Филогенетические деревья вирус гриппа

Теория является эволюции одним краеугольных из камней биологии и естествознания в целом. В последние теория годы эволюции ускоренное испытывала изменение и развитие в связи с появлением в естественнонаучной нового практике мощного экспериментальных пласта данных и теоретических методов. В поле теории зрения эволюции кодирующие попали макромолекулы: ДНК, РНК и белки, костяк составляющие клеток организации и организмов. Теперь широко уже известна роль ДНК и РНК материальных как носителей генов, переносчика как генетической информации от генов к белкам и белков исполнителей как самых биологических разнообразных функций: ферментов процессов катализаторов обмена, антител защитников иммунных организма, структурных элементов, регуляторных и транспортных

Первые аминокислот последовательности в были белках расшифрованы нуклеотидов в генах и РНК но массовое началось секвенирование только став к настоящему рутинной времени технологической операцией. Результаты секвенирования с тех пор накапливаются в компьютерных банках данных. К осени 1997 года международные крупнейшие банки содержали данных сведения примерно об одном секвенированных миллиарде нуклеотидов генов и других и о более

Легко понять, расшифровка что нуклеотидных генов последовательностей , РНК и аминокислотных белков последовательностей создаёт новую ситуацию, взглянуть позволяющую на процесс эволюции с молекулярного организации уровня жизни. Действительно, в классической аллели генетике генов обозначать принято однородными буквами или индексами: B и b, Если в процессе один эволюции аллель другого вытесняет , то кажется, происходят что как бы предыдущего утрата и распространение . В то же время в молекулярной генетике известно, многие что мутации состоят в замене одного лишь или нескольких нуклеотидов:

Поэтому аллеля замена может фактически сводиться к замене и фиксации единственного нуклеотида, а остальная, часть большая гена остаётся неизменной. Сходство аллельных последовательностей генов остаётся максимальным. Чем больше накапливается различий, меньше тем сходство последовательностей. Чем раньше два дивергировали гена, больше тем фиксированных они различий накопят.

Таким образом, последовательностей сходство макромолекул положить можно в основу построений. Число мономеров различий к нему быть может мерой эволюционной дивергенции. Обилие последовательностей секвенированных в банках делает данных применимость подхода этого практически неограниченной.

В последних течение 30 были лет разработаны десятков несколько компьютерных методов и пакетов программ для построения деревьев филогенетических макромолекул и филогенетического анализа, при помощи были которых построены сотни многие филогенетических деревьев макромолекул. В результате их анализа многочисленные получены интереснейшие данные, причём некоторые из них фундаментальное имели значение. Многие эволюционировали макромолекулы гораздо медленнее, морфологические чем признаки живых форм, поэтому их филогенетический позволяет анализ заглянуть в очень периоды ранние эволюционного процесса лет млн тому .

На базируется этом развитие молекулярной теории эволюции. Здесь мы не будем описывать её на профессиональном уровне, посвящены этому другие издания, а продемонстрируем, так сказать, научный продукт этой науки филогенетические деревья и покажем, к каким выводам любопытным приводят их анализ и интерпретация. Некоторые результаты приводимые получены автором и его сотрудниками.

Кодирующие эволюционируют макромолекулы с разными скоростями. Наиболее обычно консервативными являются гены и белки очень некоторых глубоких и рано генетических возникших процессов, представлены которые у многих форм жизни. Таковы, например, рибосомных гены РНК в молекулярный синтеза механизм , некоторых гистонов компактизации белков ДНК хромосом. Менее гены консервативны и белки систем, встречаются которые у определённых групп широких видов , глобины . Наконец, изменчивыми наиболее являются гены и белки вирусов, стремительно которые изменяются в борьбе с иммунной системой их хозяев гриппа, , онкогенные .

Примером глобального дерева, все охватывающего крупнейшие биологического таксоны мира, дерево является РНК, американцем построенное К. Вуузом и сотрудниками . Наиболее свойством неожиданным этого является дерева существование в нём трёх крупнейших ветвей, эубактерий объединяющих , архебактерий группа экзотическая и эукариот ядерные . До этой работы считалось, бактерии что составляют надцарство единое Prokariota, отделённое от второго надцарства Eukariota существенной дистанцией. В дереве Вууза три все глобальные примерно ветви равно друг удалены от друга. Поэтому следует архебактерий считать самостоятельным надцарством. Таким образом, Вууз ввёл три надцарства, или домена: Bacteria, Archaea, Eucarya. Некоторые предлагали исследователи также термин империя.

Этот результат важный сразу привлёк внимание к изучению архебактерий, причём было вскоре показано, что по многим свойствам другим они существенно действительно удалены как от эукариот, так и от эубактерий. Многие существуют архебактерии в природе в весьма экзотических условиях: при высокой вблизи температуре подводных вулканов; в среде, насыщенной метаном, соединениями Время надцарств разделения Bacteria и Archaea примерно оценивается в 3,5 млрд лет назад.

Дерево Вууза в включает себя фракции кодируемых не только ядерными генами, но и генами клеточных органелл митохондрий и хлоропластов. Легко заметить, ядерная что фракция кукурузы попадает в ветвь эукариот, как и ожидается, а фракции из митохондрий и хлоропластов этой же кукурузы mitochondrion, в ветвь эубактерий. Этот считается факт самым аргументом веским в пользу гипотезы симбиотической эволюционного возникновения эукариот, которой согласно митохондрии происходят от симбиотических пурпурных предковых бактерий, а хлоропласты от цианобактерий , а вовсе не от ядерных эукариотических структур клеток.

Белки-глобины (гемоглобины крови, миоглобины и их гены распространены в живой природе не столь широко. Они найдены в основном у животных, некоторые удалённые их представители также найдены у растений, а у прокариот пока они не обнаружены. Поэтому образуют глобины молекулярное надсемейство, лишь охватывающее часть дерева таксономического жизни. Деревья глобинов эволюции и их генов построены были многими исследователями. На рис. 2 филогенетическое приведено дерево глобинов, построенное А. Жарких в нашей лаборатории. В целом достаточно оно хорошо принятой соответствует таксономии животных.

Из палеонтологических независимых данных почерпнуть можно датировки существования эпох общих многих предков ныне биологических живущих форм. Так, в дереве датированы глобинов шесть точек ветвления. Поскольку реконструкции методы деревьев определить позволяют длины рёбер дерева фиксированных замен, на различных маршрутах, то с учётом это датировок даёт подсчитать возможность скорости эволюции на разных этапах и в разных ветвях дерева. Нами очень получены любопытные .

оказалось, средняя что скорость эволюции по всему была белку непостоянна и имела примерно максимум лет назад, в эпоху позвоночных выхода животных из Мирового океана на сушу . особенность эта выявилась ещё ярче для тех участков глобинов, отвечают которые за образование их четвертичной , структуры. Дело в том, миоглобины что и гемоглобины примитивных некоторых животных до сих пор собой представляют протомеры субъединицы . Круглоротые рыбы , димерные имеют агрегаты гемоглобинов, а большинство других позвоночных тетрамерные агрегаты, состоящие из двух и двух . Субъединицы соединяются при помощи называемых так центров контакта, обозначаются которые Для современных известны гемоглобинов аминокислоты, входящие в центры контакта. Поэтому подсчитать можно скорости непосредственно эволюции для центров контакта. Максимум скорости чётко выявляется для центра контакта и регуляторного связывания центра дифосфоглицерата . Таким образом, при выходе животных позвоночных на сушу их гемоглобин приобрёл тетрамерную структуру, разные когда между связаны собой центрами и регуляторным центром ДФГ. Прежде всего в эту эпоху общего ген предка был гемоглобинов дуплицирован, а его копии в ходе дали дивергенции начало родственным двум . Именно в ту эпоху мы видим скорость максимальную эволюции центров их контакта и регуляции, а затем в течение миллионов сотен лет резко скорость падала, часто до нуля, возникшие когда центры просто были неизменны. Иначе говоря, мы как бы события видим эпохи новых формирования функциональных молекул структур гемоглобина, которые в дальнейшем сохраняются у всех форм наземных позвоночных. Следует учесть, выход что позвоночных на сушу и переход к дыханию кислородом свободным воздуха резкой сопровождались перестройкой системы всей дыхания, и в том структуры числе гемоглобинов. Ускорение эволюции в эту эпоху означает, указанные что приобретения высоко были адаптивными, то есть существенное обеспечивали преимущество их обладателям. Примером наиболее дерева быстрой эволюции молекулярной является дерево генов, кодирующих гемагглютинины H3 вируса , построенное Л.В. Омельянчуком и сотрудниками. Это белок вирусного капсида, выпуклые некоторые участки которого специфическими узнаются антителами хозяина . В результате сопротивление иммунное хозяина размножению препятствует вируса. Вирус имеет гриппа в котором происходят мутации с наибольшей известной частотой на позицию, за репликацию. В XX веке несколько изучены локальных эпидемий и пандемий гриппа. Одной из первых была изученных пандемия испанки . В дальнейшем зафиксированы были пандемии гонконгского В большинстве образцы случаев эпидемических вируса штаммов гриппа собраны были и сохранены в коллекциях. После 1978 года РНК эпидемических этих штаммов были секвенированы, а позже построены теоретиками филогенетические деревья.

Анализ на дерева рис. 4 показал, все что эпидемические оказались варианты на нижних ветвях тупиковых дерева висячие . Это значит, эпидемические что штаммы, как правило, не бывают потомками прямыми других эпидемических штаммов. Иначе говоря, неэпидемический вирус, видимо, циркулирует резервуаре популяции человека, где к вирусу устойчивый есть иммунитет, животных, могут которые быть носителями промежуточными . Эпидемии возникают тогда, появляется когда новый вариант вируса, которого против нет готовых антител, то есть иммунитета готового хозяина. Этот вариант как бы выплёскивается в человеческую популяцию и быстро в ней распространяется, пока не будет адекватный выработан иммунный ответ. Тогда эпидемия затухает. Следующая возникает эпидемия путём независимого выплёскивания варианта нового вируса гриппа, не связанного, как правило, с предыдущей эпидемией.

Поскольку эпидемии все были датированы , возможным оказалось определить скорости эволюции. В эпидемических они ветвях оказались выше, чем в неэпидемических, причём большое особенно ускорение выявлено было именно в позициях, антигенные кодирующих детерминанты белка. Иммунное хозяина сопротивление размножению является вируса главным селективным фактором, действующим на вирус. Поэтому эпидемического выплеск штамма, не встречающего сопротивления иммунного хозяина, ускорением сопровождается эволюции. Это размножение адаптивно высоко для вируса и неадаптивно Напротив, выработки после иммунного спокойное ответа размножение становится вируса для него и хозяина нейтральным в ожидании адаптивных новых мутаций и рекомбинаций. В целом говорить можно о коэволюции вируса и иммунного системы ответа хозяина. Вирус стремится как бы выскользнуть мутационно иммунного готового ответа хозяина, а хозяин догнать стремится новые вируса варианты путём нового выработки специфичного иммунного ответа.

Ещё пример один вируса эволюция ВИЧ иммунодефицита человека, HIV в английской , заболевание вызывающего СПИД приобретённого иммунодефицита, в английской транскрипции . Вирус ВИЧ передаётся половым путём, а также нередко при переливании крови, инъекциях нестерильных и хирургических вмешательствах, при родах от матери к ребёнку и в других подобных ситуациях. Он был обнаружен в начале в крови больных, погибавших от различных тяжёлых заболеваний. Эти заболевания одно имели общее свойство система иммунная больного неспособна была противостоять этому как вирусу, так и сопровождавшим других возбудителям заболеваний, от которых, собственно, больные и погибали. Были образцы обследованы из банков переливания крови, созданы которые во многих странах для медицинских целей. Оказалось, многие что образцы содержали вирус ВИЧ.

Различные вируса штаммы ВИЧ, в выделенные разных районах Африки, Карибского бассейна и США, были секвенированы, для них теми же методами, что и выше, филогенетические построены деревья из них показано . Это дерево указывает, вирус что ВИЧ существовал в Центральной Африке до 1960 года, был занесён на Гаити до середины и в США до 1978 года. Иначе говоря, истоки его лежат в Африке, где в некоторых вирусоносители странах составляют до половины населения, заболевание хотя СПИД далеко проявляется не у всех. Видимо, вируса размножение всё же сдерживается их иммунной системой. Вирус ВИЧ сходен с некоторыми вирусами обезьян, многие поэтому учёные предполагают, что он возник в результате этих изменчивости вирусов и был занесён в популяцию извне человека относительно недавно.

Интересно, изменчивость что вируса ВИЧ столь велика, что он успевает измениться в сторону своей усиления агрессивности непосредственно в ходе болезни развития СПИД у некоторых больных в течение и менее. Оценки изменчивости показывают, она что превышает допустимый верхний предел, в результате иммунная чего система больного не успевает справиться с выработкой вариантов новых антител и фактически распадается, путь открывая процессу заболевания СПИД и других болезней. Именно в этом, источник состоит агрессивности заболевания СПИД.

Есть биологические проблемы, которые в большой степени и всегда человека интересуют и человечество. Среди особое них место проблема занимает происхождения самого эволюции человечества. В последние годы в этой прогресс области связан в основном с филогенетическим анализом макромолекул. Американский учёный М. Гудмен и сотрудники филогенетические построили деревья для некоторых генов и белков от высших приматов и человека. На рис. 6 одно приведено из них. Из него следует, порядок что последовательного видов ответвления от эволюционного человека ствола таков: макак резус орангутан горилла шимпанзе человек. Иначе говоря, близким наиболее к человеку является шимпанзе.

Следует отметить, до что этих в работ таксономии приматов высших выделяли два семейства: Hominidae, только включавшее вид Homo sapiens, и Pongidae, включавшее гориллу, шимпанзе и орангутана. существенно анализ изменил эту классификацию. Гудмен и его предложили сотрудники новую высших таксономию приматов:

Семейство Hominidae

Homininae

Gorilla

Homo

Pan

Ponginae

Pongo

Близость и человека шимпанзе основание дала Дж. Дайамонду человека назвать третьим шимпанзе. По его оценкам, человека геномы и шимпанзе примерно различаются замен одиночных , то есть на каждый сотый нуклеотид, но остальные 99 из 100 нуклеотидов у них одинаковы. Время их молекулярной оценивается дивергенции лет назад. Эти факты очень являются веским аргументом в пользу происхождения естественного человека в процессе развития филогенетического жизни на Земле в противовес религиозным различным мифам о разовом творении тому назад.

Таким образом, позволяет анализ приблизиться к решению важных очень вопросов эволюции. Иногда единственная это возможность далеко заглянуть назад. При этом всегда почти мы можем только оперировать кодирующими последовательностями от ныне живущих видов. Ископаемых последовательностей почти нет. Правда, в последнее время удаётся выделить и секвенировать фрагменты ДНК из замёрзших животных ископаемых , тел мумифицированных человека. Особых эти открытий данные пока не содержат. Исключение уникальная представляет возможность выделения ДНК из мелких насекомых , термиты, пчёлы, , законсервированных в природной деревьев смоле . Известно, эту что идею американский использовал кинорежиссёр С. Спилберг в фильме Парк юрского периода: в янтаре найден якобы комар, в кишечнике содержатся которого остатки крови клеток динозавра, этим укушенного комаром; из них выделяется ДНК динозавра. Затем полностью динозавр воспроизводится методами на радость и страх посетителям парка. Разумеется, это фантазия. Но анализ ДНК насекомых законсервированных вполне реален. Так, для термита, пчелы и долгоносика из янтаря клонированы были и секвенированы гены . Они включены в филогенетические этих деревья молекул. Возраст найденных в янтаре термитов и пчёл долгоносика Пока рекордные это случаи.

В можно заключение отметить, молекулярный что филогенетический становится анализ сейчас одним из весомых таксономии методов живых форм. Таксономия приматов высших сейчас базируется больше на молекулярных данных, чем других. В систематике наивысших таксонов, высших систематике растений роль решающую играют деревья рибосомных РНК. Таксономию вообще бактерий невозможно без построить молекулярных данных. Можно надеяться, что в дальнейшем этого роль подхода только возрастёт.

Были проанализированы 201 штамм вирусов гриппа А и В, выделенные в эпидемические сезоны 2006–2009 годов и 10 пандемических вирусов гриппа А субтипа H1N1v 2009 года выделения.

С помощью программ Vector NTI8 и MEGA2.1 предсказаны первичные аминокислотные последовательности гемагглютинина, нейраминидазы и М2-белка, построены филогенетические деревья и элайнменты вирусов гриппа A двух субтипов (H1N1, H3N2) и вируса гриппа B, циркулировавших на территории России в 2007–2009 гг.

В последние годы наблюдалась активизация вирусов гриппа A субтипа H1N1. Доля этих вирусов увеличилась c 12% в 2005–2006 годах, до 60% в 2007–2008 годах от общего количества выделенных штаммов. Активизация была связана с появлением на эпидемической арене вирусов новой антигеной разновидности.

Для вирусов гриппа А субтипа H1N1 2006 и 2007 годов выделения было показано увеличение гетерогенности популяции. Вирусы гриппа А (H1N1), выделенные в 2006 году, подразделялись на две группы: вирусы подобные штамму А/Н.Каледония/20/99 (клайд 1) и вирусы, отличающиеся как от референс-штамма А/Н.Каледония/20/99, так и от референс-штамма 2007 года А/Соломоновы острова/3/06 (клайд 2а). Эти штаммы образовали клайд 2d. Вирусы 2007 года выделения содержали замены, характерные как для штаммов 2006 года (S36N, T82K, R145K, V165A), так и оригинальные (E169K, N183T, R188S, A189T).

Штаммы вируса гриппа А подтипа H1N1 2007–2008 годов выделения по молекулярно-генетическим характеристикам были родственны штамму вируса гриппа А/Брисбен/59/07 (клайд 2В), рекомендованному ВОЗ для производства гриппозных вакцин. Большинство изолятов 2008 года кластеризовались в отличную от изолятов 2006–2007 годов выделения эволюционную группу. У них были выявлены отличия по шести аминокислотным позициям от вакцинного штамма А/Новая Каледония/20/99, по пяти позициям от вакцинного штамма А/Соломоновы Острова/3/06 и по восьми аминокислотным позициям от российских изолятов 2006–2007 годов выделения.

Часть штаммов вируса гриппа А подтипа H1N1, выделенных в сезоне 2008–2009 года, по молекулярно-генетическим характеристикам была родственна вакцинному штамму вируса гриппа А/Брисбен/59/07 (клайд 2В), а часть штаммов — штамму вируса гриппа A/Москва/5/08, выделенному в эпидемический период 2007–2008 года (клайд 2С) и отличалась по 6 аминокислотным позициям в молекуле гемагглютинина от штамма вируса гриппа А/Брисбен/59/073.

Согласно предсказанным аминокислотным последовательностям HA пандемического вируса — штамма А/Санкт-Петербург/04/2009v содержит в 83 положении сериновый остаток, также как и референс-штамм А/Техас/05/2009. Вместе с тем, выявлены отличия Санкт-Петербургского штамма от прототипных штаммов — две замены аминокислотных остатков I189L и T203S. Все проанализированные штаммы (8 штаммов) содержали в нейраминидазе аминокислотную замену остатка валина на изолейцин в 136 позиции (также как и штамм А/Москва/01/2009v). Кроме того, штамм A/Санкт-Петербург/01/2009v содержит замену D128A, а штаммы A/Санкт-Петербург/02/2009v и A/Санкт-Петербург/04/2009v — D248N по сравнению с прототипными штаммами. Таким образом, согласно анализу предсказанных аминокислотных последовательностей белков пандемические штаммы вируса гриппа А/H1N1v, выделенные в Санкт-Петербурге, родственны штаммам А/Техас/05/2009 и А/Калифорния/07/2009.

Штаммы вируса гриппа А H3N2, выделенные в 2007 и 2008 годах, по результатам филогенетического анализа и предсказанной первичной аминокислотной последовательности гемагглютинина вирусы можно было разделить на три группы, эволюционно близкие к вакцинному штамму A/Висконсин/67/2005 (H3N2) (2007 год) и штамму вируса гриппа А/Брисбен/10/07 (H3N2), рекомендованному ВОЗ для производства гриппозных вакцин (2008 год). Большинство изолятов 2008 года кластеризовались в отличную от изолятов 2006-2007 года выделения эволюционную группу, с двумя аминокислотными заменами в НА1.

Штаммы вируса гриппа А подтипа H3N2 2008–2009 годов. выделения, по молекулярно-генетическим характеристикам родственны вакцинному штамму А/Брисбен/10/07 (H3N2) и являются эволюционным продолжением штаммов предыдущего эпидемического периода. Они сохранили замены, характерные для штамма А/Брисбен/10/07 E50G в антигеном сайте С.

Филогенетический анализ штаммов вирусов гриппа В, циркулировавших в эпидемические сезоны 2006–2009 годов. показал, что данные штаммы относились к двум линиям: Викторианской и Ямагатской. В 2006–2007 годах циркулировали преимущественно вирусы гриппа В, относящиеся к Викторианской линии. В 2008 году, согласно филогенетическому анализу все проанализированные российские изоляты (15 штаммов) относились к Ямагатской линии. Большинство штаммов (94%) вируса гриппа В 2008–2009 годов выделения (32 штамма) по молекулярно-генетическим характеристикам относятся к Викторианской линии.

Проведен анализ мутаций, определяющих устойчивость вирусов гриппа А к ремантадину. Установлено, что у 23,0% вирусов гриппа А подтипа H1N1и 100% штаммов подтипа H3N2 в 31 положении М2-белка находится аспарагин, что, может свидетельствовать об устойчивости этих штаммов к ремантадину. По данным секвенирования показано отсутствие штаммов вируса гриппа А подтипа H1N1, устойчивых к ремантадину и озельтамивиру одновременно.

Проведен анализ устойчивости изолятов вируса гриппа А субтипа H1N1 2007–2009 годов выделения к озельтамивиру методами RFLP (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) и секвенирования фрагмента гена NA. Показано, что 80,5–91,4% изолятов имели замену гистидина на серин в гене NA в положении 275, что определяло их устойчивость к озельтамивиру. Все проанализированные штаммы A H1N1v не имели подобной мутации.

У проанализированных штаммов A H1N1v показано отсутствие аминокислотных замен в белках М2 и NS2 по сравнению со штаммами вируса гриппа А/Техас/05/2009 и А/Калифорния/07/2009. Штаммы из Санкт-Петербурга, также как и прототипные штаммы имели мутацию в белке М2, ответственную за устойчивость к ремантадину.

По итогам выполнения опубликованы 4 статьи (3 из них в иностранных изданиях), 3 тезисов в материалах международных конференций, сделано 14 докладов на Российских и зарубежных конференциях и съездах.

Георгий Александрович Базыкин — кандидат биологических наук, заведующий сектором молекулярной эволюции в Институте проблем передачи информации им. А. А. Харкевича РАН, ведущий научный сотрудник лаборатории эволюционной геномики факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М. В. Ломоносова. Занимается изучением различных вопросов биологической эволюции с использованием методов геномики и биоинформатики.

Юрий Эдуардович Стефанов — кандидат биологических наук, научный сотрудник Института молекулярной биологии РАН им. В. А. Энгельгарта и научный консультант студии научного дизайна Visual Science. Область научных интересов — эволюция мобильных генетических элементов, трехмерное компьютерное моделирование вирусных частиц.

В общественном сознании закрепилось довольно легкомысленное отношение к гриппу. Действительно, зачастую его симптомы не тяжелее простудных, да и беспокоит он нас не дольше недели, причем проходит обычно без всякого лечения. Однако история взаимодействий человека и вируса гриппа требует более серьезного подхода к этому патогену. Достаточно вспомнить, что одни из самых страшных пандемий прошлого века были вызваны этим вирусом * . Да и обычный сезонный грипп далеко не безвреден: по оценкам Всемирной организации здравоохранения, ежегодно от него и связанных с ним осложнений умирают сотни тысяч человек (в первую очередь, пожилые люди, младенцы и страдающие хроническими заболеваниями), а в годы тяжелых пандемий — миллионы. По числу унесенных жизней среди инфекционных заболеваний грипп уступает, пожалуй, только ВИЧ. Основная проблема профилактики и лечения гриппа связана с тем, что вирус очень быстро меняется, и каждый год мы имеем дело с его новыми формами, поведение которых далеко не всегда можно предсказать. Очередным шагом на пути к пониманию изменчивости вируса гриппа стал компьютерный анализ последовательностей аминокислот в белках вируса и нуклеотидов в его геноме.

Первая в мире полная достоверная модель вируса гриппа A/H1N1 с атомным разрешением, созданная в рамках проекта Viral Park компании Visual Science при участии Национального центра биотехнологии в Мадриде. Цель проекта — построение научно достоверных 3D-моделей распространенных вирусов человека с максимальной детализацией. Специалисты Visual Science собирают воедино данные огромного количества работ по молекулярной биологии, вирусологии и кристаллографии вирусов, мнения экспертов ведущих научных центров мира и результаты молекулярного моделирования, полученные научным отделом компании. Модель в значительной степени построена на основе данных, опубликованных исследовательскими коллективами под руководством: Хуана Ортина (Испанский национальный центр биотехнологий, Мадрид, Испания), Такеши Нода (Университет Токио, Япония), Роба Ригро (Отдел взаимодействий вируса и клетки, Гренобль, Франция) и Питера Розенталя (Национальный институт медицинских исследований, Лондон, Великобритания). Точное строение генома вируса гриппа удалось смоделировать благодаря сотрудничеству с Хайме Мартин-Бенито (Испанский национальный центр биотехнологий, Мадрид, Испания), группа которого добилась уникальных результатов в описании упаковки вирусного генетического материала. Создатели модели: Иван Константинов (руководитель проекта), Юрий Стефанов (научный консультант), Анастасия Бакулина (ведущий молекулярный моделлер), Дмитрий Щербинин (молекулярный моделлер), Александр Ковалевский (3D-моделлер)

Сегментированный геном

Общая длина генома вируса гриппа составляет приблизительно 13 500 нуклеотидов [2]. Три самых крупных (примерно по 2300 нуклеотидов) его сегмента (PA, PB1 и PB2) кодируют вирусную полимеразу — белок, копирующий РНК и состоящий из трех крупных субъединиц. Четвертый по длине (около 1750 нуклеотидов) сегмент (HA) отвечает за синтез гемагглютинина. Этот белок заякорен в липидной оболочке вируса и отвечает за его проникновение в клетку, связываясь с рецептором на поверхности клеточной мембраны [3]. В зависимости от того, какой именно вариант гемагглютинина несет вирус, связывание может быть более или менее крепким. После этого клетка поглощает вирус, помещая его в мембранный пузырек внутри цитоплазмы. Большинство макромолекулярных комплексов, поглощаемых таким образом, перевариваются клеткой. Однако вирус избегает этой участи: его мембрана сливается с мембраной пузырька, в результате чего ее содержимое оказывается в цитоплазме. В этом процессе гемагглютинин также играет важную роль. Затем геном вируса проникает в ядро, где с него может начать считываться информация.

Сегмент размером около 1550 нуклеотидов (NP) кодирует нуклеопротеин — белок, необходимый вирусу для упаковки РНК. Множество копий такого белка распределяется по каждому из геномных сегментов, связываясь с молекулой нуклеиновой кислоты. В результате фрагменты генома образуют нуклеопротеидные тяжи, сложенные пополам и закрученные в спираль, к каждому из которых прикрепляется своя копия полимеразного комплекса [4].

Сегмент M1/M2 длиной 1000 нуклеотидов, в соответствии со своим названием, кодирует сразу два белка — М1 и М2. Из молекул первого из них образован слой (матрикс), подстилающий вирусную липидную оболочку. Обычно М1 играет ключевую роль в формировании вирусных частиц, поскольку он взаимодействует одновременно с поверхностными белками вируса и внутренними компонентами вирусной частицы. Задача матриксного белка — собрать все составляющие воедино [6]. Белок М2 выполняет роль ионного канала. Он расположен в липидной оболочке вируса и способствует его распаковке в цитоплазме клетки [7].

Последний, самый короткий (из 865 нуклеотидов) сегмент РНК вируса гриппа отвечает за синтез двух белков, которые не попадают в зрелую вирусную частицу. Эти белки называются NS1 и NEP. Первый необходим вирусу, в частности, для того, чтобы блокировать считывание информации с клеточных молекул РНК [8]. Благодаря ему клетке приходится синтезировать преимущественно вирусные белки, оставляя свои собственные нужды. Второй белок, NEP, обеспечивает транспорт новообразованных геномных комплексов вируса из ядра к клеточной мембране, где происходит сборка вирионов [9].

Новые штаммы и поиск реассортаций

Классификация штаммов вируса гриппа основана прежде всего на том, какие именно варианты гемагглютинина и нейраминидазы входят в его состав. Широко известные комбинации букв H и N в сочетании с порядковыми номерами (например, H3N2) как раз и обозначают подтип вируса: гемагглютинин 3, нейраминидаза 2. Таких подтипов десятки, однако человека заражают лишь немногие — обычно те, у которых не слишком большие номера N и H. Наиболее давние хозяева вируса гриппа — птицы, от которых новые штаммы время от времени передаются домашнему скоту и, прямо или опосредованно, людям [10]. Чем более долгий период коэволюции провели вместе патоген и хозяин, тем менее болезненным становится их совместное существование. Птичьи штаммы вируса зачастую оказываются очень опасными после передачи новым хозяевам [11].

Известно, что именно реассортации сегментов РНК привели к возникновению штаммов, которые вызвали пандемии азиатского и гонконгского гриппа в 1957 и 1968 гг., унесшие около 2,5 млн жизней [12]. Возможно, что и испанский грипп начала прошлого века, число жертв которого шло на десятки миллионов, тоже появился в результате такой эволюционной схемы [13].

Подобное исследование можно провести с использованием геномов вируса гриппа, опубликованных в свободном доступе. Избрав в качестве объекта штаммы H3N2, можно составить выборку из 1376 сегментированных геномов, а затем сравнить между собой филогенетические деревья для этих вирусов, построенные в отдельности по каждому из геномных сегментов [15].

В результате такого сравнения оказалось, что число реассортаций примерно сопоставимо для разных сегментов: в ходе эволюции гриппа в популяции человека каждая пара сегментов в недавнем прошлом реассортировала около 50 раз.

Последствия реассортаций

После того как ветви, в которых произошли реассортации, были обнаружены, стало возможным оценить их влияние на накопление в сегментах вирусного генома точечных замен. Для этого можно сравнить время, прошедшее между каждой такой заменой и ближайшей предшествующей ей реассортацией, с тем, которое бы ожидалось из компьютерной модели, если бы реассортации не влияли на замены. Проведенный анализ показал, что по крайней мере в пяти из восьми сегментов генома мутации ускоренно накапливаются после реассортации. Наиболее ярко эффект проявился для нейраминидазы и белка PB1. Ускорение аминокислотных замен после реассортаций вирусных геномов указывает на то, что в такие периоды эволюции вируса гриппа прежде всего происходит адаптация белков к новому генетическому окружению. Из-за того, что вирусные белки взаимодействуют между собой, молекулы из разошедшихся штаммов вынуждены какое-то время изменяться, приспосабливаясь друг к другу.

Интересно, что у нейраминидаз наблюдалось 30 замен, расстояние от которых до ветви, несущей реассортацию, меньше того эволюционного расстояния, на котором мы бы ожидали встретить одну случайную синонимичную замену в гене данного белка. Такой результат свидетельствует о том, что все эти 30 мутаций произошли и закрепились необычайно быстро, и что необходимость быстрой адаптации возникла именно благодаря тому, что соответствующий сегмент генома попал в новое генетическое окружение.

Реассортация — это резкое эволюционное изменение, которое поначалу может снижать общую приспособленность вируса к условиям окружающей среды и к организму-хозяину. Однако иногда оказывается, что из-за такой перетасовки белков из разных штаммов новая форма патогена оказывается более приспособленной, чем штаммы-предшественники, получая возможность эффективнее распространиться [18]. Похоже, что за коррекцию первичного вредного эффекта от реассортации как раз и отвечают быстро закрепляющиеся адаптивные мутации.

Предсказания, полученные только статистическими методами, — путем анализа последовательностей белков и кодирующих их генов, — конечно, не могут иметь стопроцентную точность. Действительно ли взаимодействуют две определенные аминокислоты, можно проверить экспериментально. Однако каждый белок вируса состоит из сотен аминокислот, так что возможны десятки тысяч разных взаимодействий. Постановка такого числа экспериментов практически неосуществимы. Биоинформатический анализ позволяет расставлять приоритеты: выбирать и анализировать только те аминокислоты, которые участвуют во взаимодействиях, экономя время и силы экспериментаторов. Кроме того, такой подход позволяет понять, насколько взаимодействия, приводящие к вредности реассортаций, распространены на уровне всего генома.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 13-04-02098) и Министерства образования и науки Российской Федерации (проект 11.G34.31.0008).

Литература
1. Steinhauer D. A., Domingo E., Holland J. J. Lack of evidence for proofreading mechanisms associated with an RNA virus polymerase // Gene. 1992. V. 22. № 2. P. 281–288.
2. Teng Q., Hu T., Li X. et al. Complete genome sequence of an H3N2 avian influenza virus isolated from a live poultry market in Eastern China // J. Virol. 2012. V. 86. № 21. P. 11944. DOI: 10.1128/JVI.02082-12.
3. Carr C. M., Kim P. S. A spring-loaded mechanism for the conformational change of influenza hemagglutinin // Cell. 1993. V. 73. № 4. P. 823–832.
4. Arranz R., Coloma R., Chichуn F. J. et al. The structure of native influenza virion ribonucleoproteins // Science. 2012. V. 338. № 6114. P. 1634–1637. DOI: 10.1126/science.1228172.
5. Kamali A., Holodniy M. Influenza treatment and prophylaxis with neuraminidase inhibitors: a review // Infection and Drug Resistance. 2013. № 6. P. 187–198. DOI: 10.2147/IDR.S36601.
6. Nayak D. P., Hui E. K., Barman S. Assembly and budding of influenza virus // Virus Res. 2004. V. 106. № 2. P. 147–165.
7. Lear J. D. Proton conduction through the M2 protein of the influenza A virus; a quantitative, mechanistic analysis of experimental data // FEBS Lett. 2003. V. 552. № 1. P. 17–22.
8. Hale B. G., Randall R. E., Ortнn J. et al. The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses // J. Gen. Virol. 2008. V. 89. № 10. P. 2359–2376. DOI: 10.1099/vir.0.2008/004606-0.
9. Robb N. C, Smith M., Vreede F. T. et al. NS2/NEP protein regulates transcription and replication of the influenza virus RNA genome // J. Gen. Virol. 2009. V. 90. № 6. P. 1398–1407. DOI: 10.1099/vir.0.009639-0.
10. El Zowalaty M. E., Bustin S. A., Husseiny M. I. et al. Avian influenza: virology, diagnosis and surveillance // Future Microbiol. 2013. V. 8. № 9. P. 1209–1227. DOI: 10.2217/fmb.13.81.
11. Kaplan B. S., Webby R. J. The avian and mammalian host range of highly pathogenic avian H5N1 influenza // Virus Res. 2013. V. 178. № 1. P. 3–11. DOI: 10.1016/j.virusres.2013.09.004.
12. Kilbourne E. D. Influenza pandemics of the 20th century // Emerg. Infect. Dis. 2006. V. 12. № 1. P. 9–14.
13. Suzuki Y. A phylogenetic approach to detecting reassortments in viruses with segmented genomes // Gene. 2010. V. 464. № 1–2. P. 11–16. DOI: 10.1016/j.gene.2010.05.002.
14. Nagarajan N., Kingsford C. GiRaF: robust, computational identification of influenza reassortments via graph mining // Nucleic Acids Research. 2011. V. 39. № 6. e34. DOI: 10.1093/nar/gkq1232.
15. Neverov A. D., Lezhnina K. V., Kondrashov A. S., Bazykin G. A. Intrasubtype Reassortments Cause Adaptive Amino Acid Replacements in H3N2 Influenza Genes // PLoS Genet. 2014. V. 10. № 1. e1004037. DOI: 10.1371/journal.pgen.1004037
16. Wolf Y. I., Viboud C., Holmes E. C. et al. Long intervals of stasis punctuated by bursts of positive selection in the seasonal evolution of influenza A virus // Biol. Direct. 2006. V. 1. P. 34.
17. Kryazhimskiy S., Dushoff J., Bazykin G. A. et al. Prevalence of epistasis in the evolution of influenza A surface proteins // PLoS Genet. 2011. V. 7. № 2. e1001301. DOI: 10.1371/journal.pgen.1001301.
18. Li K. S., Guan Y., Wang J. et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia // Nature. 2004. V. 430. № 6996. P. 209–213.
19. Ferguson N. M., Fraser C., Donnelly C. A. et al. Public health. Public health risk from the avian H5N1 influenza epidemic // Science. 2004. V. 304. № 5673. P. 968–969.
20. Yong E. Influenza: Five questions on H5N1 // Nature. 2012. V. 486. № 7404. P. 456–458. DOI: 10.1038/486456a.
21. Herfst S., Schrauwen E. J., Linster M. et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets // Science. 2012. V. 336. № 6088. P. 1534–1541. DOI: 10.1126/science.1213362.
22. Imai M., Watanabe T., Hatta M. et al. Experimental adaptation of an influenza H5 HA confers respiratory droplet transmission to a reassortant H5 HA/H1N1 virus in ferrets // Nature. 2012. V. 486. № 7403. P. 420–428. DOI: 10.1038/nature10831.
23. Russell C. A., Fonville J. M., Brown A. E. et al. The potential for respiratory droplet-transmissible A/H5N1 influenza virus to evolve in a mammalian host // Science. 2012. V. 336. № 6088. P. 1541–1547. DOI: 10.1126/science.1222526.

Читайте также: