cm3. Using PCR analysis, a LSD virus genome was detected in the virus-containing culture medium. The obtained LSD virus strain was deposited to the State Collection of Microorganisms of the Federal Research Center for Virology and Microbiology, # 3161. Also, the permissivity of some other cell lines including elk embryo skin (KEL/07), African green monkey kidney ( CV-1 ) and VERO cells, a hybrid line of porcine embryo kidney cells (SPEV TK-) × porcine spleen splenocytes (A4C2/9k), and sheep kidney (ShK), rabbit kidney (RK-13/2-03) and calf kidney ( Taurus-1 ) cells to this LSD virus strain were determined. We found that some continuous cell lines of both homologous ( MDBK , Taurus-1 , KEL/07, ShK) and heterologous (RK-13/2-03, VERO , CV-1 , A4C2/9k, SPEV) origin were sensitive to the LSD virus. This work has revealed for the first time ever that LSD virus can proliferate in cells of wildlife species like elk. Also, permissivity of some heterologous continuous cells, RK-13/2-03 and A4C2/9k, to LSD virus was revealed for the first time. The virus culture period until 95 to 100 % CPE depended on the cell substrate selected and the multiplicity of infection. Thus, for MDBK or VERO cells it was 48 hours, and for Taurus-1 , SkK, RK-13/2-03 or CV-1 the maximal destructive alterations in the cell monolayers were observed within 48 to 96 hours post infection. With an optimal multiplicity of infection of 0.001-0.00001 TCID50 per cell and 2-5 % cattle serum in the maintenance medium the LSDV titers were 6.0 to 6.8 lg TCID50/cm3 in the ShK and VERO cells, and 5.8 to 6.6 lg TCID50/cm3 for RK-13/2-03.

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2017, том 52, № 6, с. 1265-1272

УДК 619:578:57.083.224 doi: 10.15389/agrobiology.2017.6.1265rus

ПЕРМИССИВНОСТЬ КУЛЬТУР КЛЕТОК РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ВИРУСА НОДУЛЯРНОГО ДЕРМАТИТА

В.И. БАЛЫШЕВА, С.П. ЖИВОДЕРОВ, Е.Ю. ПИВОВА, Н.К. БОБРОВСКАЯ, А.В. ЖИВОДЕРОВА, Л.И. АНИСИМОВА, С.Д. КУШНИР, Т.Р. УСАДОВ, С.Г. ЮРКОВ, Н.И. САЛЬНИКОВ, А.В. ЛУНИЦИН

Нодулярный дерматит крупного рогатого скота (НД, заразный узелковый дерматит, кожная бугорчатка, узелковая экзантема, dermatitis nodulares, lumpy skin disease) — трансмиссивная вирусная высококонтагиозная трансграничная эмерджентная болезнь. В 2015 году она была занесена в Республику Дагестан из Азербайджана. В 2016 году заболевание обнаружили в Краснодарском крае, затем еще в 6 областях Российской Федерации. Болезнь приводит к снижению молочной продуктивности до 50 %, потере живой массы тела, абортам и мертворождения, повреждению шкуры, нарушению воспроизводительной функции у больных особей (вплоть до полной потери фертильности у быков) и гибели животных от секундарных инфекций. Нодулярный дерматит вызывает ДНК-содержащий вирус рода Capripoxvirus (подсемейство Chordopoxvirinae, семейства Poxviridae). Выделение и идентификация вируса, изготовление вакцинных и диагностических препаратов во многом зависят от удачного выбора системы культивирования. Целью нашей работы было изучение культуральных свойств изолята вируса нодулярного дерматита и оптимизация условий получения вирусосодержащего материала в наиболее перспективных клеточных культурах. Вирус выделяли из проб органов (печень, легкие, селезенка, лимфатические узлы и пораженная подкожная клетчатка) от вынужденно убитых быков калмыцкой породы (хозяйства Волгоградской области, 2016 год) с характерными проявлениями клинических признаков НД. Для выделения вируса готовили 10 % суспензию образцов и вносили в культуральные флаконы (по 3 флакона для каждой культуры) со сформировавшимся монослоем клеток тестикул козленка (ТК), перевиваемыми линиями клеток почек теленка (MDBK) и кролика (R& 13/2-03). В третьем пассаже титр вируса, полученного в клетках MDBK и R&13/2-03, составлял 4,675,00 lg ТЦД50/см3. В вирусосодержащем культуральном материале выявляли геном вируса НД методом ПЦР. Полученный штамм вируса НД был депонирован в Государственную коллекцию микроорганизмов Всероссийского НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии под номером 3161. В работе с этим штаммом вируса НД также определяли пермиссивность культур клеток кожи эмбриона лося (КЭЛ/07), почки африканской зеленной мартышки (CV-1, VERO), гибридной линии клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ ТК") х спленоцитов селезенки свиньи (А4С2/9к), почек овцы (ПО), кролика (R&13/2-03) и теленка (Taurus-1). Установлено, что к вирусу чувствительны перевиваемые клеточные линии гомологичного (MDBK, Taurus-1, КЭЛ/07, ПО) и гетерологичного происхождения (R&13/2-03, VERO, CV-1, А4С2/9к, СПЭВ). Впервые выявлено, что вирус НД размножается в клетках диких животных (лося), а также установлена возможность его культивирования в перевиваемых гетерологичных клеточных культурах R&13/2-03 и А4С2/9к. Длительность культивирования вируса до проявления 95-100 % ЦПД зависела от клеточного субстрата и множественности заражения. В культурах клеток MDBK и VERO она составляла 48 ч, в Taurus-1, ПО, R&13/2-03, CV-1 максимальные деструктивные изменения клеточного монослоя наблюдали через 48-96 ч после инфицирования. При оптимальной множественности заражения, составляющей 0,001-0,00001 ТЦД50/кл и культивировании в поддерживающей среде, содержащей 2-5 % сыворотки крупного рогатого скота, титр вируса, полученного в культурах клеток ПО и VERO, составлял 6,0-6,8 lg ТЦД50/см3, в клетках R&13/2-03 - 5,8-6,6 lg ТЦД50/см3. Таким образом, наиболее перспективным представляется использование для накопления вируса НД клональной перевиваемой линии клеток почки кролика R& 13/2-03.

Ключевые слова: вирус нодулярного дерматита, перевиваемые культуры клеток, культура клеток кожи эмбриона лося, CV-1, VERO, MDBK, Taurus-1, цитопатическое действие.

Нодулярный дерматит крупного рогатого скота (НД) продолжает причинять значительный экономический ущерб животноводству во многих странах. В России болезнь была занесена в Республику Дагестан из Азербайджана в 2015 году (1, 2). Тогда же вспышки заболевания регистрировали в Чеченской Республике и Республике Северная Осетия — Алания. В 2016 году его обнаружили в Краснодарском крае, затем еще в шести областях Российской Федерации (3, 4). Нодулярный дерматит (заразный

узелковый дерматит, кожная бугорчатка, узелковая экзантема, dermatitis nodulares, lumpy skin disease) — трансмиссивная вирусная высококонтагиозная трансграничная эмерджентная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, узелками на коже, язвенными поражениями на слизистых оболочках и внутренних органах, истощением, увеличением лимфатических узлов и отеком кожи. НД КРС вызывает ДНК-содержащий вирус рода Capripoxvirus (lumpy skin disease virus, LSDV, подсемейство Chordopoxvirinae, семейства Poxviridae) (5-7). Болезнь приводит к снижению молочной продуктивности до 50 %, потере живой массы тела, абортам и мертворождению, повреждению шкуры, нарушению воспроизводительной функции у больных животных, вплоть до полной потери фертильности у быков, гибели животных от секундарных инфекций (8-10). Единственный эффективный способ борьбы с НД в регионах, где болезнь эндемична, — это вакцинация (11, 12). Для специфической профилактики нодулярного дерматита используют вирус-вакцину из аттенуиро-ванного гомологичного штамма Neethling или вакцины из гетерологичных аттенуированных штаммов вирусов оспы овец или оспы коз (13-15).

Для культивирования LSDV перспективны перевиваемые линии клеток. Они обеспечивают получение больших объемов однородного виру-сосодержащего материала, который применяется при исследовании биологических, молекулярно-генетических свойств вируса, а также используется в качестве лабораторной модели для изучения его эволюции, разработки средств диагностики и специфической профилактики (16, 17). Успех разработки вакцинных и диагностических препаратов во многом зависит от удачного выбора системы культивирования. Поэтому первоначально необходимо определить чувствительность клеточных культур и степень их пер-миссивности. При выборе клеточных систем мы опирались на видовую принадлежность культур (Bos taurus, Ovis aries, Capra hircus), клеточный и тканевой тропизм вируса (dermis), а также на данные литературы по использованию для этих целей клеточных линий гомологичного (культуры клеток тестикул ягненка LT, тестикул плода теленка FBT, почки теленка MDBK и др.) (19-21) и гетерологичного происхождения (9).

А.В. Кононов с соавт. (22) установили, что в клетках гомологичного происхождения — субкультуре тестикул ягненка (ТЯ) и перевиваемой культуре клеток гонады козы (ЯДК-04) LSDV, выделенный из патологического материала, который был получен на территории Республики Дагестан в 2015 году, накапливался в титрах 4,5-5,5 lg ТЦД5о/см3. Однако в некоторых случаях возникает необходимость в вирусном сырье, произведенном в гетерологичной клеточной системе, в частности при накоплении вирусного антигена для получения специфических сывороток. Использование гетерологичных клеточных систем культивирования позволяет исключить появление фоновых антител на гомологичные тканевые антигены, что затрудняет применение сывороток в диагностических исследованиях или требует дополнительных процедур по очистке антигена.

В представленной работе впервые выявлено, что вирус нодулярного дерматита размножается в клетках диких животных (лося) и установлена эффективность перевиваемых гетерологичных клеточных культур — RK-13/2-03 и А4С2/9к при его культивировании.

Нашей целью было изучение культуральных свойств изолята вируса нодулярного дерматита и оптимизация условий получения вирусосодер-жащего материала в наиболее перспективных клеточных культурах.

Методика. Пробы органов (печень, легкие, селезенка, лимфатические узлы) и пораженной подкожной клетчатки были получены от вынужденно убитых быков калмыцкой породы (хозяйства Волгоградской обла-

При адаптации вируса к гомологичным и гетерологичным линиям клеток применяли метод серийного пассирования. Kyльтyры клеток кожи эмбриона лося Alces alces (K&n/07), почки африканской зеленной мартышки (CV-1, VERO), почки эмбриона свиньи (ПП^66б), внутривидовой гибридной линии клетки почки эмбриона свиньи (СПЭВ TK ) х сплено-циты селезенки свиньи (А4С2/9к), почки овцы (ПО), почки теленка (Taurus-1) выращивали в среде Игла с 10 % фетальной сыворотки ^С. При образовании сплошного монослоя (24 ч) из культуральных флаконов удаляли ростовую среду и вносили вирус со множественностью заражения 0,1-0,00001 ТЦД50/кл. Адсорбцию вируса проводили в течение 1 ч при 37,0±0,5 "С. После этого вносили поддерживающую среду, содержащую 2 % фетальной сыворотки ^С. Инфицированную культуру клеток инкубировали при 37,0±0,5 "С в течение 5 сут или до наступления 90-100 % ЦПД вируса. Затем культуру клеток и культуральную жидкость замораживали при -50,0±0,5 "С. При следующем пассаже культуры клеток инфицировали размороженной вирусосодержащей суспензией. О пермиссивности культур клеток судили по наличию цитопатических изменений в монослое и изменению титра вируса в процессе пассирования. Инфекционную активность вируса определяли титрованием в 1-2- суточных культурах перевиваемых линий клеток VERO или ПО, выращенных в 96-луночных микропланшетах. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД^/см3 (24).

Данные обрабатывали методами вариационной статистики. В таблице приведены средние значения (М) и стандартные ошибки средних (±SEM).

Результаты. Для выделения LSDV вирусосодержащий материал вно-

сили в культуральные флаконы (по 3 флакона для каждой культуры) со сформировавшимся монослоем клеток ТК, MDBK и RK-13/2-03. В 1-м пассаже изменений в культуре не было, начиная со 2-го пассажа выявлялись незначительные изменения морфологии клеток, их округление. В 3-м пассаже наблюдали характерное цитопатическое действие вируса в культуре клеток MDBK и RK-13/2-03 (рис., А), инфицированных первоначально суспензией ткани печени: на 2-е сут инкубации в зараженной культуре кле-

ток RK-13/2-03 образовывались тяжи, на 3-и сут клетки округлялись, в то время как в контрольной культуре таких изменений не выявляли. Аналогичные изменения происходили в культуре клеток MDBK. Титр вируса в клетках MDBK и RK-13/2-03 составлял 4,67-5,00 lg ТЦД50/см3. Полученный штамм (депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов ФИЦВиМ под номером 3161) далее использовался в работе. При инфицировании перевиваемой культуры КЭЛ/07 наблюдали аналогичные изменения (см. рис., Б) (накопление вируса — 4,5-5,5 lg ТЦД5о/см3). В первичной культуре клеток ТК в 3-м пассаже инфекционная активность вируса была несколько ниже — 3,5 lg ТЦД5о/см3. Для адаптации штамма к перевиваемым линиям клеток и определения чувствительных к нему культур использовали линии гомологичного и гетерологичного происхождения: MDBK, Taurus-1, ПО, CV-1, VERO, RK-13/2-03, АА^к, СПЭВ.

Характер ЦПД в разных культурах клеток был неодинаковым. Так, в RK-13/2-03 (см. рис., А) проявление ЦПД вируса было сходным с таковым при его репродукции в культуре клеток ПО (см. рис., Г): через 48 ч после заражения здесь регистрировали формирование тяжей из веретенообразных клеток, а через 72 ч — округление и отслоение инфицированных клеток от подложки с лизисом и деструкцию клеточного монослоя. В инфицированной культуре VERO (см. рис., В) наблюдалось нарастающее округление клеток, формирование включений, не свойственных нормальным (неинфици-рованным) клеткам, с последующим лизисом и отслоением. Инфекционная активность вируса в этих культуральных системах также различалась. Максимальные титры наблюдали в культурах клеток Taurus-1 и А^2/9к — 7,00 ^ТЦД50/см3, а также VERO и RK-13/2-03 — 6,67 ^ТЦД50/см3 (табл. 1).

1. Накопление вируса нодулярного дерматита в разных перевиваемых культурах клеток

Культура клеток | Пассаж (Длительность культивирования, ч Титр вируса, lg ТЦД50/см3

ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ , комплекс методов исследования, позволяющих распознать этиологию вирусного заболевания и изучить его возбудителя.

Осн. этапами В. и. являются выделение вируса от больных и павших животных (взятие, консервирование, пересылка и подготовка материала, заражение им животных, куриных эмбрионов, культуры клеток); титрование вирусов для определения их кол-ва в исследуемых материалах; культивирование вирусов на восприимчивых домашних и лабораторных животных, особенно на развивающихся куриных эмбрионах и культурах тканей (гл. обр. первичнотрипсинизированных).

С помощью морфологич. методов выявляют элементарные тельца, внутриклеточные включения (напр., Бабеша — Негри при бешенстве, Боллингера при оспе птиц). Иммунохимич. методы (гл. обр. метод флуоресцирующих антител) позволяют определить специфич. вирусный антиген в заражённых [зараженных] клетках тканевой культуры или органов и тканей инфицир. животных. С помощью серологич. методов проводят видовую и группоспецифич. идентификацию вируса и антител в сыворотках переболевших животных. С этой целью используют реакции нейтрализации, РСК, реакцию гемагглютинации, задержки гемагглютинации, диффузионной преципитации, торможения гемадсорбции. Реакция нейтрализации позволяет улавливать антигенные различия сходных между собой вирусов даже в пределах одноимённой [одноименной] группы. РСК применяют для обнаружения вирусных антигенов в материалах от больных и павших животных, идентификации выделенного вируса, изучения антигенных связей между различными вирусами и определения антител у переболевших животных. Реакции гемагглютинации и задержки гемагглютинации широко применяют в В. и. для диагностич. целей и типирования возбудителей болезни Ньюкасла, гриппа птиц, парагриппа и нек-рых аденовирусов; непрямую реакцию гемагглютинации используют для выявления адено- и миксовирусов, хламидий. Реакцией прицепитации в агаре изучают антигенную структуру вирусов, выявляют антитела в сыворотке и антигены в исследуемом материале. Реакцию гемадсорбции применяют для предварительной индикации и титрования вирусов в культуре клеток, особенно тех, к-рые не вызывают цитопатич. действия. Гемадсорбция наступает раньше проявления цитопатогенного действия, поэтому её [ее] используют как ранний метод предварительной индикации вирусов. Гемадсорбция островковая (адсорбция эритроцитов на отдельных участках монослоя клеток) типична для гриппа свиней, эпидемич. паротита; диффузная (адсорбция эритроцитов на клетках всего монослоя)— для классич. чумы кур, болезни Ньюкасла, афр. чумы свиней и др. Методы очистки и концентрации вирусов используют при изучении физич., химич. и морфологич. свойств вирусов. Фазовые системы, образованные полимерами, используют для концентрации вирусов из больших объёмов [объемов] вируссодержащих жидкостей, выделения нуклеиновых к-т вирусов. Радиобиологич. методы применяют в В. и. для изучения распределения и локализации вирусов (антител) в организме и особенно для изучения процессов онтогенеза вирусов. С помощью электронной микроскопии обнаруживают вирионы в исследуемом материале и специфич. конгломераты вирусов и антител (иммунная электронная микроскопия). Иммуноэлектроосмофорез обусловлен одновременным встречным движением в геле агара антигена и антитела в результате разной величины электрич. заряда с образованием комплекса антиген — антитело в виде линии преципитации и последующей его денатурацией. Метод применяют при изучении антигенной структуры вируса. Изоэлектрич. фокусирование основано на способности белков переходить в инертное (в отношении электрофоретич. подвижности), а затем агрегированное состояние в изоэлектрич. точке. Метод применяют для изучения белков вирусов. При иммуноферментативном методе происходит присоединение фермента к антителам с последующим образованием комплекса фермент — антитело — антиген, к-рый выявляют в клетке с помощью цитохимич. реакции на фермент (пероксидазу, щелочную и кислую фосфотазу, глюкозооксидазу). Метод используют с диагностич. целью для выявления вирусных антигенов в культурах клеток, мазках-отпечатках, криостатных срезах, а также для изучения тонкой структуры антигенов вируса, патогенеза вирусных болезней и др. См. также Вирусоскопия .

Лит.: Тихоненко Т. И., Методические основы биохимии вирусов, М., 1973, с. 152—58; Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, пер. с англ., ред. Э. Леннет и Н. Шмидт, М., 1974.

Крюкова Е.Н., Самуйленко А.Я., Мельник Р.Н . ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности", Московская область, пос. Биокомбината
Ельников В.В., Красуткин С.Н., Литенкова И.Ю . ФКП "Щелковский биокомбинат", Московская область, пос. Биокомбината
Боровой ВН. Департамент ветеринарии МСХРФ, г. Москва
Мельник НВ. "Национальная Ассоциация ветеринарно-биологической промышленности" ("Ветбиопром"), г. Москва
Дресвянникова С.Г. ГКУ КСББЖ "Краснодарская", г. Краснодар

Введение . Суспензионные культуры являются наиболее перспективными в решении практических проблем, связанных с получением вирусных и клеточных материалов. При благоприятных условиях клетки в суспензии дают более высокий урожай, чем в стационарных средах.

Для изготовления требуемого количества противовирусных вакцин необходимы современные технологии изготовления, в частности, в последние годы для производства вакцин практикуется использование перевиваемых культур клеток. После того как появилась возможность выращивать вирус в культурах, на повестку дня встал вопрос о разработке приемов масштабирования таких культур, которые обеспечивали бы промышленное производство вакцин. С этой целью часто используют клеточную культуру ВНК-21, отдельные клоны которой, можно выращивать в суспензионных условиях без поддерживающей поверхности, практически неограниченно и использовать в качестве биологического субстрата для репродукции многих вирусов, в частности ящура, бешенства [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7].

Целью работы стала адаптация "ВНК-21/13-13 - перевиваемой монослойно-суспензионной сублинии клеток почки новорождённого сирийского хомячка" к суспензионному способу выращивания с использованием питательной среды для суспензионного выращивания в масштабах биотехнологического производства.

Материалы и методы . Нами получена культура клеток ВНК-21/13-13 в Российской коллекции клеточных культур в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (РККК) (СХЖ РАСХН) ВИЭВ при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко. Линии клеток присвоен коллекционный № 89.

Перевиваемая линия клеток ВНК-21/13-13 выделена из линии клеток ВНК-21/13-02, и используется в производстве ФКП "Щелковский биокомбинат".

Результаты исследований . Клетки ВНК-21/13-13 предназначены для промышленного культивирования с целью выработки вируссодержащего сырья для изготовления противовирусных вакцин. Перевиваемая сублиния клеток ВНК чувствительна к вирусу ящура и бешенства, жизнеспособна при хранении в жидком азоте в течение 10 лет и 14 дней при 4°С.

Клетки адаптированы к суспензионному культивированию при аэрации воздухом и выдерживают колебания рН в пределах 6,6-7,4 в пассажах, свободны от контаминатов.

Адаптацию клеток к суспензионным условиям культивирования Б проводили в биоферментёре MD-300 фирмы "MARUBISHI" (Япония) с автоматическим поддержанием концентрации водородных ионов (рН 6,9-7,0), температуры (37°С), ручным регулированием подачи воздуха и скорости перемешивания (до 100 об/мин). Культивирование проводили используя питательную среду на основе раствора Хенкса, содержащую 0.25% суммы гидролизатов лактальбумина и мышечных белков, 7% сыворотки крупного рогатого скота, пять аминокислот и витамины группы В.

В первых трёх пассажах отмечали некоторое уменьшение численности популяции к концу культивирования, что требовало увеличить засевную концентрацию клеток до 500 тыс/мл. Последующие пять пассажей клетки росли с образованием довольно значительных клеточных конгломератов, появлением зернистости в цитоплазме. При дальнейшем пассажировании, с 9-го по 13 пассаж, число конгломератов уменьшалось, цитоплазма становилась прозрачной и гомогенной. Посадочную концентрацию снизили до 200 тыс/мл, популяция клеток в суспензии увеличивалась в 6-7 раз, время генерации составило 48 часов. После проведения 13 пассажей в суспензии, были получены клетки, отличающиеся однообразием морфологии и размера, с небольшим количеством конгломератов и высокой пролиферативной активностью (индекс пролиферации составил 5-7).

Процесс выращивания культуры клеток для формирования производственного банка начинали с извлечения ампул с консервированной суспензией маточной культуры клеток ВНК-21/13-13 из хранилища (рисунок 1).

Выращивание клеток ВНК-21 /13-13 в КС-40 в объеме 30 л. Подготовленный культиватор размещают на установке для культивирования, в стерильный бокс выводят рабочие шланги, заполняют питательной средой в объеме 22 л, включают перемешивающее устройство, подогревают до 37°С и через штуцер по стерильному шлангу перекачивают культуру клеток под давлением 0,2 атм. из КС-40 (где культивируют клетки в объеме 8-10 л). Добавляют 10 мл пеногасите-ля. Исходная концентрация клеток должна быть 0,4-0,5 млн/мл, рН 7,05-7,15, скорость перемешивания постоянной в пределах 35-40 об/мин.

Через два часа после заполнения культиватор (период, необходимый для адаптации культуры, установления газового равновесия между жидкой и газовой фазами, накопления С02 и снижения рН до 7,0) начинают аэрацию культуры воздухом. Подачу воздуха регулируют в зависимости от объема суспензии и продолжительности выращивания клеток. Режим аэрации в КС-40 приведен в таблице 1.

Через 20-48 ч культивирования клеток берут пробу для определения концентрации и жизнеспособности клеток, проводят корректировку рН 7,5 %- ным раствором бикарбоната натрия.

Выращивание клеток ВНК-21/13-13 в 200 л реакторе . Культиватор тщательно моют, проверяют его на герметичность путем подачи в него воздуха до 0,7 атм. Если за 30 минут давление в реакторе упадет не более, чем на 0,1 кг/см, то такой реактор считают герметичным. В случае большой утечки воздуха находят место разгерметизации с помощью мыльного раствора и устраняют неисправности.

Рис. 1. Получение производственного банка клеток ВНК 21/13-13

Продолжительность культивирования, час

Расход воздуха при объеме, л

Загрузка 200 л реактора и культивирование клеток . В реактор с питательной средой (80 л), нагретой до 37°С, перекачивают 30 л суспензии клеток из КС-40. Культивирование осуществляют в течение 48 часов, при скорости перемешивания культуры 25-30 об/мин. Аэрацию осуществляют воздухом, подачу которого начинают через 2 часа после начала культивирования. В первые сутки воздух подают из расчета 1,5 объема на один объем суспензии клеток, вторые сутки - 2 объема воздуха на объем клеток в час.

Через 20-48 часа культивирования осуществляют коррекцию рН 7.5 %-ным раствором бикарбоната натрия. Одновременно осуществляют контроль стерильности культуры, определяют концентрацию и жизнеспособность клеток.

Выращивание клеток ВНК-21/13-02 в 600 л реакторе . Культивирование осуществляется в реакторе объемом 600 литров. В реактор фильтруют питательную среду, включают перемешивающее устройство, систему термостатирования. При достижении температуры питательной среды 37°С в реактор перекачивают суспензию клеток из 200 литрового реактора. По истечении 2 часов после посева клеток отбирают пробу для измерения рН, концентрации клеток, контроля стерильности и подают через барбатер воздух для аэрации культуры. Через 20 и 48 часов культивирования осуществляют коррекцию рН 7.5 %-ным раствором бикарбината натрия. Процесс выращивания клеток ведут в течение 48 часов при непрерывном перемешивании со скоростью 35 об/мин., подсчет клеток проводят при взятии пробы для корректировки рН.

В процессе выращивания возможны поломки в системах перемешивания, термостатирования и аэрации культуры. Неисправности устраняют без разгерметизации реактора. После устранения неисправностей процесс выращивания продолжают, если доля жизнеспособных клеток составляет не менее 90%. По окончании цикла выращивания суспензию клеток передают на заражение вирусом, если концентрация не ниже 1,6 млн/мл., жизнеспособных клеток не менее 90%, отсутствует грибково-бактериальная микрофлора.

Заключение . Усовершенствованы технологии получения недорогих эффективных универсальных вакцин для крупного и мелкого рогатого скота, собак и кошек, которые по иммуногенности и стабильности конкурентоспособны лучшим современным зарубежным аналогам. С целью установления оптимального режима культивирования клеток и вируса в суспензии проведены испытания по отработке начальной посевной концентрации клеток и режимов перемешивания. Максимальное накопление клеток и вируса было получено при следующих показателях основных технологических параметров (табл. 2).

Таблица 2. Основные показатели технологического режима культивирования клеток ВНК-21 и вируса бешенства, штамм "Щелково-51"

Окислительно-восстановительный потенциал (еН, мВ)

Концентрация растворенного углекислого газа (рСО2), %

Концентрация растворенного кислорода (р02), %

Скорость перемешивания, об/мин

Разработанная нами технология позволила обеспечить потребность сельского хозяйства Российской Федерации и стран СНГ в эффективных препаратах и внести весомый вклад в улучшение эпизоотической ситуации по ящуру и бешенству, наметить пути совершенствования технологий с переходом на инновационную технологию изготовления противоящурных, антирабических вакцин, с использованием вирусов ящура и бешенства, культивируемых в суспензии клеток ВНК-21/13-13.

1. Сергеева С.П . Потребности культур клеток в пластических I веществах и некоторые вопросы конструирования питательных сред. Бюллетень ВИЭВ, №33, М., 1978.
2. Дьяконов Л.П. Специализированная Коллекция клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) РККК РАН и криобанк ВИЭВ, "Консервация генетических ресурсов", Материалы XIV рабочего совещания, Пущино, 28-30 мая 1996, 76-79 с.
3. Дьяконов Л.П., Бахарев В.Н. Методические рекомендации по получению и субкультивированию культур клеток из репродуктивных органов самок крупного рогатого скота. М. 1983 г.
4. Дьяконов Л.П . Проблемы культивирования клеток животных и некоторые вопросы цитопатологии. Бюлл, ВИЭВ, выпуск 49, 1983 г. стр. 3-8.
5. Игнатова Т.Н . Трансформация клеток. В кн. "Биология клетки в культуре" Ленинград, 1984, стр. 101-194.
6. Федотова А. В., Снежко А. Г., Федотов А. В. и др. Культивирование клеток млекопитающих на биологически активном полимерном субстрате. "Биотехнология" - 1992, №4, с. 15-17.
7. Животная клетка в культуре. Под ред. Л.П. Дьяконова, В.М. Ситькова. М., Спутник+, 2000. 400 с.

Резюме . Суспензионные культуры являются наиболее перспективными в решении практических проблем, связанных с получением вирусных и клеточных материалов. При благоприятных условиях клетки в суспензии дают более высокий урожай, чем в стационарных средах. В статье представлены научные данные по изучению суспензионного культивирования культуры клеток ВНК-21/13-13 в масштабах биотехнологического производства, адаптации к суспензионному способу выращивания и использовании ее в изготовлении проти-воящурных и антирабических вакцин. Показана технологическая постадийная схема получения производственного банка клеток ВНК-21/13-13. Показаны параметры культивирования в КС-40 в объеме 30 л, выращивание клеток в 200600 литровых реакторах в промышленных технологиях по изготовлению противовирусных вакцин. В статье описаны основные показатели технологического режима культивирования культуры клеток ВНК-21/13-13 в производственных условиях. Авторами усовершенствованы технологии получения недорогих эффективных универсальных вакцин для крупного и мелкого рогатого скота, собак и кошек, которые по иммуногенности и стабильности конкурентоспособны лучшим современным зарубежным аналогам. С целью установления оптимального режима культивирования клеток и вируса в суспензии проведены испытания по отработке начальной посевной концентрации клеток и режимов перемешивания. Разработанная авторами технология позволила обеспечить потребность сельского хозяйства Российской Федерации и стран СНГ в эффективных препаратах и внести весомый вклад в улучшение эпизоотической ситуации по ящуру и бешенству, наметить пути совершенствования технологий с переходом на инновационную технологию изготовления противоящурных, антирабических вакцин, с использованием вирусов ящура и бешенства, культивируемых в суспензии клеток ВНК-21/13-13.

Ключевые слова : культура клеток, суспензия, питательная среда, суспензионное культивирование, перевиваемая сублиния клеток, пассаж, фильтры, реакторы, технологическая схема производства, аэрация.