Гепатит с и костный мозг

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Согласно современным представлениям, восстановление поврежденных тканей и органов взрослого организма осуществляется при участии низкодифференцированных или стволовых клеток. Основным источником стволовых клеток является костный мозг, способный генерировать клетки-предшественники для большого числа тканей организма. В экспериментах на животных была показана возможность стимуляции регенерации печени аутогенными стволовыми клетками костного мозга [1, 2] и аллогенными стволовыми клетками пуповинной крови [3]. Получены первые положительные результаты лечения заболеваний печени у людей - установлена высокая эффективность применения ал-логенных стволовых клеток пуповинной крови при лечении вирусных гепатитов [4]. Более того, стволовые клетки с фенотипом CD133+, полученные из крови больных и введенные в печень через воротную вену, в 2,5 раза ускоряли процесс регенерации печени после резекции опухоли [5]. Положительная динамика функциональных проб печени была отмечена в рамках первой фазы клинических исследований, когда больным хроническими гепатитами [5 человек] была проведена трансплантация аутогенных стволовых клеток с фенотипом CD34+ [6]. Таким образом, к моменту начала нашей работы имелись теоретические, экспериментальные и клинические предпосылки для проведения ограниченных клинических испытаний применения аутологичных гемопо-этических клеток в терапии хронических гепатитов.

Методика исследования

На первом этапе после тщательного анализа литературы нами был разработан протокол клинических исследований. Отличительными чертами разработанного протокола являются: 1) способ трансплантации стволовых клеток в печень; 2) критерии оценки эффективности трансплантации.

Выбор способа трансплантации

В экспериментах на животных для стимуляции регенерации печени стволовые клетки чаще всего вводят внутри-брюшинно или в селезёнку, из которой они через воротную вену поступают в печень. В протоколах клинических исследований по применению стволовых клеток при хронических гепатитах и после резекции печени клетки вводили либо в периферический кровоток [7] [при этом большая часть клеток диссеминировалась по организму), либо в воротную вену -в этом случае все клетки поступали в печень с венозной кровью [5, 6].

Целью нашего исследования было изучение возможности использования стволовых клеток в лечении не просто хронических гепатитов, а хронических гепатитов в стадии тяжелого фиброза и цирроза. В этой стадии у больных развивается портальная гипертензия, причем введение клеток в воротную вену на фоне портальной гипертензии может вызвать внутреннее кровотечение в месте введения иглы. Исходя из этого, мы предположили, что клетки безопаснее вводить не в воротную вену, а в артериальный кровоток. Причем стволовые клетки целесообразнее вводить не в печёночную артерию, а в чревный ствол [рис. 1), от которого отходят печёночная артерия, левая желудочная артерия и селезёночная артерия [рис. 2). В результате такого введения часть клеток сразу попадает в печень по общей печёночной артерии, а те клетки, которые ушли к желудку и селезёнке, могут попасть в печень с венозной кровью через воротную вену [рис. 3).

Преимуществом предложенного метода введения, по нашему мнению, является не только его безопасность, но и возможность воздействовать стволовыми клетками на разные участки печеночной дольки. Дело в том, что кровь в печень поступает по двум сосудам - воротной вене [венозная кровь от всех непарных органов брюшной полости) и печеночной артерии [артериальная кровь из аорты). Венозная кровь составляет до 80% всей крови, проходящей через печень, и из мелких портальных вен она напрямую поступает в синусоидные капилляры железы. Артериальная кровь, перед тем как попасть в синусоиды, снабжает питательными веществами и кислородом все структуры портальных трактов и, в частности, желчные протоки [8]. Даже при легком перипортальном фиброзе происходят изменения в желчных протоках, которые сначала приводят к их компенсаторной пролиферации [дуктулярной реакции), а в дальнейшем к дук-топении с нарушением экскреторной функции печени [9]. В предложенном нами методе стволовые клетки могут действовать как внутри дольки [с венозной кровью), так и в области портальных трактов [с артериальной кровью).

Критерии оценки эффективности трансплантации

Кроме того, в протокол исследований, наряду с обязательным определением степени активности и стадии заболевания, были введены методы иммуногистохимической оценки: 1) пролиферативной активности клеток печени [по экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток, Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA); 2) активации миофибробластов [по экспрессии альфа-гладкомышечного актина, а-ГМА); 3] капилляризации синусоидов [по экспрессии CD34).

Уровень пролиферации позволяет судить о выраженности регенераторного ответа гепатоцитов на повреждение.

а-ГМА - это один из контрактильных белков гладкой мышцы, который в здоровой печени обнаруживается только в мышечных клетках сосудов печени. При хроническом повреждении печени происходит трансдифференцировка перисинусоидальных клеток печени в миофибробласты, которые усиленно синтезируют коллаген, что приводит к развитию фиброза. Маркером миофибробластов является а-ГМА. Появление а-ГМА-позитивных миофибробластов, таким образом, приводит к отложению новых волокон коллагена и прогрессированию фиброза.

CD34 - это гликопротеин, который находится на наружной поверхности мембраны эндотелиальных клеток и проге-ниторных кроветворных клеток. В частности, его используют при выделении стволовых кроветворных клеток в качестве их маркера. При морфологическом исследовании биопта-тов CD34 интересовал нас как маркер эндотелия синусои-дов печени. Дело в том, что эндотелий синусоидов печени отличается от эндотелия капилляров других органов. Во-первых, он фенестрированный, во-вторых, у него нет сплошной базальной мембраны, и поэтому на мембране эндотелиальных клеток нет молекулы CD34. CD34 появляется в эндотелии синусоидов только при так называемой капилляризации последних. В этом случае в пространстве Диссе откладывается коллаген [перисинусоидальный фиброз), формируется подобие базальной мембраны и нарушается диффузия веществ из крови к гепатоцитам. Таким образом, появление CD34 в синусоидах позволяет судить о нарушении гемодинамики в синусоидах печени.

Для проведения морфологического анализа биоптаты печени фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Иммуногисто-химическое окрашивание срезов печени проводили стреп-тавидин-биотиновым методом [10] с использованием коммерческих моноклональных антител к PCNA, а-ГМА, CD34 и визуализационных систем фирм DAKO [Дания] и NOVOCASTRA [Великобритания).

Отбор больных

Критерием включения пациентов в программу клинических исследований было, согласно утвержденному протоколу, наличие хронического токсического [этанолового) гепатита и тяжелого фиброза печени. В настоящий момент в клиническом исследовании находятся 3 пациента и отобрано еще 12. Все больные до включения в программу исследований прошли курс стационарного лечения, состоявший из гепа-тотропных препаратов [Урсосан, Карсил и т.д.). У пациентов не было выраженных изменений функциональных проб печени: отмечены повышение аланинаминотрансферазы [АЛТ, в среднем в 2 раза) и у-глутаминтранспептидазы [у-ГТП, в 2-4 раза) и снижение протромбинового индекса [до 70%). При ультразвуковом исследовании печени обнаружены повышение эхогенности и диффузная неоднородность ее паренхимы. Перед началом лечения всем больным была проведена пункционная биопсия печени.

Получение стволовых клеток

Результаты и обсуждение

Наблюдение за больными в течение 4-х недель после введения стволовых клеток показало улучшение общего самочувствия, повышение работоспособности, исчезновение слабости и дискомфорта в правом подреберье. Через месяц после введения стволовых клеток у всех больных снизились показатели цитолиза, повысился протромбиновый индекс, произошло снижение у-ГТП [в одном случае до нормы) [табл. 1).

Согласно протоколу, всем больным была проведена пунк-ционная биопсия печени до трансплантации стволовых клеток и через месяц после трансплантации. Сравнительный анализ индекса гистологической активности [ИГА) представлен в табл. 2.

Через месяц после трансплантации у всех больных произошло снижение ИГА на 2-3 балла. За счет чего произошло это снижение? В первую очередь, за счет уменьшения внутридольковых некрозов и дегенераций паренхимы и портального воспаления. К сожалению, выраженность некрозов вокруг портальных трактов не изменилась, и в био-птатах отмечены порто-портальные мостовидные некрозы. Эти некрозы всегда были локализованы в области портопортальных соединительнотканных септ, за счет которых у больных был диагностирован тяжелый фиброз [3 балла).

Очевидно, что один месяц - недостаточный срок для разрешения фиброза. В то же время снижение ИГА за счет уменьшения внутридольковых дегенераций и портального воспаления отражает позитивные изменения в состоянии печени после трансплантации. Более того, благоприятные морфологические изменения в паренхиме печени объясняют и положительную динамику биохимических показателей.

Наиболее выраженным морфологическим изменением, которое мы обнаружили, было исчезновение соединительной ткани из пространства Диссе. До трансплантации у всех больных был выявлен перисинусоидальный фиброз, а через месяц после трансплантации стволовых клеток мы не обнаружили отложения коллагеновых волокон между эндотелием и гепатоцитами [рис. 4). Согласно протоколу, биоптаты окрашивали антителами против PCNA, а-ГМА и CD34. Данные иммуногистохими-ческого исследования представлены в таблице 3. Два факта обращают на себя внимание - резкое снижение пролиферативной активности гепатоцитов и исчезновение CD34 в мембранах эндотелия синусоидов после трансплантации.

Высокая пролиферативная активность в гепатоцитах до трансплантации [рис. 5А) указывает на напряженность регенераторного ответа. Такого рода напряженность всегда наблюдается при повреждении гепатоцитов и является ответной реакцией на уменьшение клеточной массы или повреждение гепатоцитов. Через месяц после трансплантации число пролиферирующих гепатоцитов было в пределах 1-5%, что является показателем, близким к норме [рис. 5Б).

Интересные изменения произошли после трансплантации стволовых клеток с эндотелием синусоидов. У всех больных до трансплантации была выражена капилляризация си-нусоидов - эндотелиальные клетки экспрессировали CD34 [рис. 6А). Такого рода изменения фенотипа эндотелия в синусоидах печени указывают на то, что фенестрированный эндотелий стал менее проницаемым. Через месяц после трансплантации ситуация кардинально изменилась - в синусоидах обнаруживали лишь единичные CD34+ эндотелиальные клетки [рис. 6Б).

Определенные изменения наблюдались и в экспрессии а-ГМА. До трансплантации у всех больных внутри соединительнотканных септ присутствовали миофибробласты [рис. 7А), что указывало на продолжающийся синтез компонентов соединительной ткани и прогрессирование фиброза. У одного больного миофибробласты были обнаружены и в синусоидах, что является неблагоприятным прогностическим фактором в плане дальнейшего фиброзирования паренхимы печени. После трансплантации количество миофибробластов заметно уменьшилось, и немногочисленные а-ГМА+ клетки обнаруживали только в пределах уже сформированных соединительнотканных септ, в основном же а-ГМА присутствовал в гладкомышечных клетках кровеносных сосудов [рис. 7Б).

Поскольку именно миофибробласты являются основным источником соединительной ткани в регенерирующей печени, уменьшение их числа объясняет как восстановление нормальной структуры синусоидных капилляров, так и исчезновение перисинусоидального фиброза.

Результаты проведенного исследования позволяют заключить, что трансплантация аутогенных гемопоэтических стволовых клеток в чревный ствол больным хроническим гепатитом в стадии тяжелого фиброза является безопасной процедурой. Через месяц после трансплантации аутогенных гемопоэтических стволовых клеток улучшаются общее состояние больного и показатели функциональных проб печени, происходят положительные изменения в морфологии печени [снижается индекс гистологической активности за счет уменьшения выраженности портального воспаления и внутридольковых некрозов). Однако самым важным результатом трансплантации гемопоэтических стволовых клеток является то, что в печени происходят качественные структурные изменения - значительно снижается пролиферация гепатоцитов, уменьшается число миофибробластов в паренхиме, что приводит к разрешению перисинусоидального фиброза и восстановлению нормального строения синусоидных капилляров. Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о перспективности данного метода лечения для подавления прогрессирования гепатита и фиброзирования печени и о высокой информативности иммуногистохимических методов в оценке эффективности трансплантации.

В связи с предстоящей 14 января 2006 года первой в Москве акцией по привлечению потенциальных доноров костного мозга и гемопоэтических стволовых клеток на вопросы о донорстве и трансплантации костного мозга ответил заместитель директора Федерального научно-клинического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии, профессор Алексей Масчан.

В разных статьях и книгах пишут по-разному. Иногда говорят о донорстве и трансплантации костного мозга. Иногда – о гемопоэтических стволовых клетках. Это одно и то же или это разные вещи?

Речь идет об одном и том же. Трансплантируют в любом случае гемопоэтические стволовые клетки. Стволовые клетки – клетки, которые могут бесконечно долго размножаться и давать зрелое потомство. Их потенциал к размножению и созреванию бесконечно велик. Гемопоэтические стволовые клетки являются предшественницами всех клеток крови и иммунитета в организме. Будучи пересажены реципиенту даже в небольших количествах, гемопоэтические стволовые клетки способны полностью восстановить кроветворение и иммунитет.

Но вот источником этих клеток могут быть разные ткани организма.

У здорового человека стволовые клетки находятся в костном мозге – кроветворной ткани, помещающейся в костях скелета. Больше всего костного мозга содержится в тазовых костях, грудине и позвоночнике. На протяжении нескольких десятилетий источником гемопоэтических стволовых клеток был только костный мозг, поэтому большинство существующих ныне западных регистров и называются регистрами доноров костного мозга.

А как это выглядит – взятие гемопоэтических стволовых клеток из костного мозга или из периферической крови? Это страшно?

Если источником гемопоэтических стволовых клеток является костный мозг, то донора госпитализируют в клинику на один день. Процедура взятия костного мозга проходит под общим наркозом под строгим контролем врача анестезиолога. Костный мозг берут из тазовых костей специальными иглами с широким просветом. В течение 1,5–2 часов через два маленьких разреза в коже делают около ста проколов кости и забирают при этом около литра жидкого костного мозга. Это составляет не более 5% от общего объема костного мозга донора. Такого количества вполне хватает, чтобы обеспечить кроветворение пациента на всю жизнь. Что тогда говорить о том, на что хватает 95% оставшегося у донора костного мозга?!

Сама потеря костного мозга при этом не ощущается, и его объем полностью компенсируется в течение двух недель. Незначительно снижается уровень гемоглобина в крови, но и он полностью восстанавливается за полторы – две недели. Почти всегда в первые два-три дня после взятия костного мозга донор испытывает болевые ощущения в тазовых костях, которые легко проходят под действием обычных обезболивающих препаратов. Кроме того, донор может испытывать неприятные ощущения после наркоза, такие как подташнивание, сонливость, слабость. Как правило, вечером в день операции донор может уйти из клиники домой.

При подготовке к аферезу самыми частыми побочным явлениям являются ломота и боли в костях, возникающие примерно у половины доноров в период стимуляции. Ростовые факторы стимулируют деление клеток в костном мозге, костный мозг увеличивается в объеме и давит изнутри на кости – отсюда и неприятные ощущения. Еще одно возможное последствие – незначительная потеря тромбоцитов во время процедуры афереза. Часть тромбоцитов просто отбирается сепаратором вместе с гемопоэтическими клетками. Возможны также обострения аутоиммунных заболеваний. Поэтому люди, страдающие аутоиммунными болезнями (ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, псориазом), не допускаются до этого вида донорства.

Донор после консультации с медиком может сам выбрать, каким способом у него возьмут гемопоэтические клетки.

Есть ли противопоказания к донорству стволовых гемопоэтических клеток?

Да, есть. Потенциальным донором стволовых гемопоэтических клеток может стать любой человек в возрасте от 18 до 55 лет, который никогда не болел гепатитом В или С, туберкулезом, малярией, злокачественными заболеваниями, психическими расстройствами и не является носителем ВИЧ.

Нельзя становиться донорами стволовых гемопоэтических клеток тем, кто страдает аутоиммунными заболеваниями. Не рекомендуется проходить процедуру взятия костного мозга тем, кому относительно противопоказан наркоз, то есть лицам, страдающим хроническими заболеваниями дыхательных путей и сердечно-сосудистой системы.

Что происходит, если потенциальный донор подходит по показателям тканевой совместимости человеку, ожидающему пересадки костного мозга? Может ли потенциальный донор отказаться от донорства?

Сама процедура вхождения в регистр потенциальных доноров стволовых гемопоэтических клеток ни к чему не обязывает. Это лишь подтверждение желания сдать стволовые гемопоэтические клетки и спасти ближнего, которому необходима пересадка. Вероятность того, что данный конкретный донор подойдет кому-то из нуждающихся по тонким показателям тканевой совместимости, сравнительно невелика.

Если все же это происходит, то представители регистра доноров костного мозга связываются с потенциальным донором и спрашивают его согласия на дачу гемопоэтических стволовых клеток. В случае согласия донора проводится повторное, расширенное высокоточное типирование. Когда результаты этого повторного, высокоточного типирования подтверждают, что донор действительно подходит человеку, ожидающему пересадки костного мозга, потенциального донора еще раз запрашивают о согласии на донорство, обследуют на наличие вирусных инфекций и согласовывают время сдачи стволовых гемопоэтических клеток.

Отказаться от донорства стволовых гемопоэтических клеток можно практически на любом этапе, но не позднее чем за 10 дней до намеченной даты трансплантации костного мозга. Отказ в последнюю минуту практически равносилен убийству человека, ожидающего пересадки костного мозга, который уже получил интенсивную химиотерапию, полностью уничтожившую его кроветворную и иммунную систему. Причины для отказа могут быть самыми разными: нездоровье, нехватка времени, страх. Но в реальности потенциальные доноры крайне редко отказываются от донорства, осознавая важность своего поступка и для человека, нуждающегося в его помощи, и для себя самого.

Что такое трансплантация костного мозга? Что приходится перенести реципиенту?

Перед трансплантацией костного мозга пациент проходит определенную подготовку. Ее еще называют кондиционированием. Цель подготовки – подавить иммунитет и костный мозг реципиента, чтобы предотвратить отторжение пересаженных клеток, а также максимально уничтожить опухолевые клетки (в том случае, если пациент страдает злокачественным новообразованием). Для этого реципиент получает настолько интенсивную химиотерапию, что восстановление собственного кроветворения и иммунитета уже невозможно. Если трансплантация костного мозга в этот момент не произойдет, пациент погибнет. Сроки проведения химиотерапии рассчитываются таким образом, что к тому моменту, когда донор отдает свои гемопоэтические клетки, реципиент уже готов их принять.

Сама трансплантация по процедуре напоминает обычное переливание крови, за которым следует длительный, около 20 дней, период ожидания приживления пересаженных стволовых гемопоэтических клеток. И до момента приживления, и многие месяцы после него возможно развитие разнообразных осложнений. Поэтому в течение длительного периода после трансплантации костного мозга пациент вынужден находиться под пристальнейшим наблюдением врачей, в любую минуту готовых к проведению интенсивной терапии.

В зарубежных регистрах доноров костного мозга собраны данные миллионов потенциальных доноров, и все равно не каждый реципиент может найти в них совместимого донора. А в России своего крупного регистра все равно нет. Имеет проведение небольших акций по типированию потенциальных российских доноров смысл, ведь даже сотни обследованных доноров – это капля в море? Неужели такие акции могут кому-то помочь?

Акции, позволяющие привлечь даже относительно небольшое количество потенциальных доноров, имеют большое значение и для России, и для людей с российским происхождением. Чем больше доноров с российской кровью будет представлено в регистрах доноров костного мозга, тем больше шансов у людей с российскими корнями найти подходящего донора. Россияне генетически отличаются от американцев и европейцев, данные которых и представлены главным образом в зарубежных регистрах. Самым подходящим донором для российского пациента может стать именно россиянин.

Акции по тканевому типированию россиян – это начало создания собственного российского регистра доноров костного мозга. Регистра, который, если все будет получаться, как задумано, в будущем спасет не одну жизнь.

В настоящее время одной из глобальных задач, стоящих перед учёными всего мира, является обеспечение воспроизводства здорового потомства. Плохая экология, стрессы, заболевания родителей являются факторами, вызывающими нарушения нормального протекания беременности. Особым фактором, негативно влияющим на внутриутробное развитие плода, являются хронические заболевания матери. Одной из самых распространённых экстрагенитальных патологий у женщин репродуктивного возраста являются хронические заболевания гепатобилиарной системы, в частности гепатиты. Согласно данным литературы, хронический гепатит матери отрицательно влияет на становление и функционирование ряда жизненно важных систем организма, в частности иммунной, макрофагальной, пищеварительной, репродуктивной и пр. [1].

Не подлежит сомнению, что для обеспечения жизнедеятельности организма необходимо нормальное функционирование одной из важнейших систем - системы крови. В свою очередь, адекватное выполнение кровью своих функций напрямую зависит от соотношения и функционирования форменных элементов крови [8].

В связи со сказанным выше целью настоящей работы явилось изучение влияния хронической патологии печени матери на миелопероксидазную активность нейтрофилов потомства. Поскольку биосинтез пероксидазы осуществляется во время дифференциации нейтрофильных предшественников в костном мозге и заканчивается ко времени выхода зрелых гранулоцитов в кровеносное русло, нами было изучено содержание этого фермента на всех морфологически идентифицируемых стадиях развития нейтрофила [5].

Материал и методы исследования

Исходя из цели настоящего исследования все экспериментальные животные были разделены на 3 группы. Первую группу составили животные от интактных матерей - контрольная группа - 12 животных из 4 пометов. Во вторую группу вошло потомство от самок с хроническим экспериментальным поражением печени с помощью D(+)-галактозамина - первая экспериментальная группа - 12 животных из 6 пометов. В третью группу вошло потомство самок с хроническим экспериментальным поражением печени с помощью фильтрата E. coli - вторая экспериментальная группа - 12 животных из 5 помётов.

Модель хронического поражения печени путем введения D(+)-галактозамина Поражение печени моделировалось путем внутрибрюшинного введения гепатотропного яда D(+)-галактозамина гидрохлорида (Sigma-G0500, США) на 0,9%-ном растворе натрия хлорида в дозе 250 мг/кг массы тела животного. Экспериментальный гепатит, вызываемый введением D(+)-галактозамина, по своим морфологическим, иммунологическим и биохимическим характеристикам рассматривается как адекватная модель вирусного гепатита В у человека [2].

Модель хронического поражения печени путем введения фильтрата E. coli

Поражение печени моделировалось путем введения половозрелому животному (самке) в три участка печени - по одной инъекции с обеих сторон у основания мечевидного отростка и справа у края реберной дуги по срединно-ключичной линии - 0,2 мл фильтрата шестидневной культуры E. coli (штамм АТСС 25922) в разведении 1:4. Разрешающую инъекцию производили через 24 часа путём введения в хвостовую вену фильтрата шестидневной культуры E. coli из расчёта 0,3 мл/кг массы тела. По данным литературы, экспериментальный гепатит, вызываемый введением фильтрата шестидневной культуры E. coli, по своим морфологическим, иммунологическим и биохимическим характеристикам рассматривается как адекватная модель вирусного гепатита А у человека [7].

Морфологические и гистохимические методы исследования

Красный костный мозг получали из отпрепарированной от мышц бедренной кости забитого животного с отсеченными эпифизами путем нагнетания 0,9%-ного раствора натрия хлорида с использованием шприца на 2 мл. Из полученного из бедренной кости костного мозга изготавливали мазки.

В мазках изучалась миелопероксидазная активность нейтрофильных предшественников. Для этого нами проводилась цитохимическая реакция на выявление пероксидазы по методу Лелле. Фиксированные формалиновым спиртом и промытые в дистиллированной воде мазки на 4 минуты помещали в инкубационную смесь, состоящую из 10 мл 40%-ного этанола, 40 мг бензидина и капли 3%-ной перекиси водорода. В основе метода реакция окисления перекисью водорода в присутствие пероксидазы бензидина в буро-коричневый оксибензидин. Ядра клеток докрашивали метиленовым зелёным. Миелопероксидаза выявляется в цитоплазме клеток в виде коричневых гранул. При отсутствии реакции гранул в цитоплазме не наблюдается [4; 8].

Выделение нейтрофилов проводили общепринятыми методами на фиколл-верографиновом градиенте плотностью 1,095. Исследования проводили в монослое клеток, который получали по общепринятой методике, основываясь на способности фагоцитов адгезироваться к чистой стеклянной поверхности [8].

Фагоцитарную и внутриклеточную киллинговую активность изучали на основе способности клеток к захвату и перевариванию микроорганизмов по общепринятым методикам, основанным на инкубации в течении часа при 37 °С монослоя фагоцитов со взвесью микроорганизмов [8]. В качестве объекта фагоцитоза использовали живые суточные культуры St. aureus, штамм АТСС 25923.

Результаты исследования и их обсуждение

Нами изучалось содержание нейтрофилов на различных стадиях развития, у которых реакция на миелопероксидазу положительная. Результаты исследования представлены в таблице 1. За 100% мы брали всё количество клеток определённого типа у данной группы животных. Анализируя данные, представленные в таблице, в первую очередь можно отметить практически одинаково невысокое содержание бензидин-положительных клеток среди ранних стадий развития нейтрофила как в контрольной, так и в опытных группах. Согласно данным литературы, миелопероксидаза является важным ферментом зрелой клетки, активно выполняющим эффекторные функции. Синтез пероксидазы начинается и усиливается по мере увеличения степени дифференцировки клеток. Соответственно, у находящихся на ранних стадиях развития клеток митотического пула нейтрофильных предшественников - миелобластов, промиелоцитов и миелоцитов наличие миелопероксидазных гранул в цитоплазме скорее исключение, чем правило [5]. Поэтому на данном этапе различия между опытом и контролем практически не проявляются - клеток с отсутствием реакции одинаково много в контрольной и обеих опытных группах.

Таблица 1 - Содержание проявляющих положительную реакцию на пероксидазу клеток нейтрофилоцитарного ростка красного костного мозга контрольных и подопытных крысят, %

Апластической анемией (АА) называют заболевание, при котором костный мозг больного перестает производить достаточные количества всех основных видов клеток крови – эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Отсюда и название болезни: она сочетает в себе анемию (недостаточное число эритроцитов, низкий уровень гемоглобина) и аплазию кроветворения (угнетение выработки всех клеток крови).

Апластическая анемия – редкая болезнь: ее частота составляет порядка 2-6 случаев на миллион жителей в год. АА может возникнуть как у детей, так и у взрослых; считается, что пики заболеваемости наблюдаются в молодом возрасте (15-30 лет) и затем в пожилом (свыше 60 лет). Мужчины и женщины заболевают одинаково часто.

В подавляющем большинстве случаев причина заболевания неизвестна – в этом случае говорят об идиопатической АА. Но иногда развитие болезни связано с некоторыми врожденными патологиями или с внешними факторами: использованием определенных лекарств (хинин, хлорамфеникол и др.), работой с токсичными веществами (гербициды, инсектициды, некоторые растворители, включая бензол), облучением или перенесенными инфекциями (инфицирование вирусами гепатитов, вирусом Эпштейна-Барр, ВИЧ; возможно, также цитомегаловирусом).

Считается, что идиопатическая АА обычно имеет аутоиммунную природу, то есть возникает тогда, когда иммунная система организма по какой-то причине начинает бороться против его собственных клеток костного мозга.

Проявления апластической анемии связаны с панцитопенией – дефицитом всех разновидностей клеток крови.

• Недостаток эритроцитов – бледность, слабость, одышка, учащенное сердцебиение, головокружения, головные боли.
• Недостаток тромбоцитов – кровотечения, в том числе из носа и десен; появление синяков и петехий (мелких подкожных кровоизлияний).
• Недостаток лейкоцитов – слабая сопротивляемость инфекциям. Могут возникнуть инфекционные заболевания, плохо поддающиеся терапии или часто повторяющиеся.

Апластическая анемия бывает разной степени тяжести: различают легкую, средней тяжести, тяжелую и сверхтяжелую формы АА.

Заподозрить АА можно при появлении у ребенка перечисленных жалоб и симптомов, а подтвердить – на основании результатов клинического анализа крови, где резко снижены количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Производятся также другие клинические и лабораторные исследования, но окончательный диагноз ставится только по результатам анализа образца костного мозга, полученного с помощью пункции и/или трепанобиопсии. Исследование костного мозга необходимо для того, чтобы исключить другие возможные причины дефицита клеток крови, такие как лейкоз, миелодиспластические синдромы, миелофиброз и др.

При апластической анемии исследование костного мозга указывает на аплазию или гипоплазию кроветворения – то есть костный мозг практически не производит клетки крови или же производит их, но существенно меньше нужного. Таким образом специалисты могут сделать вывод, что дефицит клеток крови связан именно с их недостаточным образованием в костном мозге, а не, например, с их ускоренным разрушением в крови.

В ходе диагностических исследований необходимо также надежно отличать АА от врожденной анемии Фанкони, так как лечение этих болезней (включая протоколы трансплантации костного мозга) заметно различается. Для подтверждения или исключения анемии Фанкони могут использоваться цитогенетические исследования.

Лечение тяжелой и сверхтяжелой АА должно быть начато сразу после постановки диагноза, так как состояние серьезного дефицита всех клеток крови опасно для жизни. Если развитие АА вызвано определенной внешней причиной (лекарства, радиация), то в первую очередь надо убрать эту причину. Однако, как уже говорилось, какой-то внешний фактор развития болезни удается установить лишь в очень небольшом числе случаев.

Для проведения курса иммуносупрессивной терапии АА обычно необходима госпитализация. Основные осложнения в ходе лечения – это инфекции и кровотечения. Если нет ответа на первый курс терапии, могут быть проведены повторные курсы. Иммуносупрессивная терапия эффективна приблизительно в 70% случаев. К сожалению, у части больных после нее возникают рецидивы болезни.

В ходе лечения АА нужна интенсивная заместительная терапия компонентами крови (переливания донорских тромбоцитов, эритроцитов, в случае тяжелых инфекций – иногда и гранулоцитов). Однако если планируется трансплантация костного мозга, то нужно помнить, что множественные переливания перед трансплантацией повышают вероятность отторжения трансплантата.

Очень важны профилактика и лечение бактериальных, вирусных и грибковых инфекций, которые представляют большую опасность для больных АА. Для лечения применяют сочетания эффективных антибиотиков и противогрибковых препаратов, иногда на протяжении долгого времени.

В качестве дополнительной терапии используются также факторы роста – препараты, помогающие костному мозгу производить нужные клетки. Среди них можно назвать гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (нейпоген, лейкостим, граноцит), который стимулирует выработку лейкоцитов, и эритропоэтин, стимулирующий выработку эритроцитов.

Без лечения больные тяжелыми формами апластической анемии погибают в течение нескольких месяцев. Однако при современном адекватном лечении прогноз достаточно хороший.

Как уже говорилось, во многих случаях эффективна иммуносупрессивная терапия. Больные после такой терапии могут продолжительное время чувствовать себя хорошо, однако у некоторых из них возникает рецидив (возвращение) болезни. Для своевременного обнаружения рецидива необходимы регулярные проверки, в первую очередь анализы крови.

Среди детей и молодых взрослых, получивших трансплантацию костного мозга от полностью совместимых родственных доноров, полностью излечиваются более 80%. При использовании неродственных доноров вероятность успеха в среднем ниже и зависит от многих факторов. Однако следует отметить, что в последние годы результаты неродственных трансплантаций при АА улучшились.