Как делают диагностику мозга животного на бешенство

Бешенство - вирусная зоонозная инфекция, передающаяся через укусы и слюну животных, сопровождающаяся дегенерацией нейронов головного и спинного мозга. Характерны симптомы глубокого расстройства нервной системы: возбужденность, агрессивность, деменция, приводящая к параличу и летальному исходу.

Источники инфекции – инфицированные животные (лисы, волки, собаки, кошки, летучие мыши, грызуны, лошади, мелкий и крупный рогатый скот). Вирус выделяется во внешнюю среду со слюной, которая становится заразной за 8-10 дней до начала заболевания.

Механизм передачи – контактный, заражение человека происходит при укусах, реже при ослюнении больными бешенством животными. В последние годы доказано, что помимо контактного возможны аэрогенный (передача через воздух (в пещерах, населенных летучими мышами, внутрилабораторные заражения), алиментарный (фекально-оральный) и трансплацентарный (от матери к плоду) пути передачи вируса. В среднем при укусах в лицо и шею заведомо бешенными животными бешенство развивается в 90% случаев, при укусах в кисти рук – в 63%, а при укусах в проксимальные (расположенные ближе к центру тела) отделы рук и ног – лишь в 23% случаев.

Бешенство регистрируют на всех континентах, исключая Австралию и Антарктиду. Некоторые островные государства (Великобритания, Мальта, Австралия, Япония, Новая Зеландия) практически свободны от бешенства благодаря строгим карантинным мерам для ввозимых собак, кошек и других животных. Заболевания бешенством становятся следствием позднего обращения укушенных за медицинской помощью, нарушения режима во время прививок или незавершенности цикла иммунизации.

Клиническая картина

Инкубационный период составляет от 10 дней до 3—4 (но чаще 1—3) месяцев, в некоторых случаях — до одного года. У иммунизированных людей в среднем он длится 77 дней, у не иммунизированных — 54 дня.

В типичном случае болезнь имеет три периода:

• Продромальный (период предвестников)

Длится 1—3 дня. Сопровождается повышением температуры до 37,2—37,3 °C, угнетённым состоянием, плохим сном, бессонницей, головной болью, беспокойством больного. Боль в месте укуса ощущается, даже если рана давно зарубцевалась.

• Стадия разгара (гидрофобия)

Длится 1—4 дня. Выражается в резко повышенной чувствительности к малейшим раздражениям органов чувств: яркий свет, различные звуки, шум вызывают судороги мышц конечностей. Водобоязнь, аэрофобия вызывают повышенное беспокойство головного мозга. Больные становятся агрессивными, буйными, появляются галлюцинации, бред, чувство страха.

Наступает паралич глазных мышц, нижних конечностей. Тяжёлые паралитические расстройства дыхания вызывают смерть. Общая продолжительность болезни 5—8 дней, изредка 10—12 дней. Зависимости продолжительности заболевания от источника заражения, места укуса и длительности инкубационного периода обнаружить не удалось.

В ряде случаев болезнь протекает атипично, с отсутствием или нечёткой выраженностью ряда симптомов (например, без возбуждения, гидро- и аэрофобии, начинаясь сразу с развития параличей).

Лабораторная диагностика

Принципиально возможны при жизни больного выделение вируса из слюны или спинномозговой жизни, а также постановка реакции флюоресцирующих АТ на отпечатках с роговицы или биоптатах кожи

Диагностика

Тестов для диагностирования инфекции бешенства у людей до наступления клинических симптомов не существует, и до тех пор, пока не разовьются особые признаки бешенства, такие как гидрофобия и аэрофобия, постановка клинического диагноза может быть затруднена. Прижизненное и посмертное подтверждение бешенства у людей может осуществляться путем применения различных диагностических методик, направленных на выявление целого вируса, вирусных антигенов или нуклеиновых кислот в инфицированных тканях (мозге, коже, моче или слюне).

Неотложная помощь

При появлении признаков недомогания у человека, укушенного животным, необходимо немедленно обратиться за медицинской помощью.

Эффективных методов лечения не существует. Проводится симптоматическая терапия для уменьшения страданий больного. Больного помещают в затемненную, изолированную от шума, теплую палату.

Профилактические мероприятия

Необходимо проводить активную санитарно-просветительную работу среди населения о мерах профилактики бешенства у животных и людей. Для предупреждения заражения бешенством среди лиц определённых профессий (собаколовы, сотрудники ветеринарных диагностических лабораторий, охотники) проводят курс профилактической иммунизации, который состоит из трёх внутримышечных введений вакцины в толщу дельтовидной мышцы плеча. Однократная повторная иммунизация рекомендуется через год и далее каждые 3 года, если человек продолжает пребывать в зоне высокого риска.

При укусах, царапинах и ослюнении животными людей необходимо обильно промыть раны водой с мылом, обработать края раны 40-70 о спиртом или йодной настойкой, наложить стерильную повязку. Пострадавших немедленно направляют в травмотологический пункт, а при его отсутствии – в хирургический кабинет для назначения и проведения курса антирабической вакцинации.

Еще фото

Автор (ы): А.А. Заволока, д.в.н., профессор, академик УТА, Ан. А. Заволока, к.в.н., Украинская ассоциация врачей ветеринарной медицины мелких животных / A.A. Zavoloka, Prof., Sc. D., Academician of UTA, Andriy A. Zavoloka, DVM, PhD, Ukrainian Small Animal Veterinary Association
Журнал: №4 - 2013

Ключевые слова: бешенство, распространение болезни в различных странах, возбудитель и его виды, проявление бешенства у различных видов животных и у человека, координация мер в борьбе с заболеванием

Key words: rabies, spread of disease in the various countries, agent and its types, manifestation of rabies in various species of animals and in human, coordination of disease prevention

Аннотация

Проанализированы представленные статистические данные по распространению бешенства в 24 Европейских странах с 2002 по 2012 гг. В работе представлены: распространение бешенства по странам мира, особенности проявления болезни у различных видов животных и у людей, патологоанатомические признаки болезни, диагностика заболевания.

Summary

Statistical data on spread of Rabies in 24 European countries from 2002 to 2012 are analyzed. The work is concerned to: spread of rabies in countries of the World, specificity of disease symptoms in various species of animals and in humans, postmortem signs, disease diagnostics.

Введение

Заболевание значительно распространено среди домашних и диких животных в тропических странах, характеризуются благополучием острова Кипр, Маврикий, Ямайка, Западные острова Тихого океана, Австралия и Новая Зеландия, продол­жительно и стабильно благополучна Великобритания, в которой действуют наиболее жесткие, но научно обоснованные и вполне оправданные требования по профилактике инфекционных заболеваний, включая и бешенство. Заболевание распространено более, чем в 160 странах мира, своевременное качественное проведение мер борьбы и профилактики болезни обеспечивает стойкое благополучие по бешенству таких стран, как Австралия, Великобритания, Япония, Финляндия, Нидерланды, Франция, Швейцария, Бельгия и Люксембург, после реализации успешных мер борьбы с болезнью, благополучием характеризуется ситуация в Германии, Венгрии, Словакии, Польше. Проведенный нами анализ, на основании данных Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) относительно регистрации случаев бешенства в европейских странах в период с 2002 по 2012 гг. свидетельствует о длительном и стабильном неблагополучии по заболеванию территорий таких стран, как Российская Федерация, Украина, Беларусь, Хорватия и Литва. При этом в Российской Федерации, Украине и Беларуси, количество случаев бешенства велико не только среди диких, но и среди домашних животных.

Эпизоотологические данные

Чаще всего бешенством заболевают собаки, лисицы, кошки, шакалы, волки, песцы. Вид животных, выступающий, как источник возбудителя инфекции зависит от природно-географических условий: в полярных и прилегающих к ним территориях это преимущественно песцы и флеминги, в условиях стран Южной Америки это преимущественно или исключительно летучие мыши. Увеличение заболеваемости бе­шенством обычно совпадает с периодами миграции животных, что связано, в свою очередь, с погодными условиями или с брачными периодами в популяциях животных. Существенно, что животное больное бешенством, может и не проявлять признаков заболевания, но заражать при этом других животных и человека. На Украине, в Беларуси, в европейской части Российской Федерации практически идентичны природные условия и животный мир дикой природы. Анализ заболевания бешенством различных видов животных на Украине показал, что заразиться бешенством можно от 30 различных видов животных, причем, даже, и от тех животных, которые не проявляют каких-либо признаков заболевания, и не только бешенства, а заболевания вообще. Это волки, лисицы барсуки, хорьки, ласки, куницы, лоси, лошади, крысы, кроты, домашние и полевые мыши, белки, хомяки, представители крупного и мелкого рогатого скота, летучие мыши и другие животные.

В тропических странах Америки заболевание преимущественно распространяют летучие мыши, по заражению людей и животных бешенством они стоят на первом месте, уже за ними следуют собаки и другие животные. В Южной Америке бешенство установлено у 23 видов летучих мышей, вирусоносителями бешенства являются не только кровососущие летучие мыши (вампиры), но и питающиеся нектаром, фруктами, насекомыми. В Европе установлены случаи заражения бешенством людей и животных от летучих мышей закончившиеся смертельным исходом. В Африке в распространении бешенства важна роль шакалов, кошек, собак, мангустов, определенную роль в распро­странении заболевания играют грызуны, а также любые другие теплокровные животные, находящиеся в неблагополучной по бешенству местности.

Заражение бешенством может произойти не только при укусе, но и при внедрении вируса в предрасположенный к болезни организм через поврежденную кожу и слизис­тые оболочки, загрязненные слюной больного животного. Возможен и алементарный путь заражения при поедании трупов животных, павших от бешенства и травмиро­вания слизистой ротовой полости острыми осколками костей. В странах Восточной и Юго-Восточной Азии регистрируют случаи заражения людей бешенством при раз­делке тушек кошек и собак идущих в пищу людям. У копытных животных заболевание часто проявляется после их пребывания на пастбище или в саванне, где они подверглись нападению хищников. Описаны случаи передачи бешенства от человека человеку при половом контакте, где, очевидно, свою роковую роль сыграл фактор ослюнения вирусоносителем своего партнера и проникновения вируса бешенства через микротрещины слизистых оболочек определенных органов.

Симптомы заболевания

Инкубационный период заболевания может варьировать от нескольких дней до нескольких лет, в среднем 3-8 недель. Быстрота развития клинических признаков заболевания значительно зависит от места проникновения вируса в организм, его близости к ЦНС, степени вирулентности вируса и устойчивости защитных свойств организма.

Типичными клиническими признаками для всех видов животных являются повышенная возбудимость, переходящая в депрессию, обильное слюноотделение, развитие перед смертью параличей. Буйная форма бешенства характеризуется угнетением в начальной стадии, стремлением животного спрятаться, уединиться. Может возникать излишняя подвижность, веселость, необоснованная активность. По мере развития заболевания повышается возбудимость, животные бурно реагируют на незначительный шум, возникает зуд в месте укуса, потребность в расчесывания места нанесенной травмы, животные поедают различные предметы: тряпки, кусочки бумаги, дерева, собственный кал. Усиливается слюнотечение, возникают парезы мышц глотки и гортани. Животное становится предельно возбудимым, агрессивным по отношению к другим животным и людям. Стадия буйства, длящаяся 3-4 дня, переходит в стадию парезов и параличей. Возникает шаткая походка, появляется косоглазие, отвисание нижней челюсти, усиливается непроизвольное обильное выделение слюны. Температура тела в период буйства повышена, с развитием параличей падает ниже нормы. Перед гибелью животного, как правило, возникает паралич зада, непроизвольное выделение мочи, в которой обнаруживают сахар. Стадия параличей продолжается 3-4 дня. При тихой форме бешенства заболевание начинает проявляться со слюнотечения и параличей нижней челюсти, глотки, задних конечностей, животное погибает через 2-5 дней.

Бешенство диких животных сопровождается агрессивностью, особенно опасны представители мелких кошачьих, которые сверху, с деревьев нападают на животных и людей, нанося укусы в области головы, шеи, мест, близких к центральной нервной системе, этим ускоряется продвижение туда вируса, сокращается инкубационный период болезни.

Больные бешенством летучие мыши в светлое дневное время залетают в квартиры людей, появляются на освещенных солнцем лужайках, в людных местах, проявляют признаки нарушения координации при передвижении, агрессивность, излишнее беспокойство, издают различные звуки. Внешне здоровые летучие мыши также спо­собны быть вирусоносителями и заражать бешенством, как людей, так и животных. Травма, нанесенная летучей мышью должна приравниваться к травме, полученной от собаки, подозреваемой в заражении бешенством, со всеми вытекающими из этого последствиями.

Патологоанатомические изменения

При наружном осмотре трупа обращают внимание на следы покусов и расчесов. Часто трупы животных истощены, в грудной и брюшной полостях находят признаки обезвоживания организма – сухость покровов. Подкожная клетчатка в месте укуса темно-вишневого цвета, отечна, имеются налеты и язвы на слизистой оболочке ротовой полости и языка. Печень и почки гиперемированы. На слизистой желудка и кишечника видны точечные или полосчатые кровоизлияния. Желудок пуст или же в нем обнаруживают инородные предметы (тряпки, щепки, камни и т.д.). В мозге обнаруживают обильное кровенаполнение сосудов и кровоизлияния.

При подозрении на гибель животного от бешенства производить патологоанатомическое вскрытие трупа, если это не предусмотрено прямыми должностными обязанностями, нет необходимости, тем более вскрывать черепную коробку животного. Данные патологоанатомического вскрытия при этом заболевании не являются основанием для установления диагноза, они мало информативны, а опасность заразиться при работе с трупом неизвестного происхождения достаточно велика.

Лабораторная диагностика бешенства

Основана на обнаружении в мозге телец Бабеша-Негри (отсутствие которых не исключает заболевание бешенством), обнаружения вируса в отпечатках из мозга, роговицы или слюнных желез с помощью РИФ, постановке ПЦР, ИФА, РДП, ставят биопробу и PH на белых мышах. В лабораторию с нарочным направляют труп или голову животного с подозрением на смерть от бешенства в двойных полиэтиленовых мешках, или влагонепроницаемых контейнерах. Свежий или консервированный в 40% растворе глицерина мозг помещают в банки, которые плотно закрывают. Окончательно материал помещают в ящик. Свежеотобранный материал перед окончательной упаковкой и отправкой в лабораторию необходимо предварительно охладить.

Мозг извлекают из черепной полости с соблюдением правил асептики, в первую очередь отбирают материал для биопробы. Учитывая возможность неравномерного распределения вируса в мозге, следует брать небольшие кусочки из разных участков: полушарий, мозжечка, аммонова рога, продолговатого мозга. Для обнаружения телец Бабеша-Негри гистологическим методом, кусочки отбирают в фиксирующую жидкость, мазки и отпечатки делают на предметных стеклах.

Для мазков и отпечатков используют окраску по Муромцеву и Селлерсу, для гистологических срезов – окраску по Туревичу и Муромцеву, методы широко доступны. Тельца Бабеша-Негри имеют величину от 0,25 до 25 мкм. Преимущественно они овальной или округлой формы, окружены оболочкой и содержат от 1 до 15 зернышек. Степень обнаружения телец Бабеша-Негри зависит от стадии инфекционного процесса. Если инкубационный период был коротким, то тельца малочисленны или вообще отсутствуют. При длительном инкубационном периоде они выявляются чаще, их количество и величина больше, структура более отчетливая. В начальной стадии развития клинических признаков заболевания телец мало и они мелкие, в конце заболевания возрастает их количество и размер. При буйной форме бешенства тельца обнаруживаются в клетках аммонова рога, при паралитической форме –в спинном и продолговатом мозге. В слюнных железах обычно выявляется незначительное количество телец. Тельца устойчивы к гниению и могут быть обнаружены в мазках из разложившегося мозга, полностью непригодного к гистоло­гическому исследованию и постановке биопробы.

Вирус бешенства может быть выявлен с помощью РИФ в наиболее короткое время. Для этой цели препараты обрабатывают коммерческим антирабическим лошадиным гамма-глобулином, конъюгированным флюорохромом по общепринятой методике. При этом мозговая ткань флюоресцирует тусклым желтоватым цветом, а вирусный антиген обнаруживают в виде ярких золотисто-зеленых или зеленых гранул.

При сохранившейся структуре клетки антиген выявляется в цитоплазме (гистосрезы и отпечатки) или в мазках и отпечатках, обнаруживается свободно среди детрита ткани. Возможность выявления телец зависит также и от экологического биоварианта вируса.

Для РДП используют кусочки головного мозга из различных участков, при этом исследовать можно несвежий головной мозг. Растертым в стерильных условиях мозгом заполняют на стекле луночки для антигена, остальные луночки заполняют преципитирующим антирабическим глобулином в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, общий объем ингредиентов – 0,02 мл. На отдельных стеклах ставят контроли. Во влажной камере, в термостате при температуре 37-38 °С оставляют стекла на 6 часов и через 3, 6 и 26 часов с момента постановки реакции периодически проводят учет. О положительной реакции судят по образованию одной или нескольких параллельно расположенных линий преципитации между лунками с глобулином и антигеном.

Биологическую пробу на мышах и кроликах ставят при получении отрицательных результатов серологических исследований и необнаружении ТБН.

Животных заражают 10% суспензией мозга на физрастворе (pH 7,2-7,4) с добавлением 500-1000 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл суспензии. На одно исследование берут 6 мышей, из которых 3-х заражают в головной мозг в дозе 0,03 мл, а 3-х – подкожно в области носа, в верхнюю губу в дозе 0,05 мл. За мышами, содержащимися в стеклянных банках, наблюдают 30 дней.

Клиника паралитического бешенства развивается на 7-15-й день.

Кроликам вводят интрацеребрально по 0,2 мл суспензии, а внутрикожно по 2,0 мл, заболевание развивается в течение 15-20 дней, наблюдают за кроликами 50 дней.

Бешенство дифференцируют от болезни Ауески, чумы плотоядных, энцефалитов, токсикозов, нарушений нервной деятельности, связанной с травмами, от острого отрав­ления свинцом, листериоза, энтеротоксемии, ценуроза.

У человека инкубационный период длится в пределах 20-60 дней, иногда более 2-х или более 6 лет. Заболевание проявляется рефлекторной возбудимостью, нарушением психики, общим недомоганием, повышением температуры, нарушением дыхания. В дальнейшем проявляется повышенная возбудимость, гидрофобия, судороги, параличи. Заболевание длится 3-7 дней, заканчивается смертью, и что существенно, при полном сознании.

В нескольких странах Африки зарегистрированы факты проявления бешенства у людей, которое в незначительном проценте случаев сопровождается специфическими клиническими признаками болезни, включая гидрофобию, и именно это обстоятельство значительно затрудняет и осложняет своевременную диагностику бешенства у заболевших людей.

Проблемы, связанные с бешенством, продолжают оставаться значимыми и в настоящее время. Каждые 10 минут от бешенства в мире погибает 1 человек, всего за год умирает около 60 000 людей. В соответствии с данными Всемирной Организации Здравоохранения бешенство занимает пятое место среди других заболеваний по наносимому им материальному ущербу, только в США, где достигнут значительный успех в борьбе с бешенством, на борьбу с заболеванием ежегодно тратится более 300 миллионов долларов, большая часть этой суммы расходуется на вакцинопрофилактику болезни. С 1950 по 2004 г. в Китае погибли от бешенства 108 412 человек, а массовые случаи бешенства возникают каждые 10 лет.

Наибольшее количество умерших от бешенства людей – это жители африканских и азиатских стран и преимущественно это дети в возрасте до 15 лет. В странах со значи­тельным распространением бешенства собаки являются основным источником заражения.

К сожалению, профилактика заболевания после укусов проводится в указанных странах только у 40% детей 5-14-летнего возраста, в отдельных местах в Африке случаи бешенства встречаются в 3-5 раз чаще среди детей чем среди взрослого населения.

В связи со Всемирным днем бешенства, 28 сентября, World Small Animal Veterinary Association (Всемирной Ассоциации ветеринаров мелких животных – WSAVA), которая представляет 180 тыс. ветеринаров по всему миру и 94 ассоциированных членов в различных странах, обратилась (rebecca@georgepr.com) с призывом к координации глобальной инициативы по ликвидации бешенства, болезни, которая убивает ребенка каждый час в таких странах, как Индия, вызывает бесчисленные смерти, требует ежегодных затрат в 70 млрд долларов.

Эта инициатива, несомненно, будет поддержана всеми людьми доброй воли, которым не безразлично здоровье людей и животных в различных странах всего мира.

Литература

1. Голдевська О., Гхазалi М., Загороднюк I., Лiна П. Кажани i сказ. Методичний поciбник. - Киiв. - 2010. - 15 с.

2. Заволока Ан. А., Заволока А. А. Особенности проведения серологических и клинико-гематологических исследований у экзотических животных при осуществлении противоэпизоотических мероприятий. Проблеми зооiнжененрii та ветеринарноi медицини.

3. Збiрник наукових праць. Частина 2. Випуск 8 (32).- Харкiв.- 2001.- С. 349 - 351.

5. Заволока А.А. Диагностика вирусных болезней животных в странах с тропическим климатом. – Харьков.- 1990.- 76 с.

6. Заволока А. А., Заволока А. А. Бешенство. Современные особенности эпизоотического процесса. – Мир Ветеринарии.- №3-4 май-август, 2013.- С. 4-8.

7. Заволока А. А., Заволока А. А. Заболевания диких и экзотических животных и их роль в заболевании людей. – VetPharma. - №3-2013.- С. 21-30.

8. Исторические и современные аспекты проблемы бешенства / Скрипченко Г. С., Пономаренко А. И., Рыбакова Т. М. и др. Украшський медичний часопис - № 4 (36) - VII/VIII, 2003.

10. Селимов М.А., Ширвинская А.И., Селимова Е.В. Состояние заболеваемости гидрофобией за 10 лет (1954-1963). – Вопросы борьбы с бешенством. – М. – Медицина. – 1967. – С. 120-138.

11. Селимов М.А. Бешенство. – М. – Медицина, 1978.- 334 с.

12. D. G. Streicker at al. Rabies in vampire bats. Proc. R. Soc. B., 2012, 0538, P. 1-6.

13. Zavoloka A., Medvedev S., Bah A. La Situation de la rage en Guinee. // Rap.a la Confer. Scientifique de l'Inst. Politech. De Kan Kan. La Republique de Guinee, 1976. – Mai. – P 7-10.

14 .Zavoloka A. Situation epizootologique de la Region de Kan Kan. // Rap. a la Confer. Scientifique del'Inst. Politech. De Kan Kan. La Republique de Guinee, 1977. – P. 24-28.

15. Zavoloka A. Etude du procesus general de l'evolution des epizooties en Republique de Guinee. // Rap. a la Confer. Scientifique de l'Inst. Politech. De Kan Kan. La Republique de Gui-nee, 1978. - P 43-49.

16. WSAVA Office Date: 29 September 2013, 14:25:12.

Сухарьков А.Ю, Назаров Н.А., Метлин А.Е. ФГБУ ВНИИЗЖ

Бешенство - острая инфекционная болезнь животных и человека, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с летальным исходом. Бешенство регистрируется во многих странах мира, в том числе и в России.

Диагностика бешенства играет важную роль для оказания своевременной постэкспозиционной лечебной помощи людям и борьбы с бешенством среди животных [7]. Она должна быть быстрой и достоверной, так как это необходимо для оценки риска, который угрожает людям.

В настоящее время базовыми методами диагностики бешенства являются реакция иммунофлуоресценции (РИФ) и биологическая проба на мышах, а также выделение вируса на культуре клеток, постепенно заменяющее биологическую пробу на мышах [6]. Несмотря на высокую надежность и чувствительность этих методов, они имеют ряд недостатков. Основным недостатком биологической пробы на мышах и выделения вируса в культуре клеток является то, что для получения результатов исследования может потребоваться длительное время [11]. Точность постановки диагноза методом РИФ во многом зависит от наличия у персонала диагностических лабораторий необходимой квалификации. Кроме этого, для проведения диагностики с использованием этих методов, как правило, не годятся пробы с признаками частичного разложения мозговой ткани, в силу возможного получения лож-ноотрицательных результатов. Эти диагностические системы также малопригодны для широкомасштабного мониторинга бешенства. Перечисленных выше недостатков метод имму-ноферментного анализа (ИФА) не имеет. Этот метод в числе других рекомендован для диагностики бешенства Всемирной Организацией Здравоохранения (В0З) и Всемирной Организацией Охраны Здоровья Животных (OIE) [5]. Иммуноферментный анализ отличается простотой и быстротой выполнения, может обходиться без применения дорогостоящего оборудования в случае визуальной оценки результатов исследований. Он отлично подходит для проведения мониторинга бешенства, при этом позволяя интерпретировать полученные результаты с высокой степенью достоверности.

Ранее нами был разработан твердофазный непрямой сэндвич-вариант иммуноферментного анализа для диагностики бешенства животных, с использованием поликлональных антител, полученных на рибонуклеопротеин вируса бешенства [2]. Прямой сэндвич-вариант ИФА более быстрый по времени и менее затратный, чем непрямой.

Целью данной работы являлась разработка прямого сэндвич-варианта ИФА для диагностики бешенства и проведение сравнительных испытаний прямого и непрямого сэндвич-варианта ИФА.

Материалы и методы. Рибонуклеопротеин вируса бешенства (далее, РНП ВБ) выделяли из клеток ВНК-21, инфицированных вирусом бешенства (далее, ВБ), штамм ВНИИЗЖ, по методике, рекомендованной ВОЗ в руководстве "Лабораторная диагностика бешенства" [8]. Вирус бешенства, штамм ВНИИЗЖ, очищали и концентрировали из культурального вирусного сырья, инактивированного димером этиленимина [3]. Концентрацию белка в очищенных препаратах вируса и РНП вируса определяли по методу Лоури [9]. Степень чистоты полученных антигенов контролировали методом вертикального электрофореза в агарозном геле с додецилсульфатом натрия в денатурирующих условиях.

В качестве улавливающих использовали поликлональ-ные антитела к РНП ВБ, которые получали иммунизацией кроликов соответствующим антигеном. Очищенный РНП ВБ вводили животным внутримышечно три раза (0, 40, 54 дни) в дозе 400 мкг на голову.

В качестве детекторных использовали антирабические антитела морской свинки, которые получали иммунизацией животных очищенным ВБ. Антиген вводили животным внутримышечно четырехкратно в дозе 200 мкг на голову с интервалами в 1 неделю, 5 и 2 недели. При иммунизации морских свинок и кроликов первую инъекцию проводили с полным, а последующие - с неполным адъювантом Фрейнда "Sigma".

Через две недели после последней инъекции в сыворотках крови иммунизированных животных определяли титры специфических антител методом твердофазного непрямого варианта иммуноферментного анализа. Титровали с шагом три, начиная с разведения 1:1000. В дальнейшей работе использовали сыворотки крови с титрами антител к ВБ и РНП ВБ не ниже 1:243000. Из отобранных сывороток выделяли фракцию IgG методом трехкратного высаливания сульфатом аммония. Концентрацию белка в конечных препаратах определяли методом спектрофотомерии при длине волны 280 нм.

Поликлональные антирабические антитела морских свинок использовали для получения антирабического перокси-дазного коньюгата по методу Накане [4].

Для отмывки лунок планшетов от компонентов реакции использовали Трис-HCl буферный раствор с добавлением Tween-20 (ТБСТ).

В качестве субстрата для пероксидазы использовали ор-тофенилендиамин.

Для учета результатов непрямого сэндвич-варианта ИФА использовали антивидовой пероксидазный конъюгат к антителам морской свинки производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи (г. Москва) в разведении 1:1000.

Положительным контролем в ИФА служила инактивиро-ванная р-пропиолактоном [10] лиофилизированная 20%-ная суспензия мозговой ткани кролика, инфицированного ВБ штамма CVS. В качестве отрицательного контроля использовалась лиофилизированная 20%-ная суспензия мозговой ткани неинфицированного кролика.

Исследуемые образцы (пробы ткани головного мозга животных) поступали в ФГБУ "ВНИИЗЖ" из разных региональных ветеринарных лабораторий. Поступивший биоматериал до использования хранили при минус 20°С. Образцы мозговой ткани для исследования готовили следующим образом. В пенициллиновый флакон с Трис - НС1 буферным раствором помещали кусочки ткани головного мозга из разных отделов (продолговатый мозг, мозжечок, аммоновы рога, кора больших полушарий) в количестве, необходимом для приготовления 30%-ной суспензии. Содержимое флакона тщательно гомогенизировали путем интенсивного встряхивания и подвергали однократному замораживанию. Далее пробу подвергали частичному размораживанию при комнатной температуре, и интенсивно встряхивали для более полной гомогенизации. Затем содержимое флакона переносили в пластиковую центрифужную пробирку с крышкой в объеме 1,5 мл и центрифугировали в течение 20 минут при 1000g. Для исследования использовали супернатант в цельном виде. Оставшийся в пенициллиновом флаконе материал хранили при минус 200С.

Кроме прямого сэндвич-варианта ИФА пробы исследовали методами РИФ [1] и непрямым сэндвич-вариантом ИФА [2]. При исследовании проб головного мозга в РИФ использовали ФИТЦ-иммуноглобулин производства ФГБУ "ВНИИЗЖ".

Результаты и обсуждение. Исследования проб в прямом сэндвич-варианте ИФА выполняли по следующей схеме.

Сенсибилизация планшетов. Для сенсибилизации планшетов в лунки вносили поликлональные кроличьи антитела к РНП ВБ по 100 мкл в лунку, разведенные в карбонатно-би-карбонатном буферном растворе (рН 9,5) до концентрации 5 мкг/мл, и инкубировали в течение 18-20 ч при 4°С. Сенсибилизированный планшет 3 раза отмывали ТБСТ.

Внесение исследуемых проб и контрольных препаратов. В лунки вертикального ряда по очереди в трех повторностях вносили положительный, отрицательный, безантигенный (промывочный буферный раствор) контроли и исследуемые пробы по 100 мкл в лунку. Планшет инкубировали 1 ч при 37°С и затем трижды отмывали промывочным буферным раствором.

Внесение пероксидазного антирабического конъюгата. Рабочее разведение антирабического конъюгата с перокси-дазой хрена готовили на ТБСТ с добавлением 5%-ной нормальной сыворотки лошади. В лунки планшета вносили по 100 мкл приготовленного коньюгата, инкубировали 1 ч при 37°С и отмывали 5 раз промывочным буферным раствором. Рабочее разведение антирабического пероксидазного конъюгата предварительно определяли в прямом сэндвич-варианте ИФА методом последовательных разведений, с использованием положительного и отрицательного контрольных препаратов, которое составило 1:1500.

Внесение субстрат-хроматогенной смеси. Раствор субстрат-хроматогена вносили по 100 мкл на лунку. Инкубировали 20 минут при комнатной температуре в темноте, реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 3н H2SO4.

Учет результатов . Результаты реакции учитывали с помощью сканирующего спектрофотометра "BioRad PR 2100" при длине волны 490 нм. Определяли среднюю оптическую плотность (ОП) безантигенного, положительного и отрицательного контролей, а также среднюю ОП тестируемых образцов. После этого рассчитывали ОП тестируемых образцов, положительного и отрицательного контролей, вычитая среднюю ОП безантигенного ряда. Согласно рекомендациям ВОЗ, расчетная ОП (ОПр) отрицательного и положительного контролей должна быть не выше 0,1 и не ниже 1,5 единиц, соответственно. Исследуемые образцы считали положительными, если их ОПр превышала ОПр отрицательного контроля на 0,1 единицы [5].

Для оценки диагностической специфичности разработанного прямого сэндвич-варианта ИФА исследовали 30 проб головного мозга от разных животных, отрицательных по бешенству в РИФ. Расчетная оптическая плотность отрицательных проб составила 0,013±0,0004, что свидетельствует о высокой специфичности разработанного ИФА, которая в данном исследовании составила 100%.

С целью измерения предела чувствительности разработанного метода провели анализ с использованием РНП ВБ известной концентрации. Проведенные исследования показали, что предел чувствительности метода находится в диапазоне 15-30 нг/мл. При этом предел чувствительности непрямого сэндвич-варианта ИФА, разработанного нами ранее [2], составил такую же величину.

Для изучения эффективности диагностики бешенства разработанным прямым сэндвич-вариантом ИФА в сравнении с другими методами, в том числе и непрямым сэндвич-вариантом ИФА, было исследовано 100 проб головного мозга животных, направленных в ФГБУ "ВНИИЗЖ" для исследования на бешенство. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты исследований мозговой ткани животных, подозреваемых в заболевании бешенством, в прямом сэндвич-варианте ИФА, в сравнении с другими методами диагностики бешенства