Иммунный ответ при вирусных инфекциях у детей

У РНК-содержащих ретровирусов сначала происходит обратная транскрипция генома в ДНК, затем ее интеграция в клеточные хромосомы и лишь после этого транскрипция генов.

Цитопатические эффекты при вирусных инфекциях разнообразны, они определяются как вирусом, так и клеткой и сводятся к разрушению клетки (цитолитический эффект), сосуществованию вируса и клетки без гибели последней (латентная и персистирующая инфекция) и трансформации клетки.

Вовлеченность организма в инфекционный процесс зависит от ряда обстоятельств - количества погибших клеток, токсичности вирусов и продуктов распада клеток, от реакций организма, начиная от рефлекторных и заканчивая иммунными. Количество погибших клеток влияет на тяжесть инфекционного процесса. Например, будут ли поражены при гриппе только клетки носа и трахеи или вирус поразит клетки эпителия альвеол, зависит тяжесть и исход болезни.

Хотя вирусы и не образуют типичных токсинов, однако и вирионы, и вирусные компоненты, накапливающиеся в пораженных тканях, выходя в кровоток, оказывают токсическое действие. Неменьшее токсическое действие оказывают и продукты распада клеток. В этом случае действие вирусной инфекции столь же неспецифично, как и действие патогенных организмов, убивающих клетки и вызывающих их аутолиз. Поступление токсинов в кровь вызывает ответную реакцию - лихорадку, воспаление, иммунный ответ. Лихорадка является преимущественно рефлекторным ответом на поступление в кровь и воздействие на ЦНС токсичных веществ.

Если лихорадка - общий ответ организма на вирусную инфекцию, то воспаление - это местная многокомпонентная реакция. При воспалении происходят инфильтрация пораженных тканей макрофагами, утилизация продуктов распада, репарация и регенерация. Одновременно развиваются реакции клеточного и гуморального иммунитета. На ранних стадиях инфекции действуют неспецифические киллеры и антитела класса IgM. Затем вступают в действие основные факторы гуморального и клеточного иммунитета. Однако гораздо раньше, уже в первые часы после заражения, начинает действовать система интерферона, представляющая семейство секреторных белков, вырабатываемых клетками организма в ответ на вирусы и другие стимулы. Описанные явления относятся к так называемой острой репродуктивной вирусной инфекции. Взаимодействие вируса и клеток может происходить, как отмечалось выше, без гибели последних. В этом случае говорят о латентной, т.е. бессимптомной или персистирующей хронической вирусной инфекции. Дальнейшая экспрессия вируса, образование вирусспецифических белков и вирионов вызывает синтез антител, на этой стадии латентная инфекция переходит в персистирующую и появляются первые признаки болезни.

Репродукция вируса в клетках сопровождается развитием цитопатических процессов, специфичных для разных вирусов и для разных типов инфекционных процессов. Цитопатические процессы при вирусных инфекциях разнообразны, они определяются как вирусом, так и клетками, причем специфика их больше "задается" клеткой, нежели вирусом, и сводится в основном к разрушению клеток, сосуществованию вируса и клеток без гибели последних и трансформация клеток. Несмотря на значительные различия цитоцидного действия разных вирусов, в общем, они сходны. Подавление синтеза клеточных макромолекул - нуклеиновых кислот и белков, а также истощение энергетических ресурсов клетки ведут к необратимым процессам, заканчивающимся гибелью пораженной клетки. Повреждение клеток вирусами, их отмирание и распад переносят вирусную инфекцию с клеточного уровня на уровень организма в целом.

При встрече организма с вирусной инфекцией продукция интерферона (растворимого фактора, вырабатываемого вирус-инфицированными клетками, способного индуцировать антивирусный статус в неинфицированных клетках) становится наиболее быстрой реакцией на заражение, формируя защитный барьер на пути вирусов намного раньше специфических защитных реакций иммунитета, стимулируя клеточную резистентность, - делая клетки непригодными для размножения вирусов.

Продукция и секреция цитокинов относятся к самым ранним событиям, сопутствующим взаимодействию микроорганизмов с макрофагами. Этот ранний неспецифический ответ на инфекцию важен по нескольким причинам: он развивается очень быстро, поскольку не связан с необходимостью накопления клона клеток, отвечающих на конкретный антиген; ранний цитокиновый ответ влияет на последующий специфический иммунный ответ.

Интерферон активирует макрофаги, которые затем синтезируют интерферон-гамма, ИЛ-1, 2, 4, 6, ФНО, в результате макрофаги приобретают способность лизировать вирус-инфицированные клетки.

Интерферон-гамма является специализированным индуктором активации макрофагов, который способен индуцировать экспрессию более 100 разных генов в геноме макрофага.

Продуцентами этой молекулы являются активированные Т-лимфоциты (Тh1-тип) и естественные киллеры (NK-клетки). Интерферон-гамма индуцирует и стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов (ФНО, ИЛ-1, 6), экспрессию на мембранах макрофагов, антигенов МНС II; гамма-интерферон резко усиливает антимикробную и противовоспалительную активность путем повышения продукции клетками супероксидных радикалов, а усиление иммунного фагоцитоза и антителоопосредованной цитотоксичности макрофагов под влиянием гамма-интерферона связано с усилением экспрессии Fc-рецепторов для JgG. Активирующее действие интерферона-гамма на макрофаги опосредовано индукцией секреции этими клетками ФНО -альфа. Этот пик наблюдается совместно с ФНО-альфа. Максимум продукции ИЛ-4 наступает через 24-48 ч с момента активации клеток. При этом ИЛ-4 рассматривается как цитокин, ограничивающий иммуновоспалительные реакции и снижающий ответ организма на инфекцию, угнетая при этом экспрессию гамма-интерферона. Интерферон-гамма ин витро усиливает фагоцитарную активность нейтрофилов, что обусловлено усилением экспрессии Fc-рецепторов и поверхностных белков семейства интегринов на нейтрофилы. Это позволяет нейтрофилам осуществлять цитотоксические функции и фагоцитоз. В качестве основных эффекторных клеток воспалительного процесса, они обеспечивают элиминацию инфекта из организма.

Взаимодействие цитокина с клеткой определяется универсальной биологической системой, специфическим механизмом которой является рецепторный аппарат, связанный с восприятием метаболического кода. Для проявления биологической активности цитокина необходимо присутствие на поверхности чувствительных клеток специфических рецепторов, которые могут экспрессироваться параллельно с синтезом цитокина. Рецепторы цитокинов представляют собой комплексы, состоящие из двух и более рецепторных молекул, которые объединяются на мембране клетки-мишени и образуют высокоаффинный рецепторный комплекс. Большинство рецепторов состоит из отдельных молекул, связывающих цитокины, которые ассоциируются после связывания лиганда с сигналпередающим рецепторным компонентом; часть рецепторов существует как растворимые изоформы, способные связывать и растворять цитокины, а часть функционирует как многокомпонентные блоки; механизм комплексирования субъединиц рецепторов объясняет плейотропные и дублирующие эффекты цитокинов, имеющих большое структурное сходство. Рецепторы ИЛ-10 имеют гомологию рецепторов интерферона, и подобно ИЛ-10 индуцирует экспрессию в моноцитах гена Fc- рецептора. Для полного функционирования цитокиновой системы необходимы повышение уровня цитокина в ответ на инфект и экспрессия нормального количества рецепторов к ним на клетках. Изменение рецепторов после их связывания с цитокином заключается в интернализации комплексов цитокин - рецептор внутрь клетки. На поверхности клеток рецептор появляется заново, постепенно синтезируясь в течение 24-36 ч (время появления рецепторов интерферон-альфа). В этот период клетки остаются чувствительными к последующим дозам цитокина, чем объясняется эффективность введения препаратов интерферона и их индукторов три раза в неделю.

Пик продукции цитокинов после стимуляции макрофагов наблюдается через 1-2,6,18-48 ч, а пик продукции интерферон-гамма наступает через 20 ч после первого выхода цитокина из клетки. Поскольку интерферон-гамма ингибирует миелопоэз, то нормализация числа нейтрофилов после элиминации инфекта связана с системой регуляции нейтропоэза. Через 6 ч после стимуляции интерферон-альфа для выполнения своих функций NK-rклетки (активность которых регулируется ИЛ-1, 4, 2) продуцируют гамма-интерферон, в результате чего происходит лизис инфицированных клеток.

При антигенной стимуляции клеток трансдукция сигнала с активированного рецептора на генетический аппарат осуществляется с помощью внутриклеточных регуляторных систем, компоненты которых (белки мембран, ферментов, хроматина) связываются с чувствительными к ним последовательностями ДНК. После связывания цитокина (интерферон) с поверхностными клеточными мембранными рецепторами происходит активация ферментов протеинкиназы-С (ПКС), тирозинкиназы, ц-АМФзависимой протеинкиназы, серин-треонинкиназы. Интерферон-альфа активирует tyk 2 и jak 1-киназы, а интерферон-гамма активирует jak 1 и 2-киназы. Далее факторы транскрипции перемещаются в ядро клетки и связывают гены раннего ответа.

Первый ответ клеток на цитокин - это быстрая индукция генов раннего ответа ("immediate early" генов), в число которых и входит ген интерферон-гамма. Стимуляция экспрессии этих генов важна для выхода клеток из Go-стадии и перехода в Gi-стадию и дальнейшей прогрессии клеточного цикла. Их индукция происходит после активации рецепторов роста на клеточной мембране и активации протеин-киназной системы. Гены раннего ответа являются ключевыми регуляторами клеточной пролиферации и дифференцировки, кодируют белки, регулирующие репликацию ДНК.

Таким образом, при активации клеток происходит стимуляция генов раннего ответа, что ассоциируется с изменением фаз клеточного цикла. Основная протективная роль в иммунном ответе, направленном против внутриклеточных паразитов (грибы, простейшие, вирусы, микобактерии туберкулеза), принадлежит клеточным механизмам. Способность перечисленных возбудителей переживать и размножаться внутри клеток делает их защищенными от действия антител и системы комплемента. Резистентность к антимикробным факторам макрофагов позволяет им длительно переживать внутри этих клеток. Для элиминации возбудителя необходим специфический клеточно-опосредованный ответ. Его специфичность определяется антигенраспознающими СД8+-Т-лимфоцитами, которые пролиферируют, активируются и формируют клон эффекторных цитотоксических лимфоцитов. Решающий момент специфического иммунного ответа - это ответ СД4+Т-лимфоцитов с хелперной направленностью на распознавание антигена. На этом этапе определяется форма иммунного ответа: либо с преобладанием гуморального иммунитета, либо с преобладанием клеточных реакций (ГЗТ). Направление дифференцировки СД4 + -лимфоцитов, от которого зависит форма специфического иммунного ответа, контролируется цитокинами, образующимися в ходе воспалительной реакции. Так, в присутствии ИЛ-12 и интерферон-гамма СД4 + -лимфоциты дифференцируются в воспалительные Тh1-клетки, начинают продуцировать и секретировать интерлейкин-2, интерферон-гамма, ФНО и определяют клеточный характер специфического иммунного ответа. Присутствие ИЛ-12 обеспечивается его продукцией макрофагами, а интерферон-гамма - естественными киллерами, активированными в раннюю фазу ответа на внутриклеточно паразитирующие бактерии и вирусы. В отличие от этого, в присутствии ИЛ-4 СД4 + -лимфоциты дифференцируются в хелперы Тh 2, которые начинают продуцировать и секретировать ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6 и запускают гуморальный иммунный ответ, т.е. синтез специфических антител - иммуноглобулинов. Воспалительные Тh 1-лимфоциты нужны для борьбы с внутриклеточными паразитами, а Тh 2 хелперы нужны для элективной защиты от внеклеточных паразитов.

Вирусная инфекция может вызывать быстрое подавление экспрессии ряда клеточных генов (из которых наиболее изучены интерфероновые гены и гены, кодирующие дс-РНК-зависимые ферменты -2,5-ОАС и ПК-дс), принимающих участие в антивирусном действии. Специальные исследования механизма антивирусного действия интерферонов и дс-РНК в клеточных и бесклеточных системах показали ключевую роль в этом процессе вышеуказанных ферментов. ПК-дс, взаимодействуя с дс-РНК, фосфорилируется и в активной форме фосфорилирует регуляторные факторы транскрипции и трансляции, из которых наиболее изучен инициирующий фактор трансляции (eIF2).

ПК-дс выполняет регуляторную роль в системе клеточной пролиферации на уровне факторов трансляции и активации ряда генов цитокинов. Вероятно, существует связь между подавлением транскрипции мРНК и ПК-дс, угнетением общего синтеза клеточного белка при вирусных инфекциях и накоплением в ядрах клеток белка нуклеокапсида и белка NSP2. Фрагментация клеточных хромосом, наблюдающаяся на ранних сроках вирусной инфекции, может быть одной из причин подавления экспрессии генов, участвующих в противовирусном ответе.

Есть основания предполагать участие белков NSP2 в регуляции активности генов цитокинов - низкомолекулярных белковых регуляторных веществ, продуцируемых клетками и способных модулировать их функциональную активность. Нарушения в системе цитокинов приводят к нарушению кооперативных взаимодействий иммунокомпетентных клеток и нарушению иммунного гомеостаза.

В последние годы показано, что ИЛ- 12, относящийся к провоспалительным цитокинам, является ключевым для усиления клеточно-опосредованного иммунного ответа и инициации эффективной защиты против вирусов.

Средства терапии гриппа и ОРЗ можно разделить на этиотропные, иммунокорригирующие, патогенетические и симптоматические. Приоритет принадлежит этиотропным препаратам, действие которых направлено непосредственно на возбудитель инфекции. Все препараты этиотропного действия целесообразно рассматривать с учетом их точек приложения в цикле репродукции вирусов гриппа и других ОРЗ.

Применение химиопрепаратов для профилактики и лечения гриппа и ОРЗ относится к базовой терапии и является общепризнанным мировым стандартом. Многолетние клинические исследования достоверно выявили их высокую лечебно-профилактическую значимость. Химиотерапевтические средства представлены тремя основными группами: это блокаторы М_2-каналов (амантадин, ремантадин); ингибиторы нейраминидазы (занамивир, озельтамивир) и ингибиторы протеаз (амбен, аминокапроновая кислота, трасилол). Препараты оказывают прямое антивирусное действие, нарушая различные фазы репликативного цикла вирусов. Несколько особняком стоит группа вирулицидных препаратов, применяемых местно для предотвращения адсорбции и проникновения вирионов в клетки.

Грипп и другие респираторные вирусные инфекции / под ред. О.И. Киселева, И.Г. Мариничева, А.А. Сомининой. - СПб, 2003.
Дриневский В.П., Осидак Л.В., Цыбалова Л.М. Острые респираторные инфекции у детей и подростков // Практическое руководство под редакцией О.И. Киселева. - СПб, 2003.
Железникова Г.Ф., Иванова В.В., Монахова Н.Е. Варианты иммунопатогенеза острых инфекций у детей. СПб, 2007. - 254 с.
Ершов Ф.И. Грипп и другие ОРВИ // Антивирусные препараты. Справочник. - М., 2006. - С.226-247.
Ершов Ф.И., Романцов М.Г. Антивирусные средства в педиатрии. - М., 2005. - С.159-175.
Ершов Ф.И., Киселев О.И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств). М., 2005. - С.287-292.
Иванова В.В. Острые респираторно-вирусные заболевания // Инфекционные болезни у детей. - М., 2002.
Онищенко Г.Г., Киселев О.И., Соминина А.А. Усиление надзора и контроля за гриппом как важнейший элемент подготовки к сезонным эпидемиям и очередной пандемии. - М., 2004. - С.5-9.
Об утверждении стандарта медицинской помощи больным гриппом, вызванным идентифицированным вирусом гриппа (грипп птиц) // Приказ Минздравсоцразвития №460 от 07.06.2006 г.
Романцов М.Г., Ершов Ф.И.Часто болеющие дети: Современная фармакотерапия. - М., 2006. - 192 с.
Стандартизированные принципы диагностики, лечения и экстренной профилактики гриппа и других острых респираторных инфекций у детей / под ред. О.И. Киселева. - Санкт-Петербург. - 2004. - С.82-95.
Лекарственные средства в фармакотерапии патологии клетки / под ред. Т.Г.Кожока. - М., 2007.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

Название Конструирование поливалентной вакцины против ОРВИ различной этиологии

Руководитель Исакова-Сивак Ирина Николаевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины", г Санкт-Петербург

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2017 - 06.2020

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-403 - Медицинская микробиология и вирусология

Ключевые слова Векторные вакцины, острые респираторные вирусные инфекции, вирус гриппа, генная инженерия, живая гриппозная вакцина, иммунный ответ

Код ГРНТИ 62.37.35

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) являются наиболее распространенной группой острых инфекционных заболеваний, возбудители которых проникают в организм через дыхательные пути и репродуцируются преимущественно в клетках слизистых оболочек респираторной системы. Ежегодно (по данным ВОЗ) инфекционными болезнями в мире заболевают 40 млн человек, из них 90% приходится на грипп и ОРВИ. К наиболее важным возбудителям ОРВИ относятся респираторно-синцитиальный вирус (RSV), грипп A и B, вирусы парагриппа 1-4 типов, аденовирусы, метапневмовирус человека (hMPV) риновирусы и коронавирусы. Ежегодные вспышки ОРВИ среди детей и пожилых лиц, а также людей с иммунодефицитами, наносят ощутимый социально-экономический ущерб всем странам мира, как развитым, так и развивающимся. На сегодняшний день против большинства возбудителей ОРВИ (кроме вирусов гриппа) не существует доступных и эффективных специфических лечебных и профилактических препаратов, способных существенно снизить заболеваемость и тяжелые последствия инфекций. Мировое научное сообщество сходится во мнении, что существенно снизить ущерб от ежегодных вспышек ОРВИ можно посредством своевременной вакцинации детей раннего возраста, а также лиц из групп риска. В настоящее время существует большое разнообразие вакцин против вирусов гриппа А и В, однако по различным причинам до сих пор не лицензированы вакцины против других респираторных инфекций, главным образом из-за неудачных попыток использования классических подходов конструирования вакцин (создание цельновирионных инактивированных или живых аттенуированных вакцин). С бурным развитием генно-инженерных технологий, а также с появлением новых знаний об особенностях иммунного ответа организма на введение инфекционного агента, акцент стал смещаться в сторону использования ключевых белков патогенов для целенаправленной иммунизации, при этом наиболее оптимальным способом презентации нужного антигена клеткам иммунной системы является использование вирусных векторов. Для вирусов-возбудителей ОРВИ наиболее адекватной векторной системой доставки антигенов в клетки-мишени являются аттенуированные вирусы гриппа, широко применяемые в качестве живых гриппозных вакцин (ЖГВ), поскольку основной механизм защиты, формируемый ЖГВ – образование мукозального иммунного ответа в верхних дыхательных путях, т.е. во входных воротах всех респираторных инфекций. Таким образом, основной целью настоящего проекта является конструирование поливалентных векторных, способных обеспечить комбинированную защиту против широкого круга возбудителей ОРВИ, используя в качестве вирусного вектора вакцинные штаммы ЖГВ. Научная новизна заявляемого проекта состоит в использовании новой векторной системы доставки чужеродных вирусных антигенов в клетки-мишени посредством хорошо изученных аттенуированных холодоадаптированных вирусов гриппа, успешно применяемых в качестве живой гриппозной вакцины уже более 30 лет. Использование вирусов гриппа как векторов имеет ряд преимуществ перед другими вирусами. Во-первых, вирус гриппа имеет РНК-геном, и в процессе его репликации не происходит стадии синтеза ДНК (у вируса есть своя РНК-зависимая РНК полимераза), соответственно, исключен риск встраивания вирусных генов в геном клетки-хозяина. Во-вторых, РНК-геном вируса гриппа является мощным индуктором врожденного иммунитета, способен стимулировать RIG-I и вызывать продукцию IFN-β. В-третьих, вирус гриппа, использованный как вирусный вектор, может способствовать развитию мощного гуморального и клеточного иммунитета после вакцинации. Несомненным преимуществом векторных вакцин на основе аттенуированных вирусов гриппа является легкий и безболезненный интраназальный путь введения – распылением в нос. Кроме того, антигенными свойствами вируса гриппа достаточно легко манипулировать, тем самым решая проблему предсуществующего иммунитета у ранее привитых людей. Благодаря уникальной высокой антигенной изменчивости и особенностям эпидемиологии вируса гриппа А, существует возможность создавать высокоиммуногенные векторные конструкции на основе ЖГВ, которые будут стимулировать как иммунитет к целевому антигену, так и поддерживать иммунологическую память к высококонсервативным антигенам вируса гриппа А. В настоящее время существует налаженное производство ЖГВ как в России, так и в зарубежных странах, а также очень хорошо отработаны ежегодные кампании по вакцинации населения. Включение в состав такой вакцины иммуногенных компонентов других возбудителей ОРВИ позволит проводить сочетанную иммунизацию против ОРВИ различной этиологии, при этом не требуя дополнительных затрат на производство вакцины, а также, не внося изменений в загруженный прививочный календарь.

Ожидаемые результаты
По результатам проекта планируется создание ряда уникальных поливалентных векторных вакцин против ОРВИ различной этиологии, не имеющих аналогов ни в России, ни за рубежом. Научное значение разработки заключается в простом факте объединения в едином вакцинном препарате факторов профилактики инфекционной патологии, вызываемой различными респираторными вирусами. Поскольку в качестве вирусного вектора будут использованные штаммы живой гриппозной вакцины, ожидается, что сконструированные поливалентные вакцины будут формировать комплексный защитный иммунитет на слизистых верхних дыхательных путей, т.е. во входных воротах инфекции. При выполнении проекта будут использоваться самые современные вирусологические, генно-инженерные, иммунологические, биохимические и биоинформационные методы, соответствующие самому высокому международному уровню. Вакцинные препараты, полученные и изученные в ходе выполнения проекта, могут быть широко применены на практике при сочетанной иммунизации против широкого круга возбудителей острых респираторных вирусных инфекций, которым наиболее подвержены дети и пожилые люди. Вакцинация детей поливалентными вакцинными препаратами позволит облегчить прививочный календарь и позволит упростить вакцинацию детей, поскольку вакцина вводится интраназально. Кроме того, создание вакцинных препаратов, сочетающих в себе профилактику гриппа и других респираторных вирусных инфекций, позволит значительно снизить расходы на производство вакцины и на проведение кампаний по вакцинации. Успешное завершение заявляемого проекта откроет практически безграничные перспективы для использования новой векторной системы при конструировании вакцин нового поколения против широкого спектра заболеваний как инфекционной, так и неинфекционной природы (различные вирусные, бактериальные, хламидийные инфекции, а также разные типы опухолей), для которых уже определены и изучены наиболее эффективные иммунодоминантные эпитопы для В- и Т-клеток. Последующее изучение безопасности и иммуногенности таких конструкций на животных позволит дать оценку перспективности их дальнейших доклинических и клинических испытаний в сотрудничестве с профильными научными центрами.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Настоящий проект направлен на конструирование рекомбинантных векторных вакцин против широкого круга возбудителей острых респираторных заболеваний человека, используя в качестве векторной системы доставки вакцинные штаммы для живой гриппозной вакцины (ЖГВ). Отечественная ЖГВ применяется в практике здравоохранения более 30 лет и хорошо зарекомендовала себя как эффективный безвредный препарат для специфической профилактики сезонного гриппа среди различных возрастных групп. Включение в состав такой вакцины иммуногенных компонентов других возбудителей ОРВИ позволит проводить сочетанную иммунизацию против ОРВИ различной этиологии, при этом не требуя дополнительных затрат на производство вакцины, а также, не внося изменений в загруженный прививочный календарь. В ходе первого года реализации проекта был отобран оптимальный вакцинный штамм вируса гриппа, который будет далее использоваться в качестве вирусного вектора. Вакцинный вирус ЖГВ, подготовленный из штамма А/Anhui/1/2013 (H7N9) и содержащий мутации 123D/149D в молекуле НА, оказался наиболее пригодным для конструирования векторных вакцин, поскольку он обладает высоким сродством к α2,6-рецепторам человеческого типа, активно реплицируется в клетках млекопитающих, а также индуцирует мощный гуморальный иммунный ответ в экспериментах на мышах. Используя такой оптимальный вирусный вектор, будет возможно оценивать влияние встроенных чужеродных антигенов на репликативную активность, иммуногенность и защитную эффективность рекомбинантных вакцин в экспериментах на лабораторных животных. Изучение на мышах линии BALB/c полученных ранее первых векторных вакцин против респираторно-синцитиального вируса (RSV) показало, что встраивание в геном вакцинных штаммов ЖГВ Т-клеточных эпитопов М2-1 белка RSV приводит к формированию после иммунизации функционального, защитного Т-клеточного иммунитета, вне зависимости от того, в какой ген вируса гриппа встраиваются чужеродные антигены. Также было продемонстрировано, что векторная вакцина, содержащая нейтрализующий эпитоп RSV F(243-294) в молекуле НА1 вируса гриппа, была неспособна корректно экспрессировать чужеродный антиген на своей поверхности, и, как следствие – данная вакцина не защищала мышей от репликации RS вируса в легких. На следующем этапе работы планируется модифицировать данную конструкцию для оптимизации экспрессии чужеродного антигена. В первый год выполнения Проекта были отобраны наиболее перспективные участки консервативных белков различных респираторных вирусов, предназначенные для встраивания в геном вакцинного вируса гриппа подтипа H7N9. Так, в составе конструкции, разработанной для метапневмовирусов, присутствуют В-клеточные пространственные эпитопы, а также экспериментально установленный T-клеточный эпитоп, описанный для мышей гаплотипа H2-Kd. Эта кассета предназначена для присоединения к N-концу гемагглютинина вируса гриппа. Компьютерное моделирование указывает на то, что данная кассета не будут негативно сказываться на структуре и функции молекулы НА вируса гриппа. Для вируса парагриппа 3 типа созданы две кассеты: одна на основе белка HN, направленная на стимуляцию развития гуморального иммунного ответа, вторая на основе фрагмента нуклеокапсида, для стимуляции Т-клеточного ответа. Кассеты на основе коронавирусов, аденовирусов и риновирусов предназначены для стимуляции Т-клеточного иммунного ответа и подходят для встраивания в гены нейраминидазы и неструктурного белка вируса гриппа. Начата работа по конструированию химерных генов вируса гриппа, содержащих смоделированные кассеты для пяти вирусов (метапневмовирус, вирус парагриппа 3 типа, риновирусы, аденовирусы и коронавирусы), и сборке жизнеспособных рекомбинантных вирусов гриппа с целью создания уникальной коллекции векторных вакцин для комбинированной защиты от гриппа и ОРВИ различной этиологии.

1. В.А. Матюшенко, И.Н. Исакова-Сивак, Т.С. Котомина, П.И. Прокопенко, Л.Г. Руденко ATTENUATED INFLUENZA VIRUS IS A PROMISING VIRAL VECTOR FOR MULTIVALENT VACCINE AGAINST ACUTE RESPIRATORY VIRAL INFECTIONS Proceedings of the 2nd International Meeting for Respiratory Pathogens, Singapore, March 6-8 2018, - (год публикации - 2018).

2. Д.А. Меженская, Т.С. Котомина, И.Н. Исакова-Сивак, В.А. Матюшенко, Д.А. Кореньков, А.С. Евсина, .М.-Ч. Ким, С.-М. Канг, Л.Г. Руденко Development of broadly-reactive influenza vaccine based on live attenuated influenza vaccine viral vector Proceedings of the 2nd International Meeting for Respiratory Pathogens, Singapore, March 6-8 2018, - (год публикации - 2018).

3. Степанова Е.А., Котомина Т.С., Матюшенко В.А., Смолоногина Т.А., Шаповалова В.С., Руденко Л.Г., Исакова-Сивак И.Н. AMINO ACID SUBSTITUTIONS N123D AND N149D IN HEMAGGLUTININ MOLECULE ENHANCE IMMUNOGENICITY OF H7N9 LIVE ATTENUATED INFLUENZA VACCINE STRAIN IN EXPERIMENT Bulletin of Experimental Biology and Medicine, - (год публикации - 2018).

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Настоящий проект направлен на конструирование рекомбинантных векторных вакцин против широкого круга возбудителей острых респираторных заболеваний человека, используя в качестве векторной системы доставки вакцинные штаммы для живой гриппозной вакцины (ЖГВ). В ходе второго года реализации проекта был подробно изучен профиль иммунного ответа полученных ранее векторных вакцин против респираторно-синцитиального вируса (RSV) при заражении мышей натуральной RS инфекцией. Было показано, что векторные вакцины, несущие CD8 Т-клеточные эпитопы RSV, полностью безопасны для лабораторных животных: в отличие от формалин-инактивированной вакцины они не вызывали вакцин-индуцированную легочную патологию при последующем заражении RSV. В отчетном периоде проведена замена гибкого линкера между нейтрализующим эпитопом RSV F(243-294) и НА1 субъединицей в химерном гене гемагглютинина с AAAPGAA на GGGGSGGGGS, в результате чего удалось детектировать вставку нейтрализующего эпитопа в сконструированной векторной вакцине методом Western Blot со специфическим антителом Паливизумаб. Установлено, что модификация конструкции не повлияла на генетическую стабильность RSV вставки в составе векторной вакцины, а также на основные вирусологические и иммунологические характеристики свойства векторной вакцины в системах in vitro и in vivo. На следующем этапе планируется исследовать противовирусную активность, иммуногенность и безопасность данной векторной вакцины в отношении RSV. В отчетный период сконструирована панель рекомбинантных векторных вакцин на основе аттенуированного вируса гриппа, направленных на индукцию либо антительного иммунного ответа к целевым антигенам, либо Т-клеточного иммунного ответа к целевым эпитопам возбудителей ОРВИ. К первой группе относятся вакцинные вирусы против респираторно-синцитиального вируса (RSV) и метапневмовируса человека (hMPV). Ко второй группе относится панель рекомбинантных вирусов гриппа, содержащих вставки иммуногенных фрагментов аденовируса, коронавируса и риновируса, закодированные либо в гене нейраминидазы (NA), либо в гене неструктурного белка NS1 вируса гриппа. Всестороннее изучение сконструированных химерных вирусов гриппа, несущих целевые антигены различных респираторных вирусов, показало, что вирусы активно реплицировались в системе in vitro (развивающиеся куриные эмбрионы, культура клеток MDCK), при этом сохраняя наиболее важный признак аттенуированных вирусов гриппа – температурочувствительный фенотип. Как следствие, векторные вакцины были неспособны активно размножаться в нижних отделах респираторного тракта мышей, указывая на аттенуированный фенотип всех вирусов. Все векторные вакцины сохраняли высокую степень иммуногенности в отношении вируса гриппа, зачастую превосходя по этому показателю классический вакцинный штамм ЖГВ, использованный в качестве вирусного вектора. Наиболее важным результатом данного раздела работы является доказанная способность векторных вакцин индуцировать функциональный Т-клеточный иммунный ответ к эпитопам респираторных вирусов, закодированных в геноме химерных вакцинных штаммов. На следующем этапе будут проводиться исследования по оценке защитного потенциала формируемого иммунного ответа к В- и Т-клеточным эпитопам возбудителей ОРВИ в отношении данных вирусов.

1. Исакова-Сивак И.Н., Матюшенко В.А., Котомина Т.С., Евсина А.С., Меженская Д.А., Прокопенко П.И., Руденко Л.Г. CTL in vivo assay to assess CD8 T-cell responses to foreign CTL epitopes inserted in LAIV viral vector Proceedings of The 1st ISIRV International Influenza Vaccine Meeting - Immunulogical Assays and Correlates of Protection for Next Generation Influenza Vaccines, 31 March - 02 April 2019, Siena, Italy, Poster #4 (год публикации - 2019).

2. Котомина Т., Кореньков Д., Матюшенко В., Прокопенко П., Руденко Л., Исакова-Сивак И. Live attenuated influenza vaccine viral vector induces functional cytotoxic T-cell immune response against foreign CD8+ T-cell epitopes inserted into NA and NS1 genes using the 2A self-cleavage site. Human vaccines & immunotherapeutics, Vol.14, Issue 12. P.1-7 (год публикации - 2018).

3. Котомина Т.С., Исакова-Сивак И.Н., Матюшенко В.А., Ким К-Х., Ли Ю., Джанг Ю-Дж., Канг С-М., Руденко Л.Г. Recombinant live attenuated influenza vaccine viruses carrying CD8 T-cell epitopes of respiratory syncytial virus protect mice against both pathogens without inflammatory disease Antiviral Research, Volume 168, Pages 9-17 (год публикации - 2019).

5. Степанова Е.А., Исакова-Сивак И.Н., Руденко Л.Г. Overview of human rhinovirus immunogenic epitopes for rational vaccine design Expert Review of Vaccines, - (год публикации - 2019).

6. Т. Котомина, И. Исакова-Сивак, Д. Кореньков, Е. Степанова, П. Прокопенко, К.-Х. Ким, Ю. Ли, С.-М. Канг, Л. Руденко Live attenuated influenza vaccine viral vector carrying CD8+ T-cell epitopes of respiratory syncytial virus is safe and protects mice against RSV Proceedings of "Influenza 2018" conference, 04-06 September 2018, Oxford UK, Page 12 (год публикации - 2018).

Читайте также: