Ифа вирусных и бактериальных инфекций
Инфекционные болезни — это заболевания, вызванные проникновением в организм бактерий, грибков или вирусов. Самая важная часть диагностики инфекций — это определение возбудителя и его концентрации. Для этих целей используются разнообразные лабораторные методы, которые позволяют выяснить, чем именно и как давно атакован организм, а в некоторых случаях — спрогнозировать эффективность лечения тем или иным препаратом.
Особенности диагностики инфекционных заболеваний
В клинической практике данный тип заболеваний встречается очень часто. Именно они, по данным Всемирной организации здравоохранения, становятся причиной 26% всех смертей. В список самых распространенных инфекционных заболеваний входят инфекционная пневмония и другие воспалительные заболевания дыхательных путей, гепатит, ВИЧ, туберкулез, малярия, воспаления органов половой системы и мочевыводящих путей, гистоплазмоз, ротавирусные инфекционные заболевания, ветряная оспа, герпес, вирус папилломы человека и еще несколько десятков болезней. Хотя бы раз в жизни каждый из нас сталкивается с инфекционными заболеваниями и необходимостью быстрой постановки диагноза.
Все инфекционные болезни делятся на пять типов — прионные, вирусные, бактериальные, протозойные и грибковые поражения. Далее будут рассмотрены последние четыре типа как наиболее распространенные. Разные возбудители иногда могут вызывать одно и то же заболевание. В частности, пневмония может быть результатом как вирусной, так и бактериальной инфекции. Лечение зависит не от проявлений, а от возбудителя болезни. Противовирусные препараты бесполезны в борьбе с бактериями и грибками, антибиотики не действуют на вирусы. Поэтому основная задача лабораторной диагностики инфекционных заболеваний — выявление типа возбудителя.
Способы лабораторной диагностики инфекционных болезней можно разделить на два типа: неспецифические и специфические методы.
К неспецифическим относятся общий анализ крови и исследование соотношения ее белковых фракций, печеночные пробы, общий анализ мочи и кала. Эти методы не дают информации о виде возбудителя, но позволяют узнать, в какой мере болезнь затронула органы и системы организма, что именно в их работе нарушено и насколько далеко зашел процесс.
Специфические — вирусологический и бактериологический методы, микроскопическое исследование возбудителей, анализы на антигены и антитела — направлены непосредственно на обнаружение возбудителя.
Современная медицина располагает множеством методов выделения возбудителей бактериальной инфекции:
Бактериоскопический . Исследуется окрашенный специальным образом мазок.
Бактериологический . Биоматериал высеивается в питательную среду, и через некоторое время специалист исследует колонию бактерий, выросшую в ней.
Биологический . Направлен на определение патогенности микроорганизмов.
Серологический . Выявляет антитела и антигены в сыворотке крови — особые вещества, которые вырабатываются организмом при контакте с возбудителем определенной болезни.
Чаще всего для исследований используют кровь или сыворотку крови, реже — слюну, мочу, кал, клетки эпителия (мазок и соскоб) и другой биоматериал.
В лабораторной диагностике вирусных заболеваний используются:
Вирусологическое исследование . Световая и электронная микроскопия дает возможность выявить наличие вирусных включений и сами вирусы и идентифицировать их.
Серологическое исследование для обнаружения антител и антигенов. Этот метод дает возможность быстро выявить агрессора, как и в случае с бактериальными инфекциями. Для диагностики используются разнообразные способы исследования материала — реакции гемадсорбции, гемагглютинации или метод непрямой иммунофлюоресценции. Имунноблоттинг, в частности, позволяет выявлять антитела сразу к нескольким инфекциям и считается современным и точным диагностическим методом.
Молекулярно-генетические методы . Последнее слово в лабораторной диагностике. Позволяют обнаружить вирус даже тогда, когда его концентрация ничтожно мала — то есть на самых ранних стадиях. Самым известным из этих методов является ПЦР, при которой фрагмент вируса многократно копируется до тех пор, пока специалист не получит достаточно материала для определения типа вируса и его изначальной концентрации.
Для выявления вирусов обычно требуется сделать анализ крови.
Так называют инфекции, вызванные простейшими паразитами, например, амебами. Малярия, амёбиаз, токсоплазмоз, лямблиоз, трихомониаз, сонная болезнь — вот неполный список самых распространенных протозойных инфекций. Лабораторная диагностика таких заболеваний включает в себя следующие методы:
Микроскопический . Простейшие паразиты выявляются путем исследования под микроскопом окрашенных образцов биоматериала. Самый простой и надежный метод для многих возбудителей.
Культуральный . Посев биоматериала в питательную следу для дальнейшего исследования размножившихся простейших. У этого метода есть существенный недостаток: результатов нужно ждать долго, сам процесс может занять не менее 5-6-ти дней.
Серологический . Используют редко ввиду малой информативности.
Аллергический . Также не является распространенным. Кожные аллергопробы делают для того, чтобы подтвердить лейшманиоз и токсоплазмоз. Это вспомогательный диагностический метод.
В качестве биоматериала для исследований в основном используется кровь, иногда — – кал или моча.
Микроскопическое исследование . Препарат окрашивается и рассматривается под мощным микроскопом. Посредством иммунофлюоресцентной микроскопии исследуется проба, помеченная флюоресцеинами — специальным красителем. Наиболее быстрый способ выявления грибка по сравнению с другими методами.
Культуральный . Происходит посев пробы на питательную среду и дальнейшее исследование полученной в результате колонии грибков.
Серологический . Используется для выявления грибковых поражений, однако для микозов он считается не особенно точным.
Гибридизация нуклеиновых кислот . Самый современный способ выявления грибковых инфекций, его применяют для идентификации основных возбудителей системных микозов. Из культуры извлекается РНК и вносится особым способом помеченная молекула ДНК. Если в пробе наличествует один из основных патогенных грибков, ДНК объединится с его РНК, создав легко различимую структуру. Несомненным преимуществом метода является возможность определить инфекцию на самых ранних стадиях.
Биоматериалом для исследований являются клетки кожи, волос и ногтей, клетки слизистых оболочек (мазок или соскоб), мокрота, моча, секрет простаты, сперма, грудное молоко.
Современные методики диагностики инфекций позволяет выявить их на начальном этапе, Чем раньше болезнь будет обнаружена, тем проще ее вылечить. Поэтому сдавать анализы на инфекции желательно регулярно, даже если вы ни на что не жалуетесь и не замечаете никаких перемен в самочувствии.
Перед сдачей биоматериала для исследований иногда требуется определенная подготовка. Так, кровь обычно сдают с утра, натощак, а перед забором мазка не рекомендуется принимать душ. Эти требования очень важны: они обеспечивают точность результата, поэтому узнайте у врача заранее о подготовительных мерах и точно следуйте всем его рекомендациям.
Похожие темы научных работ по промышленным биотехнологиям , автор научной работы — Дрыгин Ю. Ф., Чирков С. Н., Кондакова О. А., Зиновкин Р. А., Иванов П. А.
ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ и ВИРОИДНОЙ ИНФЕКЦИЙ КАРТОФЕЛЯ
Ю.Ф.ДРЫГИН С.Н. ЧИРКОВ О.А. КОНДАКОВА Р.А. ЗИНОВКИН П.А. ИВАНОВ А. Н. БЛИНЦОВ ЕС. ТАВРЮ ШИНА
Московский государственный университет А.В. ЖЕРДЕВ НА. БЫЗОВА Б. Б. ДЗАНТИЕВ
Институт биохимии им. А.Н. Баха И.Г. АТАБЕКОВ
Московский государственный университет
Одна из главных причин хронически низкой урожайности картофеля в РФ — практически повсеместное использование семенного материала, зараженного вирусными, вироидными и бактериальными патогенами. Контроль его качества, начиная с элиты и при последующем репродуцировании недостаточно эффективен, поскольку проводится только путем визуальной оценки. Формирование рынка семенного картофеля в России вызвало необходимость коренного улучшения контроля его качества и сертификации. На сегодняшний день система сертификации оригинального (предбазисного) семенного материала предусматривает его обязательную лабораторную проверку на зараженность возбудителями наиболее вредоносных вирусных и бактериальных болезней в испытательных лабораториях, аккредитованных для выполнения такого рода работ. Диагностика вирусных и ви-роидных заболеваний, помимо сертификации семян, в массовых масштабах применяется для контроля процесса оздоровления растений, фитосанитарного мониторинга посевов и карантинной проверки импортируемого посадочного материала.
Современные методы лабораторной диагностики основаны на высокой специфичности молекулярного взаимодействия антител с антигеном или нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) между собой. Высокая их чувствительность обеспечивается усилением (в миллионы раз) сигнала взаимодействия молекул специальными биохимическими системами (ферментными в ИФА и множительными в ПЦР). Разработано несколько технологий молекулярной диагностики вирусных и вироидных заболеваний картофеля, которые применяются или могут быть использованы в элитном семеноводстве.
Иммуноферментный анализ (ИФА). Сегодня в странах с развитым картофелеводством, в том числе и в России, лабораторная диагностика вирусной инфекции семенного материала осуществляется в ос-
новном с помощью ИФА. Этот метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, позволяющей количественно определять вирусы в экстракте вплоть до концентрации 1 нг/мл. Важнейшее его достоинство — высокая производительность, которая дает возможность проанализировать сотни образцов за короткое время (2 суток). Иммуноспе-цифические реагенты, диагностические наборы и приборы для выполнения ИФА производят многие фирмы и широко представлены на рынке.
Метод иммунохроматографии. Для большинства практически значимых вирусов и вироида картофеля разработаны методы молекулярной диагностики, основанные на выявлении вирус-специфического белка (иммунохимические методы) или вирусных нуклеиновых кислот [ПЦР, РНК(ДНК) зонды]. Они характеризуются исключительно высокой чувствительностью, которая позволяет выявлять минимальные количества вируса. Как уже отмечалось, инструментальные методы анализа, согласно действующей системе сертификации, надлежит использовать для лабораторной проверки оригинального семенного материала (микрорастения, мини-клубни, первое полевое поколение из мини-клубней и супер-суперэлита). В то же время, они достаточно трудоемки, сложны, занимают много времени, требуют высококвалифицированного персонала и дорогостоящего оборудования, что ограничивает
иммунохроматографии — высокая чувствительность и скорость (исчисляемая минутами) анализа, простота подготовки образца и выполнения анализа, не требующего лабораторного оборудования или реагентов. В результате совместной работы кафедры вирусологии биологического факультета МГУ им. М.ВЛомоносо-ва и лаборатории иммунобио-химиии Института биохимии РАН были разработаны тест-полоски для экспресс-анали-женного картофеля сорта за вирусов X и У картофеля. С Невский; В — экстракт из
Рис. 1. Определение вируса У картофеля методом иммунохроматографии: А — препарат вируса У картофеля (5 мкг/мл); Б — экстракт из листьев зара-
листьев здорового растения картофеля; Г— экстракт из листьев картофеля сорта Невский, зараженного ХВК. Аналитическая область отмечена стрелкой.
альную оценку. Кроме того, этот метод можно применять для экспресс-анализа импортируемого картофеля на карантинные и другие особо вредоносные вирусы, а также в личных, подсобных, мелких фермерских хозяйствах, в которых сегодня сосредоточено основное производство картофеля в России.
МГА-ИФА технология. На сегодняшний день в ряде регионов РФ наиболее распространенное и экономически самое опасное заболевание, вызываемое вироидом веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) [ 13]. ВВКК — это небольшая (около 360 нуклеотидов) кольцевая молекула РНК с сильно развитой вторичной структурой [14]. Вироиды не кодируют белков и поэтому не определяются с помощью им-муноферментного анализа. Их можно обнаружить методами, основанными на молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Обычно диагностические фирмы для детекции вироидов используют метод молекулярной гибридизации с кРНК-зондами, меченными дигоксигенином, или ПЦР.
Мы разработали технологию МГА-ИФА (рис. 2), в которой для выявления ВВКК используют кДНК-
их помощью указанные патогенны определяются в экстракте из зараженного растения картофеля в концентрации до 0,2 мкг/мл. Результат анализа можно получить через 5 мин.
По нашему мнению, наиболее эффективно тест-полоски можно использовать, например, при сертификации элитного и репродукционного семенного материала, что будет существенно дополнять визу-
Рис. 2. Схема технологии МГА-ИФА (на примере диагностики ВВКК)
зонды, меченные хлордиэтилентриаминоплатиной хлористой — (диен)Р1. ДНК-зонд синтезируют на основе рекомбинантной плазмиды, содержащей вставку кДНК длиной 300 и более нуклеотидов (фрагмент ДНК, комплементарный РНК вироида и способный с ней специфически гибридизоваться).
Рекомбинантные ДНК получают методами генной инженерии, клонируют в бактериях и выделяют в препаративных количествах из размноженной бактериальной массы.
Для получения зонда мы метим рекомбинантную плазмиду комплексным соединением платины — (диен) [4]. Выбор этой метки вызван чрезвычайной простотой процедуры мечения, заключающейся в обыч-
ном смешивании ДНК с (диен)Р1, и количественным их связыванием (таким образом отпадает необходимость дополнительной очистки зонда). При этом наличие метки практически не отражается на специфической гибридизации кДНК-зонда с вироидной РНК. Еще одно важное преимущество диен-платиновой метки — высокая иммуногенность ее комплекса с ДНК, что позволяет получать аффинные антитела с высокой специфичностью, узнающие любую ДНК, меченную (диен)Р1.
Технология МГА-ИФА включает несколько этапов. Она начинается с подготовки образца к анализу, а именно, с депротеинизаци и выделения нуклеиновых кислот клеточного экстракта.
Сегодня для выделения нуклеиновых кислот из зараженных растений применяют токсичные реагенты (фенол, хлороформ и гуанидинизотиоцианат). Мы разработали новый метод, в котором оно осуществляется с использованием водорастворимого нетоксичного хаотропного агента — НТХА (находится на стадии патентования) и дешевого доступного сорбента, что заметно упрощает подготовку образцов к анализу. Выходы РНК, а также их спектральные и электрофоретические характеристики при этом соответствуют высокоочищенным вирусным РНК и идентичны для препаратов, полученных новым методом и путем фенольной депротеинизации (рис. 3).
РНК ХВК РНК втм
Рис. 4. Определение ВВКК с использованием диен-платино-вого ДНК-зонда в препаратах вироидной РНК (ряды 2-4), полученных из листовой ткани картофеля (ряды / и 5 — из здоровых растений); колонка А — фенольным методом; В— гунидин-тиоцианатным методом с последующей сорбцией РНК на силикагель; С — с применением НТХА.
Сравнение результатов анализов методом МГА-ИФА препаратов, полученных разными способами (фенольная депротеинизация с использованием гуани-динтиоцианата [9], сорбция на силикагель [11] и с помощью НТХА) показало, что эффективность экстракции и определения вироидной РНК, выделенной из одинакового количества листовой ткани картофеля, совпадает (рис. 4).
Технология МГА-ИФА позволяет выявить до 100 молекул РНК вироида на клетку [3, 5]. Последние несколько лет она успешно используется для практической диагностики вироида в элитном семеноводстве картофеля РФ.
МГА-ИФА технологию, первоначально разрабатывавшуюся для диагностики вироида, можно применять для определения вирусов картофеля (рис. 5).
Количество рекомбинантной Количество суммарной
плазмиды в положительном контроле (1), ПГ РНК в образцах (2-5), иг
Рис. 3. Сравнение электрофоретической подвижности препаратов РНК ВТМ и РНК ХВК, выделенных из очищенных вирусов с помощью НТХА (/ и 3) и методом фенольной депротеинизации (2 и 4).
Рис. 5. Определение вируса X картофеля (ХВК) технологией МГА-ИФА 1 — рекомбинантная плазмида риС-19, содержащая вставку кДНК ХВК, пг. 2-5 — препараты суммарной РНК, полученные из здоровых (2, 4) и зараженных ХВК (3, 5) растений картофеля (сорт Невский) фенольным методом (4, 5) и с помощью НТХА (2, 3). Препараты суммарной РНК из анализируемых пробирочных растений картофеля наносили на нитратцеллюлозную мембрану и фиксировали облучением УФ-светом.
На сегодняшний день получены кДНК-копии РНК вирусов: X, У, А, Б, М, аукуба-мозаики картофеля, ВСЛК, ВМВК. Созданы и клонированы рекомбинантные плазмиды со вставками их кДНК.
Следует отметить, что МГА-ИФА технология имеет ряд важных преимуществ перед традиционной диагностикой вирусов с помощью серологических методов. В частности, она не требует получения вирусного антигена, иммунизации животных для получения специфических к каждому вирусу антител, так как их детекция осуществляется в конечном итоге с помощью универсальных антител к (диен)Р1>ДНК.
Технология ОТ-ПЦР. Для проверки на зараженность вирусами и вироидом коллекционных сорто-образцов необходима предельно высокая чувствительность определения РНК патогена с большой степенью надежности. Это приобретает особую важность в связи с началом работ по созданию в РФ ге-нобанка здоровых сортов картофеля [6]. Один из наиболее чувствительных методов обнаружения молекул нуклеиновых кислот — полимеразная цепная реакция (ПЦР или ОТ-ПЦР), которая позволяет размножить копию молекулы нуклеиновой кислоты патогена в анализируемом препарате в десятки миллионов раз. Его недостатки — высокая стоимость и трудность идентификации размноженной вирусной ДНК из-за присутствия артефактных зон.
Для оптимизации метода ОТ-ПЦР исследование проводили на модельной системе с высокоочшцен-ными образцами РНК ХВК, а затем на тотальных препаратах нуклеиновых кислот, полученных из инфицированных и здоровых пробирочных растений. В ка-
честве затравок для реакций обратной транскрипции (ОТ) РНК ХВК использовали комбинацию олигонуклеотидов РУХ5755+/РУХ6105-. В этом случае нам уда-лось детектировать до 1 фг вирусной РНК, что соответствует уровню 300 молекул вирусной РНК для реакции ОТ и всего лишь 30 молекул кДНК в полимеразной цепной реакции (рис. 6).
рядок, но ее достаточно для детекции с помощью комбинированной технологии ОТ-ПЦР — МГА-ИФА одной молекулы РНК фитопатогена в анализируемой пробе.
Для сравнения чувствительности используемых технологий молекулярной диагностики препараты РНК, полученные с помощью НТХА, амплифицировали по технологии ОТ-ПЦР и продукты анализировали по флуоресценции в геле с помщью МГА-ИФА и технологии ОТ-ПЦР — МГА-ИФА (рис. 8). Результаты исследований показывают, что по чувствительности детекции патогена перечисленные методы можно расположить следующим образом: МГА-ИФА Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
ка вирусных и вироидных инфекций достигла пре- Авторы выражают глубокую благодарность колле-
дельной чувствительности, когда в соответствующих гам из ВНИИ картофельного хозяйства имЛГЛорха
условиях реальным становится определение единич- и ВНИИ фитопатологии за помощь в постановке этого
ных молекул фитопатогена в целом растительном исследования.
организме. Дальнейшее их совершенствование будет Работа поддержана грантом РФФИ N2 06-04-
определяться техническим упрощением каждой ста- 08290.
2. Бобкова А.Ф., Блинцов А.Н, Чирков С.Н. (2003). Пиротест — метод иммуноферментного анализа вирусов картофеля. Аграрная Россия, 3:23 — 27.
3. Дрыгин Ю.Ф., Мусин С.М., Кондакова ОА., Савенков Е.И., Соломатин С.В.,Можаева К.А., Атабеков И.Г. (1996), Молекулярная диагностика зараженности оздоровленных сортообразцов картофеля Российской Федерации вироидом веретеновидности клубней. Доклады РАСХН 6:24-25.
4. Киселева В.И., Турчинский М.Ф., Колесник Т.Б., Поверенный А. М. (1994). Использование диэтилентриаминхлорплатины в гибридиза-ционном анализе специфических последовательностей нуклеиновых кислот. Биоорган, хим. 20:14-20.
5. Кондакова, О А., Дрыгин, Ю.Ф. (1999). Диагностика вироидного заболевания картофеля зондами (диен)Р1-ДНК. Биотехнология 4: 83-90.
6. Симаков ЕА., и др. О совершенствовании научного обеспечения производства оригинального, элитного и репродукционного семенного картофеля в России (2004). М., ВНИИКХ.
7. Чирков С.Н., Новиков В.К., Бобкова А.Ф., Атабеков И.Г. (2000). Пиротест — усовершенствованный вариант иммуноферментного анализа вирусов картофеля. Защита и карантин растений, 12:15-16
9. Chomczynski, P. and N. Sacchi (1987). Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyonate-phenol-chloro/orm extraction. Anal Biochem. 162: 156—159.
10. Clark, M.F. and A. N Adams (1977). Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection ofplant viruses. J. gen. Virol. 34:475—483.
11. Malinowski, T. (1996). In: H.-WDehne, GAdam. etal. (Eds.) Developments in Plant Pathology, vol.ll, KluwerAcad. Publishers, .445-448.
12. Mizenina, О. А., О. V. Borisova, V. К Novikov, O. A. Evtushenko, A. A. Baykov and J. G Atabekov (1991). Inorganic pyrophosphatase from E. coli as a label for the detection ofplant viruses by ELISA. J. Phytopathol. 133:278-288.
13. Mozhaeva, K.A., NVGirsova, N. V. and T.B. Kastalyeva (2002). Main causes of Potato Spindle Tuber Viroid distribution in seed potato in Russia in 1990s. J. Russ. Phytopath. Soc. 3: 39-42.
14. Semancik, J.S. Viroids and Viroidlike Pathogens (1987). (Semancik, J. S., Ed.). CRC Press, Boca Raton, FL 127-160.
15. Surguchova N., Chirkov S., Atabekov J. (1998) ELISA-test bei Nepoviren mit einem neuen Enzym — einer anorganischen Pyrophosphatase aus Escherichia coli. Arch.Phytopath.Pflanz., 31: 535-541.
ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ УДОБРЕНИЙ В КАРТОФЕЛЕВОДСТВЕ РОССИИ
А. В. КОРШУНОВ Л.С. ФЕДОТОВА
ВНИИ картофельного хозяйства им. А.Г.Лорха
НИИ агрохимии им. Д.Н.Прянишникова
В российском земледелии существует неадекватное суждение об оценке экологических последствий химизации сельского хозяйства, которое сильно преувеличено в сторону ее издержек.
Конечно, экологический риск необдуманного применения средств химизации существует. Однако рациональное использование удобрений не представляет существенной опасности для окружающей среды. Гораздо хуже, если элементы минерального питания не
будут вноситься или их дозы окажутся необоснованно малы. Даже сторонники органобиологического земледелия признают необходимость минеральных удобрений для восполнения выноса питательных элементов с урожаями сельскохозяйственных культур. Поэтому для современного картофелеводства решение экологических проблем применения агрохимикатов заключается в оптимизации их доз, а не в отказе или минимальном применении. Именно рациональные дозы минеральных удобрений, химическая и биологическая мелиорация в совокупности с оптимальной агротехникой и севооборотами, адаптированными к почвенно-климатическим условиям, способствуют поддержанию устойчивости и высокой продуктивности агроценозов.
Известный немецкий ученый в области биологического растениеводства Г.Кант [2] допускает разумное использование минеральных удобрений и пестицидов. По его утверждению, агроландшафт выпол-
Взятие и вид материала
1 . Время взятия: взятие материала следует проводить в остром периоде инфекции, а в случае серологических исследований также после 2–4 нед. (с целью выявления динамики изменений концентрации антител).
2 . Вид, способ взятия и транспортировка материала: зависит от клинической формы инфекции и этиологического фактора, а также от используемого диагностического метода →табл. 28.2-1 и ниже.
