Ингибировании репродукции вируса это

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛШЮХОЗЯЙСТВЕШШ НАУК ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯИСТВЕШЮЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

" На правах рукошн.и

ЗЕЛИВЯНСКИЙ Станислав Викторович

ИНГИБИРОВАНИЕ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КОРОВ В КШ'ОЧШК КУЛЬТУРАХ ГЕНАМИ ПРОТИВОВИРУСШК РИВОЗШШ ПШ

(ПЗ.ПО.ОЗ - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации ни соискание ученой степени кандидата биологических наук

РЯООТ.Ч ВШ10ЛН9КЗ £ ЛЙООрЗТОрШТ ГбКНОЙ ITHK6H9pitK ¡КИРОТИН ? ОТДЕЛИ ГвМЧОЙ КНЖЭНврИЙ ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ 0*П0Тс?Х,НпЛОП!И

Н^уч.чий руководит 8ль

доктор оиологических п^ук, проф., '¡.п. —корр. РАО 11 Ткхоненко Т.Н.

Офщ щвлышв оппоненты * доктор о!!ологич9ск1!7 нзук t

проф., ЗйЕриев O.K. какпндат хз^ми'шсккх наук Кэюшш? А. Л. Евду! \ я оргйш?зв>"1Я

.Биологический фэкулътбт Московского Гооудирсть'?нного унивйрситйтэ им. М* Е•Ломоносов.*>•

В '¿20. НЭ ЭSС9Д5Н11П СПбЦНЭЛИЗКрОВЙНКОРО C0B9TS Д*050. "10%ОТ

пj)И FiliHM сельокохозяйствонной о™отэхнолоп?л РАС*СН по йдр9суt ТЧ7550 Г• НГ|Г>КЕ5> ул. ТТ!М1<рЯ39ВСК5Я, Д. "iP. •

О ДИСС^рТЯЦИЭЙ МОЛЕНО О 3 Н ^ К Oi.fli Т1-СЯ

Актуальность проблемы. Исследования последних лот показали ъф^ктивность использования рибозимов и антисмыслових РНК (асРНК) дли подавления репродукции различных вирусов. Кроме того, открытие рибозимов дало совершенно новый инструмент для изучения экспрессии различи!« гонов и их регуляции в клетках. С этой точки зрения вти комплексы адресованных рибополинуклеотидов представляют собой потенциально мощный инструмент в медицинской практике и ветеринарии., так как могут быть использованы в генной терапии, а также дают реальную возможность для создали пород трансгешшх животных, устойчивых к одной или доже нескольким ЛИрусНИМ ШфЖЦИЯМ.

Несмотря на отдельные успехи, достигнутые в лечении и профилактики вирусных инфекций, продолжаются поиски новых подходов к борьбе с ними. К числу подобных подходив несомненно относится разработка технологии создания искусственного антивирусного шилу нити та и тератш с помощью ннтисмыок'вих полинуклеошдов, ьоторио представляют сиоой либо «оРНК, кан

Особую ценность ¡"ибозимнм как (Ычнциалишм чмржшмиччоким

агентом придает их практически абсолютная специфичность и нетоксичпость. Кроме того возмокно создание рекомбинантных илазмид обладающих аддитивностью и тканеспвцифичностыо. Наличие технологии получения трансгенншс иивотных делает использование плазмидных конструкций с генами рибозишшх РНК в сельском хозяйстве весьма актуальным.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось создание рибозим-кодирувдих конструкций, способных эффективно ингибировать репликацию вируса лейкоза коров в культуре клеток.

В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Разработать простую и, надежную систему In vitro для детекции уровня репродукции ВЖ.

2. Создать генно-инженерные конструкции, несущие рибозим-кодирующий ген под контролем различных промоторов.

3. Испытать антивирусное действие полученых конструкций в условиях разработанной модельной системы in vitro.

Научная новизна и практическая значимость.

В настоящей работе впервые показана способность рибозима, направленного против R-области LTR BLV, расщеплять вирусную РНК tri vliro и ингибировать его репликацию в культуре клеток.

Первая часть данной работы посвящена созданию анти-BLV рибозима и изучению условий его оптимальной работы in vitro.

Вторая часть работы связана с разработкой простой и надежной системы тестирования уровня репликации BLV в культуре клеток. Впервые была получена линия клеток FLK-BLV-SEAP, в которой продукция секретируемой щелочной фосфатазы связана с уровнем вирусной репликации. Полученная линия позволяет легко тестировать

влияние различных ингибирущих агентов на репликацию BLV. На заключительном этапе работи Оили сконструированы рекомбинантние нлазмиды несущие ген рибозима. Котрансфекция данных конструкций в клетки CC8I с инфекционной вирусной ДНК и и FI.K-BLV-SKAP сопровождается сштезом рибозимной РНК, обуславливающей эффективное подавление репродукции BLV. Максимальный уровень ингибирования составил ЭО-95% при весовом соотношении вирусного генома и плазмида с рибозимом I/IO при трансфекции клеток CC8I и Г>7 на Зсы чашку при трансфекции клеток FLK-BLV-SEAP для плазмидн pCMVR.

Таким образом впервие показана сносооность рибозима против R-области BLV подавлять его репродукцию In vitro.

Работа представляет не только научный, но и практический интерес, так как плазмиды с генами рибозимов, обладающие ыисокоЛ антивирусной активностью могут быть использовани для получении трансгешшх животных, устойчивых к вирусу Bi.V.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждена на конференциях "Всесоюзное рабочее совещание по молекулярной биологии ДНК-содержащих вирусов, имеицих практическое значение для с/х и медицины" (Киев [991), "Новейшие методы биоинненерии." (Москва 1994).

Публикации. Основные результаты диссертации отражены в трех печатных работах, список которых приводится в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа из: введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и метиды", "Результаты", "Обсуждение . результатов", "Выводы" и списка литературы, включите го 170 бномю! рафнческих ссыпок. Работа

изложена lia 126 страницах матинопистного текста, включая 15 рисунков и 3 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Шшзмидныв вектора. Ttyrn яслсшировании рибогшма и фрагмента генома BLV использовались илазмидные вектора - рС.ЕМ1, рОШ2 (rromega), pSVb (Pharmacia) ¡pRc/CMV (Invitrogen) вектор pMPSVEHE, полученный от Tir. Artelt.; плазмида рВ6490, любезно предоставленная ¡DívSeMkava, шшумвда pI.V12, получешшя от 1)г. Kntólne.

В работе итю'лпнтьжаь следующие клеточные линии: CC8I -кошачьи ^¡ибробласти,, iffp'jиetfoрм ира н ш п ш о вирусом саркомы Раушвра, любезно продостаышш ¡\.И. 'Пш/лиш (Институт канцерогенеза) FLK-BLV - клеточгшл зшншк, иоодчшшая сокультивировагаем овечьих фибробластов с -клетками 'саркоматозного узла больной коровы, полученная от в.н.-с. Шринешсо 'Н.'Г.

Методы. Все генно-4шаюнерные манипуляции проводились но стандартным протоколам, изложенным в Maniatls et al (1989).

Получение РНК-транскриптов In vitro.Синтез Pint проводили на предварительно линеаризированных плазмидах путем обработки их рестриктазами Pvu II или EooR I в объеме 50 мкл в следующих условиях: 40 мМ Трис HCI, pli 7,5, 13 мМ MgCl^, 2 мМ спермидина, 10 мМ Ш)Т, 10 ед РШазного ингабитора, по 800 цМ кавдого NTP, 100 мкКи [а32Р] Ш'Р и 10 ед Врб РНК полимеразы. После 1ч инкубации при 37°С добавляли 50 ед. ДНКазн I и инкубировали 10 мин. После якотрпкции фэнол-хлороформом и осаждения отннолом FHK хранили при

20°С. Процент расщепления субстрата определяли по формуле OOx(PI+P2)/(C+PI+P2), где С, PI и Р2 отражают соответственно оличество субстрата и продуктов, измеренных в расп/мин..

Расщепление субстратной РНК рибозимом. [а-Рой]иТР мэчошше ибозим и субстрат после денатурации в течение 2 мин при 90°С и емедленного охлаждения до 25°С инкубировали в объеме 50)1.1, одержащем БОмМ Тг1в-НС1 рН 7,6 после добавления MgClg Д" онцентрации 10 тМ. РНК-субстрат брали в концентрации 100 пМ, а ибозим 20 riM. Реакцию проводили при 25°С в то четка 8 часов, ачальный температурный интервал брался в пределах от 0° до Б6°С, рН 5,6-9. Оптимальной была определена температура в 25°С и р!1 ,Г>.

Ltertek автоматическом ридере (Plow). Активность щелочноП эсфлтачн п.ннп в миллпединицах (мй) на мл.

Ретровирусы представляют значительный интерес в качестве мишени для действия рибоэимов, так как являются возбудителями ряда заболеваний человека и животных. В частности, вирус лейкоза коров (BLV) способен вызывать у крупного рогатого • скота патологическое состояние, характеризующееся феноменом персистентного лимфоцитоза, а в некоторых случаях и лимфолейкоза. Уровень инфицированное™ скота на территории России очень высок, поэтому проблема ингибирования BLV с помошыо рибозимов имеет не только теоретический, но и практический интерес.

Судя по данным, полученным в экспериментах по ингибированию репродукции вирусов с, помощью асРНК и рибозимов других ретровирусов наиболее удобной мишенью является R область. Во-первых, часть R региона входит в состав всех субгеномных РНК этого вируса. Во-вторых, этот регион играет существенную роль в репликации вируса. Это определяет возможность ингибирования BLV как на уровне репликации и транскрипции, так и на уровне трансляции, что может существенно усилить ингибирующий эфр-жт.

Получение рекомбинантных плазмид для экспрессии рибоэимной РНК и РНК-мишени in vitro.

В позиции 356-358 R-обласги генома BLV находится потенциальный сайт CUC для расщепления рибозимом. В работе показано, что антисмысловая РНК, включающая область 359-559 яф|октивно ингибировала репликацию вируса. Исследование вторичной

структуры, участка LTR BLV с координатами 200-500, .проведенное с использованием программы DNASIS (Hitachi), показало, что выбранный в качестве мишени сайт с указанными выше координатами не принимает участие в образовании шпилечной структуры, следовательно вероятность того, что он будет доступен для атаки рибозимом достаточно высока. К сайту-мишени химически синтезировали два рибозима, структура одного из них показана на рисЛА. Рибозимы содержали идентичные каталитические центры, различилиоь лишь длиной фланкирующих последовательностей, обеспечивающих их взаимодействие с РНК-мишенью. (Данный раздел работы проводился совметсно с н.с. отдела генной инженерии Карповым В.А.)

Каталитический центр рибозима I состоящий из 22 нуклеотидов был фланкирован 7-ю нуклеотидами слева и 10-ю скрапа комплементарными области 351-368 R-области LTH BLV. Рибозим был клонирован по Sma I сайту в вектор pGEM1, полученная конструкции получила название pGRI8. Нуклеотидная последовательность второю рибозима, фланкировашшя сайтами для рестриктаз Sph I и Bainfl I была клонирована в вектор pGEM 3Zt по соответствующим сайтам. Полученная плазмида получила название pGR3l5. Плазмида pULVc' получена на основе плаэмиды pGEM2 путем клонирования в Sma I сайг 88-446 п.н. генома BLV, несущего сайт расщепления (РисЛА). нуклеотидов.

Инкубирование [a32-P]UTP-меченных рибозима и субстрата в присутствии Mg2+ ионов, приводило к специфическому раещъшюыды РНК-субстрата длиной 513 нуклеотидов, содержащем область 4-15 LTR BLV с образованием фрагментов длиной 308 и 205 нуклеотнд-л;

(см PI и Р2 фрагменты на рис.2). Через 8 часов инкубации субстра расщеплялся на 80$.

2. Оптимизация условий расщепления РНК-мишени In vitro.

С целью выявления оптимальных условий расщепления, реакци проводилась при изменении различных параметров. Как видно и рис.4 при изменении рН среда расщепление происходит наиболе эффективно при нейтральных и слабощелочных значениях. При pi! расщепления не наблюдается, но при увеличении концентрации ОН ионов скорость расщепления возрастает более чем в 100 ро достигая своего максимума при рН 7,3-7,6. Дальнейшее увеличени значений рН среды существенно не влияет на скорость реакци расщепления (рис.3).

Для определения оптимальной температуры реакции смесь РН pGR18 или pGR315 и pGLV2 денатурировали 90 сек при 9Б°С, а аате немедленно охлаждали до О, Б, 10, 20, 25, 37, 56 , 65°С

инкубировали В присутствии 10 мМ Mg в течении 3 часог Полученные данные показывают, что при увеличении температур скорость реакции сначала линейно возрастает достигая своег максимума при 25°С (для pGR1S) или 56°С (для pGR315), а зат« снижается (рис.4). Эффективность расщепления при оптимальнс температуре, как видно из рисунка, выше у короткого рибозима. Щ инкубации 100 пМоль субстрата с 20 пМоль рибозимов мы нaблюдaJ расщепление субстрата при оптимальных условияхна 86 и 6? соответственно. На основании полученных данных в дальнейше исследование брался лишь рибозим с короткими фланкируицю

поолндинншлыюстями, кок работающий болев &ф1ч1пиьно

Противовирусные препараты — соединения природного или синтетического происхождения, применяющиеся для лечения и профилактики вирусных инфекций. Действие многих из них избирательно направлено на различные стадии развития вирусной инфекции и жизненного цикла вирусов.

В настоящее время известно более 500 вирусов, возбудителей заболеваний человека. Вирусы содержат одно- или двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (РНК) или дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), заключенную в белковую оболочку — капсид. У некоторых из них есть и внешняя оболочка из липопротеидов. Многие вирусы содержат ферменты или гены, обеспечивающие репродукцию в клетке-хозяине. В отличие от бактерий у вирусов нет собственного обмена веществ: они используют метаболические пути клетки-хозяина.

РНК-содержащие вирусы или синтезируют матричную РНК (мРНК), или сама РНК выполняет функцию мРНК. На ней синтезируются вирусные белки, в том числе РНК-полимераза, при участии которой образуется мРНК вируса. Транскрипция генома некоторых РНК-содержащих вирусов осуществляется в ядре клетки-хозяина. Под действием обратной транскриптазы ретровирусов на основе вирусной РНК синтезируется комплементарная ей ДНК (провирус), которая встраивается в геном клетки-хозяина. В дальнейшем при транскрипции образуется как клеточная РНК, так и мРНК вируса, на которой синтезируются вирусные белки для сборки новых вирусов. Вирусы и заболевания, которые ими вызываются, отражены в табл. 1.

На стадии заражения вирус адсорбируется на клеточной мембране и проникает в клетку. В этот период применяются препараты, нарушающие этот процесс: растворимые ложные рецепторы, антитела к мембранным рецепторам, ингибиторы слияния вируса с клеточной мембраной.

На следующем этапе начинается внутриклеточный синтез вирусных компонентов. На этом этапе эффективны ингибиторы вирусных ДНК-полимераз, РНК-полимераз, обратной транскриптазы, геликазы, праймазы, интегразы. На трансляцию вирусных белков действуют интерфероны (ИФН), антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы и ингибиторы регуляторных белков. На протеолитическое расщепление воздействуют ингибиторы протазы.

ИФН и ингибиторы структурных белков активно воздействует на сборку вируса.

Заключительный этап репликационного цикла включает выход дочерних вирионов из клетки и гибель инфицированной клетки-хозяина. На этом этапе эффективны ингибиторы нейраминидазы, противовирусные антитела и цитотоксические лимфоциты.

Существуют различные классификации противовирусных средств. В данной статье представлена классификация по воздействию на тот или иной вирус (табл. 2).

Рассмотрим противогриппозные и противогерпетические препараты.

Классификация противовирусных препаратов, разрешенных к применению на территории России.

• руппа противогриппозных препаратов:
  – Амантадин;
  – Арбидол;
  – Осельтамивир;
  — Римантадин.
• Препараты, действующие на герпесвирусы:
  – Алпизарин;
  – Ацикловир;
  – Бонафтон;
  – Валацикловир;
  – Ганцикловир;
  – Глицирризиновая кислота;
  – Идоксуридин;
  – Пенцикловир;
  – Риодоксол;
  – Теброфен;
  – Тромантадин;
  – Фамцикловир;
  – Флореналь.
• Антиретровирусные препараты:
  – Абакавир;
  – Ампренавир;
  – Атазанавир;
  – Диданозин;
  – Залцитабин;
  – Зидовудин;
  – Индинавира сульфат;
  – Ламивудин;
  – Нелфинавир;
  – Ритонавир;
  – Саквинавир;
  – Ставудин;
  – Фосфазид;
  – Эфавиренз.
• Другие противовирусные препараты:
  – Инозин пранобекс;
  – Интерферон альфа;
  – Интерферон альфа-2;
  – Интерферон альфа-2b;
  – Интерферон бета-1а;
  – Интерферон бета-1b;
  – Йодантипирин;
  – Рибавирин;
  – Тетраоксо-тетрагидронафталин (Оксолин);
  – Тилорон;
  – Флакозид.

Арбидол — производное индолкарбоновой кислоты. Механизм действия препарата складывается из подавления репродукции вируса гриппа, влияния на синтез ИФН, повышения количества Т-лимфоцитов и функциональной активности макрофагов, а также антиоксидантного эффекта.

Препарат проникает в неизмененном виде как в незараженные, так и в зараженные клетки и определяется в ядерной и цитоплазматической фракциях. Арбидол ингибирует процесс слияния липидной вирусной оболочки с мембранами эндосом (при рН 7,4), приводящий к высвобождению вирусного генома и началу транскрипции. В отличие от амантадина и римантадина, Арбидол ингибирует освобождение самого нуклеокапсида от наружных белков, нейраминидазы и липидной оболочки. Таким образом, Арбидол действует на ранних стадиях вирусной репродукции.

У препарата отсутствует штаммовая специфичность (в культурах клеток он подавляет репродукцию вируса гриппа А на 80%, вируса гриппа В — на 60% и вируса гриппа С — на 20%, а также воздействует и на вирус птичьего гриппа, однако слабее, чем на репродукцию человеческих штаммов вируса гриппа).

Синтез ИФН нарастает, начиная с приема 1 таблетки до 3 таблеток. Однако дальнейшего увеличения уровня ИФН при приеме Арбидола не наблюдается. Быстрое нарастание синтеза ИФН может оказывать профилактическое действие при приеме препарата до начала заболевания гриппом.

Арбидол оказывает иммуномодулирующее действие, приводя к повышению общего количества Т-лимфоцитов и Т-хелперов. Причем нормализация данных показателей наблюдалась у пациентов с исходно сниженным числом CD3- и CD4-клеток, а у лиц с нормальным функционированием клеточного звена иммунитета практически отсутствовали изменения количества Т-лимфоцитов и Т-хелперов. При этом применение Арбидола не ведет к существенному снижению абсолютного числа Т-супрессорных лимфоцитов — таким образом, стимулирующая активность препарата не связана с угнетением функции супрессорных клеток. Арбидол увеличивает общее число макрофагов с поглощенными бактериями и фагоцитарное число. Предполагается, что активирующими стимулами для фагоцитарных клеток явились цитокины и, в частности, ИФН, продукция которого усиливается под воздействием препарата. Увеличивается также содержание натуральных киллеров — NK-клеток, что позволяет характеризовать препарат как индуктор активности естественных киллеров.

Препарат быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Т_1/2 составляет 16–21 ч. Экскретируется в неизмененном виде с калом (38,9%) и мочой (0,12%). В течение первых суток выводится 90% введенной дозы.

Лекарственные взаимодействия Арби­дола с другими лекарственными препаратами в литературе не описаны.

Практически единственными побочными эффектами препарата являются аллергические реакции. Препарат разрешен к применению с 2-летнего возраста.

Арбидол обладает достаточно широким спектром противовирусного действия и используется для профилактики и лечения гриппа типов А и В, в том числе осложненного бронхитом и пневмонией; острых респираторных заболеваний (ОРВИ); хронического бронхита, пневмонии, рецидивирующей герпетической инфекции; в послеоперационном периоде — для нормализации иммунного статуса и профилактики осложнений.

Амантадин и римантадин — производные адамантана. Оба препарата даже в малых дозах подавляют репродукцию вируса А. Их противовирусная активность обусловлена двумя механизмами.

Во-вторых, они могут действовать и на этапе сборки вируса, по-видимому, за счет изменения процессинга гемагглютинина. Этот механизм возможен у некоторых штаммов вирусов.

Среди диких штаммов устойчивость к препаратам возникает редко, однако от больных, принимающих их, получают устойчивые штаммы. Чувствительность и устойчивость вирусов к амантадину и римантадину перекрестная.

Оба препарата хорошо всасываются при приеме внутрь, имеют большой объем распределения. Большая часть амантадина выводится с мочой в неизмененном виде. Период полувыведения (Т_1/2) у молодых людей составляет 12–18 ч, у пожилых возрастает почти вдвое, а при почечной недостаточности увеличивается еще больше. Поэтому дозу препарата необходимо уменьшать даже при незначительном изменении функции почек. Римантадин активно метаболизируется в печени, Т_1/2 в среднем составляет 24–36 ч, 60–90% препарата выводится с мочой в виде метаболитов.

При приеме обоих препаратов наиболее часто отмечают незначительные дозозависимые нарушения со стороны ЖКТ (тошнота, снижение аппетита) и центральной нервной системы (ЦНС) (раздражительность, бессонница, нарушение концентрации внимания). При приеме высоких доз амантадина возможно значительное нейротоксическое действие: спутанность сознания, галлюцинации, эпилептические припадки, кома (эти эффекты могут усиливаться при одновременном приеме Н₁-блокаторов, М-холиноблокаторов, психотропных средств и этанола). Безопасность применения во время беременности не установлена. Разрешено применение с 7-летнего возраста.

Препараты применяются для профилактики и лечения гриппа А. Их прием во время эпидемий гриппа позволяет избежать инфекции в 70–90% случаев. У лиц с неосложненным гриппом А лечение препаратами в течение 5 дней в возрастных дозировках, начатое на ранней стадии заболевания, на 1–2 сут уменьшает длительность лихорадки и общих симптомов, ускоряет выздоровление и иногда сокращает период выделения вируса.

Осельтамивир является неактивным предшественником, который в организме превращается в активный метаболит — осельтамивира карбоксилат. Он является переходным аналогом сиаловой кислоты и избирательным ингибитором нейраминидазы вирусов гриппа А и В. Кроме того, он подавляет штаммы вируса гриппа А, устойчивые к препаратам — производным адамантана.

Нейраминидаза вируса гриппа отщепляет концевые остатки сиаловых кислот и, таким образом, разрушает рецепторы, находящиеся на поверхности клеток и новых вирусов, т. е. способствует выходу вируса из клетки по окончании репродукции. Активный метаболит осельтамивира вызывает изменения в активном центре нейраминидазы и подавляет ее активность. Происходит агрегация вирусов на поверхности клетки и замедляется их распространение.

Устойчивые штаммы вируса гриппа А обнаруживают у 1–2% больных, принимающих препарат. Устойчивых штаммов вируса гриппа В на сегодняшний день не обнаружено.

При приеме внутрь препарат хорошо всасывается. Прием пищи не влияет на его биодоступность, но снижает риск побочного действия на ЖКТ. Препарат подвергается ферментативному гидролизу в ЖКТ и печени с образованием активного метаболита. Объем распределения препарата приближается к объему жидкости в организме. Т_1/2 осельтамивира и его активного метаболита составляет 1–3 и 6–10 ч соответственно. Оба соединения выводятся главным образом почками в неизмененном виде.

При приеме внутрь возможны незначительные неприятные ощущения в животе и тошнота, которые уменьшаются при приеме препарата во время еды. Желудочно-кишечные расстройства обычно проходят через 1–2 сут, даже если больной продолжает прием препарата. Клинически значимых взаимодействий осельтамивира с другими препаратами не выявлено. Препарат применяют у детей старше 1 года.

Осельтамивир применяют для лечения и профилактики гриппа. Профилактический прием осельтамивира в период эпидемий снижает заболеваемость как среди вакцинированных противогриппозной вакциной, так и среди невакцинированных. При лечении гриппа этим препаратом выздоровление наступает на 1–2 сут раньше, а количество бактериальных осложнений снижается на 40–50%.

Прежде чем перейти к обсуждению противогерпетических средств, необходимо вспомнить различные вирусы герпеса и заболевания, вызываемые ими (табл. 4). К сожалению, в арсенале современных противовирусных средств нет препаратов, действующих на все вирусы герпеса одновременно (табл. 5).

Вирус простого герпеса типа 1 вызывает поражение кожи, рта, пищевода и головного мозга, вирус простого герпеса типа 2 — поражение наружных половых органов, прямой кишки, кожи и мозговых оболочек. Первым из допущенных к применению противогерпетических препаратов был видарабин (1977). Однако ввиду высокой токсичности его применяли для лечения заболеваний, вызванных вирусом простого герпеса и Varicella–zostervirus, лишь по жизненным показаниям. С 1982 г. для лечения больных с менее тяжелым течением заболевания стали применять ацикловир.

Ацикловир — ациклический аналог гуанозина, а валацикловир — L-валиновый эфир ацикловира. Ацикловир подавляет синтез вирусной ДНК после фосфорилирования вирусной тимидинкиназой внутри зараженных клеток. Образующийся в клетке ацикловиртрифосфат встраивается в синтезируемую в клетке-хозяине цепь ДНК, что приводит к прекращению роста вирусной цепи ДНК. Молекула ДНК, в состав которой входит ацикловир, связывается с ДНК-полимеразой, необратимо инактивируя ее.

Устойчивость вируса может возникнуть в результате снижения активности вирусной тимидинкиназы и изменения вирусной ДНК-полимеразы. Изменение активности ферментов возникает в результате мутаций.

Биодоступность ацикловира при приеме внутрь составляет всего 10–30% и уменьшается с увеличением дозы. В отличие от ацикловира, биодоступность валацикловира при приеме внутрь достигает 70%. Препарат быстро и почти полностью превращается в ацикловир. Ацикловир проникает во многие биологические жидкости, в том числе в содержимое везикул при ветряной оспе, спинно-мозговую жидкость, накапливается в молоке, околоплодных водах и плаценте. Концентрация его во влагалищном содержимом колеблется в широких пределах. Сывороточная концентрация препарата у матери и новорожденного примерно одинаковы. Через кожу препарат практически не всасывается. Т_1/2 ацикловира составляет в среднем у взрослых 2,5 ч, у новорожденных — 4 ч, у больных с почечной недостаточностью может увеличиваться до 20 ч. Препарат практически полностью выводится почками в неизмененном виде. При беременности фармакокинетика препаратов не меняется.

Как правило, ацикловир переносится хорошо. При применении мази на основе полиэтиленгликоля возможно раздражение слизистой половых органов и чувство жжения. При приеме внутрь препарат изредка вызывает головную боль, головокружение, сыпь и диарею. Еще реже отмечаются почечная недостаточность и нейротоксическое действие. Побочные эффекты валацикловира сходны с таковыми у ацикловира — тошнота, диарея, головная боль; высокие дозы могут вызвать спутанность сознания, галлюцинации, поражения почек и — очень редко — тромбоцитопению. При внутривенном введении больших доз ацикловира могут развиться почечная недостаточность и поражения ЦНС.

Фамцикловир сам неактивный, но при первом прохождении через печень быстро превращается в пенцикловир. Пенцикловир — это ациклический аналог гуанозина. Механизм действия препарата сходен с механизмом действия ацикловира. Как и ацикловир, пенцикловир действует главным образом на вирусы простого герпеса и Varicella–zostervirus. Устойчивость к пенциклавиру в клинике встречается редко.

В отличие от пенцикловира, биодоступность которого при приме внутрь составляет лишь 5%, фамцикловир хорошо всасывается. При приеме фамцикловира биодоступность пенцикловира возрастает до 65–77%. Прием пищи совместно с препаратом замедляет всасывание последнего, но в целом биодоступность не снижается. Объем распределения пенцикловира в 2 раза превышает объем жидкости в организме, Т_1/21/2 увеличивается до 9,9 ч. Препарат легко удаляется при гемодиализе.

Переносится ацикловир хорошо, но иногда возможно возникновение головной боли, тошноты, диареи, крапивницы, а у пожилых людей — галлюцинаций и спутанности сознания. Препараты для местного применения могут вызвать контактный дерматит и изъязвления.

Безопасность препарата во время беременности, а также взаимодействие его с другими лекарственными средствами не установлена.

Ганцикловир — это ациклический аналог гуанозина. Механизм действия препарата сходен с механизмом действия ацикловира. Активен в отношении всех герпесвирусов, но наиболее эффективен в отношении цитомегаловируса.

Биодоступность ганцикловира при приме внутрь во время еды составляет 6–9% и несколько меньше при приеме натощак. Валганцикловир хорошо всасывается и быстро гидролизуется до ганцикловира, биодоступность которого возрастает до 61%. При приеме валганцикловира во время еды биодоступность ганцикловира повышается еще на 25%. При нормальной функции почек Т_1/2 составляет 2–4 ч. Более 90% препарата выводится почками в неизмененном виде. При почечной недостаточности Т_1/2 увеличивается до 28–40 ч.

Основной дозалимитирующий побочный эффект ганцикловира — угнетение кроветворения (нейтропения, тромбоцитопения). У 5–15% больных отмечают поражения ЦНС разной степени тяжести (от головной боли до судорог и комы). При внутривенном введении возможны флебиты, азотемия, анемия, сыпи, лихорадка, изменение биохимических показателей печени, тошнота, рвота, эозинофилия.

У лабораторных животных препарат оказывал тератогенное и эмбриотоксическое действие, необратимо нарушал репродуктивную функцию. Цитостатические препараты усиливают побочное действие ганцикловира на костный мозг.

Идоксуридин — йодсодержащий аналог тимидина. Механизм противовирусного действия до конца не изучен. Известно, что фосфорилированные производные препарата встраиваются в вирусную и клеточную ДНК, но ингибируют репликацию только вирусной ДНК. При этом ДНК становится более хрупкой, легко разрушается, при ее транскрипции чаще возникают ошибки. Устойчивые штаммы выделяют от больных герпетическим кератитом, получавших идоксуридин. Препарат разрешен лишь для местного применения. При его использовании возможны боль, зуд, воспаление и отек в области глаз, аллергические реакции.

Успехи антимикробной терапии ХХ столетия привели к почти полному контролю над бактериальными инфекциями. Задачей инфекционистов и фармакологов ХХI века является обеспечение контроля над вирусной инфекцией. Помимо высокой эффективности новые противовирусные препараты должны обладать хорошей переносимостью. В настоящее время разрабатываются новые средства с принципиально новыми механизмами действия. Перспективными могут оказаться средства для подавления патологических иммунных реакций и иммунотерапия моноклональными антителами и вакцинами.

Н. М. Киселева, кандидат медицинских наук, доцент
Л. Г. Кузьменко, доктор медицинских наук, профессор
РГМУ, Москва

Предложено применение алкилирующих производных фосфотиоатных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов в качестве ингибитора репродукции ВИЧ. Данные соединения отличаются наиболее высокой эффективностью в ряду испытанных производных фосфотиоатных аналогов олигодезоксирибонуклеотидов. Изобретение применяется для подавления репродукции ВИЧ типа 1. 2 ил., 1 табл.

Фосфотиоатные аналоги олигонуклеотидов (ФТАО) и их производные нашли широкое применение в качестве биологически активных соединений 7. По своим свойствам ФТАО отличаются от природных олигонуклеотидов устойчивостью к действию клеточных нуклеаз, что способствует их длительной сохранности в клеточной среде и приводит к увеличению биологической активности таких препаратов.

Известно, что наиболее выраженным ингибирующим свойством среди известных производных ФТАО, испытанных на анти-ВИЧ активность, обладают холестероловые производные ФТАО 4. Однако такие производные обладают недостаточно высокой активностью, поскольку блокирование репродукции вируса в данном случае происходит за счет связывания их с компонентами вирусных частиц, которое является обратимым.

В случае воздействия реакционноспособных производных ФТАО может происходить не только обратимое связывание реагента с компонентами вирусных частиц, но и необратимая модификация составных компонентов вируса, обеспечивающих различные этапы его размножения. Вследствие этого введение реакционноспособной группы в состав ФТАО может в значительной мере повысить эффективность ингибирования репродукции вируса. Однако, из-за высокой нуклеофильности фосфотиоатной группы не исключается самомодификация межнуклеотидных фосфотиоатных групп под воздействием реакционноспособной группировки, вводимой в состав ФТАО [9]. Как следствие, такая самомодификация может приводить к потере реакционной способности реагента. Проявление повышенного эффекта ингибирования репродукции вируса в этом случае не очевидно и может в существенной мере зависеть от нуклеофильности модифицируемых соединений и компонентов среды и их концентрации, а также от избирательности реакционноспособной химической группировки, вводимой в состав ФТАО.

Известны реакционноспособные алкилирующие производные ФТАО общей формулы (I), которые в присутствии нулеофильных соединений в среде способны их модифицировать 9. Однако на сегодняшний день такие производные ФТАО на анти-ВИЧ активность не испытаны.

Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности ингибирования репродукции ВИЧ в ряду производных ФТАО и расширение ассортимента производных ФТАО, обладающих анти-ВИЧ активностью.

Поставленная задача решается применением описанных [10, 11] реакционноспособных алкилирующих производных ФТАО общей формулы (I) в качестве ингибиторов репродукции вируса иммунодефицита человека.

Данные производные получают исходя из полностью деблокированных фосфотиоатных олигонуклеотидов общей формулы (I), где RCl = -ОН, путем предварительной активации 3'-концевой фосфатной группы в присутствии конденсирующей пары трифенилфосфин - дипиридилдисульфид по описанному ранее методу [10, 11] .

Реакционноспособная RCl группа в используемых соединениях (I) представляет собой остаток ароматического азотистого иприта, который способен через образование промежуточного этилениммониевого катиона алкилировать различные нуклеофилы [9, 12].

В качестве контрольного соединения для оценки анти-ВИЧ эффекта было использовано холестероловое производное ФТАО, поскольку из литературных данных известно, что среди известных производных ФТАО холестероловые производные ФТАО проявляют наибольшую анти-ВИЧ активность 3.

Для проведения испытаний был синтезирован антисмысловой 12-звенный фосфотиоатный аналог олигонуклеотида структуры GpsCpsApsTpsCpsApsApsGpsCpsApsGpsCp (II), комплементарный области (+)-цепи ДНК ВИЧ-1 (нуклеотиды 7516-7527) [13]. На основе фосфотиоатного олигонуклеотида (II) по методу [10] были получены его холестероловое GpsCpsApsTpsCpsApsApsGpsCpsApsGpsCpNH(CH₂)₂C(O)-Chol (III) и алкилирующее GpsCpsApsTpsCpsApsApsGpsCpsApsGpsCp-RCl (IV) производные, модифицированные по 3'-концу и несущие в этом положении молекулы остаток холестерина или реакционноспособную алкилирующую RCl-группу. Была проведена сравнительная оценка эффективности ингибирования репродукции ВИЧ-инфекции этими соединениями (олигонуклеотидными производными (III) и (IV)).

Ингибирование репродукции ВИЧ включает культивирование первично инфицированных ВИЧ лимфоидных клеток МТ-4 в присутствии олигонуклеотидных препаратов (III) и (IV), конечная концентрация которых в культуральной среде составляет 10,0 - 0,01 мкМ, на протяжении одного пассажа - в течение 4 суток.

Об ингибировании репродукции ВИЧ в клетках судят по снижению накопления вирусспецифического белка p24 (по данным иммуноферментного анализа), а также по увеличению жизнеспособности клеток, определяемой методом исключения трипановым синим, на 4-е сутки культивирования по сравнению с контролем.

Полученные экспериментальные данные приведены в таблице и в виде графических иллюстраций на фиг. 1 и 2, из которых видно, что алкилирующее фосфотиоатное производное (IV), фрагмент которого несет реакционную RCl-алкилирующую группировку на 3'-конце, в концентрации 1 мкМ практически на 100% защищает клетки от гибели, тогда как защитный эффект холестеролового производного (III) того же олигонуклеотида GpsCpsApsTpsCpsApsApsGpsCpsApsGpsCp в той же концентрации не превышает 40%. При этом дозовая концентрация препарата, необходимого для защиты клеток от гибели (PD₅₀) и для ингибирования репродукции вируса (ID₅₀) на 50%, для алкилирующего и холестеролового производного (IV) и (III) составляют 0.06 и 1.97 мкМ, и 0.14 и 3.4 мкМ соответственно. Т. е. алкилирующее производное (IV) по этим параметрам (PD₅₀ (12ps-Chol)/PD₅₀(12ps-RCl) = 1.97/0.06= 32.8; ID₅₀(12ps-Chol)/ID₅₀(12р8-RCl) = 3.4/0.14 = 24.3; ) более чем в 20 раз эффективнее, чем холестероловое производное (III).

Таким образом, впервые установлена способность алкилирующих производных ФТАО ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита человека 1 типа в культуре клеток, не известная ранее, причем эффективность ингибирования таким препаратом значительно выше эффективности холестеролового препарата, обладающего наибольшей среди известных производных ФТАО анти-ВИЧ активностью. Эффект обнаружен уже при длине цепи в 12 нуклеотидных звеньев. На основании общих закономерностей действия таких препаратов проявляемый эффект в ряду 13-30 должен быть по крайней мере не меньше, чем при длине цепи, равной 12 [3, 4].

Приведенные ниже конкретные примеры подробно раскрывают сущность изобретения.

Пример 1. Оценка цитотоксичности соединений.

Пример 2. Изучение влияния алкилирующего и холестеролового производного фосфотиоатного аналога олигонуклеотида на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток.

Полученные экспериментальные данные приведены в таблице. На основании этих данных строят дозозависимую кривую и определяют концентрацию соединений, на 50% снижающую накопление вирусспецифического белка p24 (ID₅₀). Кроме того, на основании рассчитанной согласно [13] степени защиты инфицированных клеток от гибели в результате вирусной инфекции на 4-е сутки культивирования в присутствии препаратов в различных концентрациях строят дозозависимую кривую и определяют концентрацию соединений, на 50% защищающую клетки от гибели (PD₅₀). Дозозависимые кривые и количественные характеристики ингибирования репродукции ВИЧ-1 для производных ФТАО (III) и (IV) представлены на фиг. 1, 2 и в таблице.

Положительный эффект, заключающийся в высокой степени подавления размножения ВИЧ в культуре клеток холестероловым и алкилирующим производными (III) и (IV), выражен количественными показателями ингибирования: ID₅₀ = 3.4 и 0.14 мкМ (по снижению накопления p24) и PD₅₀ = 1.97 и 0.06 мкМ (по защите инфицированных клеток от гибели) соответственно.

Таким образом, на примере испытанных конкретных соединений показано, что алкилирующие производные ФТАО обладают способностью ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита человека 1 типа в культуре клеток, причем эффективность таких препаратов может значительно (более чем в 20 раз) превышать эффективность известных холестероловых производных ФТАО.

Следует отметить, что по предварительным оценкам количество одной дозы предлагаемого препарата, необходимого для полного подавления репродукции ВИЧ в организме человека и действующего в течение 4-х суток, составит 16 мг, а стоимость такой дозы в среднем приблизительно 15-75 $. Количество же и стоимость такой же дозы холестеролового препарата ФТАО, необходимого для полного подавления репродукции ВИЧ, при этом должна быть выше не менее чем в 20 раз. Это указывает на перспективность предлагаемого ингибитора репродукции ВИЧ для создания лекарственных средств, пригодных для терапии СПИДа.

Список литературы: 1. Agrawal S., Goodchild J., Civeira M., Sarin P.S., Zamecnik P.C. Phosphoroamidate, phosphorothioate and methilphosphonate analogs of oligodeoxynucleotide: inhibitors of human immunodeficiency virus. // Nucleosides & Nucleotides, 1988, v. 8, p. 819-823.

2. Agrawal S., Goodchild J., Civeira M.P., Thornton A.H., Sarin P.S. and Zamecnik P.C. Oligodeoxynucleoside phosphoramidates and phosphorothioates as inhibitors of human immunodeficiency virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988. v. 85. p. 7079-7083.

3. Stein C.A., Pal R., De Vico A.L., Hoke G., Mumbauer S., Kinstler O., Sarngadharan M. G. , Letsinger R.L. Mode of action of 5'-linked cholesteryl phosphorothioate oligodeoxynucleotides in inhibiting syncytia formation and infection by HIV-1 and HIV-2 in vitro // Biochemistry, 1991, v. 30, N 9, p. 2439-2444.

4. Letsinger R. L., Znang G., Sun D.K., Ikeuchi Т., Sarin P.S. Cholesteryl-conjugated oligonucleotides: synthesis, properties, and activity as inhhibitors of replicatioon of human immunodeficiency virus in cell culture // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, v. 86, p. 6553-6556.

5. Temsamani J., Kubert M., Tang J., Padmapria A., Agraval S. Cellular uptake of oligodeoxynucleotide phosphorothioates and their analogs // Antisense research and development, 1994, v. 4, N 1, p. 35-42.

6. Cohen J.S. (ed): "Oligonucleotides: Antisense inhibitors of gene expression". Topic in Molecular and Structural Biology, v. 12, 1989, London: The Macmillan Press LTD.

7. Knorre D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F., Lebedev A.L., Fedorova O.S. (1993) Design and targeted reactions of oligonucleotide derivatives. CRC Press, Inc Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo.

8. Stein C.A., Subasinghe C., Shinozuka K., Cohen J.S. Physicochemical properties of phosphorothioate oligonucleotides // Nucleic Acids Res., 1988, v. 16, N 8, p. 3209-3221.

9. Амирханов Н.В., Зарытова В.Ф. Реакционноспособные производные фосфотиоатных аналогов олигонуклеотидов. II. Свойства производных фосфотиоатных аналогов олигонуклеотидов, содержащих ароматический остаток азотистого иприта. Биоорган. химия. - 1997, т. 23, N 7, с. 569-575.

10. Патент РФ N 94010679, 20.11.1996.

11. Амирханов Н.В., Зарытова В.Ф. Реакционноспособные производные фосфотиоатных аналогов олигонуклеотидов. I. Селективная активация концевых фосфатов и получение фосфамидных производных фосфотиоатных аналогов олигонуклеотидов. Биоорган. химия. - 1995, т. 21, N 5, с. 365-375.

12. Гимаутдинова О.И., Карпова Г.Г., Ломакина Т.С., Шелпаква Е.Л., Чемасова Л. Н., Гринева Н.И. Алкилирование ДНК в комплементарных комплексах с 4-(N-2-хлорэтил-N-метиламино)бензил- 5'-фосфамидами олигонуклеотидов. Биоорган. химия. - 1980, т. 6, N 1, с. 70 - 80.

13. Svinarchik P. P. , Konevetz D.A., Pliasunova O.A., Pokrovsky A.G., Vlassov V.V. Inhibition of HIV proliferation in MT-4 cells by antisense oligonucleotide conjugated to lipophilic groups. //Biochimie, 1993, v. 75, p. 49-54.