Диагностика вирусных и фитоплазменных болезней
КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
Название Создание высокочувствительных тест-систем для одновременной экспресс-диагностики широкого спектра болезней картофеля на основе qPCR-матриц длительного хранения с возможностью быстрой оптимизации архитектуры матрицы в соответствии с запросами регионального потребителя
Руководитель Приданников Михаил Викторович, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии", Московская обл
Года выполнения при поддержке РНФ 2016 - 2018
Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-104 - Агробиотехнологии
Ключевые слова ПЦР в реальном времени, qPCR матрица, мультиплексный анализ, диагностика болезней картофеля, вирусы и вироиды картофеля, фитоплазма, картофельные нематоды, Phytophthora infestans, Alternaria sp., Dickeya solani, Ralstonia solanacearum, Erwinia sp., Clavibacter sp., Pectobacterium sp., Rhizoctonia solani
Код ГРНТИ 68.37.31
Статус Успешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Ожидаемые результаты
Ожидаемые результаты: 1) Будет создана и испытана в лабораторных и полевых условиях qPCR-матрица для диагностики вирусных и вироидных болезней картофеля (PLRV, PMTV, PVХ, PVA, PVM, PVY, PVYn, PVS, PSTV). 2) Будет создана и испытана в лабораторных и полевых условиях qPCR-матрица для диагностики грибных и оомицетных патогенов картофеля (Phytophthora infestans, Alternaria solani, A. alternatа, Synchytrium endobioticum, Rhizoctonia solani, Fusarim sp.). 3) Будет создана и испытана в лабораторных и полевых условиях qPCR-матрица для диагностики бактериальных болезней картофеля (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pectobacterium atrosepticum, Dickeya sp., Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Ralstonia solanaceaum). 4) Будет создана и испытана в лабораторных и полевых условиях qPCR-матрица для диагностики фитоплазменных болезней картофеля (Candidatus liberibacter, 16 Sr I, 16 Sr III, 16 Sr VI). 5) Будет создана и испытана в лабораторных и полевых условиях qPCR-матрица для диагностики нематодных болезней картофеля (Globodera rostоchiensis, Meloidogyne hapla, Ditylenchus destructor, и внешние карантинные объекты G. pallida, M. chitwoodi, M. fallax, M. enterolobii). 6) Будет выполнен переход на 48-луночный формат qPCR-матрицы, позволяющий увеличить количество одновременно тестируемых патогенов. 7) На основании данных фитосанитарного мониторинга посадок картофеля в различных регионах РФ будет проведено картирование распространенности и вредоносности экономически значимых болезней картофеля, на основании которого будут предложены различные варианты локализации разрабатываемых диагностических тест-систем в соответствии с потребностями регионов. 8) Будут разработаны методические указания по диагностике болезней картофеля различной этиологии с использованием предлагаемых диагностических тест-систем. 9) Будут подготовлены не менее 12 публикаций, из них 8 – в журналах, индексируемых в Web of Science/Scopus и 4 – в журналах, индексируемых в РИНЦ/Google Scholar. Результаты выполнения работ по проекту будут представлены на международных конференциях. 10) На базе ВНИИ фитопатологии будет организована и проведена научно-практическая конференция (с участием не менее 10 юридических лиц – сельскохозяйственных предприятий), в рамках которой будут представлены итоговые результаты проекта. В предлагаемом проекте предполагается максимально расширить спектр диагностируемых фитопатогенов картофеля, включив в них патогенные микроорганизмы, которые отсутствуют в предлагаемых на рынке коммерческих диагностических наборах, но в последние годы приобретают важное экономическое значение (Dikeya solani, фитоплазмы, некротическая форма вируса картофеля Y). На основании биоинформатического анализа ДНК включенных в проект фитопатогенов будут подобраны уникальные праймеры и оптимальные условия проведения qПЦР-анализа. Помимо тест-систем для диагностики вирусных/вироидных, бактериальных, фитоплазменных и грибных болезней картофеля, будет разработана тест-система для диагностики нематодных болезней картофеля, включающая не только распространенные на территории РФ патогенные нематоды картофеля (Globodera rostоchiensis, Meloidogyne hapla, Ditylenchus destructor), но и объекты внешнего карантина (G. pallida, M. chitwoodi, M. fallax, M. enterolobii). Такие тест-системы будут востребованными российской службой карантина; а также могут вызвать интерес сельскохозяйственных служб стран, в которых упомянутые внешние карантинные объекты наносят реальный ущерб сельскому хозяйству. Будут проанализированы данные Россельхознадзора и ВНИИ фитопатологии по фитосанитарному мониторингу посадок картофеля в различных регионах, а также собрана информация о потребностях и запросах региональных производителей картофеля в отношении диагностических тест-систем. На основании полученных результатов будет выполнено картирование распространенности наиболее вредоносных фитопатогенов картофеля, включая те, экономическое значение которых в последние годы в ряде регионов значительно выросло (Dickeya solani, фитоплазмы), что позволит осуществить локализацию разрабатываемых тест-систем в соответствии с нуждами и запросами потребителей путем изменения архитектуры qPCR-матриц. Практическим результатом проекта станет разработка и внедрение новых диагностических тест-систем длительного хранения, обладающих уникальными характеристиками по совокупности таких показателей как стоимость анализа, чувствительность, специфичность, количество одновременно определяемых патогенов, а также простота и удобство проведения анализа. Кроме того, будет проведена локализация этих тест-систем в соответствии с нуждами каждого конкретного региона; в перспективе такая локализация может быть выполнена и для зарубежных потребителей. К настоящему моменту в мире не существует аналогов предлагаемой тест-системе даже на уровне лабораторных исследований, не говоря уже о практическом производстве. Таким образом, практические результаты проекта будут отвечать мировому уровню значимости. Кроме того, поскольку некоторые включенные в исследование патогены вредоносны не только для картофеля, но и для других культур, то в перспективе наработки, полученные в ходе выполнения проекта, могут быть востребованы и в других секторах сельского хозяйства в создании аналогичных тест-систем для других сельскохозяйственных культур.
Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В течение первого года работы по проекту были достигнуты следующие результаты: А) При помощи программы Oligo 6 и баз данных GenBank и BLAST были подобраны уникальные праймеры для диагностики методом ПЦР или ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией следующих патогенов: 1) Золотистая нематода Globodera rostochiensis Прямой праймер: GCGCAGATATGCTAACATG Обратный: GGCACGGGTCCTAACAC Зонд: [FAM]CAGACATGCCGCAAGGTACG[BHQ1] 2) Некротическая форма вируса Y картофеля (PVYntn) Прямой: TGGCAACTTACACATCAACA Обратный : CGCAATCTGGACATCAGT Зонд: [ROX] CATCTCCAAACTTGCGAAGGG [BHQ2] 3) Вироид веретеновидности клубней (PSTVd) Прямой: GGTTCACACCTGACCTCC Обратный: CTTCAGTTGTTTCCACCG Зонд: [FAM]AGTAGCCGAAGCGACAGCG[BHQ1] 4) Вирус S картофеля (PVS) Прямой: CGAACACCGAGCAAATG Обратный : GAACTCCACGGTCCCAG Зонд: [FAM]TCCCTACTGAACACGTTGCTG [BHQ1] Б) Для всех перечисленных выше тест-систем выполнена оптимизация состава амплификационной смеси и подтверждена возможность применения в универсальном режиме амплификации, т.е. возможность их одновременного использования на одной и той же матрице. В) Для всех перечисленных выше тест-систем была проведена лабораторная проверка специфичности детекции с использованием референтных образцов и оценка предела аналитической чувствительности метода. Полученные результаты подтвердили высокую специфичность используемых праймеров, позволяющую уверенно диагностировать присутствие целевой ДНК или РНК в присутствии генетического материала фитопатогенных микроорганизмов той же группы, а также ДНК растения-хозяина (картофеля). Проведенные испытания показали, что для всех перечисленных выше тест-систем концентрационный предел обнаружения целевой ДНК в пробе составляет 1 нг ДНК(РНК)/мл. Г) Выполнена сравнительная оценка аналитической чувствительности диагностических тест-систем для обнаружения вирусных и вироидных патогенов картофеля при переходе с 30-луночного на 48-луночный формат qPCR-матриц. Показано, что связанное с таким переходом уменьшение объема реакционной смеси до 1 мкл не привело к ухудшению аналитической чувствительности систем.
1. Малько А.M., Живых А.В., Никитин М.М., Французов П.А., Стацюк Н.В., Джавахия В.Г., Голиков А.Г. Мониторинг вирусных инфекций картофеля с использованием матричной ПЦР-диагностики Картофель и овощи, № 12, с. 26-29 (год публикации - 2017).
2. Никитин М.М., Дейч К.О., Павлова Е.А., Иванов А.В., Стацюк Н.В., Джавахия В.Г., Голиков А.Г. Выявление и идентификация возбудителя порошистой парши картофеля Spongospora subterranea методом ПЦР в реальном времени Защита и карантин растений, - (год публикации - 2018).
Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и пнтомниководства
На правах рукописи
Кандыба Дмитрий Николаевич
изучение возможности использования электрофореза белков и нуклеиновых кислот для диагностики вирусных и вирусоподобных болезней ягодных
Специальность - 06. 01. 11- защита растений.
ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук
доктор с.-х. наук, академик РАСХН кандидат с.-х. наук
Кашин В. И. Приходько Ю.Н.
Цели и задач исследований. 6
Научная новизна и практическая ценность работы. 7
Глава 1. Обзор литературы. 8
1.1. Вирусные, фитоплазменные и вирусоподобные болезни
ягодных культур. 8
1.2. Основные принципы и методы очистки вирусов и
вирусных белков. 14
1.3. Особенности очистки непереносимых соком вирусов. 23
1.4. Выделение и очистка вирусспецифических нуклеиновых кислот. 25
1.5. Использование электрофореза белков для изучения и диагностики вирусов. 33
1.6. Диагностика и анализ вирусов методом электрофореза нуклеиновых кислот. 36
Глава 2. Материалы и методы. 38
2.1. База исследований. 38
2.2. Материалы и объекты исследований. 38
2.3. Методика выделения и очистки вирусспецифических белков. 40
2.4. Выделение и очистка вирусспецифических нуклеиновых кислот. 45
2.5. Методика проведения электрофореза. 48
Глава 3. Результаты исследований. 51
3.1. Очистка и выявление методом электрофореза специфического
белка вируса хлороза жилок малины (ЯУСУ). 51
3.2. Очистка и выявление методом электрофореза специфических белков вирусов крапчатости (БМУ) и морщинистости (8СУ) земляники. 55
3.3. Очистка и выявление методом электрофореза специфических белков возбудителей вирусных и вирусоподобных болезней смородины
и крыжовника. 60
3.4. Изучение возможности использования разработанной методики для
выявления вирусов косточковых культур. 63
3.5. Очистка и выявления методом электрофореза специфических РНК вирусов ягодных культур. 65
3.6. Ожидаемый экономический эффект по использованию метода электрофореза белков и нуклеиновых кислот для диагностики вирусных и вирусоподобных болезней ягодных культур. 68
3.7. Обсуждение результатов. 69
5. Рекомендации по практическому использованию. 86
6. Список литературы. 87
7. Приложение. 104
Ягодные культуры в сильной степени поражаются вирусными и фито-плазменными заболеваниями. К настоящему времени число выявленных вирусов и фитоплазм составляет на землянике -27, малине -25, смородине -14, на крыжовнике 9 (R.H. Converse, 1987). Вредоносность этих заболеваний может быть значительной. Так, израстание на малине и реверсия на смородине могут вызывать полное бесплодие насаждений (Ю.Н. Помазков, 1975). Потери урожая малины в результате заражения мозаикой могут достигать 53% (Г.Т. Борзых, 1975; A.A. Кузнецова, 1970), на землянике от вирусов крапчатости и морщинистости урожаи уменьшаются в 1,7 раза (О.О. Белошапкина, 1986; В.Ю. Минаев, 1985). Из-за внутриклеточного характера паразитирования и теснейшей взаимосвязи цикла развития вирусов с жизнедеятельностью растений-хозяев борьба с этими патогенами в существующих насаждениях невозможна. Единственный эффективный способ снижения их вредоносности в условиях многофакторной динамичной системы адаптивного садоводства является использование высококачественного оздоровленного посадочного материала (В. И. Кашин, 1995).
Производство оздоровленного посадочного материала и фитовирусологи-ческие исследования, в целом, в настоящее время невозможны без современных методов экспресс-диагностики вирусов. К одним из таких методов относится иммуноферментный анализ, основанный на производстве антисывороток к вирусам. Однако область применения этого метода довольно ограничена ввиду наличия целого ряда так называемых соконепереносимых вирусов, частицы ко-
торых необратимо разрушаются либо в экстрактах сока, либо в процессе очистки. Получение антисывороток к таким вирусам в настоящее время не представляется возможным. Диагностика этих вирусов в настоящее время возможна только путём прививок на соответствующие растения - индикаторы, что весьма трудоёмко, требует наличия зимних теплиц и большого количества растений-индикаторов, в то время, как продолжительность теста составляет 1-2 года. Аналогичным образом осуществляется сейчас и диагностика фитоплазм, поражающих ягодные культуры: израстания малины, желтухи и позеленения лепестков земляники и т. д.
Исследования последних десятилетий показали возможность решения данной проблемы на основе использования метода электрофореза белков и нуклеиновых кислот данных патогенов.
Широкое применение электрофорез получил в области фитопатологии первоначально как метод изучения, выделения и очистки нативных вирусных частиц. Позднее было признано использование данного метода для анализа кап-сидного вирусного бежа и нуклеиновых кислот. Данный метод позволяет установить природу болезнетворного агента (вироид, вирус или фитоплазменный организм), определить молекулярную массу, макроструктуру и концентрацию белков и нуклеиновых кислот, контролировать качество очистки вирусных препаратов и иммуноглобулинов, анализировать конечный продукт полимеразной цепной реакции и т.д. В последнее десятилетие электрофорез выделился в качестве самостоятельного метода диагностики некоторых флоэмограниченных ви-
русов, вироидов и считается единственным методом выявления так называемых критических вирусов.
В России и СНГ метод электрофореза использовали для диагностики вироидов веретеновидности клубней картофеля и карликовости хризантем (Т.Я. Васильева, 1985; Т.Б. Кастальева, К.А. Можаева, 1988; Ю.А. Леонтьева и др., 1988) и для изучения прижилковой мозаики и бороздчатости древесины винограда (H.A. Мулюкина, 1993); на ягодных культурах данный метод не испытывал ся.
В связи с выше изложенным, целью наших исследований являлось изучение возможности использования метода электрофореза белков и нуклеиновых кислот для диагностики вирусных и вирусоподобных болезней ягодных культур.
В конкретные задачи исследований входило следующее:
1. Выделить и изучить методом электрофореза специфические белки возбудителей вирусных и вирусоподобных болезней ягодных культур.
2. Отработать методику выделения и анализа РНК для диагностики ряда непереносимых соком вирусов ягодных культур.
3. Оценить возможность использования метода электрофореза белков и нуклеиновых кислот для выделения безвирусных клонов ягодных культур.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ
Впервые разработана методика очистки и выявления методом электрофореза специфических белков и нуклеиновых кислот труднодиагностируемых вирусов хлороза жилок малины (КУСУ), морщинистости земляники (8СУ) и крапчато-сти земляники (8МУ) непосредственно из тканей растений хозяев.
Впервые выявлено наличие у КУСУ и 8СУ двух белков с молекулярными массами 52кД и 37кД, типичных для представителей группы рабдовирусов.
Впервые очищены и фракционированы методом электрофореза специфические белки возбудителей реверсии чёрной и красной смородины, а также нуклеиновые кислоты КУСУ, БМУ и 8СУ.
Практическое значение работы состоит в разработке методики тестирования наличия специфических белков и нуклеиновых кислот соконепереносимых вирусов ягодных культур, что позволяет сократить сроки их диагностики с 1-2 лет до 2 дней по сравнению с методом растений - индикаторов и в 43 раза снизить затраты на проведение диагностических тестов.
1. Обзор литературы
1.1. Вирусные, фитоплазменные и вирусоподобные болезни
В 1994 году Европейской организацией защиты растений (ЕОЗР) были приняты сертификационные схемы получения свободного от патогенов посадочного материала ягодных культур (Certification schemes №№ 09,10,11 ЕРРО,1994). В этих схемах перечислены вирусы, фитоплазмы и вирусоподобные агенты, которые должны отсутствовать в сертифицируемых клонах, и описаны методы их тестирования (Таб. 1-3).
Схема получения сертифицированного посадочного материала земляники регламентирует подавляющее большинство известных вирусных и вирусоподобных патогенов этой культуры (Таб.1), за исключением неповируса кольцевой пятнистости томата (Том RSV), выявленного на этой культуре лишь в Северной Америке (N.N. Frasier et. al., 1961; R.H. Converse 1981).
Анализ таблицы 1 показывает, что из 22 регламентируемых патогенов земляники только четыре неповируса (AMV, SLRV, RRV, TBRV) и один илар-вирус (TSV) можно диагностировать механической инокуляцией сока растений травянистого индикатора Chenopodium quinoa, или методом иммуноферментно-го анализа (ИФА). Для выявления 12 сокопереносимых вирусов и вирусоподобных агентов земляники требуется наличие целого набора индикаторных клонов Fragaria vesca (UC-4; UC-5; UC-1; UC-6; UC-10; EMK; Alpina) и осуществление их прививки листочками тестируемых растений земляники методом Фрезера (N.W.Frazier, 1974а,б) в различных модификациях. Методы гибридизации нуклеиновых кислот и полимеразной цепной реакции, успешно испытанные для выявления вирусов слабого пожелтения краёв листьев и окаймления жилок земляники, пока ещё не используются в сертификационных программах из-за их высокой стоимости (R.H. Converse et. al., 1988; D.C. Stenger et.al., 1988; W.Jelkmann et.al., 1990). Диагностика 5 известных фитоплазмозов земляники
осуществляется по наличию характерных симптомов и методом электронной микроскопии.
Сертификационная схема ЕОЗР по малине (Табл. 2) включает фактически все важнейшие вирусы этой культуры, широко распространённые в России и Европе (Ю.Н. Приходько,1997; А.Т. Jones, 1986 и др.). В схему из-за ограниченной распространённости не включены сокоиереносимые вирусы погремковости табака (TRV) и некроза табака (TNV), обнаруженные на малине в Шотландии (С.Н. Cadman, 1961). Очевидно, редко встречается на малине и У-вирус картофеля (PVJ), серологически выявленный на этой культуре в Подмосковье (Ю.Н. Приходько, 1997). Однако, ввиду массового завоза различными коммерческими фирмами посадочного материала ежевики и малины из США, существует реальная опасность интродукции в нашу страну сокопереносимых вирусов кольцевой пятнистости томата (TomRSV), кольцевой пятнистости табака (TobRSV), штриховатости табака (TSV), рашпилевидности листьев черешни (CRLV) и афидофильного вируса скручивания листьев малины (RLCV), широко распространённых на культурах рода Rubus на американском континенте (R.H. Converse, 1987).
Видовой состав вирусов чёрной и красной смородины значительно беднее, чем у малины и земляники. Сертификационной схемой ЕОЗР регламентируется на смородине лишь 5 переносимых соком вирусов (неповирусы -AMV, SLRV, RRV, TBRV и кукумовирус огуречной мозаики) и 2 соконепереносимых патогена -вирус окаймления жилок крыжовника (GVBV) и реверсия смородины
(Таб. 3). Последние, однако, имеют наиболее важное экономическое значение (R.H. Converse, 1987). Для условий России необходимо также включение в схему рябухи смородины, повсеместно распространённой в Сибири (В.И. Гладких, 1978) и регулярно интродуцируемой с посадочным материалом в Европейскую часть нашей страны (О.Ю. Суркова, 1994). Кроме того, на наш взгляд, в схему сортификации необоснованно не включены такие вирусоподобные болезни смородины, как желтуха и инфекционная пестролистность, отмеченные в ряде стран Европы (C.Putz, 1972; J.Thresh, 1970;R.H. Converse, 1987) и в нечернозёмной зоне России (О.Ю. Суркова, 1994).
В качестве индикаторов для выявления GVBV рекомендуется использовать здоровые растения красной смородины сорта Йонхер ван Тете, для диагностики реверсии, желтухи и пестролистности -растения чёрной смородины сортов Амос Блэк, Болдуин и Оджибьён (R.H. Converse, 1987) или сорта Катюша (О.Ю. Суркова, 1994); к рябухе наиболее чувствителен сорт Голубка (В.И. Гладких, 1978). Индикаторы инокулируют прививкой щитками коры или верхушками побегов; продолжительность тестов -2года для реверсии и не менее 1 года-для остальных патогенов.
Все перечисленные в таблице 3 сокопереносимые вирусы, а также вирус окаймления жилок крыжовника, широко распространены также в Европейской части России на крыжовнике (Ю.Н. Приходько, О.Ю. Суркова, 1994).
Таким образом, все известные вирусы ягодных культур можно подразделить на две группы по способности к передаче с соком на травянистые растения. Как уже отмечалось выше, сокопереносимые вирусы диагностируются на травянистых индикаторах и методом ЙФА. Методика ИФА для выявления этих вирусов применительно к условиям средней полосы России детально отработана (OJO. Суркова, 1994; Ю.Н. Приходько, 1996; Ю.Н. Приходько и др., 1994, 1995; М.Т. Упадышев, 1996; Е.А. Лукьянова, 1998), и при условии наличия антисывороток и необходимого оборудования не представляет трудностей. Диагностика же непереносимых соком вирусов и вирусоподобных агентов по-прежнему осуществляется трудоёмким и дорогостоящим методом растений - индикато-
ров. Разработка экспресс -методов выявления этих патогенов является актуальнейшей задачей безвирусного питомниководства.
Вирусы, фитоплазмы и вирусоподобные агенты земляники, регламентируемые сертификационной схемой Европейской организации защиты растений (Certification scheme №11 Pathogen -tested strawberry //OEPP/EPPO.-1994).
№ п/п Патогены Тест-методы**) Растения -индикаторы
Переносимые соком вирусы
1 Неповирус мозаика резухи (Arabis mosaic nepovirus =AMV 1,3 Chenopodium quinoa
2 Неповирус кольцевой пятнистости малины (Raspberry ringspot nepovirus = RRV) 1,3 Chenopodium quinoa
3 Неповирус латентной кольцевой пятнистости земляники (strawberry latent ringspot nepovirus = SLRV) 1,3 Chenopodium quinoa
4 Неповирус чёрной кольчатости томата (Tomato black ring nepovirus = TBRV) 1,3 Chenopodium quinoa
5 Иларвирус штриховатости табака (Tobacco streak ilarvirus = TSV)*) 1.3 , Chenopodium quinoa
Непереносимые соком вирусы
1 Рабдовирус морщинистости земляники (strawberry crincle rhbdovirus -SCV) 2 Fragaria vesca UC-4, UC-5
2 Вирус крапчатости земляники (strawberry mottle virus = SMV) 2 Fragaria vesca UC-4, UC-5
3 Вирус слабого пожелтения краёв листьев земляники (strawberry mild yellow etge virus = SMYEV) 2 Fragaria vesca UC-4, UC-5
4 Каулимовирус окаймления жилок земляники (strawberry vein banding caulimovirus =SVBV) 2 Fragaria vesca UC-6, UC-12
5 Латентный вирус С земляники (strawberry latent С virus - SLCV)*) 2 Fragaria vesca UC-5, EMC
6 Карлавирус ложного слабого пожелтения краёв листьев земляники (strawberry pseudo mild yellow edge virus = SPMYEV) 2 Fragaria vesca UC-4, UC-12, Alpine
Продолжение таблицы 1
№ п/п Патогены Тест-методы**) Растения - индикаторы
1 Хлоротическая крапчатость (Chlorotic fleck)*) 2 Fragaria vesca EMB,EMK
2 Скручивание листьев (Leafroll)*) 2 Fragaria vesca UC-5
3 Ведьмина метла (Witches'broom)*) 2 Fragaria vesca UC-4,UC-5
4 Многоверхушечность(МиШрНег plant)*) 2 Fragaria vesca UC-4,UC-5
5 Перистость листьев (Feather-leaf) 2 F. vesca UC-1;4, Alpina
6 Паллидозиз (Pallidoses)*) 2 F. vesca UC-10/UC-11
1 Фитоплазма позеленения лепестков земляники (strawberry green petal phytoplasma) 1,4 Vinca rosea
2 Фитоплазма желтухи астр (Aster yellow phytoplasma)*) 4
3 Фитоплазма желтухи (Yellows phytoplasma)*) 4
4 Фитоплазма летального увядания (Lethal decline phytoplasma)*) 4
5 Риккетсия желтухи (Yellows ricket-sia)*) 4
Примечание: *) Патогены, отсутствующие в регионе ЕОЗР и подлежащие тестированию только в материале из других регионов; **) Тест—методы: 1 - Травянистые растения -индикаторы;
2 - Индикаторные клоны Fragaria vesca;
3 - Иммуноферментный анализ;
4 - Электронная микроскопия
Вирусы и фитоплазмы малины, регламентируемые сертификационной схемой Европейской организации защиты растений (Certification scheme №10 Pathogen -tested materialofRubus//OEPP/EPPO.- 1994).
№ п/п Патогены Тест-методы**) Растения -индикаторы
Переносимые соком вирусы
1 Неповирус мозаики резухи (AMV) Chenopodium quinoa
2 Неповирус кольцевой пятнистости малины (RRV) ^ LI _ Chenopodium quinoa
3 Неповирус латентной кольцевой пятнистости земляники (SLRV) _______1,3 Chenopodium quinoa
4 Неповирус чёрной кольчатости томатов (TBRV) 1,3 Chenopodium quinoa
Подписка на журнал "АгроПрофи":
Все статьи из свежей периодики. Удобно, быстро, точно!
Фейсконтроль для патогенов
Своевременная диагностика болезней растений – важный фактор, обеспечивающий стабильность сельскохозяйственного производства. Но в зависимости от ситуаций и масштабов предприятия затраты и методы работы могут сильно варьироваться. Новые сервисы и услуги, которые появляются на рынке, существенно расширяют инструментарий агрономов. Какие аспекты необходимо учесть при выборе стратегии работы?
Заражение растений зачастую происходит через почву, накопившую споры и мицелий возбудителей заболеваний. Вот почему для фитосанитарного благополучия поля перед посевом или после уборки урожая рекомендуется определить весь спектр микроорганизмов и соотношение вредной и полезной почвенной микробиоты. Такой анализ проводят путем культивирования на питательных средах.
– Диагностика состава патогенов в почве наиболее важна при закладке посадок многолетнего пользования – садов, ягодников, парников, ирригационных участков, монокультур, – считает региональный координатор по развитию Bayer, дивизион Crop Science Роман Дробязко. – Если почвенные условия будут благоприятствовать ежегодным эпифитотиям корневых гнилей, лучше перенести посадки на участки с богатой супрессивной микрофлорой, это уменьшит потери от болезней и затраты на борьбу с ними.
Для определения количественного и качественного состава патогенов, передающихся с посевным материалом, используются распространенные методы проращивания семян методом влажных рулонов и во влажной камере.
Специалисты учреждения часто сталкиваются с зараженностью семенного материала разнообразными патогенными микроорганизмами. Если речь идет о зерновых культурах, то значительной вредоносностью отличаются такие заболевания, как фузариоз и гельминтоспориоз. В последние годы увеличилось количество случаев выявления бактериозов. Но гораздо опаснее головневые грибы, контроль которых наиболее продуктивен на этапе протравливания семян.
В случае использования органов вегетативного размножения (в особенности у картофеля), по мнению Романа Дробязко, важно сделать анализ на зараженность вирусами, фитоплазмами и бактериями, чтобы избежать заражения посевных площадей этими трудно контролируемыми патогенами.
По наблюдениям Андрея Созонова, распространена такая ситуация, когда видимые симптомы могут проявляться через длительное время после заражения. Так, например, инкубационный период при заражении картофеля вирусами может достигать нескольких недель.
Найти то небольшое количество патогенов на семенном материале возможно только в лабораторных условиях. Особенно это важно при смешанных инфекциях.
Первыми среди всех заболеваний проявляются корневые гнили. Ранней весной, сразу же после таяния снега, может обнаружиться снежная плесень. Начиная с фазы кущения на посевах зерновых культур распространяются болезни, поражающие надземные части растений, – мучнистая роса, септориоз и пиренофороз. Некоторые опасные заболевания проявляются уже на стадии формирования колоса, вызывая существенное ухудшение качества зерна или семян, – спорынья, пыльная и твердая головня, фузариоз и септориоз колоса.
– Найти специалиста в области диагностики болезней растений – довольно непростая задача. В будущем ситуация может усложниться, потому что с изменением климата появляются новые болезни, вот почему потребность в лабораторной диагностике будет возрастать, – уверен Евгений Мазурин.
Большая часть болезней вызвана такими возбудителями, как грибы. В настоящее время описано свыше 10 тыс. видов фитопатогенных грибов, симптомы грибных болезней изучены, описаны, фотографии приводятся в различной справочной литературе и электронных ресурсах. Несмотря на все это, диагностика таких заболеваний нередко вызывает затруднения.
– Испытательный центр проводит исследования иммуноферментным методом на 11 некарантинных инфекций: штриховая мозаика ячменя (Barley stripe mosaic virus (BSMV)), вирус полосатой мозаики пшеницы (Wheat streak mosaic virus (WSMV)), вирус мозаики костра (Brome mosaik virus (BMV)), вирус карликовости пшеницы (Wheat dwarf virus (WDV)), вирус слабой мозаики ячменя (Barley mild mosaic Bymovirus (BaMMV)), вирус полосатой мозаики костра (Brome Streak Mosaic Tritimovirus (BStV)), вирус веретеновидной полосатой мозаики пшеницы (Wheat Spindle Streak Mosaic Bymovirus (WSSMV)), вирус желтой карликовости ячменя (Barley yellow dwarf virus (BYDV)), вирус желтой мозаики ячменя (Barley Yellow Mosaic Bymovirus (BaYMV)), вирус карликовой мозаики кукурузы (Maiz Dwarf Mosaic Potyvirus (MDMV), вирус хлоротической крапчатости кукурузы (Maize Chlorotic Mottle Machlovirus (MCMV)), – сообщает она.
Многие болезни проявляются в виде пятнистостей. Отличить их от неинфекционных повреждений возможно только в лабораторных условиях.
– Неинфекционные проявления могут быть вызваны нехваткой питательных элементов, термическими повреждениями, фитотоксичностью пестицидов, агрохимикатов и химических загрязнителей окружающей среды, генетическими нарушениями развития и многими другими факторами. Если симптомы таких повреждений спутать с инфекционными заболеваниями и применить химические препараты, можно только усугубить ситуацию, – предупреждает Роман Дробязко.
Методы диагностики заболеваний растений можно разделить на макроскопические и микроскопические. Макроскопические включают определение заболевания по внешним признакам и предусматривают тщательное обследование большого количества растений, так как симптомы болезней могут быть не всегда хорошо выражены.
Микроскопические методы (лабораторная диагностика) предусматривают выявление и диагностику патогенов. Стандартный подход при определении фитопатогенных грибов – это выделение их в чистую культуру на питательной среде с последующей идентификацией под микроскопом.
– Но не все паразитические грибы возможно выращивать на искусственных питательных средах: многим требуется наличие живых тканей растения-хозяина, например, видам ржавчин злаковых культур, – уточняет Татьяна Долбилова. – Дальнейшая идентификация многих микромицетов после получения спороношения сопряжена с рядом трудностей, таких как сходство морфологических характеристик разных видов и одновременно внутривидовая изменчивость признаков. Несмотря на внешнее сходство, возбудители могут значительно отличаться по вредоносности, способности образовывать токсины, чувствительности к фунгицидам и т.д. То есть разные виды обладают разной хозяйственной значимостью. Хорошим примером здесь является определение различных видов рода Alternaria или Fusarium.
Как поясняет Татьяна Долбилова, иммуноферментный анализ состоит из двух основных этапов: иммунной и ферментативной реакций. Иммунная реакция заключается в специфическом взаимодействии характерного для данного микроорганизма антигена с диагностическим антителом. Ферментативная реакция необходима для обнаружения этого связывания. Как правило, она сопровождается изменением цвета, интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
По ее словам, у данного метода есть много модификаций, большая часть которых применяется для обнаружения возбудителей болезней растений. Особенно интересен для применения в сельском хозяйстве так называемый lateral flow assay. Он отличается высокой скоростью анализа и не требует никакого специального оборудования или знаний. Используя такой набор (а он представлен в карманном формате), можно провести анализ непосредственно в поле, так что не нужно даже отправлять образцы в лабораторию.
Методы, основанные на ИФА, широко применяются для обнаружения вирусов, но реже – для идентификации грибов и бактерий. Основная причина – трудность получения антител с необходимой специфичностью: ведь строение клеточных стенок грибов и бактерий гораздо сложнее, чем вирусного капсида, и может изменяться в ходе их жизненного цикла.
Оба эксперта отмечают, что наиболее современным, точным и перспективным на сегодняшний день является метод, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Метод ПЦР считается эффективным для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях. ПЦР-технологии, как правило, позволяют избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.
В то же время, по наблюдениям Сергея Завриева, обычный ПЦР в рутинной диагностике сегодня почти никто не применяет. Причина в том, что анализ результатов проводят с помощью электрофореза, который требует много времени, и возникают проблемы при контаминации: тест может дать ложноположительные результаты.
Гораздо более распространенными стали его модификации: FLASH-формат ПЦР и ПЦР-RT (в реальном времени). Использование этих методов позволяет значительно сократить время анализа образца – до 1–2 часов.
Самым главным фактором, сдерживающим широкое распространение молекулярных методов анализа, эксперты называют их высокую стоимость. Так, диагностика вирусов и бактерий методов ПЦР-RT в прайсах фирм обойдется в 6–15 тыс. руб. за образец. ИФА-диагностика стоит в пределах 5–9 тыс. руб.
– Существует прямая зависимость между ценой и уровнем надежности метода диагностики, – поясняет кандидат биологических наук, директор Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (ФГБНУ ВИЗР) Филипп Ганнибал. – Чем надежнее и достовернее результат диагностики, тем он дороже стоит. При выборе метода исследований я предлагаю руководствоваться следующими факторами – цель диагностики, наличие предположений о возбудителе болезни, достаточная надежность и точность диагностики, бюджет. Проанализировав все это, можно выбрать вариант с подходящими ценой и качеством.
– Молекулярные методы анализа сейчас интенсивно развиваются, поэтому цена одного анализа становится все ниже. Возможно, в скором будущем они найдут широкое применение у агрономов предприятий, – выражает надежду Татьяна Долбилова.
По мнению Сергея Завриева, микроскопические методы нужны, когда видны симптомы болезней и наблюдается снижение урожая, его качества, при покупке посадочного материала, долгом хранении или транспортировке сельхозпродукции (на наличие фитопатогенов, продуцирующих опасные для человека и животных токсины, такие как фузариозы и продуцируемые ими микотоксины).
– Он не требует специального оборудования, его можно проводить непосредственно в поле, но его чувствительность, как правило, на порядок ниже. В ближайшем будущем возможно расширение использования тест-полосок для быстрого и точного экспресс-определения ряда вирусных, бактериальных и грибных заболеваний прямо в поле, – считает Григорий Заднепровский.
Для средних хозяйств достаточно иметь в арсенале биологический микроскоп с соответствующими принадлежностями и владеть методикой влажной камеры для диагностики рода возбудителя. Если речь идет о маленьком предприятии, где фермер выступает и в качестве агронома, важно иметь под рукой хотя бы ручную лупу или бинокулярный микроскоп с небольшим (до пяти крат) увеличением для наблюдений при прямом освещении. Во всех этих случаях актуально пользоваться услугами специализированных лабораторий.
– Услуги по диагностике заболеваний растений имеют небольшую стоимость и выполняются опытными специалистами в минимально возможные сроки на базе хорошо оснащенных лабораторий. Выдаваемые заключения отличаются научной точностью, подкрепляются подробной документацией и содержат рекомендации по проведению защитных мероприятий, – уверен Григорий Заднепровский.
– Многие компании ведут разработки таких программ, сейчас можно столкнуться с различным уровнем качества работы таких систем, – отмечает Роман Дробязко. По его мнению, в ближайшие пять лет появятся специализированные системы распознавания, учитывающие региональную информацию, с русским интерфейсом. Они позволят прогнозировать появление и развитие заболеваний в поле, подскажут оптимальные сроки борьбы.
В настоящее время существуют агромодели (они тестировались учеными в Кубанском государственном аграрном университете, Самарской ГСХА, Костанайском НИИ Республики Казахстан, Брестским государственным техническим университетом и прочими пользователями), которые позволяют с относительно высокой долей вероятности прогнозировать вероятность заражения заболеваниями на зерновых, пропашных, технических культурах и многолетних плодовых насаждениях.
Николай Юзефов, директор:
Площадь земли в обработке – 6300 га, семеноводческое хозяйство, специализируется на выращивании картофеля, овощных, зерновых, масличных культур.
Перед покупкой семенного картофеля посещаем поля производителей, ведем мониторинг посевов. После покупки проводим фитоэкспертизу. Это защищает нас как покупателей – был случай, когда фитоэкспертиза показала зараженность семенного материала, мы его вернули производителю и получили обратно деньги. Такой контроль очень важен, поскольку защищает нас от заражения полей нематодой и опасными болезнями картофеля.
Также и с зерновыми – всегда проводим фитоэкспертизу, но если по вегетации выявляется корневая гниль, больше с этим производителем семян не работаем.
Референтный центр установил у нас бесплатно метеостанции, их данные позволяют лучше прогнозировать развитие растений и возможное появление болезней. Но специальными программами пока не пользовались.
Владимир Литвинов, директор:
Площадь земли в обработке – 2300 га, семеноводческое хозяйство, специализируется на выращивании зерновых и масличных культур.
В процессе фитосанитарного мониторинга посевов пользуемся методами визуальной диагностики, при необходимости используем микроскоп. Проводили также лабораторную почвенную диагностику, но мы считаем, что для получения достоверных результатов ее необходимо делать регулярно, несколько раз в течение сезона, так как в зависимости от погодных условий состав почвенной микрофлоры может меняться. В своей работе большое значение придаем профилактике заболеваний – для этого подбираем сортовую мозаику, соблюдаем севооборот, используем комплекс химических и биологических препаратов – пожар легче предотвратить, чем потом тушить.
Читайте также:
