Диагностика гепатита с микробиология

Исследование проводится в целях первичного выявления вируса в организме и включает в себя определение в крови специфических маркеров инфицирования – суммарных антител ( IgG , IgM ) к вирусу гепатита С и вирусной РНК.

Какие тесты входят в данный комплекс:

anti-HCV, антитела
HCV , РНК [реал-тайм ПЦР]

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исключить из рациона жирную пищу в течение 24 часов до исследования.
Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Вирус гепатита С (ВГС) – РНК-содержащий вирус из семейства Flaviviridae , который поражает клетки печени и вызывает гепатит. Он способен размножаться в клетках крови (нейтрофилах, моноцитах и макрофагах, В-лимфоцитах) и ассоциирован с развитием криоглобулинемии, болезни Шегрена и В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний. Среди всех возбудителей вирусных гепатитов у ВГС наибольшее количество вариаций, а благодаря высокой мутационной активности он способен избегать защитных механизмов иммунной системы человека. Существует 6 генотипов ВГС, не исключена возможность инфицирования человека одновременно несколькими вирусами с различными генотипами. В 60-80 % случаев острая инфекция переходит в хроническую.

В лабораторной диагностике заболевания используют два основных подхода:

- серологические методы, основанные на обнаружении специфических антител к вирусу (anti-HCV);

- молекулярно-биологические методы, основанные на выявлении РНК вируса (реал-тайм ПЦР).

Антитела к вирусу гепатита С (anti-HCV) – специфические иммуноглобулины классов IgM и IgG к белкам вируса. Их появление в крови свидетельствует о возможной инфицированности или ранее перенесенной инфекции. Однако единственным достоверным критерием присутствия вируса в организме является определение вирусной РНК, так как она выявляется уже в первые 1-2 недели заболевания, в то время как антитела появляются в среднем через 8 недель. Определение вирусной РНК подходит и для обследования лиц, у которых антитела к вирусу не обнаружены, но в силу сопутствующих заболеваний или других причин (ВИЧ-инфекция, постоянный гемодиализ) снижена выработка антител.

Выявление РНК вируса считается "золотым стандартом" в диагностике гепатита С и подтверждает положительный результат обнаружения антител (anti-HCV) к белкам вируса и свидетельствует о наличии и репликации (размножении) вируса в крови.

Современные молекулярно-биологические методы диагностики обладают высокой чувствительностью (98-99 %) и в сочетании с серологическими исследованиями позволяют правильно оценить стадию заболевания, принять решение о тактике лечения, включая выбор препаратов и сроки медикаментозной терапии.

Для чего используется исследование?

Для диагностики вирусного гепатита С;
для дифференциальной диагностики гепатитов;
для выявления ранее перенесенного вирусного гепатита С.

Когда назначается исследование?

При обследовании людей из группы риска по заражению вирусным гепатитом С;
при обнаружении антител к вирусу гепатита С для подтверждения диагноза;
при симптомах вирусного гепатита и повышении уровня печеночных трансаминаз;
если известно о перенесенном гепатите неуточненной этиологии;
при скрининговых обследованиях;
при сомнительных результатах серологического исследования;
если ребенок родился от инфицированной матери;
при гемодиализе;
до начала лечения и в конце терапии вирусного гепатита C, затем через 6 и 24 месяца наблюдения.

Что означают результаты?

Для каждого показателя, входящего в состав комплекса:

1. Наличие антител (anti-HCV) не свидетельствует о продолжающейся репликации вируса, поскольку может являться признаком как текущей, так и перенесенной инфекции.

2. В ряде случаепри отсутствии антител не исключает инфекции - в ранний период острого гепатита C (ОГС) и при иммунодефицитах.

3. Необходимо учитывать, что у реципиентов, которым была перелита инфицированная кровь, могут обнаруживаться антитела (anti-HCV) донора; их наличие не обязательно свидетельствует о заражении HCV.

4. Одновременное обнаружение в крови РНК вируса и антител (anti-HCV) указывает на текущую острую инфекцию или обострение хронического гепатита С (ХГС). Дифференциальная диагностика острого гепатита С в большинстве таких случаев должна базироваться на наличии соответствующих данных эпидемиологического анамнеза за 1-4 месяца до момента обнаружения антител и увеличения печеночных ферментов.

5. Отсутствие РНК HCV при наличии антител (anti-HCV-позитивные образцы) в крови может являться признаком неустойчивой виремии, перенесенного острого гепатита, а также ложноположительного результата лабораторного исследования.

Интерпретация сочетаний серологических маркеров гепатита С

Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Сокурова Алла Михайловна

Specific laboratory diagnosis of viral hepatitis

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ

Ключевые слова: лабораторная диагностика; вирусный гепатит; иммуноферментный анализ; полимеразная цепная реакция; маркеры инфекции.

В РФ в последние годы заболеваемость хроническими формами гепатитов возросла более чем в 2 раза. По данным Роспотребнадзора, в 2013 г. зарегистрировано 73 570 случаев хронических вирусных гепатитов (заболеваемость составляет 51 случай на 100 тыс. населения), в том числе около 500 случаев у детей до 14 лет включительно. В г. Санкт-Петербурге заболеваемость хроническими формами гепатитов значительно выше, чем в среднем по стране и составляет 184 случая на 100 тыс. населения. Заболеваемость острыми вирусными гепатитами в Российской Федерации постепенно снижается (в 2013 г. зарегистрировано 12 745 случаев острых вирусных гепатитов, в том числе около 3 тыс. случаев у детей до 14 лет включительно).

Правильно выбрать алгоритм специфической лабораторной диагностики и интерпретировать полученные результаты, что позволит выявить заболевших, предотвратить распространение вирусных гепатитов, определить схему лечения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для специфической лабораторной диагностики применяют следующие методы:

• иммунная электронная микроскопия (ИЭМ);

• иммуно-ферментный анализ (ИФА);

• полимеразная цепная реакция (ПЦР).

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

Специфическая лабораторная диагностика гепатита А включает:

1. Выявление в сыворотке крови М к вирусу гепатита А (ВГА, ИДУ) (апИ-ИАУ М) — маркер острой инфекции, в том числе бессимптомной формы. Иммуноглобулины класса М присутствуют в сыворотке крови с первых дней болезни и сохраняются до 3-6 месяцев [7].

3. Исследование фекалий на наличие ВГА методом ИЭМ. Проводится с эпидемиологической целью для выявления в очаге вспышки инфицированных лиц до проявления клинических симптомов заболевания, так как к моменту проявления клинических симптомов вирус в фекалиях практически отсутствует. Дети могут выделять вирус более длительно, чем взрослые, возможно, в течение нескольких недель после появления клинических симптомов заболевания [11, 12].

Соответствие серологических маркеров HAV иммунному статусу обследуемого [11]

Серологические маркеры HAV Иммунный статус

anti-HAV ^ M ± anti-HAV ^ G Недавно перенесённый гепатит А

Отсутствие anti-HAV ^ M и anti-HAV ^ G Отсутствие иммунитета к HAV

anti-HAV ^ Иммунитет к HAV

В таблице 1 представлены основные серологические маркеры ВГА и их соответствие иммунному статусу обследуемого.

Условной защитной концентрацией специфических антител к ВГА для населения является 22 МЕ/л, а для спецконтингентов, в том числе военнослужащих, — не менее 30 МЕ/л [7].

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА В

Диагностика вирусного гепатита В (ГВ) основана на выявлении антигенов вируса — HBsAg, HВeAg, антител М и С к НВсAg, С к HВeAg, С к НВэА§) методом ИФА (чувствительность 0,1 нг/мл), либо его ДНК в крови и других биологических жидкостях организма, а также в клетках и тканях органов методом ПЦР [2].

Только комплексный анализ маркеров инфекции позволяет определить наличие вируса, установить клиническую стадию протекания инфекции (табл. 2) и иммунологический статус обследуемого, а также судить об эффективности лечения [11].

Взаимоисключающие маркеры (не могут присутствовать в крови одновременно): НВэА§ и С к HBsAg, HBeAg и ^ G к HBеAg.

КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СЕРОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ГВ

НВэА§ — основной и первый маркер инфицирования вирусом ГВ, появляется в крови в инкубационном периоде, циркулирует при остром заболевании до 5-6 месяцев. Положительный результат исследования на НВэА§ должен быть проверен путем перестановки и последующего подтверждения в одном из тестов.

HВeAg — циркулирует только при наличии HBsAg. Появляется в крови больных острым или хроническим ГВ в фазе вирусемии, указывает на репликацию вируса в гепатоцитах и высокую инфек-ционность крови (антиген инфекционности).

Тестировать кровь на наличие HBeAg необходимо лишь при положительном результате на HBsAg. Длительность циркуляции HBeAg — важный прогностический признак. Его выявление через два месяца с начала заболевания свидетельствует о вероятном развитии хронического гепатита.

НВеА§ — сердцевинный (коровый) антиген в крови в свободном виде не циркулирует и не определяется. Обнаруживается только в гепатоцитах при морфологическом исследовании биоптатов печени.

М±1§ С к НВсА§ — антитела к сердцевинному антигену — важный диагностический маркер, особенно при отрицательных результатах индикации НВэА§, свидетельствует о встрече организма с вирусом ГВ.

Схема определения стадии болезни по серологическим маркерам ВГВ [11]

Стадия болезни Маркеры ВГВ

Острая фаза болезни ДНК ВГВ HBsAg HBeAg ^ M к HBcAg

Фаза реконвалесценции/хронический гепатит ^ G к HBеAg ^ M±Ig G к HBcAg

Интерпретация сочетаний серологических маркеров вируса гепатита В [11]

Клиническое состояние Серологические маркеры

HBsAg Ig G к HBsAg Ig M к HBcAg Ig M±Ig G к HBcAg HBeAg Ig G к HBeAg

Острый ГВ, ранняя фаза ± - ± ± ± -

Острый ГВ, поздняя фаза ±/- - ± ± - ±

Острый ГВ, стадия реконвалесценции - - - ± - ±

Острый ГВ в анамнезе - ± - ± - ±/-

^ G к HBеAg — указывают на начало стадии ре-конвалесценции при остром вирусном гепатите В.

В таблице 3 представлены основные алгоритмы интерпретации сочетаний серологических маркеров вируса ГВ.

ДНК вируса ГВ обнаруживается в сыворотке или плазме крови методом ПЦР. Ее наличие свидетельствует о высокой репликативной активности вируса. Количество ДНК вируса в крови быстро возрастает в течение инкубационного периода и становится максимальным в острой фазе заболевания. Циркуляция более 5-6 месяцев является неблагоприятным прогностическим критерием и свидетельствует о переходе инфекции в хроническую форму.

Количественная характеристика содержания ДНК вируса ГВ в клинических образцах важна для оценки эффективности противовирусной терапии. Если концентрация вируса меньше 105 копий/мл, то прогноз курса лечения благоприятный, если выше, то необходимо применить другие схемы лечения.

Частота выявления ДНК вируса ГВ коррелирует с частотой определения HBsAg, HBeAg и ^ М к HBcAg.

Используя технику ПЦР, можно определить и подтип HBsAg.

Так как в практику отечественного здравоохранения были включены национальные стандарты обязательного обнаружения различных концентраций поверхностного антигена вируса ГВ в образцах сывороток крови (с 2003 г. — 0,1 нг/мл), решающее

значение для индикации HBsAg имеют такие методы как ИФА в различных модификациях и ПЦР [10, 12].

В исключительных случаях (если нет специального оборудования) разрешено использовать имму-нохроматографический экспресс-тест (чувствительность 5 нг/мл) [2].

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА О

Серологическое исследование крови на маркеры вируса гепатита О (ВГD) показано только у пациентов с наличием в крови HBsAg, т. е. инфицированных вирусом ГВ.

Маркеры инфицированности В^:

Методы лабораторной диагностики: антитела в крови определяют методом ИФА, РНК ВГО — методом ПЦР.

При коинфекции в желтушный период на протяжении 2 недель выявляют РНК вируса и ^ М к ВГD. Несколько позднее, через 1-2 месяца с момента появления желтухи, выявляют ^ G к ВГD. Титр ^ G снижается до практически неопределяемых уровней после выздоровления, и не сохраняется никаких серологических маркеров того, что человек был когда-либо инфицирован ВГD.

При суперинфекции в острый период РНК ВГО может не выявляться. Наряду с ^ М к ВГD выявляют ^ G к ВГD, причем в более высоких титрах, чем при коинфекции. Стойкое увеличение титра ^ М ± ^ G к ВГD является маркером хронического гепатита D [3-6, 11].

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА С

Материал для исследования — кровь и сыворотка крови.

Первый метод — ИФА — определение антител к белкам вируса гепатита С (ВГС).

Современные диагностические тест-системы ИФА в качестве антигенов должны содержать полный спектр структурных и неструктурных белков вируса. Теперь используются тест-системы 4-го поколения, содержащие рекомбинантные С-, №3-, №4-, Ш5-белки [2].

Также разработаны тест-системы ИФА и имму-ноблотинга для раздельного определения антител к различным белкам ВГС. Их используют в качестве подтверждающих тестов и устанавливают стадию инфекционного процесса, так как первыми появляются антитела к С- и ^3-белкам, а антитела к и NS5 появляются позже. Но все эти антитела являются только маркерами инфицированности ВГС и защитной роли не играют.

там до начала лечения для правильного назначения противовирусных препаратов и продолжительности терапии [9, 10].

Типируют ВГС путем обнаружения генетических изменений (мутаций) в консервативных областях вирусного генома: амплификация консервативных областей и анализ специфичных нуклеотидных последовательностей при помощи метода прямого секвенирования амплифицированных фрагментов с последующей ПЦР с типоспецифичными прайме-рами RFLP (анализ амплифицированных фрагментов с помощью ферментов рестрикции), обратной гибридизации с типоспецифичными зондами (LiPA) и SSCP (анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК).

ПЦР позволяет выявить РНК ВГС не только в сыворотке крови, но и в ткани печени, что важно в подтверждении роли вируса в формировании гепа-тоцеллюлярной карциномы при отсутствии антител к вирусу и его РНК в сыворотке крови [9, 10, 12].

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА Е

Лабораторная диагностика гепатита Е проводится методом исключения специфических маркеров острых гепатитов А, В, С, а также методом ИЭМ — обнаружение вируса гепатита Е (ВГЕ) в фекалиях. Разработана ПЦР для детекции вирусной РНК. Кроме того, разработаны тест-системы ИФА для выявления антител в сыворотке крови к ВГЕ:

• ^ М (выявление больных в острой стадии болезни);

• общие антитела (^ M±Ig G) — выявление больных в период реконвалесценции [11, 12].

Признавая огромное значение вирусных гепатитов, Всемирная ассамблея здравоохранения в 2010 году приняла резолюцию WHA63.18, призвав применять комплексный подход к профилактике вирусных гепатитов и борьбе с ними. В связи с чем необходимо обеспечить качественную и сво-

Перечень маркеров диагностики ВГС [11] Таблица 4

Цель исследования Маркер ВГС

Диагностика ВГС • 1д М ± ^ G к ВГС

Диагностика острого ВГС, мониторинг больных, определение прогноза и исхода • 1д М ± ^ G к ВГС; • РНК ВГС; • раздельное определение антител к белкам: С, ЫБЗ, ЫБ4, ЫББ

Скрининг доноров крови • 1д М ± ^ G к ВГС

Скрининг беременных • 1д М ± ^ G к ВГС

Скрининг групп повышенного риска • 1д М ± ^ G к ВГС

евременную диагностику этих заболеваний. Методы специфической лабораторной диагностики вирусных гепатитов все время совершенствуются, перечень маркеров инфицирования расширяется, и правильная интерпретация их сочетаний позволит врачам быстро оценить результаты лабораторных исследований и назначить больному лечение.

3. Положение о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 15.09.2005 г. № 569.3.

9. Пименов Н. Н., Чуланов В. П., Комарова С. В. и др. Гепатит С в России: эпидемиологическая характеристика и пути совершенствования диагностики и надзора // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2012. - № 3. - С. 4-9.

10. Ющук Н. Д., Климова Е.А, Знойко О. О. и др. Протокол диагностики и лечения больных вирусными гепатитами В и С // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2010. - Т. 20, № 6. - С. 4-60.

12. Медицинские лабораторные технологии: руководство по клинической лабораторной диагностике: в 2 т. / В. В. Алексеев, В. Б. Сбойчаков, А. М. Сокурова и др.; Под ред. А. И. Карпищенко. - 3-е изд., пере-раб. и доп. - Т. 2. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 792 с.

SPECIFIC LABORATORY DIAGNOSIS OF VIRAL HEPATITIS

♦ Key words: laboratory diagnosis of viral hepatitis; enzyme immunoassay; polymerase chain reaction; markers of infection.

Вирус гепатита С

Гепатит С. Таксономия.
Относится к роду Hepacivirus семейству Flaviviridae.

Гепатит С. Морфология.
Имеет всего 1 ген, в котором зашифрована структура 9 белков. Эти белки участвуют в проникновении вируса в клетку, в создании и сборке вирусных частиц, называют структурными, стальные выполняют разные ферментные функции. По строению вирион сходен с вирусом клещевого энцефалита: 30-50нм в диаметре, суперкапсид. Белок нуклекапсида, представленный одной нитью РНК, заключенной в белковую оболочку, не только выполняет важную функцию в сборке вириона и регуляции синтеза РНК, но, что весьма усложняет ситуацию с HBC, может нарушать иммунный ответ инфицированного.

Гепатит С. Резистентность.
Чувствителен к эфиру, УФ-лучам, детергентам.

Гепатит С. Патогенез и клиника.
Вирус передается парэнтериально, фиксируется в печени, репродукция происходит преимущественно в гепатоцитах, вызывая их гибель. Однако, не исключено поражение других клеток, например иммунокомпетентных.

Репродукция вируса происходит в гепатоцитах, цикл репродукции заканчивается лизисом зараженной клетки. В геноме вируса с высокой частотой происходят мутации в участках, ответственных за синтез поверхностных белков. Таким образом, вирус уходит из-под иммунологического контроля организма.

Продолжительность инкубационного и продромального периодов сходна с таковыми при гепатите В. Протекает, в основном, в бессимптомной или стертой формах. Около 80% случаев инфицирования перетекает в хроническую форму. Исход хронической инфекции неблагоприятен (цирроз, гепатоцеллюлярная карцинома).

Гепатит С. Мутации и генотипы.
В геноме вируса часто происходят мутации, причем преимущественно в участках, ответственных за синтез оболочных белков-антигенв. Антитела больного не распознают такие измененные вирусные антигены и вирус, таким образом, уходит из-под иммунного контроля и постепенно разрушает печень.

HCV имеет до 6 разных генотипов и несколько десятков субтипов, различающихся по чувствительности к интерферонам, географической распространенности, интенсивности вирусемии.

Гепатит С. Лабораторная диагностика.
Осуществляется с помощью определения антител с помощью ИФА. Более информативным методом является обнаружение вирусной РНК в сыворотке крови или биоптате печени с помощью полимеразной цепной реакции.

Диагностика также осуществляется с помощью ПЦР (вирусный геном определяется уже в инкубационном периоде). Антитела (Анти-HCV) выявляются при иммуноферментном анализе от нескольких дней до нескольких недель полсе начала заболевания. При хронической инфекции маркеры гепатита С (HCV и анти-HCV) обнаруживаются всегда.

Гепатит С. Профилактика
Неспецифическая – комплекс мероприятий, направленных на предупреждение наиболее распространенного механизма передачи – парэнтедиального (кровь в кровь), те же, что при гепатите В.

Гепатит С. Лечение.
Применяют препараты альфа-интерферона, которые помогают снизить репродукцию вируса, приблизительно, у 50% больных.

Вирус Гепатита Д.

Гепатит Д – относится к мелким (35-37нм), дефектным РНК-содержащим вирусам рода Deltavirus семейства Togaviridae. Геном вируса представлен кольцевой молекулой одноцепочечной РНК. В состав капсида, кроме собственного белка входит НВs-антиген (вирус гепатита В). Таким образом, вирус гепатита D является дефектным вирусом, использующим вирус гепатита В, как вирус-помощник.

Гепатит Д. Механизм и пути передачи
идентичны таковым для вируса гепатита В. Инфекция существует в двух формах: либо смешанная (гепатита В и D), либо гепатит D, развивающийся на фоне хронического гепатита В.

Клинически смешанная инфекция протекает тяжелее, чем гепатит В с более частым исходом в хроническую форму. Инкубационный период 3-7 недель, затем в течении 3-7 дней отмечается ухудшение самочувствия, потеря аппетита, тошнота (преджелтушный период). В это время уже отмечается высокий уровень трансаминаз. Желтушный период часто тяжелый, почти в 10 раз чаще, чем при HB отмечается молниеносное (фулминантное) течение, заканчивающееся гибелью больного.

Гепатит Д. Лабораторная диагностика
существляется с помощью обнаружения антител к вирусу гепатита D методом ИФА.

Гепатит Д. Профилактика
иммунизация против гепатита В защищает и от гепатита D.

Для лечения используют альфа-интерферон.

Вирус гепатита Е

Гепатит С. Распространение
в странах с субтропическим и тропическим климатом. Эпидемиология аналогична гепатиту А. механизм передачи – фекально-оральный, путь – водный. Эпидемии возникают в результате массивного фекального загрязнения источников питьевой воды. Поражаются преимущественно молодые люди (15-40 лет).

Гепатит С. Инкубационный период
не превышает 40 дней. Клинически заболевание сходно с гепатитом А, но протекает значительно тяжелее, особенно у беременных, среди которых наблюдается высокий процент летальных исходов.

Гепатит С. Лабораторная диагностика.
РНК вирус можно обнаружить с первых суток инфицирования в сыворотке крови при использовании метода полимеразной цепной реакции, однако в желтушный период вирусная РНК не выявляется. Спустя 6-10 суток от начала желтухи выявляются антитела класса IgM к антигену гепатита Е с помощью ИФА.

Гепатит С микробиология рассматривает как наиболее опасный из всех гепатовирусов. Вирус HCV поражает гепатоциты – клетки печени – и обладает высокой онкогенностью (приводит к раковому перерождению). Часто болезнь протекает бессимптомно или со смазанными признаками, что затрудняет своевременную постановку диагноза. Без лечения приводит к летальному исходу.

Таксономия

Микробиология выделяет несколько семейств вирусов, поражающих печень. Вирус гепатита С входит в семейство Flaviviridae и принадлежит роду Hepacivirus.

Строение

Микробиологией хорошо изучено строение возбудителя гепатита С. HCV – это сферический вирион размером 55-65 нм из одной нити РНК, состоящей из нуклеотидов. Сфера имеет оболочку из липидов и белковых включений – суперкапсид, которая позволяет патогену быстрее проникать в клетки человека. А вот у вируса гепатита А суперкапсид отсутствует.

Под внешним липидным слоем расположен нуклеокапсид – оболочка, которая защищает микроорганизм от внешнего воздействия. Белок нуклеокапсида является в микробиологии генетическим маркером гепатита С, что используется для ПЦР-диагностики.

Генотипы вируса

Возбудитель гепатита С отличается высокой генетической изменчивостью. Это говорит о высокой способности к мутации генома вируса. В результате затрудняется защитное действие иммунной системы, возникают проблемы в лечении.

Сегодня микробиология идентифицирует 11 генотипов HCV, они имеют разный генетический набор. Каждый из них, в свою очередь, делится на подтипы. В медицинской номенклатуре существует только 6 генотипов – они обозначаются арабскими цифрами, а их подтипы (или квази-типы) – латинскими буквами. Например, генотип 1 подтип а (гепатит С 1а). Они не имеют разницы в строении по микробиологии, но отличаются течением болезни и прогнозом.

Самым опасным подтипом является HCV 1b. Этот микроорганизм имеет нестабильный генный набор, что позволяет ему приспосабливаться к лечению и действию иммунной системы. В 85% случаев, при отсутствии терапии, возникает хронизация заболевания. Это ведет к необратимым поражениям печени.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – в настоящий момент, наиболее информативное исследование в микробиологии. При анализе крови ПЦР вирусный геном определяется за счет многократного увеличения его фрагментов. Частицы РНК копируют до тех пор, пока их нельзя будет различить в микроскоп.

Антигены

Микробиологии известно, что геном вируса гепатита С кодирует около 10 белков. Вирусные белки являются антигенами, то есть веществами, на которые реагирует иммунная система – вырабатывает антитела. Для выявления инфицирования гепатитом С применяется метод ИФА (иммунноферментый анализ), который позволяет обнаружить специфические антитела IgM (появляются в крови через месяц после заражения) и IgG (вырабатываются через несколько месяцев, сохраняются до 10 лет).

В микробиологии выделяют структурные и нестуктурные белки гепатита С:

Структурные (core, E1, E2) входят в состав нуклеокапсида и внешней оболочки – суперкапсида.
Неструктурные (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) отвечают за биохимические процессы вириона.

Фрагменты этих белков, полученные с помощью генной инженерии, используются в микробиологии для создания тест-систем идентификации микроорганизма.

РНК вируса

РНК возбудителя гепатита С является единицей генетического материала, представленной одной цепочкой нуклеиновых кислот. Она содержит 9400-9600 нуклеотидов. Определенный участок цепочки, который имеет видоспецифичность, можно выделить при ПЦР и определить его количество, тип, субтип (генотип). Таким образом происходит обнаружение инфекции и определение стадии заболевания, вирусной нагрузки, эффективности лечения.

Устойчивость возбудителя

Микробиология выяснила, что вирус гепатита С обладает невысокой устойчивостью во внешней среде. Не очень крепкая оболочка не позволяет ему долго сохраняться вне организма человека:

В засохшей крови может сохраняться и нести угрозу в течение 45 дней. Поэтому наибольшую опасность несут некачественно обработанные медицинские и маникюрные инструменты, бритвы и иглы в парикмахерских и тату-салонах.
При нагревании до 60 градусов погибает через 30 минут, при 100 градусах – в течение 5 минут.
При отрицательной температуре может оставаться заразным до нескольких лет (например, в крови для переливания).
Чувствителен к антисептическим средствам (спирт, хлоргексидин, мирамистин).
УФ-лучи не убивают вирус.

Несмотря на слабую устойчивость, ВГС более заразен, чем вирус иммунодефицита человека.

Механизм передачи заболевания

Выделяют 3 способа заражения гепатитом С:

Парентеральный – наиболее частый механизм. Происходит при попадании инфицированной крови в кровоток здорового человека. Это может произойти при переливании крови, через необработанные иглы и инструменты.
Вертикальный – заражение от матери. Чаще происходит при прохождении ребенка по родовым путям. Очень редко инфекция передается внутриутробно.
Половой – при незащищенном сексе. Это наиболее редкий путь заражения. В сперме, влагалищном отделяемом находится минимальное количество возбудителя, и его, как правило, недостаточно для инфицирования.

С развитием микробиологии и медицины стало возможным полное излечение от заболевания. При своевременно поставленном диагнозе и правильной терапии выздоровление наступает в 95-99% случаев.

ГБОУ ВПО “Уральский государственный медицинский университет” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Методические указания к практическим занятиям для студентов

ООП специальности 060301.65 Фармация Дисциплина С2.Б.11 Микробиология

1. Тема: Возбудители вирусных гепатитов.

2. Цели занятия : Изучить со студентами строение возбудителей вирусных гепатитов, патогенез вирусных гепатитов, методы диагностики, профилактики и лечения вирусных гепатитов.

3. Задачи занятия:

3.1. Изучение строения и репродукции возбудителей вирусных гепатитов.

3.2. Изучение патогенеза, диагностики, профилактики и лечения вирусных гепатитов.

3.3. Выполнение самостоятельной работы.

проблемы и процессы,

и клинических наук в

готовность к участию

в постановке научных

4. Продолжительность занятия в академических часах : 3 часа.

5. Контрольные вопросы по теме:

5.1. Строение и репродукция вируса гепатита А.

5.2. Патогенез и клиника гепатита А.

5.3. Диагностика гепатита А.

5.4. Профилактика и лечение гепатита А.

5.5. Строение и репродукция вируса гепатита В.

5.6. Патогенез и клиника гепатита В.

5.7. Диагностика гепатита В.

5.8. Профилактика и лечение гепатита В.

5.9. Строение и репродукция вируса гепатита С.

5.10. Патогенез и клиника гепатита С.

5.11. Диагностика гепатита С.

5.12. Профилактика и лечение гепатита С.

6. Задания и методические указания к их выполнению .

На занятии студенту необходимо:

6.1. Ответить на вопросы преподавателя.

6.2. Принять участие в обсуждении изучаемых вопросов.

6.3. Выполнить самостоятельную работу.

Теоретическая справка Возбудители вирусных гепатитов:

- вирус гепатита А (НАV);

- вирус гепатита В (HBV);

- вирус гепатита С (HCV);

- вирус гепатита D (HDV);

- вирус гепатита E (HEV);

- вирус гепатита F (HFV);

- вирус гепатита G (HGV).

Вирусные гепатиты подразделяются на 2 группы:

- энтеральные гепатиты (гепатиты А и Е);

- парентеральные гепатиты (гепатиты В, С, D, F, G).

I. Вирус гепатита А

Гепатит А (болезнь Боткина) – это инфекционное заболевание,

характеризующееся поражением печени. Болезнь проявляется лихорадкой, интоксикацией, желтухой, склонностью к эпидемическому распространению. Антропоноз. Вирус впервые выделил С. Фейнстоун (1973 г.).

Таксономия . Вирус гепатита А включён в род Hepatovirus семейства

Морфология . Вирионы сферической формы размером 25-30 нм. Геном образует несегментированная молекула плюс-РНК , окруженная капсидом . Геном имеет белок VPg. Нуклеокапсид кубической симметрии. Суперкапсид отсутствует.

Репродукция . Вирус высвобождается из клеток путем экзоцитоза.

Эпидемиология . Резервуар возбудителя и источник инфекции - больной человек. Больной выделяет возбудитель с фекалиями со второй половины инкубационного периода (в течение 2-3 недель до начала желтушного периода) и в течение первых 3-5 суток желтушного периода. Передача возбудителя происходит фекально-оральным путём (через воду, пищевые продукты, грязные руки, различные предметы обихода). Пик заболеваемости приходится на позднюю осень

или зиму. Преимущественно болеют дети в возрасте 4-15 лет. Возможны водные и пищевые эпидемические вспышки. Гепатит А распространен повсеместно, но особенно в местах с дефицитом воды, плохими системами канализации и водоснабжения, а также при низком гигиеническом уровне жизни населения. После перенесённого заболевания формируется стойкая невосприимчивость к повторному заражению.

Устойчивость . Вирус гепатита А устойчив в окружающей среде, при 21°С сохраняется несколько недель; при 60°С сохраняется в течение 12 часов, при кипячении погибает в течение 5 минут. Вирус хорошо переносит низкие температуры, устойчив к хлору, благодаря чему сохраняется в очищенной питьевой воде.

Патогенез поражений . Попадая в организм человека с водой или пищей, вирус гепатита А размножается в эпителии слизистой оболочки тонкой кишки и регионарных лимфоидных тканях. Затем наступает фаза кратковременной вирусемии. Максимальная концентрация вируса в крови возникает в конце инкубационного периода и в преджелтушном периоде. В это время возбудитель также выделяется с фекалиями. Основная мишень для цитопатогенного действия – гепатоциты ( гепатотропизм вируса ), куда вирус поступает через портальную вену. Репродукция вируса в цитоплазме гепатоцитов приводит к гибели клеток в результате иммунопатологических механизмов. Цитопатический эффект усиливают NК-клетки, активированные интерфероном, синтез которого индуцируется вирусом.

Клиника . Инкубационный период составляет от 15 до 50 дней, чаще около месяца. Начало острое: повышение температуры и явления со стороны желудочнокишечного тракта (тошнота, рвота). На 5-7 день развивается желтуха склер, кожных покровов. Клиническое течение заболевания в основном легкое, без особых осложнений, у детей до 5 лет чаще всего бессимптомное. Продолжительность заболевания 2-3 недели. Хронические формы не развиваются.

Иммунитет . После перенесенного заболевания формируется стойкий пожизненный иммунитет. В начале заболевания в крови появляются IgM, которые сохраняются в организме в течение 4-6 месяцев и имеют диагностическое значение. Позднее появляются IgG. Помимо гуморального иммунитета в кишечнике развивается и местный иммунитет. У детей первого года жизни обнаруживаются антитела, полученные через плаценту от матери.

Принципы микробиологической диагностики . Материал для исследования – сыворотка крови и испражнения. Маркёры репликации вируса - антитела (IgM и IgG) к антигенам вируса гепатита А и вирусная РНК. Указанные маркёры определяют в ИФА и РИА .

Лечение . Средства специфической противовирусной химиотерапии отсутствуют, лечение симптоматическое .

Профилактика . Разработанный сывороточный иммуноглобулин

предупреждает развитие заболевания в течение 3 месяцев, а также значительно смягчает течение заболевания. Его применяют по эпидпоказаниям для пассивной иммунизации лиц, направляющихся в эндемичные районы. Для активной иммунопрофилактики вирусного гепатита А используют инактивированную культуральную концентрированную вакцину . Разработана также рекомбинантная генно-инженерная вакцина .

Общие профилактические мероприятия направлены на улучшение санитарной обстановки, включают соблюдение карантинных мероприятий, улучшение условий водоснабжения и повышение гигиенической культуры населения.

II. Вирус гепатита В

Гепатит В - инфекционное заболевание с парентеральным механизмом передачи, клинически и морфологически характеризующееся поражением печени с возможностью развития острой печеночной недостаточности, хронического гепатита, цирроза печени и первичного рака печени (гепатоцеллюлярной карциномы). Возбудитель впервые обнаружили Д. Дейн и соавт. в 1970 г. (частица Дейна).

Таксономия . Вирус гепатита В включён в состав рода Orthohepadnavirus

Морфология . Вирионы вируса гепатита В сферической формы 42-47 нм в диаметре, имеют суперкапсид . Сердцевина вириона имеет кубический тип симметрии и состоит из 180 белковых частиц (сердцевинный НВс-антиген). Внутри сердцевины находится ДНК , фермент ДНК-полимераза и НВе-антиген. Липидсодержащая поверхностная оболочка включает HBs-антиген. Геном вируса гепатита В представлен двунитевой кольцевой ДНК, одна нить которой короче (неполная плюс-нить) другой нити. В состав сердцевины также входит ДНК-зависимая ДНК-полимераза, связанная с минус-цепью ДНК.

Репродукция . После адсорбции внутрь клетки проникает сердцевина вируса. Затем неполная нить ДНК достраивается; формируется полная двунитевая кольцевая ДНК и созревающий геном попадает в ядро клетки. Здесь клеточная ДНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует разные иРНК (для синтеза вирусных белков) и РНК-прегеном - матрицу для репликации генома вируса. Далее иРНК перемещаются в цитоплазму и транслируются с образованием белков вируса. Белки сердцевины вируса собираются вокруг прегенома. Под действием РНК-зависимой ДНК-полимеразы вируса на матрице прегенома синтезируется минус-нить ДНК, на которой образуется плюс-нить ДНК. Оболочка вириона формируется на НВsсодержащих мембранах эндоплазматической сети или аппарата Гольджи. Вирион выходит из клетки экзоцитозом.

Устойчивость . Вирус гепатита В отличается высокой устойчивостью к факторам окружающей среды. Температуру минус 20°С выдерживает более 10 лет. При 100°С сохраняет жизнеспособность в течение 5 минут. Вирус устойчив к длительному воздействию кислой среды, УФ-излучению, действию спирта, фенола. Чувствителен к действию формалина, эфира, хлороформа.

Эпидемиология . Основной резервуар и источник возбудителя -

инфицированный человек (вирусоносители, больные острой и хронической формами). Основные пути передачи вируса гепатита В - инъекционный, гемотрансфузионный и половой. Также показана возможность вертикальной передачи вируса гепатита В от матери к плоду. У инфицированных лиц вирус находится во всех биологических жидкостях – крови, слюне, моче, сперме, синовиальной жидкости, цереброспинальной жидкости, грудном молоке. В крови вирус появляется за 2-3 месяца до наступления симптомов поражения печени и сохраняется до 5 лет после клинического выздоровления.

Основные группы риска - медицинские работники; лица, получающие гемотрансфузии или препараты крови; наркоманы, вводящие наркотики внутривенно; больные гемофилией; лица, находящиеся на гемодиализе; дети матерей-носителей HBsAg; половые партнёры носителей вируса.

HBsAg . Первый идентифицированный антиген вируса гепатита В; впервые его выделил Б. Блюмберг (1963) из крови австралийского аборигена, поэтому этот антиген также называют австралийским. HBsAg появляется в крови через 1,5 месяца после инфицирования; постоянно циркулирует в сыворотке инфицированных лиц. HBsAg обнаруживается в крови не только в составе вирионов, но и в виде самостоятельных фрагментов.

HBcAg . Сердцевинный HBcAg обнаруживают только в сердцевине частиц Дейна, в свободном состоянии в крови этот антиген не обнаруживается. Антиген маркирует репликацию вируса в гепатоцитах. Может быть обнаружен только при морфологическом исследовании биоптатов или аутопсийного материала печени. В крови в свободном виде его не определяют.

HBeAg . Появляется в сыворотке в инкубационном периоде, сразу после появления HBsAg. HBeAg можно расценивать как наиболее чувствительный диагностический показатель активной инфекции. Обнаружение HBeAg у пациентов с хроническим гепатитом указывает на активацию процесса, что представляет высокую эпидемическую опасность.

ДНК появляется в сыворотке одновременно с другими антигенами вируса. Исчезает из кровотока в начале второй недели острого заболевания. Длительное персистирование - свидетельство хронической инфекции. В диагностике острого гепатита В определение ДНК используют редко.

Патогенез . Вирус гепатита В гематогенно заносится в печень и размножается в гепатоцитах. После проникновения вируса в гепатоцит возможно развитие двух типов вирусной инфекции – интегративной и продуктивной.

Интегративная инфекция сопровождается интеграцией вирусной ДНК в хромосому гепатоцита с образованием провируса. При этом синтезируется HBsантиген. Клинически это проявляется вирусоносительством, развитием первичного рака печени.

Продуктивная инфекция сопровождается формированием новых вирусных частиц. Клинически это проявляется активным инфекционным процессом в виде острого или хронического гепатита. Маркером этого является появление в крови анти-HBс-IgM антител. Разрушение гепатоцитов опосредуется CD8 Т-лимфоцитами, которые взаимодействуют с НВс-антигеном на поверхности зараженных гепатоцитов. Во второй половине инкубационного периода (40-180 суток) вирус выделяют из крови, спермы, мочи, фекалий и секрета носоглотки.

Клиника . Инкубационный период – 3-6 месяцев. При интегративной инфекции наблюдается вирусоносительство без проявления клинических симптомов. При продуктивной инфекции поражение печени сопровождается развитием желтухи. Возможны и безжелтушные формы.

Принципы микробиологической диагностики . Маркёры репликации вируса гепатита В - HBeAg, антитела (IgM) к HBcAg, ДНК вируса и вирусная ДНКполимераза. Для выявления HBsAg и HBeAg применяют ИФА и РНГА;

исследования дополняют выявлением ДНК вируса гепатита В и вирусной ДНКполимеразы. Вирусспецифические антитела к HBsAg, HBcAg, HBeAg определяют в ИФА и РНГА. На наличие “свежей” инфекции указывают высокие титры HBsAg и IgM к HBsAg и HBcAg. У пациентов с клинически проявляющимся гепатитом титр HBsAg сначала растёт, а затем снижается. Антитела к HBsAg можно выявить только через несколько недель, что объясняют их активным связыванием в иммунные комплексы. В течение этого периода можно обнаружить лишь антитела к HBcAg.

Антитела к HBcAg . Важный диагностический маркер инфицирования, особенно при отрицательных результатах выявления HBsAg:

- IgM к HBcAg. Один из наиболее ранних сывороточных маркёров вирусного гепатита В. При хроническом гепатите маркируют репликацию вируса и активность процесса в печени;

- IgG к HBcAg. Сохраняются многие годы. Свидетельствуют об имеющейся или ранее перенесённой инфекции.

Антитела к HBeAg . Серологический маркёр интеграции вируса. В комплексе с IgG НВсАg и НВsАg свидетельствуют о полном завершении инфекционного процесса.

Антитела к НВsАg . Свидетельствуют о завершении вирусной инфекции. Лечение . Средства специфической терапии отсутствуют, лечение в

основном симптоматическое. Применяют ингибиторы ДНК-полимеразы (ламивудин), α-интерферон, виферон, амиксин.

Иммунопрофилактика . Пассивная иммунизация специфическим Ig (НВIg) показана лицам, контактировавшим с инфицированным материалом и носителями НВsАg (включая половых партнёров и детей, родившихся от НВsАg-положительных матерей). Для активной иммунизации разработаны два типа вакцин. Первые готовят из плазмы пациентов, содержащей антиген вируса гепатита В. Вторую группу составляют рекомбинантные вакцины (Recombivax В, Engerix В), полученные методом генной инженерии на культурах пекарских дрожжей ( Saccharomyces cerevisiae ) и содержащие HBs-антиген.

III. Вирус гепатита С

Гепатит С – это антропонозное вирусное заболевание с парентеральным механизмом заражения, протекающее в виде посттрансфузионного гепатита с преобладанием безжелтушных и легких форм и склонное к хронизации.

Вирус гепатита С относится к семейству Flaviviridae (лат. flavus - желтый) роду Hepacivirus (лат. hepar - печень). Вид – вирус гепатита С, Hepatitis C virus ( HCV) .

Вирионы вируса гепатита С имеют сферическую форму размером 55-65 нм. Геном представлен линейной плюс-РНК. Снаружи вирион окружен липидным суперкапсидом с белковыми выступами. Репродукция вируса происходит в цитоплазме инфицированной клетки.

Резистентность . Вирус во внешней среде нестоек.

Эпидемиология . Источник инфекции - инфицированный человек.

Механизм передачи – парентеральный. Пути передачи – при переливании крови, трансплацентарно, половым путем.

Клиника . Различают следующие периоды заболевания: 1. Инкубационный период – 6-8 недель.

2. Преджелтушный период – 1-2 недели.

3. Разгар заболевания – развитие желтухи, продолжительность – 2-3 недели. Отмечается повышение уровня билирубина, АЛТ, интоксикация, гепато- и спленомегалия. Заболевание протекает в виде острого или хронического гепатита. Часто встречаются безжелтушные формы.

Диагностика осуществляется с помощью ПЦР (вирусный геном определяется уже в инкубационном периоде). Антитела (анти-HCV) выявляются при иммуноферментном анализе от нескольких дней до нескольких недель после начала заболевания.

После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет порядок проведения самостоятельной работы.

1. Постановка опыта по выявлению IgM к HAV в сыворотках крови больных гепатитом. Реакцию ставят в микропланшетах в верхнем ряду с сыворотками №№1, 2, 3, 4 (лунки 1, 3, 5, 7), положительной контрольной сывороткой “K+HAV” (лунка 9), отрицательной контрольной сывороткой “K-HAV” (лунка 11). При наличии IgM

к HAV в испытуемых сыворотках (№№2 и 3) раствор субстрата из бесцветного становится розовым, как и в лунке №9 с положительной контрольной сывороткой. В лунке №11 с отрицательной контрольной сывороткой раствор не изменяет окраски.

2. Постановка ИФА для выявления HBsAg в сыворотках крови больных гепатитом. Реакцию ставят в микропланшетах в верхнем ряду с сыворотками больных №№5, 6, 7, 8 (лунки 1, 3, 5, 7), положительной контрольной сывороткой “K+HBs” (лунка 9) и отрицательной контрольной сывороткой “K-HBs” (лунка 11). При наличии HBsAg в испытуемых сыворотках раствор субстрата становится розовым, как и в лунке №9 с положительной контрольной сывороткой. В лунке №11 с отрицательной контрольной сывороткой цвет раствора не меняется.

7. Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:

Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.

8. Литература для подготовки темы:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.

2. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 1 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 448 с.: ил.

3. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 2 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65

“Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.: ил.

1. Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и

доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.

2. Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.

Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В.

Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.

Читайте также: