Ires-элемент мрнк вируса паралича сверчка

IRES (англ. Internal Ribosome Entry Site — участок внутренней посадки рибосомы) — регуляторный участок мРНК эукариот и их вирусов, который обеспечивает кэп-независимую, или внутреннюю инициацию трансляции. При таком механизме инициации рибосома связывается с мРНК непосредственно в районе IRES, которые чаще всего располагаются в 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) недалеко от сайта инициации трансляции, минуя стадии узнавания кэпа и сканирования [1] .

К 2016 году описано более 80 клеточных (у дрожжей, растений и других высших эукариот) и 56 вирусных IRES. IRES были обнаружены у представителей следующих семейств вирусов: пикорнавирусы, флавивирусы, дицистровирусы [en] и лентивирусы [2] . Кроме того, недавно была показана возможность трансляции, зависимой от IRES вируса эукариот, в клетках бактерий [3] .

Содержание

История [ | ]

Участки внутренней посадки рибосомы были открыты в мРНК полиовируса и вируса энцефаломиокардита [en] в 1988 году группами Н. Соненберга [en] [4] и Э. Виммера [en] [5] соответственно. Они обнаружили, что в молекуле РНК есть участки, способные связывать рибосомы, тем самым инициируя трансляцию. Оказалось, что если поместить IRES между двумя репортёрными генами в мРНК, то второй (3'-концевой) цистрон также будет экспрессироваться. Однако использование данного метода (т. н. метода бицистронных конструкций) может привести к ряду артефактов, связанных со сплайсингом и потенциальной промоторной активностью участков внутренней посадки рибосомы [6] .

Структура [ | ]

Для всех IRES пикорнавирусов характерно наличие мотива GRNA в центральном домене, который обеспечивает формирование четырёхпетельной конформации, а также небольшого пиримидинобогащённого участка, который расположен на 20—25 нуклеотидов выше она AUG. IRES флавивирусов содержит 4 домена, обозначаемых I—IV, причём у IRES вируса гепатита C (HCV), типового представителя IRES данной группы вирусов, последовательности, необходимые для активности IRES, находятся между доменами II, III и IV и захватывают первые 30 нуклеотидов открытой рамки считывания, начинающейся со старт-она AUG. Вторичная структура IRES HCV была тщательно изучена. В частности, установлено, что домен II представляет собой шпильку длиной 75 нуклеотидов с тремя внутренними и одной терминальной петлёй и что домен III обладает наиболее сложной вторичной структурой, которая включает несколько спиралей и шпилек. Вторичная и третичная структура IRES дицистровирусов довольно консервативна и включает 3 различных домена, каждый из которых содержит псевдоузел. IRES были выявлены почти у всех членов семейства лентивирусов (в число которых входит и вирус иммунодефицита человека), причём IRES у них располагаются не только в 5'-НТО, но и в ирующей области, где они участвуют в экспрессии некоторых изоформ основного структурного полипротеина Gag [en] [2] .

Структуры эукариотических IRES очень разнообразны, и в них не выявлено никаких консервативных последовательностей и мотивов. В некоторых случаях для эффективной работы IRES должны быть стабильными структурами в мРНК, а в других, напротив, слишком жёсткая структура IRES ингибирует инициацию трансляции. Было высказано предположение, что IRES не являются жёстко зафиксированными структурами и способны к перестройкам, регулирующим их активность. IRES могут также обусловливать образование различных изоформ белка, тем самым дополнительно расширяя число возможных белковых продуктов, получаемых с одного гена [7] .

Механизм [ | ]

IRES обнаружены в 5'-нетранслируемых областях геномных мРНК вирусов и позволяют им транслироваться независимо от кэпа. Ряд клеточных мРНК также содержат IRES [8] .

В клетках IRES отвечают за посадку рибосом как на кэпированные, так и на некэпированные транскрипты в тех случаях, когда кэпзависимая инициация трансляции заингибирована (при стрессе, на определённой стадии клеточного цикла или при апоптозе), и тем самым обеспечивают непрерывный синтез необходимых белков. Ряд генов, мРНК которых содержат IRES — c-Myc, APAF1, Bcl-2 — при нормальных условиях экспрессируются мало, но в определённых ситуациях их экспрессия может существенно возрастать за счёт IRES-зависимой трансляции. Считается, что IRES могут также участвовать в поддержании низкого уровня трансляции ряда мРНК при нормальных условиях, связывая рибосомы и не позволяя им присоединяться к основным сайтам инициации. Такой механизм внутренней инициации в настоящее время плохо понятен, однако совершенно ясно, что эффективность IRES сильно зависит от транс-регуляторных белковых факторов, которые обеспечивают тонкую регуляцию IRES-зависимой трансляции на уровне отдельных клеток [1] .

Структуры в 5'-НТО могут влиять на активность IRES, причём это влияние может быть опосредовано взаимодействиями как с различными транс-регуляторными факторами, так и непосредственно с рибосомами. Примерами генов, IRES которых находятся под контролем транс-регуляторных белков, являются протоонкогены Myc, участвующие в регуляции пролиферации клеток [9] . Для IRES-зависимой трансляции этих мРНК необходимы особые факторы трансляции ITAF (англ. IRES trans-acting factors ), которые выступают как шапероны РНК, заставляющие её принять правильную конформацию, подходящую для связывания с 40S субъединицей рибосомы [10] .

Наличие IRES между AUG и другими старт-онами (отличными от AUG) свидетельствует о возможной роли IRES в инициации трансляции со слабых нестандартных старт-онов. IRES также могут взаимодействовать с короткими рамками считывания (uORF). Для доказательства существования IRES в структуре РНК недостаточно анализа её последовательности — все предположения должны быть подтверждены экспериментальными данными [7] .

Х-связанный ингибитор апоптоза [en] (англ. X-linked inhibitor of apoptosis, XIAP ) играет важную роль в регуляции апоптоза, поэтому его синтез должен точно контролироваться. 5’-НТО мРНК XIAP составляет 1700 нуклеотидов в длину и содержит IRES, облегчающий синтез XIAP в условиях стресса. Кроме описанной мРНК XIAP, в результате альтернативного сплайсинга образуется мРНК с более короткой 5'-НТО длиной 323 нуклеотида и не содержащая IRES. Количество мРНК XIAP с короткой 5'-НТО в клетках в 10 раз в больше, чем с длинной. Установлено, что мРНК с короткой 5’-НТО ответственна за синтез XIAP в нормальных условиях и транслируется по кэп-зависимому механизму, а мРНК с длинной 5’-НТО обеспечивает синтез XIAP в условиях стресса. Итак, комбинация альтернативных 5’-НТО и механизмов инициации трансляции обеспечивает постоянную экспрессию XIAP в любых условиях [7] .

Другим примером контроля экспрессии генов через различные элементы 5’-НТО, является ген человеческого фактора роста фибробластов 2 (англ. fibroblast growth factor 2, FGF-2 ). FGF-2 экспрессируется в 5 различных изоформах, образующихся при использовании альтернативных инициаторных онов в 5’-НТО, и трансляция его мРНК может идти не только кэпзависимо, но и IRES-зависимо. Интересно, что трансляция с четырёх из пяти инициаторных онов опосредована IRES. Предполагается, что IRES облегчает трансляцию с каждого из этих четырёх онов через модуляцию структуры мРНК при помощи транс-активирующих факторов [7] .

У многих РНК-содержащих вирусов инициация трансляции происходит по кэпнезависимому механизму при участии IRES, локализованных в 5'-НТО [11] . Например, так происходит у ВИЧ, вирусов гепатита A и С [12] . Такой механизм инициации трансляции удобен тем, что в его случае нет необходимости в сборке преинициаторного белкового комплекса, и вирус может быстро размножаться [13] .

Некоторые вирусные мРНК имеют на 5'-конце ковалентно связанный белок ( VPg [en] ), поэтому использование кэпзависимой инициации для них исключено. IRES вируса гепатита C образует комплекс с 40S субъединицей рибосомы и привлекает фактор трансляции eIF3 клетки-хозяина [7] . IRES многих пикорнавирусов не связывают 40S напрямую, а делают это через фактор инициации eIF4G, высокоаффинный сайт связывания которого находится в IRES [14] . У многих вирусов (например, пикорнавирусов) для IRES-зависимой инициации одних канонических факторов инициации трансляции недостаточно: им также необходимы особые факторы, называемые ITAF [15] . В зависимости от особенностей вторичной структуры и потребности в тех или иных факторах трансляции IRES делят на различные классы внутри отдельных семейств вирусов [16] . Например, IRES пикорнавирусов делят на 4 класса (I—IV) [17] .

Вирусный РНК-геном может содержать больше одного IRES. Например, вирус паралича сверчков [en] , входящий в семейство дицистровирусов [en] , имеет РНК-геном с двумя IRES, один из которых локализован в 5'-НТО, а другой в межгенном участке [en] . Оказалось, что функционирование этих элементов отличается: IRES, расположенный в 5'-НТО, инициирует трансляцию на всех этапах вирусной инфекции, а IRES, локализованный в межгенном участке, большую часть времени подавлен и активируется только через 2—3 часа после заражения. Временное разобщение двух IRES — эффективная вирусная стратегия для экспрессии определённых белков в строго определённую фазу инфекции [18] .

Клиническое значение [ | ]

Поскольку IRES играют важнейшую роль в регуляции ряда генов, мутации, затрагивающие IRES, приводят к развитию тех или иных заболеваний. В частности, к числу таких заболеваний у человека относят Х-сцепленную болезнь Шарко — Мари — Тута, множественную миелому и синдром ломкой Х-хромосомы [19] .

Вирусные IRES могут выступать мишенями многих противовирусных препаратов. В настоящий момент разрабатываются препараты, которые непосредственно разрушают структуру IRES или же мешают взаимодействию IRES с рибосомой или белковыми факторами, например, факторами инициации трансляции. В частности, IRES вируса гепатита C, ввиду своей консервативности среди встречающихся в клинике образцов, может быть мишенью лекарств, блокирующих трансляцию у этого вируса [20] . Среди препаратов, направленых против IRES, есть антисмысловые олигонуклеотиды, пептидо-нуклеиновые кислоты (RNA), замкнутые нуклеиновые кислоты [en] (LNA), морфолиновые олигонуклеотиды, короткие шпилечные РНК, аптамеры РНК, рибозимы, дезоксирибозимы [en] , пептиды и малые молекулы [21] . Показано, что ингибитор янускиназы 2 [en] AZD1480 способен подавлять размножение вируса гепатита A, блокируя его IRES-зависимую трансляцию [22] . Апигенин [en] — препарат, применяющийся при лечении ящура — подавляет развитие вирусной инфекции, нарушая IRES-зависимую трансляцию у вируса ящура [23] . Жизненный цикл энтеровирусов эффективно подавляет противоопухолевый препарат идарубицин, связывающийся с IRES [24] .

Особый интерес представляют онколитические вирусы [en] , жизненный цикл которых зависит от IRES, в связи с их возможным использованием в противораковой терапии [25] .

IRES нашли широкое применение в создании векторов для генной терапии. Если локализовать IRES в 5'-НТО мРНК необходимых генов, то можно добиться их скоординированной экспрессии. В таких случаях чаще всего используется IRES вируса энцефаломиокардита [en] [26] .

Методы [ | ]

Для проверки того, обладает ли данная последовательность РНК свойствами IRES, можно использовать следующий метод. Создаётся бицистронная эукариотическая мРНК, в которой исследуемая последовательность находится между двумя репортёрными открытыми рамками считывания. Открытая рамка, находящаяся до исследуемой последовательности, будет транслироваться в белок по кэпзависимому механизму. Если изучаемая последовательность обладает свойствами IRES, то в клетке будет накапливаться и белок, соответствующий второй открытой рамке [6] .

Разработаны web-серверы, позволяющие предсказывать наличие IRES в вирусных РНК (VIPS) или в вирусных и клеточных РНК (IRESPred) [27] .

В 2016 году был предложен алгоритм RNAiFold2T для разработки особых РНК-термометров, содержащих IRES. Кэпнезависимая трансляция таких термо-IRES-элементов примерно на 50 % интенсивнее при 42 °С, чем при 30 °С. Впрочем, эффективность их трансляции всё равно меньше, чем у IRES дикого типа, которая не зависит от температуры [28] .

Крикет Паралич Вирус (CrPV) был первоначально обнаружен в австралийских сверчков местах ( Teleogryllus Коммода и Teleogryllus oceanicus ) Карла Рейнганумом и его коллеги в викторианском институте растениеводства исследований ( Бернли , Мельбурн , Австралия ). Паралитическая болезнь быстро распространяется через гнездовую колонию, а также через лабораторное население вызывает около 95% смертности. Это был первый зарегистрированный изолят вируса и , как правило , называют CrPVvic , чтобы отличить его от последующих изолятов.

содержание

Описание

Шаровидным, лишенные оболочки вирусные частицы CRPV около 27 нм в диаметре в отрицательно окрашенных электронных микрофотографиях и содержат одну часть положительной смысловой оцРНК. Вириона состоит из 4 белков капсида с молекулярными массами в основном сообщалось, что 33, 31 и 30 кДа с незначительным VP4 белка около 8 кДа. Частицы напоминают те из млекопитающих пикорнавирусах но CRPV вирионы осадка с более высокой скоростью (167 S ) , чем полиовируса частиц (158 S) в сахарозе скорости-зонального градиентов и, в изопикнических нейтральных хлоридных цезия градиентов, частицы CRPV плотнее , чем у вируса полиомиелита (1,368 г / см 3 против 1,340 г / см 3 соответственно).

Спектр

CrPV был обнаружен в ряде видов насекомых из по крайней мере , пяти различных порядков класса Insecta, в естественных и лабораторных популяциях, и, как правило , определен с помощью стандартных серологических методов. Инфекции включают не только австралийские виды крикета , но крикет в Новой Зеландии, Pteronemobius nigrovus, а также крикет европейского дома, Acheta Domesticus . CrPV не появляется заражать саранчу. Это обычно обнаруживаются вирус в пчелах в качестве бессимптомной инфекции. Штамм CrPVbrk был выделен из крикета А. Domesticus ca.1980 после крупного обрушения населения в крикете выращивания фермы в Грузии. Родственный вирус из Арканзаса, первоначально назывался Pseudoplusia includens вирус и переименованы CrPVark, был записан в середине 1980-х годов. Штаммы БРК и ковчега тесно связаны между собой серологически , но по всей видимости, очень отдаленное отношение к другим CRPV изолятов так, несмотря на их физические и химические сходства, остается спекулятивным , что эти два американских изолятов фактически штаммы CRPV. Сообщения о обнаружений и / или обособления CRPV были сделаны в Австралии, Новой Зеландии, Соединенных Штатов Америки, Соединенного Королевства и Индонезии. CrPV имеет один из самых широких диапазонов принимающих, если не самый широкий, любого вируса, насекомое или нет. Потенциал для использования CRPV в качестве агента биологической борьбы для насекомых был предложен. В лабораторных экспериментах CrPVbrk оказались чрезвычайно заразными и патогенными для взрослого Ceratitis capitata ( средиземноморская плодовая муха ). Детальные исследования были также сделаны на использовании штамма CRPV для контроля европейской оливковых плодовой мушки (Dacus ОЛЕАЭ)

американские вспышки

Исследования

CrPV , как был показан реплицироваться в непрерывно культивируемых клеточных линиях , полученных из плодовой мушки дрозофилы и другие клеточных линий насекомых. Эта способность позволила детальные исследования по стратегии репликации вируса. Тот факт , что доказуем цитопатический эффект был также произведен в этих культивируемых клеточных инфекциях привели к развитию чувствительных методов анализа титрования аналогичных тем , которые использовались при изучении пикорнавирусов млекопитающих. В 1990 - е годы крупномасштабного производства вируса в клеточной суспензии культур клеток Drosophila или T.ni из рентгеновских кристаллографических исследований возможно. CrPV был первый вирус насекомых , чтобы его кристаллическая структура определена.

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

240 руб. | 75 грн. | 3,75 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Теренин Илья Михайлович. Структура и функция универсального участка внутреннего связывания рибосомы из мРНК вируса RhPV (Rhopalosiphum padi virus) : Дис. . канд. хим. наук : 02.00.10 Москва, 2005 85 с. РГБ ОД, 61:06-2/172

Содержание к диссертации

1. Молекулярные механизмы инициации трансляции у про- и эукариот 8

1.1 Общий механизм инициации трансляции у прокариот 8

1.2 Связывание рибосомы с мРНК и выбор инициаторного кодона 9

1.3 Энхансеры трансляции 13

1.4 Структура и функции индивидуальных факторов инициации 16

2 Эукариоты и Археи 19

2 2 Структура эукариотических мРНК 21

2 3 Сканирующая модель инициации трансляции 22

2 4 Эукариотические факторы инициации 24

3. Вирус Rhopalosiphum pad! 38

4 Результаты и обсуждение 4 0

1. IRES-элемент RhPV эффективно направляет трансляцию в лизате ретикулоцитов кролика 40

2. Факторы инициации 4-й группы eIF4A, 4В, 4G не являются абсолютно необходимыми для образования 48S комплекса на 5' -концевом IRES-элементе RhPV 41

3. Фактор инициации elFl необходим 40S рибосомной субчастице для достижения инициаторного кодона мРНК RhPV 45

4. Анализ целостности мРНК в ходе экспериментов 46

5. 5'-IRES RhPV не содержит специфических сайтов связывания с компонентами инициаторного аппарата 4 9

6. Структурный анализ 5'-НТО RhPV

7. Рибосомная 40S субчастица и фактор инициации eIF3 образуют стабильный комплекс с IRES-элементом RhPV 51

5 Заключение 52

Введение к работе

Белковый синтез является сложным процессом, регулируемым на нескольких уровнях. Однако после попадания в цитоплазму влиять на эффективность трансляции становится возможным только на уровне стабильности мРНК и скорости образования инициаторных комплексов, и именно эти области регуляции трансляции вызывают повышенный интерес исследователей. Не последнюю роль играет и то, что многие вирусы в процессе эволюции научились перепрограммировать трансляционный аппарат клетки на преимущественное использование вирусных мРНК. Очень часто это достигается именно на стадии инициации за счет наличия в ряде вирусных мРНК сложных структур, называемых участками внутреннего связывания рибосомы или IRES-элементами (от англ. Internal Ribosome Entry Site). Ввиду сложного устройства клеток высших эукариот, до сих пор не разработаны эффективные методы анализа инициации трансляции in vivo. Поэтому, по крайней мере, в ближайшие годы наилучшим методом изучения трансляции останется реконструкция комплексов рибосома*мРНК из очищенных компонентов в сочетании с техникой тоу-принта - ингибирования обратной транскрипции рибосомными комплексами. На сегодняшний день этим методом были определены механизмы инициации трансляции на ряде клеточных и вирусных мРНК.

Показано, что инициация происходит на полноразмерной 5'-НТО RhPV, как в присутствии факторов группы elF4, так и в их отсутствие.

Путем последовательного удаления фрагментов 5'-НТО RhPV было продемонстрировано отсутствие каких-либо специфических участков связывания факторов инициации. Оказалось, что только 200 5'-концевых нуклеотидов неспособны функционировать как IRES, в то время как любой другой достаточно протяженный фрагмент 5'-НТО мог направлять внутреннюю посадку рибосомы. Эти результаты были интерпретированы в свете полученных в этой же работе данных по вовлеченности нуклеотидов 5'-НТО RhPV в образование вторичных структур. Было выяснено, что достаточно протяженные фрагменты 5'-НТО RhPV, обладающие слаборазвитой вторичной структурой, способны неспецифически привлекать компоненты инициаторного аппарата, в частности, образовывать стабильный тройной комплекс MPHK*elF3*40S.

Полученные данные объясняют, почему IRES-элемент RhPV способен функционировать в различных эукариотических клетках. Эта способность может быть использована при создании универсальных векторов для экспрессии генов в клетках самого разного происхождения.

Связывание рибосомы с мРНК и выбор инициаторного кодона

Структура эукариотических мРНК

После этого в рибосоме происходят конформационные изменения, приводящие к снижению сродства elF1 K40S субчастице практически на порядок [241]. Впрочем, elF1 по прежнему остается связанным с 48S комплексом [240], вероятно, за счет взаимодействия с elF3 [221,242]. Было показано непосредственное взаимодействие elF1 с eIF5 [242,243], однако конкретные стадии процесса инициации, на которых это взаимодействие образуется или разрывается, и блокирует ли этот контакт активность elF5 или стимулирует ее, остается неизвестным. Этот белок, являющийся ортологом прокариотического фактора IF1 [111,113], также имеет небольшой молекулярный вес (17-22 кДа) и его удаление летально для дрожжей [244]. Соответственно и свойства его можно разделить на консервативные и специфицеские для эукариот. Как и его прокариотический аналог, IF1, elF1A взаимодействует с elF5B/IF2 [183,222,245-247] и связывается с малой рибосомной субчастицей в районе А-сайта [248,249], и, по всей видимости, стимулирует посадку инициаторной тРНК в составе тройного комплекса в Р-сайт [227,229,250], аналогично своему прокариотическому ортологу [139,183]. elF1A, как и IF1, препятствует ассоциации рибосомных субчастиц [248], и, хотя в других работах этот факт оспаривается [250,251], расхождения можно объяснить различными условиями проведения экспериментов: при повышенной концентрации Мд++ (больше 4 mM) elF1A и elF1 теряют способность предотвращать ассоциацию рибосомных субчастиц. Возможно, in vivo elF1A белок препятствует также аберрантной агрегации 40S субчастиц с образованием димеров [252]. elF1A имеет неспецифические РНК-связывающие свойства [113,244], возможно, необходимые для взаимодействия с 18S рРНК [249], а также взаимодействует напрямую с elF2 и elF3 [222]. В системе сборки 48S in vitro elF1A увеличивает выход 48S комплекса и необходим для эффективного нахождения AUG-кодона на мРНК (З-глобина [236], однако практически не оказывает влияния на сборку 48S на мРНК с неструктурированной 5 -НТО, лишь немного увеличивая процессивность сканирования и стимулируя сборку комплекса в отсутствие факторов группы elF4 [235]. В клетке elF1A может подвергаться фосфорилированию, которое, вероятно, снижает его активность [253]. 2.4.3 elF2 Как уже упоминалось, наиболее существенным отличием эукариот от прокариот является наличие фактора elF2, основная функция которого заключается в доставке инициаторной тРНК на рибосому [246,254]. Хотя в литературе и описаны экзотические случаи инициации белкового синтеза без участия инициаторной тРНК [255,256] или вызывающие определенное сомнение случаи инициации на CUG-триплетах, кодирующих (в отличие инициации на триплетах, отличных от AUG, но распознаваемых инициаторной Мет-тРНК [199,199]) лейцин 258, во всех остальных случаях elF2 оказывается необходим. elF2 состоит из трех субъединиц, обозначаемых а, 3 и у (У млекопитающих 36, 38 и 52 кДа, соответственно). В литературе описано связывание elF2 с GTP, АТР, тРНК, мРНК, а из факторов инициации с elF2B, elF3 и elF5.

Факторы инициации 4-й группы eIF4A, 4В, 4G не являются абсолютно необходимыми для образования 48S комплекса на 5' -концевом IRES-элементе RhPV

Затем реакционную смесь наносили на градиент сахарозы (5-20%) и центрифугировали 4,5 часа при скорости 33000 об/мин в роторе SW41 (Beckman) для разделения 48S комплекса и несвязавшейся мРНК. РНК из обоих пиков экстрагировали смесью фенол-хлороформ, переосаждали и наносили на денатурирующий полиакриламидный гель, и анализировали посредством Фосфоримиджера. Подобным образом мы проанализировали сборку 488-комплекса на мРНК RhPV в присутствии и в отсутствие факторов инициации группы 4. Профили Для анализа вторичных структур б -нетранслируемой области мРНК RhPV мы использовали следующие реагенты: DMS (диметилсульфат) - метилирует N7 гуанина, N1 в аденина, и, в меньшей степени, N3 цитозина, и СМСТ (мето-р- толуолсульфонат 1 -циклогексил-3-(2-морфол ино-этил)-карбодиимид) модифицирует N3 урацила и, менее эффективно, N1 гуанина. При этом, за исключением реакции с остатками гуанина, эти модификации затрагивают функциональные группы азотистых оснований, участвующие в образовании водородных связей с комплементарными основаниями. Таким образом, удается провести реакцию только с основаниями, не участвующими в образовании внуртимолекулярных водородных связей. Также в работе были использованы рибонуклеазы Т1 (специфична к неспаренным и ненаходящимся в стекинге остаткам гуанина), Т2 (неспецифично гидролизует одноцепочечные участки РНК) и V1 (специфична к основаниям, вовлеченным в пространственные взаимодействия, в том числе в стекинг). При последующей обратной транскрипции с меченного праймера, отожженного к исследуемой молекуле РНК, ревертаза терминирует синтез кДНК на основании, предшествующем модифицированному химическими реагентами или нуклеазами. Анализ полученных кДНК электрофорезом в 6% ПААГ в сопоставлении с кДНК сиквенсных реакций, выполненных с использованием того же праймера, позволяет определить, какие основания подвергаются модификации или гидролизу нуклеазами, и, стало быть, не участвуют в образовании вторичных структур. Все реакции модификации и ферментативного гидролиза проводились в условиях, идентичных используемым нами при реконструкции инициаторных 48S комплексов из индивидуальных компонентов (прежде всего, это концентрация ионов К+ и Мд++), поэтому полученные структуры мРНК объективно отражают их состояние в условиях образования инициаторных комплексов. Данные пробинга (некоторые из гелей представлены на рисунках 11А-В), несмотря на отсутствие анализа вовлеченности в пространственные взаимодействия остатков цитидина, а также неканонических вариантов спаривания нуклеотидов, можно с уверенностью утверждать, что AUG-проксимальный участок 5 -НТО находится практически полностью в одноцепочечной конформации. Схематически степень вовлеченности в спаривание оснований на различных участках 5 -НТО мРНК RhPV представлена нарис. 11 Г.

Рибосомная 40S субчастица и фактор инициации eIF3 образуют стабильный комплекс с IRES-элементом RhPV

ГОРБАЧЕВА Л.Р., КИСЕЛЕВА Е.В., САВИНКОВА И.Г., СТРУКОВА С.М.

СОГОРИН Е.А., СЕЛИХАНОВ Г.К., АГАЛАРОВ С.Ч.

Недавно нами описано новое явление, наблюдаемое в процессе трансляции в эукариотической бесклеточной системе: сопряжение инициации и терминации на разных молекулах мРНК. В данной работе мы показали, что данный эффект не зависит от какого-либо определенного способа инициации. Были исследованы мРНК с несколькими лидерными последовательностями, которые требуют наличия разного набора факторов, определяющих успешную инициацию. Даже в случае использования в качестве лидерной последовательности межгенного IRES (Internal Ribosome Entry Site) РНК вируса паралича сверчка, для инициации трансляции которой инициаторные факторы не требуются вовсе, эффект сопряжения оставался явно выраженным, в т.ч. и в опытах в присутствии ингибитора eIF4A - хиппуристанола. Таким образом, данное явление сохраняется и в отсутствие стадии сканирования, а также не зависит от инициаторной тРНК и eIF2. Полученные результаты позволяют предположить, что факторы инициации не вовлечены в механизм сопряжения.

СИДИКИ НИДА, СТРАУБЕ АННА

Внутриклеточный транспорт вдоль микротрубочек дает возможность эффективно перемещать различные клеточные компоненты на дальнее расстояние в крупных эукариотических клетках. В то время как диффузия малых везикул от тела нейрона к окончанию его растущего аксона на расстояние 1 м произошла бы за 200 лет, транспорт с помощью кинезина происходит в течение одной недели. Из этого примера становится ясно, что эволюционное развитие системы внутриклеточного транспорта было тесно связано с развитием сложных форм живых организмов. В геноме человека закодировано 45 кинезинов, восемь из которых относятся к семейству кинезинов-3, осуществляющих транспорт клеточных органелл в направлении плюс-конца микротрубочек. Однако данные о механизме действия кинезинов, их третичной структуре и регуляции пока еще довольно спорные. Представленный обзор призван суммировать последние достижения в области изучения этих замечательных молекулярных двигателей.

СУН ЧЖИХУЭЙ, ПАНЬ ЦЗЕ, СЕ ЛИПИН, ГУН ГУЙХУА, ХАНЬ ШУ, ЧЖАН ВЕЙ, ХУ ЮЦЗЯ

Тиаминпирофосфат является незаменимым для всех живых организмов коферментом. Его биосинтез включает независимые стадии синтеза предшественников: пиримидина и тиазола, которые затем сшиваются. В нашей предыдущей работе нами было показано существование корреляции повышенной экспрессии ActhiS и блокирования синтеза ActhiS с внутриклеточным содержанием тиамина у Acremonium chrysogenum. Однако до сих пор отсутствуют точные данные о структуре и функциях ActhiS. В настоящей работе с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и ЯМР-спектроскопии охарактеризована связанная форма, состоящая из производного ADP - 5-(2-гидроксиэтил)-4-метилтиазол-2-карбоновой кислоты (ADT - 5-(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazole-2-carboxylic acid). Свободная от метаболита форма ActhiS, экспрессированная в клетках, культивируемых на минимальной среде M9, катализировала превращение NAD+ и глицина в ADT в присутствии ионов железа. Кроме того, показано, что остаток цистеина C217 является донором атома серы для образования тиазола. Наши данные подтверждают, что ActhiS является ферментом биосинтеза тиазола и одновременно источником атома серы у A. chrysogenum.

У МЭН, ЧЭНЬ НАНЬ, ХУАН ЧУНЬ-СЯО, ХЭ ЯНЬ

Низкая температура является важным фактором, влияющим на рост, развитие и даже выживание водных животных. В настоящей работе нами было изучено влияние низкой температуры на креветок Litopenaeus vannamei на физиологическом и молекулярном уровнях. Нами были определены последовательности кДНК двух кислород-транспортирующих белков: цитоглобина (Cygb) и нейроглобина (Ngb), структурный анализ которых показал, что они содержат домен, характерный для белков суперсемейства глобинов. Результаты ПЦР в реальном времени показали, что при снижении температуры с 25 до 15 °C уровень мРНК для Cygb и Ngb постепенно увеличивается, после чего вновь снижается при достижении 10 °C в мышцах, желудке и сердце, продолжая повышаться лишь в жаберной ткани. В то же время в печени и поджелудочной железе наблюдалась другая картина изменения уровня их экспрессии: концентрация гемоцианина постепенно снижалась при снижении температуры. Кроме того, была определена активность ферментов, поставляющих электроны на дыхательную цепь, включая лактатдегидрогеназу (LDH) и сукцинатдегидрогеназу (SDH). Было показано, что при понижении температуры активность LDH постепенно возрастает, в то время как активность SDH в этих условиях снижается. Наконец, нами было обнаружено нарушение структуры жабр при низкой температуре, которое усиливалось при дальнейшем понижении температуры. Таким образом, низкая температура оказывает неблагоприятное влияние на метаболизм и морфологию L.vannamei. Полученные результаты могут быть использованы для системного понимания механизмов адаптации креветок к низкой температуре.

МУХАММАД МАДЖИДА АТТА, ФАЛАК САМИЯ, РАШИД НАИМ, ГАРДНЕР КУИРРАТУЛ-ЭНН АФЗА, АХМАД НАЗИР, ИМАНАКА ТАДАЮКИ, АХТАР МУХАММАД

Открытая рамка считывания гена Tk1884 из Thermococcus kodakarensis, кодирующая α-амилазу, была клонирована вместе с нативной сигнальной последовательностью и экспрессирована в клетках Escherichia coli. Ге-терологичная экспрессия гена привела к секреции рекомбинантного белка в культуральную среду. Внеклеточная активность α-амилазы после индукции постепенно возрастала. Белок Tk1884 был выделен из куль-туральной среды. При определении его молекулярной массы с помощью метода масс-спектрометрии с ионизацией электронапылением было обнаружено отщепление нескольких аминокислотных остатков. В связи с этим была определена TV-концевая последовательность очищенного белка Tk1884, которая показала, что сигнальный пептид подвергся расщеплению пептидной связи между остатками Ala26 и Ala27 сигнальной пептидазой E. coli. По нашим сведениям, это первая работа, в которой показано, что сигнальная пептидаза из E. coli распознает и расщепляет сигнальную последовательность архей.

Изучение продолжительности жизни нормальных мышей и мышей с мутацией задержки роста показало, что скорость их вымирания в онтогенезе испытывает воспроизводимые колебания. Положения пиков вымирания на кривых зависимости скорости вымирания от продолжительности жизни (дифференциальные кривые смертности) в значительной степени совпадают как в разнополых группах мышей-мутантов, так и в независимых подгруппах однополых мышей-мутантов. На дифференциальных кривых смертности мышей-мутантов в месячном возрасте имеется пик смертности, отсутствующий у нормальных мышей. У нормальных мышей совпадения в положении большей части пиков наблюдаются в независимых подгруппах самцов и в меньшей части - в независимых подгруппах самок. Это можно объяснить сдвигами пиков вымирания самок в результате выполнения ими детородных функций. Совпадения в положении пиков на дифференциальных кривых смертности животных из независимых групп и подгрупп указывают на закономерное проявление повышенных рисков смерти в определенных возрастах. Эта закономерность может быть объяснена программированием в геноме как сроков наступления повышенных рисков смерти, так и разделяющих их периодов устойчивого развития.

МУСТЯЦА В.В., БОЯХЧЯН А.В., АТАУЛЛАХАНОВ Ф.И., ГУДИМЧУК Н.Б.

Микротрубочки - полимеры белка тубулина и один из главных элементов цитосклета. Они представляют собой полярные филаменты, при этом их направленный к периферии плюс-конец более динамичен, чем обращенный к центру минус-конец. В клетках микротрубочки организованы в сеть, которая непрерывно перестраивается и обновляется за счет переключения индивидуальных филаментов от роста к укорочению и обратно. Благодаря своей динамике и механическим свойствам, микротрубочки участвуют в целом ряде жизненно важных процессов, начиная от внутриклеточного транспорта и заканчивая поиском и перемещением хромосом во время митоза. Динамика микротрубочек регулируется множеством белков, которые располагаются на плюс-концах этих филаментов. Одной из важнейших и наиболее распространенных групп плюс-концевых белков являются белки семейства EB, которые автономно распознают структуры растущих плюс-концов микротрубочек, модулируют их динамику и привлекают на плюс-концы микротрубочек множество белков-партнеров с разнообразными функциями. В этом обзоре мы рассмотрели имеющиеся литературные данные о свойствах и функциях белков семейства EB, уделив особое внимание анализу механизма их взаимодействия с растущими концами микротрубочек.

КОРШУНОВА Г.А., ШИШКИНА А.В., СКУЛАЧЕВ М.В.

В обзоре впервые обобщены данные по дизайну и синтезу биологически активных соединений нового поколения - митохондриально-направленных антиоксидантов, которые представляют собой природные (или синтетические) n-бензохиноны, конъюгированные через липофильный линкер с трифенилфосфониевым или аммониевыми катионами с делокализованным зарядом. Также описан синтез митохондриально-направленных разобщителей окислительного фосфорилирования на основе флуоресцирующих красителей.

СУДНИЦЫНА М.В., ГУСЕВ Н.Б.

Метилглиоксаль, дикарбонильное высокореакционное соединение, образующееся в ходе метаболизма глюкозы, способно модифицировать некоторые фосфолипиды, нуклеиновые кислоты и белки, входящие в так называемый дикарбонильный протеом. Малые белки теплового шока, участвующие в защите клеток от различных неблагоприятных воздействий, могут модифицироваться метилглиоксалем. Вероятность таких модификаций возрастает при нарушениях обмена углеводов (диабет), при использовании гликолиза в качестве основного источника энергии (злокачественные перерождения) и/или при низкой скорости обмена модифицируемых белков. Проанализированы данные по модификации малого белка теплового шока HspB1 (Hsp27) в различных опухолевых клетках и при нарушениях обмена углеводов. Представлены данные о влиянии модификации метилглиоксалем на стабильность, шапероноподобную и антиапоптотическую активность HspB1. Обсуждены результаты исследования модификации α-кристаллинов хрусталика глаза метилглиоксалем. Сопоставлена взаимная зависимость и влияние модификации метилглиоксалем с другими посттрансляционными модификациями кристаллинов хрусталика глаза. Сделан вывод, что несмотря на то что модификация малых белков теплового шока метилглиоксалем не вызывает сомнения, физиологическая значимость этого процесса остается недостаточно понятной и потребуется разработка новых экспериментальных подходов для понимания того, как модификация метилглиоксалем влияет на функционирование малых белков теплового шока в клетке.

ДАЙ СЯНПИН, ЛИ МЭНШУНЬ, ГЭН ФЭН

Дексаметазон широко применяется при лечении множественной миеломы (MM - multiple myeloma), т.к. он проявляет цитотоксический эффект в отношении лимфоидных клеток. Тем не менее значительное число пациентов с множественной миеломой не чувствительны к действию дексаметазона, хотя у некоторых из них наблюдается улучшение состояния при его применения. В настоящей работе нами было показано, что ю-3 полиненасыщенные жирные кислоты (PUFAs - poly-unsaturated fatty acid) повышают чувствительность клеток множественной миеломы к действию дексаметазона путем индукции апоптоза клеток. Чтобы выяснить механизм, с помощью которого PUFAs повышают чувствительность клеток MM к дексаметазону, был использован метод количественной ПЦР в реальном времени. Было установлено, что PUFAs вызывают значительное повышение содержания микро-РНК miR-34a в клетках U266 и первичных клетках множественной миеломы. Трансфекция клеток антагонистом miR-34a или miR-34a agomiR может восстановить или супрессировать активность дексаметазона в клетках U266. С помощью метода репортерной люциферазы и вестерн-блоттинга было показано, что ген Bcl-2 является первичной мишенью для действия miR-34a в клетках MM. Кроме того, нами также было продемонстрировано, что PUFAs индуцируют экспрессию белка p53 в клетках MM после введения дексаметазона. Более того, супрессия p53 с помощью PTF-a, ингибитора p53, регулировала экспрессию miR-34a и также модулировала чувствительность клеток U266 к действию декса-метазона. В целом, полученные в настоящей работе результаты позволяют предположить, что PUFAs усиливают чувствительность клеток MM к дексаметазону путем регуляции p53/miR-34a и, возможно, супрессию гена Bcl-2.

Request

Unfortunately, we have no right to provide any kind of access to this resource in the territory of Western Europe. In any case, we will process your request and contact you with possible variants of solution.

Читайте также:

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.

Вирус паралич Cricket
классификация Вирус
Группа: