Что такое штамм и изолят вируса

Были проанализированы 201 штамм вирусов гриппа А и В, выделенные в эпидемические сезоны 2006–2009 годов и 10 пандемических вирусов гриппа А субтипа H1N1v 2009 года выделения.

С помощью программ Vector NTI8 и MEGA2.1 предсказаны первичные аминокислотные последовательности гемагглютинина, нейраминидазы и М2-белка, построены филогенетические деревья и элайнменты вирусов гриппа A двух субтипов (H1N1, H3N2) и вируса гриппа B, циркулировавших на территории России в 2007–2009 гг.

В последние годы наблюдалась активизация вирусов гриппа A субтипа H1N1. Доля этих вирусов увеличилась c 12% в 2005–2006 годах, до 60% в 2007–2008 годах от общего количества выделенных штаммов. Активизация была связана с появлением на эпидемической арене вирусов новой антигеной разновидности.

Для вирусов гриппа А субтипа H1N1 2006 и 2007 годов выделения было показано увеличение гетерогенности популяции. Вирусы гриппа А (H1N1), выделенные в 2006 году, подразделялись на две группы: вирусы подобные штамму А/Н.Каледония/20/99 (клайд 1) и вирусы, отличающиеся как от референс-штамма А/Н.Каледония/20/99, так и от референс-штамма 2007 года А/Соломоновы острова/3/06 (клайд 2а). Эти штаммы образовали клайд 2d. Вирусы 2007 года выделения содержали замены, характерные как для штаммов 2006 года (S36N, T82K, R145K, V165A), так и оригинальные (E169K, N183T, R188S, A189T).

Штаммы вируса гриппа А подтипа H1N1 2007–2008 годов выделения по молекулярно-генетическим характеристикам были родственны штамму вируса гриппа А/Брисбен/59/07 (клайд 2В), рекомендованному ВОЗ для производства гриппозных вакцин. Большинство изолятов 2008 года кластеризовались в отличную от изолятов 2006–2007 годов выделения эволюционную группу. У них были выявлены отличия по шести аминокислотным позициям от вакцинного штамма А/Новая Каледония/20/99, по пяти позициям от вакцинного штамма А/Соломоновы Острова/3/06 и по восьми аминокислотным позициям от российских изолятов 2006–2007 годов выделения.

Часть штаммов вируса гриппа А подтипа H1N1, выделенных в сезоне 2008–2009 года, по молекулярно-генетическим характеристикам была родственна вакцинному штамму вируса гриппа А/Брисбен/59/07 (клайд 2В), а часть штаммов — штамму вируса гриппа A/Москва/5/08, выделенному в эпидемический период 2007–2008 года (клайд 2С) и отличалась по 6 аминокислотным позициям в молекуле гемагглютинина от штамма вируса гриппа А/Брисбен/59/073.

Согласно предсказанным аминокислотным последовательностям HA пандемического вируса — штамма А/Санкт-Петербург/04/2009v содержит в 83 положении сериновый остаток, также как и референс-штамм А/Техас/05/2009. Вместе с тем, выявлены отличия Санкт-Петербургского штамма от прототипных штаммов — две замены аминокислотных остатков I189L и T203S. Все проанализированные штаммы (8 штаммов) содержали в нейраминидазе аминокислотную замену остатка валина на изолейцин в 136 позиции (также как и штамм А/Москва/01/2009v). Кроме того, штамм A/Санкт-Петербург/01/2009v содержит замену D128A, а штаммы A/Санкт-Петербург/02/2009v и A/Санкт-Петербург/04/2009v — D248N по сравнению с прототипными штаммами. Таким образом, согласно анализу предсказанных аминокислотных последовательностей белков пандемические штаммы вируса гриппа А/H1N1v, выделенные в Санкт-Петербурге, родственны штаммам А/Техас/05/2009 и А/Калифорния/07/2009.

Штаммы вируса гриппа А H3N2, выделенные в 2007 и 2008 годах, по результатам филогенетического анализа и предсказанной первичной аминокислотной последовательности гемагглютинина вирусы можно было разделить на три группы, эволюционно близкие к вакцинному штамму A/Висконсин/67/2005 (H3N2) (2007 год) и штамму вируса гриппа А/Брисбен/10/07 (H3N2), рекомендованному ВОЗ для производства гриппозных вакцин (2008 год). Большинство изолятов 2008 года кластеризовались в отличную от изолятов 2006-2007 года выделения эволюционную группу, с двумя аминокислотными заменами в НА1.

Штаммы вируса гриппа А подтипа H3N2 2008–2009 годов. выделения, по молекулярно-генетическим характеристикам родственны вакцинному штамму А/Брисбен/10/07 (H3N2) и являются эволюционным продолжением штаммов предыдущего эпидемического периода. Они сохранили замены, характерные для штамма А/Брисбен/10/07 E50G в антигеном сайте С.

Филогенетический анализ штаммов вирусов гриппа В, циркулировавших в эпидемические сезоны 2006–2009 годов. показал, что данные штаммы относились к двум линиям: Викторианской и Ямагатской. В 2006–2007 годах циркулировали преимущественно вирусы гриппа В, относящиеся к Викторианской линии. В 2008 году, согласно филогенетическому анализу все проанализированные российские изоляты (15 штаммов) относились к Ямагатской линии. Большинство штаммов (94%) вируса гриппа В 2008–2009 годов выделения (32 штамма) по молекулярно-генетическим характеристикам относятся к Викторианской линии.

Проведен анализ мутаций, определяющих устойчивость вирусов гриппа А к ремантадину. Установлено, что у 23,0% вирусов гриппа А подтипа H1N1и 100% штаммов подтипа H3N2 в 31 положении М2-белка находится аспарагин, что, может свидетельствовать об устойчивости этих штаммов к ремантадину. По данным секвенирования показано отсутствие штаммов вируса гриппа А подтипа H1N1, устойчивых к ремантадину и озельтамивиру одновременно.

Проведен анализ устойчивости изолятов вируса гриппа А субтипа H1N1 2007–2009 годов выделения к озельтамивиру методами RFLP (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) и секвенирования фрагмента гена NA. Показано, что 80,5–91,4% изолятов имели замену гистидина на серин в гене NA в положении 275, что определяло их устойчивость к озельтамивиру. Все проанализированные штаммы A H1N1v не имели подобной мутации.

У проанализированных штаммов A H1N1v показано отсутствие аминокислотных замен в белках М2 и NS2 по сравнению со штаммами вируса гриппа А/Техас/05/2009 и А/Калифорния/07/2009. Штаммы из Санкт-Петербурга, также как и прототипные штаммы имели мутацию в белке М2, ответственную за устойчивость к ремантадину.

По итогам выполнения опубликованы 4 статьи (3 из них в иностранных изданиях), 3 тезисов в материалах международных конференций, сделано 14 докладов на Российских и зарубежных конференциях и съездах.

Молекулярно-биологическая характеристика российских изолятов вируса оспы сливы НИР

Руководитель НИР: Чирков С.Н.
Участники НИР: Иванов П.А., Кудрявцева А.В., Пундик М.В., Шевелева А.А.
Подразделение: Кафедра вирусологии
Срок исполнения: 31 января 2014 г. - 31 декабря 2016 г.
Номер договора (контракта, соглашения): 14-04-01786а
Номер ЦИТИС: 01201450688
Тип: Фундаментальная
Приоритетное направление научных исследований: Физико-химические основы биологии и биотехнологии
ПН России: Науки о жизни
Рубрики ГРНТИ:
- 34.25.29 Биология вирусов человека, животных, растений и бактерий
Ключевые слова: иммунохимический анализ, штамм, пиросеквенирование, вирус оспы сливы, филогенетический анализ, секвенирование нового поколения, полимеразная цепная реакция

Основные результаты:

Целью работы являлось изучение распространения, генетического разнообразия и молекулярно-биологических свойств изолятов вируса оспы (шарки) сливы (Plum pox virus, PPV) и структуры популяции вируса в Европейской России. Вирус обнаружен в Ленинградской, Тверской, Московской, Тамбовской, Липецкой областях, Краснодарском и Ставропольском краях, в Республике Татарстан, Республике Дагестан, Республике Крым на различных видах естественно зараженных косточковых культур: сливе, персике, нектарине, алыче, терне, вишне, войлочной вишне и сливе канадской. Установлено широкое распространение штаммов W, С и CR, исключительно редких или вовсе не обнаруженных в других регионах мира. Определены последовательности полных геномов 7 изолятов штамма С, 5 изолятов штамма CR, 9 изолятов штамма W, 5 изолятов штамма D, 2 изолятов штамма Rec, а также около 50 3'-концевых последовательностей генома изолятов различных штаммов, что создает новые возможности для изучения генетического разнообразия PPV и его эволюционной истории, в особенности штаммов С, CR и W, распространенных преимущественно или только в России. Впервые обнаружена и охарактеризована новая группа изолятов PPV, адаптированных к вишне, которые, видимо, не принадлежат ни к одному из известных штаммов вируса. При анализе природных изолятов обнаружен ряд мутаций в универсальном и штамм-специфичных эпитопах белка оболочки, которые препятствуют взаимодействию моноклональных антител с соответствующими эпитопами и могут влиять на достоверность иммунохимической диагностики PPV. Впервые выявлено широкое распространение внутриштаммовой рекомбинации среди изолятов штаммов W, М и С и обнаружены новые рекомбинационные события в 5'-терминальном районе генома у штаммов Rec и M. Установлено, что молекулярная масса БО изолятов штаммов W, C, CR и Tat, определенная по его электрофоретической подвижности в денатурирующих условиях, заметно превосходит ее значения, рассчитанные по аминокислотному составу, что может быть обусловлено посттрансляционными модификациями БО. Полученные результаты существенно дополняют сведения о географическом распространении PPV, основательно расширяют представления о молекулярно-биологических свойствах и генетическом разнообразии этого вируса и могут иметь большое значение для совершенствования существующих и разработки новых методов диагностики PPV.

грант РФФИ

#	Сроки	Название
1	31 января 2014 г.-31 декабря 2014 г.	Молекулярно-биологическая характеристика российских изолятов вируса оспы сливы
Результаты этапа: Определены полные последовательности генома 8 изолятов вируса оспы сливы (Plum pox virus, PPV), относящихся к штамму W (P2, P3, Pd2, RD4, STNB1, STNB2, 1410-1, 1410-7), 4 изолятов штамма С (Bg6, Bg26, Bg66, Pul), 5 изолятов штамма CR (Kp8-1U, Kp8-2U, Fl-3, Pul-1, Pul-DS) и 2 изолятов штамма Rec (K28, Kisl-1pl). Рекомбинационный анализ полногеномных последовательностей изолятов штамма W с помощью программы RDP4 впервые выявил у PPV наличие и широкое распространение внутриштаммовых рекомбинационных событий. Все 8 изолятов PPV-W, секвенированных в данной работе, оказались рекомбинантами. Впервые обнаружено, что универсальный эпитоп 96DRDVDAG102, общий для всех исследованных в этом отношении изолятов PPV (кроме ряда изолятов нового штамма CR), у двух представителей штамма C (Bg6 и Bg26) изменен в результате мутации D96E (Таблица). Эти изоляты не определяются методом иммуноферментного анализа с моноклональными антителами 5B, которые специфичны к универсальному эпитопу и распознают, как считалось, любые изоляты этого вируса. Впервые описаны симптомы на плодах вишни, зараженной изолятами нового штамма PPV-CR, которые проявлялись в виде оспин и растрескивания плодов. Впервые в России и на территории бывшего СССР выявлены 2 природных изолята PPV, относящихся к штамму Rec. Изолят К28 обнаружен на алыче Prunus cerasifera в коллекционных насаждениях Никитского ботанического сада (Крым), а изолят Kisl-1pl – на сливе P. domestica на дачном участке в окрестностях Кисловодска. Полные последовательности их геномов депонированы в GenBank под номерами KF472134 и KM273015, соответственно. Рекомбинационный анализ полногеномных последовательностей K28 и Kisl-1pl, а также 7 других изолятов штамма Rec, доступных в GenBank, с помощью программы RDP4 впервые выявил рекомбинационное событие в 5’-конце генома всех исследованных изолятов штамма Rec в районе генов P1 и HcPro. При обследовании насаждений косточковых культур обнаружено свыше 30 новых изолятов штамма D. Несколько представителей этого штамма обнаружены на персике (P. persica) и нектарине (P. persica var. nectarine), которые не являются типичными хозяевами для изолятов этого штамма, а ряд изолятов не распознавались моноклональными антителами 4DG5/4DG11 к эпитопу 56PATKP60, специфичному для штамма D.
2	1 января 2015 г.-31 декабря 2015 г.	Молекулярно-биологическая характеристика российских изолятов вируса оспы сливы
Результаты этапа:
3	1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г.	Молекулярно-биологическая характеристика российских изолятов вируса оспы сливы
Результаты этапа: 1) Открыта новая группа изолятов PPV, адаптированных к вишне (Prunus cerasus), и охарактеризованы их молекулярно-биологические свойства. При исследовании коллекционных насаждений и сортоиспытательных участков вишни Татарского НИИ сельского хозяйства (г. Казань) обнаружены необычные изоляты PPV, названные, в соответствии с их локализацией, Tat (татарскими) изолятами. Tat изоляты индуцировали на листьях зараженных растений симптомы, типичные для PPV, и выявлялись методом иммуноферментного анализа (ИФА) с поликлональными антителами к PPV и моноклональными антителами 5В, а также методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с универсальными праймерами P1/P2 и праймерами, специфичными к 3'-нетранслируемому участку генома (3'-NCR). По многим важным параметрам Tat изоляты обладали высоким сходством со штаммами C и CR, вероятно, ввиду предполагаемой общности происхождения и адаптации к одному и тому же хозяину. Однако, они не определялись в ОТ-ПЦР с праймерами к штаммам С и CR (которые только и были описаны ранее на вишне), а также с праймерами к штаммам M и W. В то же время, некоторые из этих изолятов (Tat-2, Tat-4, Tat-26) выявлялись в ОТ-ПЦР с праймерами к штамму D, который никогда не был обнаружен на вишне. Изоляты Tat-2, Tat-3 и Tat-26 реагировали в ИФА с моноклональными антителами АС, специфичными к штамму С. Ни один из Tat изолятов не распознавался моноклональными антителами 4DG5 к штамму D. Таким образом, применение иммунохимических и молекулярных методов анализа не позволило установить штамм новых изолятов. С использованием смысловых вырожденных праймеров, распознающих последовательности большинства потивирусов: NIb2F (Zheng et al., 2010) и Potyvirid primer 2 (Gibbs and Mackenzie, 1997), и известных антисмысловых праймеров 4CPR1, P1 или H1, специфичных к консервативным С-концу белка оболочки (БО) или к 3’-NCR, определена 3'-концевая последовательность генома этих изолятов длиной 1747 нуклеотидов (nt), включающая часть гена NIb, весь ген БО и большую часть 3'-NCR. Филогенетический анализ этих последовательностей показал, что Tat изоляты входят в группу "вишневых" штаммов C и CR, однако достоверно кластеризуются отдельно от них. Tat-2, Tat-4 и Tat-26 и изоляты штамма С происходят, по-видимому, от общего предка. Изоляты Tat-2 и Tat-4 оказались близкородственными. Определение генетических дистанций и степени идентичности нуклеотидных и аминокислотных последовательностей показало, что дивергенция между изолятами Tat-2/4 и Tat-26 в исследуемом сегменте генома составляла более 15% на нуклеотидном уровне, что сопоставимо с междуштаммовыми различиями, характерными для PPV. Изолят Tat-3 кластеризовался отдельно как от остальных Tat изолятов, так и от штаммов С и CR. Наиболее вероятной причиной этого является рекомбинация, обнаруженная в 5'-концевом сегменте гена БО Tat-3. Рекомбинантная последовательность длиной 287 nt обладала наибольшим сходством (87%) с соответствующим сегментом генома изолята Volk143, относящимся к штамму C. Точное филогенетическое положение Tat-3 еще предстоит определить. Новые изоляты PPV, по-видимому, не относятся ни к одному из известных штаммов вируса и представляют собой отдельные дивергентные линии эволюции. Для решения этого вопроса необходим анализ полногеномных последовательностей. Полная последовательность генома 4 Tat изолятов была определена посредством секвенирования нового поколения на платформе Illumina с использованием геномного секвенатора HiSeq2000 и его программного обеспечения. В отсутствие надежной референсной последовательности контиги собирали de novo. Некоторые результаты исследований Tat изолятов доложены на 3 Международном симпозиуме по вирусу оспы сливы (3rd International Symposium on Plum pox Virus) 9 - 13 мая 2016 г., Анталья, Турция, и представлены для опубликования в журнале Virology. 2) В коллекционных насаждениях вишни Татарского НИИ сельского хозяйства (г. Казань) обнаружены 20 новых изолятов PPV штамма С (PPV-C). Впервые обнаружена природная инфекция PPV-С на войлочной вишне (P. tomentosa). Определены 3'-концевые последовательности генома новых изолятов длиной около 1300 nt с использованием известной пары праймеров p84С/4CPR1. Определены полные последовательности генома 3 татарских изолятов PPV-C (Tat-7, Tat-15 и Tat-23) посредством секвенирования нового поколения на платформе Illumina с использованием геномного секвенатора HiSeq2000 и его программного обеспечения и полногеномной референсной последовательности изолята BY181.

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, . ). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".

В настоящее время усилиями специалистов центра Коллекция формируется как депозитарий патогенных микроорганизмов. В коллекционном фонде содержатся:

5961 изолятов вирусов – представителей семейств Arenaviridae, Filoviridae, Togaviridae, Flaviviridaе, Rhabdoviridae, Retroviridae, Picornaviridae, Herpesviridae, Reoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Coronaviridae, Poxvirida, в том числе и особо опасные патогенны Ласса, Марбург, Эбола.

5516 изолятов бактерий – Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacteriaceae, Spirochaetaceae, Enterobacteriaceae, Staphylococcocaceae, Enterococcocaceae, Pseudomonadacea, аэробные неферментирующие грамотрицательные палочки и кокобациллы.
плазмиды – оригинальные авторские векторные конструкции.

Целью работы коллекции является обеспечение правовой охраны штаммов микроорганизмов, а также гарантированное сохранение микроорганизмов в жизнеспособном состоянии и создании условий для длительного хранения с целью стандартизации исследований с различными микроорганизмами.

В задачи исследований коллекции входит:

накопление и гарантированное сохранение вирусов, в том числе и выделенных на территории Республики Беларусь;
	хранение штаммов, подлежащих элиминации в окружающей среде;
подбор оптимальных методов консервации и длительного хранения вирусов;
	гармонизация правил депонирования оригинальных штаммов вирусов, выделенных на территории республики Беларусь референс-штаммов, штаммов-продуцентов вакцинных и лечебных препаратов, генетически измененных штаммов вирусов, а также рекомбинантных плазмид, содержащих вирусспецифические вставки;
обеспечение международного сотрудничества и обмена информацией по вопросам выполнения Будапештского договора по депонированию и поддержанию штаммов микроорганизмов, предоставления доступа и пересылки штаммов, в соответствии с международными соглашениями и стандартами.

Сотрудники Коллекции организуют и проводят работы по подготовке ежегодной информации в рамках Конвенции о запрещении разработки, производства и накопления запасов бактериологического (биологического) и токсинного оружия (КБТО), а также участвуют в системе контроля трансграничного перемещения патогенных микроорганизмов.

Общую информацию о коллекции можно скачать здесь.

Коллекция включена в Государственный регистр информационных ресурсов 21.11.2012 № 1761203264

Адрес:
ул. Филимонова, д. 23
220114, г. Минск, Республика Беларусь

doi: 10.18527/2500-2236-2017-4-1-10-20

Получена: 2017-10-18 Принята к печати: 2017-11-02 Опубликована: 2017-12-06

Р. Н. Гейдаров 1 , Н. Ф. Ломакина 2 , Е. Ю. Боравлева 2 , И.С. Холодилов 2 , А. С. Гамбарян 2# , В. М. Михайлович 1 , Е. Е. Фесенко 3

# Для корреспонденции: Александра Гамбарян: al.gambaryan@gmail.com

Среди изолятов от диких птиц идентифицированы вирусы гриппа субтипов H3N1, H3N6, H3N8, H4N6, H1N1, H5N3 и H11N9. Все они содержали последовательность ESEV на С-конце белка NS1, полноразмерную рамку считывания для белка PB1-F2. Замена N66S в PB1-F2 обнаружена у шести штаммов. Однако такие маркеры патогенности, как последовательность ESEV (лиганд PDZ-домена) в вирусном белке NS1 и замена N66S PB1-F2 в контексте генома вирусов гриппа диких уток, не делали вирус патогенным для мышей. Все изоляты были высокоурожайны в куриных эмбрионах, инфекционны и иммуногенны для мышей, но не вызывали у этих животных клинических симптомов заболевания.

Forty-two strains of avian influenza viruses were isolated from the wild waterfowl’s feces in the city of Moscow. These viruses as well as reference strains and some experimental reassortants were analyzed by microarrays. The used microarrays contained 176 probes to the different segments of influenza virus genome. The microarray allows to determine 1) the hemagglutinin and neuraminidase proteins subtype; 2) the primary structure of the C-terminal sequence of the viral NS1 protein, which serves as a ligand for the PDZ domain; 3) the presence of stop codons and substitution N66S in the reading frame of the viral protein PB1-F2; 4) the presence of the polybasic site for hemagglutinin cleavage. The viruses of H3N1, H3N6, H3N8, H4N6, H1N1, H5N3 and H11N9 subtypes were identified from the group of wild bird’s isolates. All isolates contained the ESEV sequence at the C-terminus of the NS1 protein and the full-length reading frame for the PB1-F2 protein. The replacement of N66S in PB1-F2 was found in six strains. However, the presence of ESEV sequence (ligand of PDZ domain) in the NS1 virus protein and the N66S substitution in PB1-F2 did not lead to the pathogenicity of these viruses for mice. All isolates demonstrated high yield growth in chicken embryos, were infectious and immunogenic for mice, but did not induce any clinical symptoms.

Низкопатогенные вирусы гриппа диких птиц (low pathogenic avian influenza viruses, LPAIV) расположены в основаниях эволюционных ветвей всех субтипов вирусов гриппа А. Они эволюционируют медленно и сохраняют ряд характерных признаков. К таким признакам относятся: консервативное строение рецепторсвязывающего участка в верхушечной части гемагглютинина (НА); строение сайта нарезания, который расщепляется только трипсиноподобными протеазами, секретируемыми в клетках респираторного и желудочно-кишечного тракта, что ограничивает распространение вируса в организме; низкий рН конформационного перехода молекулы НА, обеспечивающий ее высокую устойчивость к кислой среде пищеварительного тракта птиц.

Повышенная патогенность вируса – многофакторная характеристика, которая определяется множественными изменениями в различных генах вируса. Так, в молекуле HA высокопатогенных штаммов присутствует полиосновная последовательность в сайте нарезания [3]. В белке нейраминидазе (NA) появляется делеция в стеблевом участке [4]. Мутация E627K в белке PB2 способствует повышению активности вирусной полимеразы и улучшению репродукции вируса [5–7]. Замена N66S в рамке считывания PB1-F2 ускоряет ядерный транспорт [8–10]. В неструктурном белке NS1 появляются замены, приводящие к эффективному подавлению синтеза интерферона в хозяйской клетке [7, 11–13].

1) устойчивость к основным противогриппозным лекарственным средствам: препаратам группы адамантанов (амантадин, ремантадин) и ингибиторам NA (озельтамивир и его аналоги);

2) наличие и структуру участка связывания PDZ-домена в белке NS1: характерные для HPAIV последовательности ESEV, EPEV, ESKV и KSEV либо характерные для LPAIV – RSKV и RSEV;

3) наличие стоп-кодонов в позициях 12 и 58 и мутацию N66S в рамке считывания белка PB1-F2;

4) наличие в НА подтипов H5 и H7 полиосновного сайта протеолитического расщепления, характерного для HPAIV.

Вирусы

Вирусы из фекалий чаек и уток выделены в 2006–2014 гг. на берегу пруда в Тропаревском парке города Москвы и хранятся в коллекции Федерального научного центра исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М. П. Чумакова (Москва, Россия).

Реассортантный вирус VNH5N1-PR8/CDC-RG (VN‑PR) (H5N1) сконструирован в Центрах по контролю и профилактике заболеваний США (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA) и содержит гены, кодирующие белки НА и NA от вируса A/Vietnam/1203/2004 (H5N1), а остальные – от штамма A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (PR8). Вирус любезно предоставлен д-ром R. Donis. В гене НА методом обратной генетики модифицирован участок, кодирующий полиосновный сайт нарезания. Холодоадаптированный вирус A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) (Len) любезно предоставлен проф. Л. Г. Руденко (Институт экспериментальной медицины, Санкт-Петербург, Россия). Вирус A/Hamburg/5/2009 любезно предоставлен д-ром М. Н. Матросовичем (Institute of Virology, Philipps University, Marburg, Germany), Вирус A/mallard/Sweden/91/2002 (H7N9) любезно предоставлен д-ром R. A. Fouchier (Department of Virology, Erasmus Medical Centre, Rotterdam, The Netherlands). Вирус А/duck/Buryatia/664/1988 (H3N1) получен из коллекции Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи (Москва, Россия). Полные названия и обозначения вирусов приведены в Табл. 1.

Вирус

Обозначение

Субтип

Номер в GenBank (ген)

PB1-F2 66 a

Линия NS1 б

A/Vietnam/1203/2004 ×A/Puerto Rico/8/34

VN-PR × Len (клон 3697)

VN-PR × Len (клон 4760)

Hamb × Len (клон 4885)

Hamb × Len (клон 4886)

Hamb × Len (клон 4888)

а Аминокислота в позиции 66 белка PB1-F2.
б Линия гена NS1 согласно [15].

Таблица 1. Исследованные вирусы

Выделение вирусов

Выделение вирусов проводили из свежих фекалий, которые суспендировали в двойном объеме фосфатно-солевого буфера (PBS) с добавлением антибиотиков: 0.4 мг/мл гентамицина, 0.1 мг/мл канамицина, 0.01 мг/мл нистатина и 2% раствора MycoKill AB (PAA Laboratories GmbH). Суспензию центрифугировали 10 мин при 4 000 об/мин и полученным супернатантом (200 мкл) заражали 10-дневные куриные эмбрионы (КЭ). Аллантоисную жидкость собирали через 48 ч и для дальнейшего пассирования отбирали пробы, положительные в реакции гемагглютинации (РГА).

Секвенирование

Анализ на микрочипе

Биочип представляет собой подложку с упорядоченно расположенными микроячейками, содержащими ковалентно иммобилизованные олигонуклеотидные зонды. На подложках закреплены пластиковые гибридизационные камеры вместимостью 30 мкл, куда вносят исследуемые флуоресцентно меченные фрагменты генома вирусов гриппа. При гибридизации флуоресцентно меченный ПЦР-продукт образует комплекс с комплементарным иммобилизованным зондом. Анализ результатов гибридизации проводили с помощью универсального аппаратно-программного комплекса ТУ 9443-004-02699501-2006 (Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта, Россия). Сигнал флуоресценции в каждой ячейке регистрировали камерой с ПЗС-матрицей и подвергали оцифровке.

Анализ патогенности вирусов для мышей

Мышам линии BALB/c весом 8–12 г вводили интраназально под легким эфирным наркозом по 50 мкл цельной или разведенной вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ). Проводили ежедневное наблюдение за состоянием подопытных особей и изменением их веса в сравнении с животными контрольной группы. На 14-е сутки после заражения отбирали кровь для определения уровня антител методом ИФА. Инфекционность вирусов определяли титрованием на КЭ и выражали в lg эмбриональных инфекционных доз (lg ЭИД₅₀).

Получение реассортантов

Для получения холодоадаптированных реассортантов с донором аттенуации Len 10-дневные КЭ заражали одновременно вирусами Len и донором поверхностных белков – по 7,0 lg ЭИД₅₀ каждого вируса. КЭ инкубировали 18 ч при 32°С, после чего проводили еще один пассаж длительностью 18 ч при 32°С. Аликвоту полученного вирусного урожая инкубировали в течение ночи с мышиной иммунной сывороткой против вируса Len; затем клонировали методом предельных разведений при 26°С и отбирали пробы, положительные в реакции торможения гемагглютинации с сывороткой против донора поверхностных белков и отрицательные с сывороткой к вирусу Len. После этого трижды клонировали вирус методом предельных разведений, выращивая в течение 96 ч при 26°С.

В качестве референсных штаммов использованы вирусы: A/duck/Buryatia/664/1988 (H3N1), A/duck/Primorie/3628/2002 (H9N2), A/mallard/Sweden/91/2002 (H7N9), штамм А/chicken/Kurgan/3654at/2005 (H5N1) [19], аттенуированный в лабораторных условиях, а также циркулировавшие в человеческой популяции вирусы гриппа подтипов H1N1, H2N2 и H1N1pdm. Основные характеристики и краткие обозначения исследованных вирусов приведены в Табл. 1.

В результате анализа определены субтипы HA и NA всех изолятов. Для вирусов, у которых гены, кодирующие белки HA и NA, были секвенированы ранее, результаты субтипирования на биочипе соответствовали результатам секвенирования.

Факторы патогенности в природных изолятах

Полиосновной сайт нарезания HA был идентифицирован в НА вируса ch/Ku (H5N1), что соответствует данным секвенирования (GenBank HQ724523.1).

Устойчивость к лекарственным препаратам адамантанового ряда, обусловленная заменами в белке М2, обнаружена только у вирусов гриппа человека: PR8 (A27 и N31) и Hamb (N31).

Во всех изолятах от диких птиц белок NS1 терминирован последовательностью ESEV, а в штаммах ch/Ku, PR8 и Len – последовательностями ESKV, RSEV и RSKV соответственно, что подтверждается данными секвенирования, опубликованными в GenBank.

Стоп-кодон в рамке считывания белка PB1-F2 обнаружен в вирусе Hamb, что также соответствует данным секвенирования. Все природные изоляты содержали полноразмерную рамку считывания белка PB1-F2. У восьми штаммов выявлена замена N66S в белке PB1-F2, которая считается фактором, повышающим патогенность вируса (Табл. 1). Для 15 штаммов, вошедших в исследование, была определена первичная структура гена PB1, и результаты секвенирования подтвердили данные анализа на биочипе.

Для выяснения вопроса, как влияет замена N66S в белке PB1-F2 на патогенность природных изолятов, мы исследовали близкородственные вирусы, отличающиеся по этой позиции, на вирулентность для мышей. На Рис. 1 приведены данные изменения веса мышей для вирусов гриппа подтипов H3N8 и H3N1. Динамика изменения веса мышей, зараженных утиными вирусами 2008–2014 гг. с N66 и S66 в белке PB1-F2, не отличалась достоверно от динамики контрольных мышей. Аналогичные результаты получены и для вирусов подтипов H4N6 и H6N2 (Табл. 2). Важно подчеркнуть, что у всех зараженных мышей наблюдался мощный вирусспецифический иммунный ответ, проявляющийся в высоких титрах антител (по данным ИФА). Это свидетельствовало о том, что заражение прошло успешно. Единственный утиный штамм вируса гриппа, который вызывал болезнь и гибель мышей, – изолят 1988 года d/664.

Читайте также: