Антитела к вирусным белкам

Определение в крови иммуноглобулинов IgG к белкам вируса гепатита С, которое используется для диагностики этого заболевания.

Антитела к белкам гепатита С;

Antibodies to structural and non-structural proteins of HCV;

Antibodies to HCV.

Иммуноферментный анализ (ИФА).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Исключить из рациона жирную пищу в течение 24 часов до исследования;
• Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Гепатит С – вирусное заболевание печени, отличительной чертой которого является бессимптомное течение и высокая частота прогрессии в хронический гепатит, цирроз печени и гепатоцеллюлярную карциному. Основной путь передачи гепатита С – через кровь и ее компоненты. Группы риска по заражению ВГС:

• Медицинские работники;
• Люди, использующие инъекционные наркотики;
• Пациенты с ВИЧ;
• Люди, которым были сделаны татуировки с помощью нестерильных инструментов;
• Пациенты, получившие переливание крови или ее компонентов до 1992 г.;
• Пациенты, получившие трансфузию факторов свертывания крови до 1987 г.;
• Пациенты, получающие лечение гемодиализом в течение длительного времени;
• Дети, рождённые от матерей с ВГС.

Следует отметить, что по крайней мере в 20 % случаев источник заражения установить не удается. В России наблюдается рост заболеваемости гепатитом С: в период с 1999 по 2011 гг. заболеваемость хроническим ВГС выросла в 3 раза. Как правило, пациенты с ВГС не догадываются о своем заболевании.

Вирус гепатита С (ВГС) – РНК-вирус, принадлежащий семейству Flaviviridae. При транскрипции его генома образуется единый белок длиной около 3000 аминокислот, который затем разрезается с помощью пептидаз клетки-хозяина и вирусных пептидаз с образованием структурных и неструктурных белков:

• Структурные белки (коровый белок, Е1 и Е2, от англ. envelope glycoproteins – гликопротеины оболочки) необходимы для формирования вирусного капсида;
• Неструктурные белки (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B, от англ. non-structural – неструктурные) выполняют различные регуляторные функции.

В ответ на заражение вирусом гепатита С в организме человека начинают вырабатываться антитела – иммуноглобулины M и G, которые можно исследовать для диагностики гепатита. Следует отметить, что при гепатите С синтез иммуноглобулинов М может наблюдаться на разных стадиях заболевания, как при остром, так и при хроническом гепатите, и поэтому не имеет никакого диагностического значения. Это важное отличие диагностики гепатита С от гепатита В (выявление иммуноглобулинов М при гепатите В наблюдается только в острую стадию). Таким образом, все серологические тесты для диагностики гепатита С основаны на выявлении иммуноглобулинов G к белкам этого вируса.

Структурные и неструктурные белки иммуногенны в разной степени. Показано, что наиболее выраженными иммуногенными свойствами обладают следующие белки (в скобках указан процент пациентов с хроническим гепатитом С, у которых в крови обнаруживаются антитела к указанному белку):

Менее иммуногенны белки E2 (31 %), NS4A(28 %) и E1 (22 %). NS2 и NS5B имеют очень слабые иммуногенные свойства, и антитела к ним у пациентов с ВГС выявляются редко.

Антитела к ВПС могут быть определены в крови приблизительно через 8 недель после первичного заражения. Ложноотрицательные результаты могут наблюдаться у людей с иммунодефицитом (например, ВИЧ-инфицированных), почечной недостаточностью и эссенциальной смешанной криоглобулинемией. Ложноположительные результаты также встречаются.

Вирусы гепатита С неоднородны по генетическому составу. На этом основании выделяют 6 генотипов ВПГ, геномы которых различаются на 30-35 %, и множество подтипов, различающихся на 20-25 %. В восточной Европе и США чаще встречаются генотипы 1a и 1b, тогда как для других стран характерны другие генотипы (например, Египет – генотип 4, Южная Африка – генотип 5). Показано, что иммунный ответ пациентов, инфицированных разными генотипами ВГС, различается. Это особенно справедливо в отношении антител к белкам E1, E2, NS3, NS4A и NS5A.

Качественный и количественный состав антител к ВГС у пациента остается достаточно постоянным в течение заболевания, в том числе и после проведенного лечения.

Антитела к гепатиту С – чувствительный, но недостаточно специфичный метод диагностики этого заболевания. Поэтому серологические тесты – это скрининговые тесты диагностики гепатита. При получении положительного результата исследования антител на гепатит С обязательно проводят подтверждающее исследование – анализ на РНК вируса с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР). Кроме того, при подтверждении диагноза "гепатит С" может понадобиться генотипирование ВГС и гистологическое исследование печени или неинвазивные методы определения состояния печени (такие как ФиброМакс).

Для чего используется исследование?

• Для диагностики гепатита С.

Когда назначается исследование?

• При профилактическом обследовании, особенно если пациент принадлежит к группе риска по гепатиту С;
• в некоторых случаях при устройстве на работу.

Что означают результаты?

Выдается по компонентам:

IgG к антигену core

IgG к антигену NS3

IgG к антигену NS4

IgG к антигену NS5

• гепатит С;
• ложноположительный результат (чаще у пациентов, не относящихся к группам риска, например доноров крови).

• норма;
• ложноотрицательный результат (сопутствующая ВИЧ-инфекция, почечная недостаточность, эссенциальная смешанная криоглобулинемия).

Что может влиять на результат?

• Время, прошедшее с момента заражения;
• Состояние иммунной системы;
• Сопутствующие заболевания почек;
• Генотип вируса гепатита С.



• Это скрининговый тест. При получении положительного результата необходим дополнительный, подтверждающий тест (определение РНК вируса с помощью ПЦР);
• результаты анализа следует интерпретировать с учетом дополнительных клинических, лабораторных и инструментальных данных.

14 Гистологическое исследование гепатобиоптата (биоптата печени) с использованием стандартных методик

Кто назначает исследование?

Инфекционист, терапевт, врач общей практики.

В настоящее время новые диагностические технологии позволяют выявить этиологические и патогенетические причины многих заболеваний и коренным образом повлиять на результаты лечения. Пожалуй, наиболее впечатляющие результаты внедрения этих технологий в клиническую практику достигнуты в области иммунологии и диагностики инфекционных заболеваний.

Для исследования может быть использован различный биологический материал: сыворотка, плазма крови, соскоб, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость (СМЖ). В первую очередь, методы лабораторной диагностики инфекций направлены на выявление таких заболеваний, как вирусный гепатит В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекции, передающиеся половым путем (гонорейная, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная), туберкулез, ВИЧ-инфекция и др.

ВИЧ-инфекция – заболевание, вызываемое вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), длительное время персистирующего в лимфоцитах, макрофагах, клетках нервной ткани, в результате чего развивается медленно прогрессирующее поражение иммунной и нервной систем организма, проявляющееся вторичными инфекциями, опухолями, подострым энцефалитом и другими патологическими изменениями.

Возбудители инфекции – вирусы иммунодефицита человека 1-го и 2-го типов (ВИЧ-1, ВИЧ-2) – относятся к семейству ретровирусов, подсемейству медленных вирусов. Вирионы являются сферическими частицами диаметром 100–140 нм. Вирусная частица имеет наружную фосфолипидную оболочку, включающую гликопротеиды (структурные белки) с определенной молекулярной массой, измеряемой в килодальтонах. У ВИЧ-1 – это gpl60, gpl20, gp41. Внутренняя оболочка вируса, покрывающая ядро, также представлена белками с известной молекулярной массой – р17, р24, р55 (ВИЧ-2 содержит gpl40, gpl05, gp36, р16, р25, р55).

В состав генома ВИЧ входит РНК и фермент обратная транскриптаза (ревертаза). Для того чтобы геном ретровируса соединился с геномом клетки хозяина, вначале с помощью ревертазы происходит синтез ДНК на матрице вирусной РНК. Затем ДНК провируса встраивается в геном клетки-хозяина. ВИЧ обладает выраженной антигенной изменчивостью, значительно превышающей таковую у вируса гриппа.

В организме человека основной мишенью ВИЧ являются Т-лимфоциты, несущие на поверхности наибольшее количество СD4-рецепторов. После проникновения ВИЧ в клетку с помощью ревертазы по образцу своей РНК вирус синтезирует ДНК, которая встраивается в генетический аппарат клетки-хозяина (СD4-лимфоциты) и остается там пожизненно в состоянии провируса. Помимо Т-лимфоцитовхелперов поражаются макрофаги, В-лимфоциты, клетки нейроглии, слизистой оболочки кишечника и некоторые другие клетки. Причиной снижения количества Т-лимфоцитов (клетки CD4) является не только прямое цитопатическое действие вируса, но и их слияние с неинфицированными клетками. Наряду с поражением Т-лимфоцитов у больных с ВИЧ-инфекцией отмечается поликлональная активация B-лимфоцитов с увеличением синтеза иммуноглобулинов всех классов, особенно IgG и IgA, и последующим истощением этого отдела иммунной системы. Нарушение регуляции иммунных процессов проявляется также повышением уровня α-интерферона, β2-микроглобулина, снижением уровня IL-2. В результате нарушения функции иммунной системы, особенно при снижении числа Т- лимфоцитов (CD4) до 400 клеток в 1 мкл крови и менее, возникают условия для неконтролируемой репликации ВИЧ со значительным увеличением количества вирионов в различных средах организма. В результате поражения многих звеньев иммунной системы человек, зараженный ВИЧ, становится беззащитным перед возбудителями различных инфекций.

На фоне нарастающей иммунодепрессии развиваются тяжелые прогрессирующие заболевания, которые не встречаются у человека с нормально функционирующей иммунной системой. Это заболевания, которые Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определила как СПИД-маркерные или СПИД-индикаторные заболевания.

СПИД-индикаторные заболевания

Первая группа – заболевания, присущие только тяжелому иммунодефициту (уровень СD4 74 100 копий/мл почти у всех пациентов развивается клиническая картина СПИДа (Senior D., Holden Е., 1996).

Вероятность развития СПИДа в 10,8 раз выше у лиц с содержанием ВИЧ-1 в крови >10 000 копий/мл, чем у лиц с содержанием ВИЧ-1 в крови 20 000 копий/мл (ПЦР). Оценка результатов антиретровирусной терапии у лиц, инфицированных ВИЧ, проводится по снижению уровня сывороточной РНК ВИЧ.

При эффективном лечении уровень виремии должен снижаться в 10 раз в течение первых 8 недель и быть ниже предела чувствительности метода (ПЦР) (

Россия готовится к тотальному тестированию, новые тест-системы позволяют быстро провести масштабную проверку на вирус. К массовому выпуску приступил один из разработчиков нового продукта, два других начинают производство. Олег Гусев, ведущий научный сотрудник Научно-клинического центра прецизионной и регенеративной медицины Казанского федерального университета и института физико-химических исследований RIKEN (Япония) помог РБК Тренды разобраться в том, как устроено тестирование на коронавирус в России и в мире.

Что предлагает ВОЗ

Глава Всемирной организации здравоохранения Тедрос Гебреисус еще в середине марта призвал страны проводить как можно больше тестов на вирус, который вызывает заболевание SARS-CoV-2, даже людям без симптомов. Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией. Как говорится в рекомендациях, на сегодня это самый точный и надежный метод диагностики вирусной инфекции. Он позволяет определить даже очень небольшое количество РНК вируса в биологическом материале человека. Это помогает выявить болезнь в инкубационном периоде.

Изобретенный в 1983 году метод и сейчас считается фундаментальным в молекулярной диагностике. Американский ученый, который придумал способ значительного увеличения малых концентраций фрагментов ДНК в биологической пробе, получил за него Нобелевскую премию. Выявление ДНК/РНК методом ПЦР позволяет диагностировать такие заболевания, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие. Метод используют в археологии, криминалистике, генетике.

Как работает ПЦР-тест

Для анализа из физиологических жидкостей извлекают одноцепочечную РНК, моделируют на ее основе двуцепочечную ДНК и многократно дублируют с помощью специального фермента (полимеразы). Увеличение числа копий ДНК называется амплификацией. В результате концентрация определенных фрагментов ДНК/РНК в биологическом образце, изначально минимальная, значительно увеличивается. При исследовании копируется только необходимый для теста участок ДНК. И, конечно, дублирование происходит только в том случае, если искомый участок вирусной ДНК или РНК присутствует в исследуемом биоматериале. В случае с коронавирусом мазок для анализа берут из ротоглотки или носоглотки, поскольку в крови или в кале вирус появляется на более продвинутой стадии болезни.

Тест-система EMG — продукт совместной разработки российских и японских разработчиков, проводившейся с 2016 года, рассказывает Олег Гусев. На данный момент эти тесты включены в систему обязательного медицинского страхования в Японии.

В ближайшее время планируется производить до 2,5 млн. тестов и 1 тыс. портативных лабораторий в неделю. Сами тесты, как и многие реагенты производятся в России. Планируется, что цена на тесты EMG будет в среднем в пять раз меньше, чем на стандартные ПЦР-тесты в Европе.

Российско-японские тесты основаны на методе изотермальной молекулярной диагностики SmartAmp, превосходящем метод ПЦР по скорости работы в восемь раз, а переносная лаборатория позволяет тестировать до 20 пациентов в час, говорит Гусев.

Ключевое отличие теста EMG в том, что многие тесты, которые производятся сейчас, это тесты ИФА (имунноферментный анализ), а не ПЦР. Данные системы определяют антитела, которые организм начинает вырабатывать не ранее, чем через неделю после заражения. Российско-японская разработка позволяет получать результат уже за 30 минут, с точностью, равной почти 100%. Кроме того, тест EMG позволяет определить наличие вируса уже на самых ранних стадиях, в то время как другие системы диагностики короновируса обладают меньшей чувствительностью и не могут выявлять вирус на ранней стадии инфицирования.

Принцип технологии российско-японского теста, по сути, не отличается от классической ПЦР — это наращивание количества целевых фрагментов ДНК и их детекция. Однако в изотермической амплификации, в отличие от классической ПЦР, где необходимы циклы нагрева и охлаждения, все происходит при одной температуре. Это позволяет многократно увеличивать скорость реакции. Метод SmartAmp был изобретен более 15 лет назад (как и LAMP — другая популярная технология изотермальной амплификации, предшествующая SmartAmp). Впервые для инфекционных заболеваний эту технологию применили в 2009 году для быстрого выявления пандемического гриппа (H1N1) в Японии.

Повторные тесты необходимы при любом методе. Отрицательный тест на COVID-19 не гарантирует, что человек не заразится этим вирусом на следующий день. Поэтому, например, в японских лабораториях персонал тестируют каждые несколько дней. Повторный тест нужен и для того, чтобы подтвердить, что человек излечился.

Эта тест-система будет использоваться для диагностики COVID-19 не только в России и Японии. 40 тыс. тестов закупила Австрия, поступили заказы из других стран Европы, Ближнего Востока, и Латинской Америки. Подана заявка в Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) для поставок в эту страну.

На данный момент в России прошли регистрацию еще три теста на коронавирус.

По некоторым данным, в Москве проводится около 700 тестов на коронавирус в сутки. В планах у московских властей увеличить этот показатель до 10 тыс. тестов в сутки, а затем довести его до 25—28 тыс. тестов ежедневно.

Новые разработки за рубежом

Компания Bosch выводит на рынок свой тест на коронавирус, который сначала будет доступен в Германии, а вскоре появится в других странах. В его основе лежит диагностический аппарат Vivalytic, который, по словам изготовителей, станет первым автоматизированным тестом на COVID-19. Тест распознает не только коронавирус, но еще шесть респираторных заболеваний, например, вирусы гриппа А и B. Во время лабораторных испытаний аппарата его точность составила 95%.

Как пишет издание ZME Science, анализ может проводиться прямо в стационаре или медицинском центре — не нужно отправлять образцы в лабораторию и ждать, пока придет ответ. Врачи смогут быстрее идентифицировать и изолировать зараженных, а пациентам не придется пребывать в неизвестности несколько дней. Тест прост в обслуживании и не требует специальной подготовки. Медперсоналу нужно только взять мазок из носа или горла пациента, нанести его на картридж, содержащий реагент, и вставить картридж в анализатор. Каждый аппарат может выполнять до десяти анализов за 24 часа.

Еще более оперативный тест на COVID-19 разработали в Великобритании. Он позволяет выявить COVID-19 всего за 30 минут. Чтобы провести его, достаточно портативного оборудования стоимостью около $120 и набора полосок для мазков из носа и горла по $5 каждая. Одновременно проходить тест могут до шести человек.

FDA в экстренном порядке одобрило сверхбыстрый тест на коронавирус, разработанный калифорнийской компанией Cepheid. С его помощью диагноз можно будет поставить всего за 45 минут. Как отмечает Business Insider, для обработки результатов теста не требуется специальное обучение. Нужен лишь доступ к системе Cepheid GeneXpert — в США их 5 тыс., а по всему миру — 23 тыс.

Начало тотального тестирования людей на COVID-19 во всем мире — хорошая новость как для людей, так и для национальных органов здравоохранения. До сих пор в мире нет четкого представления о том, сколько людей заражены коронавирусом и выявление тех, у кого он уже есть: их госпитализация или отправка на домашний карантин позволит быстрее оценить масштаб угрозы и вовремя принять правильные меры.

355017, г. Ставрополь, ул. Ленина 304

(8652) 951-951, (8652) 35-61-49 (факс)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (справочная служба)

355029 г. Ставрополь, ул. Западный обход, 64

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (контактный телефон)

(8652) 31-68-89 (факс)

Клиника семейного врача:

355017 г. Ставрополь, пр. К. Маркса, 110 (за ЦУМом)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (контактный телефон)

(8652) 31-50-60 (регистратура)

Обособленное структурное подразделение на ул. Чехова, 77 :

355000, г. Ставрополь, ул. Чехова, 77

8(8652) 951-943 (контактный телефон)

Обособленное структурное подразделение в г. Михайловске:

8(988) 099-15-55 (контактный телефон)

357107, г. Невинномысск, ул. Низяева 1

(86554) 95-777, 8-962-400-57-10 (регистратура)

Обособленное структурное подразделение в г. Черкесске :

369000, г. Черкесск, ул. Умара Алиева 31

8(8782) 26-48-02, +7-988-700-81-06 (контактные телефоны)

Обособленное структурное подразделение в г. Элисте :

358000, г. Элиста, ул. Пушкина 3А, корпус 1, офис 9

(84722) 3-36-21, 8(989) 735-42-07, 8(961) 843-77-11 (контактные телефоны)

ЗАО "Краевой клинический диагностический центр":

355017 г. Ставрополь, ул. Ленина 304

(8652) 951-951, (8652) 35-61-49 (факс)

(8652) 951-951, (8652) 31-51-51 (справочная служба)

Обособленное структурное подразделение на ул. Савченко, 38 корп. 9:

355021, г. Ставрополь, ул. Савченко, 38, корп. 9

8 (8652) 316-847 (контактный телефон)

Вирус Эпштейна- Барр(ВЭБ) относится к семейству герпесвирусов и является самой распространенной и высоконтагиозной вирусной инфекцией.По разным данным, антитела, свидетельствующие о встрече с ним, оказываются у 80- 90 % взрослых, хотя первый контакт, как правило, происходит уже в детском саду .Передача инфекции происходит :воздушно- капельным путем,через контакт с зараженным или предметами его обихода,при половом акте,поцелуях,через плаценту.Попав в организм человека, вирус Эйнштейна- Барра может вообще никак не проявляться или же привести к инфекционному мононуклеозу, синдрому хронической усталости. Опасность его кроется также и в способности провоцировать хронические процессы практически в любых органах, в том числе в печени, почках, ЖКТ, а также в возможности вызывать лимфогранулематоз, лимфому Беркитта, рак носоглотки.При первичном заражении развивается инфекционный мононуклеоз для которого характерно : повышение температуры, боли в горле при глотании (ангина),воспаление и увеличение лимфатических узлов более чем в пяти группах (шейные, подчелюстные, затылочные, над- и подключичные, подмышечные и так далее),увеличение печени и селезенки,частые головные боли, мигрень, головокружения,слабость,утомляемость.Заболевание может протекать бессимптомно или как респираторная инфекция.Хроническая усталость, вызванная вирусом Эпштейна- Барр, часто сопровождается ломотой во всем теле, слабостью в мышцах, головными болями и различными гриппоподобными проявлениями ,плохим сном,ухудшением памяти, забывчивостью, невнимательностью,нарушениями психического состояния: депрессии, психозы, апатия, перепады настроения, неудовлетворенность жизнью.Антитела к раннему антигену вируса Эпштейна- Барр достигают максимального титра на 3–4- й неделе острой фазы заболевания и исчезают через 2–6 месяцев,у некоторых людей данные иммуноглобулины сохраняются длительно и определяются в течение нескольких лет после выздоровления. Являются маркёром острой фазы Эпштейна- Барр вирусной инфекции. Данный тип антител появляется при реактивации инфекции и отсутствует при атипичной форме заболевания. Высокие титры IgG- антител к раннему антигену Эпштейна- Барр выявляются также при хронической ВЭБ- инфекции, вызванных вирусом раковых и аутоиммунных заболеваниях, иммунодефицитных состояниях.Определение антител к раннему антигену Эпштейна- Барр необходимо комбинировать с определением антител к капсидному белку, антител к ядерному белку,что позволит не только выявить инфекцию, вызванную вирусом Эпштейна- Барр, но и определить, является ли она текущей, недавней или давно перенесенной. Тест показан при подозрении на острый инфекционный мононуклеоз, для оценки стадии течения инфекции, для диагностики онкологических и лимфопролиферативных заболеваний, ассоциированных с вирусом Эпштейна- Барр.Исследуемый материал: Сыворотка крови.Кровь сдается натощак ,до физических нагрузок, до лечебных и диагностических процедур.

Цель

Определение рабочей концентрации моноклонального антитела 6B11 к рекомбинантному белку NS4 вируса гепатита С методом иммуноферментного анализа, при которой комплекс антиген-антитело является наиболее стабильным.

Описание

Вирус гепатита С (ВГС) является одной из наиболее актуальных проблем современности. Это заболевание имеет широкую распространённость: по данным ВОЗ, хронической инфекцией гепатита С страдают около 70 миллионов человек во всём мире, и примерно 399 000 человек ежегодно умирают от этого заболевания.

В связи с этим в мае 2016 года Всемирной ассамблеей здравоохранения разработана стратегия, перспективой которой является ликвидация вирусного гепатита на 90 % и сокращение случаев смерти из-за вирусного гепатита на 65 % к 2030 году.

Актуальность изучения этого заболевания обусловлена:

- высоким риском хронизации инфекции (в 55–85 % случаев острый гепатит С принимает хроническую форму);

- неблагоприятным исходом (у 20–30 % инфицированных лиц гепатит С приводит к циррозу печени или гепатоцеллюлярной карциноме);

- малодоступностью лечения и его высокой стоимостью;

- высокой способностью к изменчивости вируса, затруднённостью симптоматической диагностики (у 80 % людей на начальной стадии заражения не проявляется никаких симптомов, а дальнейшие проявления гепатита С совпадают с проявлениями других заболеваний).

Большую роль в развитии болезни играет вирусный белок NS4, который создаёт мембранную сеть с комплексом репликации РНК-вируса. Таким образом, изучение этого белка играет ключевую роль в лечении гепатита С. Активность белка в клетке можно проследить, пометив его антителом, но для этого необходимо подобрать такое антитело и такую его концентрацию, чтобы комплекс антиген-антитело был наиболее стабильным в среде организма человека.

В работе изучалась способность белка NS4 формировать комплекс антиген-антитело с моноклональным антителом 6В11, что необходимо для изучения механизма функционирования NS4 в культуре клеток гепатокарциномы человека с помощью моноклональных антител.

Задачи

1. Определить эффективность моноклонального антитела 6В11 и возможность его использования в дальнейших исследованиях вирусного белка NS4.

2. Подобрать наиболее эффективную концентрацию моноклонального антитела.

Содержимое виросомы представлено синтетическим фрагментом белков капсида вируса гепатита С.

Исследование и перспектива изучения помеченных МКА 6В11 белков NS4B вируса гепатита С может уточнить роль этого белка в вирусе, так как на данный момент известно лишь то, что он создаёт мембранную сеть, которая помогает репликации, однако более точный механизм пока не открыт.

Были выбраны два варианта разведения МКА – 8 мкг/мл (1:1000) и 10 мкг/мл.

Для работы наиболее подходящим оказался метод непрямого твёрдофазного ИФА, который основан на образовании комплекса антиген-антитело.

Ход работы

1 этап. Сорбция рекомбинантного белка.

Рекомбинантный белок rNS4 засорбировали в разведении 1:2000 по 50 мкл/лунку 96-луночного микропланшета с использованием PBS×1 (однократного соляного буфера).

Инкубация проводилась при +4 °C в течение ночи.

2 этап. Отмывка после сорбции.

Отмывка необходима для удаления несвязавшихся веществ. В каждую лунку многоканальным семплером вносили по 250 мкл PBSTw20 (соляного буфера с содержанием твина-20 в концентрации 0,1 %). Панель отмывали в течение 3 минут, затем содержимое лунок сбрасывали. Отмывку повторяли 4 раза.

3 этап. Титрование и внесение моноклонального антитела 6B11.

4 этап. Инкубация. Проводилась при температуре +37 °C в термостате в течение 1 часа. Планшет закрывался крышкой для предотвращения испарения и кантаминирования.

5 этап. Отмывка. Повторная отмывка для удаления первичных антител, не связавшихся с антигенами. Процесс отмывки производился так же, как на 2 этапе.

6 этап. Внесение конъюгата. В качестве конъюгата использовали вторичные козьи антитела, соединённые с пероксидазой хрена в разведении 1:500 по 50 мкл на лунку с использованием казеина. Инкубация проводилась при температуре +37 °C в термостате в течение 1 часа. Планшет закрывался крышкой.

7 этап. Инкубация в термостате при +37 °C.

8 этап. Отмывка не связавшихся вторичных антител производилась так же, как на 2-м и 5-м этапах.

9 этап. Внесение субстрата.

10 этап. Инкубация при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.

11 этап. Остановка реакции, внесение стоп-реагента по 50 мкл на лунку.

12 этап. Определение результатов на микропланшетном анализаторе.

Для определения рабочей концентрации МКА 6B11 были построены графики с помощью программы Microsoft Excel.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Рекомбинатный белок NS4

• Мышиные моноклональные антитела

• Конъюгат (козьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена)

• Казеин для разведения

• PBS×1 (однократный соляной буфер)

• PBSTw20 (соляной буфер с содержанием твина-20 в концентрации 0,1 %)

• Микропланшетный спектрофотометр (ИФА-ридер)

Результаты

1. Результаты по МКА 6В11 в разведении 8 мкг/мл являются более достоверными, поэтому для дальнейшей работы будет использована концентрация 7,51 мкг/мл моноклонального антитела.

2. В разведении 8 мкг/мл наиболее эффективная концентрация 6В11 меньше, чем в разведении 10 мкг/мл, поэтому использовать концентрацию 7,51 мкг/мл более целесообразно.

3. Доказана эффективность практического применения моноклональных антител на примере МКА 6В11, что обеспечивает возможность его дальнейшего использования в фундаментальных исследованиях, направленных на борьбу с вирусом гепатита С.

Перспективы использования результатов работы

Исследование механизма функционирования rNS4, помеченного моноклональными антителами, в культуре клеток гепатокарциномы человека.
Возможность дальнейшего использования моноклонального антитела МКА 6В11 в фундаментальных исследованиях, направленных на борьбу с вирусом гепатита С.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина.

Особое мнение

Коронавирус SARS-CoV-2 ранее 2019-nCoV, вирус, вызывающий коронавирусную инфекцию (COVID-19), в настоящее время распространяется по всему миру. Известно, что по меньшей мере шесть других типов коронавируса заражают людей, причем некоторые вызывают простуду, а две вызывают эпидемии: атипичная пневмония в 2002 году и MERS в 2012 году.

Покрыты шипами

Коронавирус назван в честь короноподобных шипов, выступающих из его поверхности. Вирус заключен в пузырек маслянистых липидных молекул, который распадается при контакте с мылом.

Вход в уязвимую клетку

Вирус попадает в организм через нос, рот или глаза, а затем прикрепляется к клеткам дыхательных путей, которые продуцируют белок, называемый ACE2. Считается, что вирус возник у летучих мышей, где он мог присоединиться к аналогичному белку.

Высвобождение вирусной РНК

Вирус заражает клетку, сливая ее масляную мембрану с мембраной клетки. Оказавшись внутри, коронавирус высвобождает фрагмент генетического материала под названием РНК.

Антибиотики убивают бактерии и не действуют против вирусов. Но исследователи тестируют антивирусные препараты, которые могут разрушить вирусные белки и остановить инфекцию.

Создание вирусных белков

По мере прогрессирования инфекции механизм клетки начинает производить новые спайки и другие белки, которые будут образовывать больше копий коронавируса.

Сборка новых копий

Новые копии вируса собираются и переносятся на внешние края клетки.

Распространение инфекции

Каждая зараженная клетка может выпустить миллионы копий вируса, прежде чем клетка окончательно разрушится и умрет. Вирусы могут инфицировать близлежащие клетки или попасть в капли, которые покидают легкие.

Иммунная реакция

Большинство инфекций Covid-19 вызывают лихорадку, поскольку иммунная система борется, чтобы очистить вирус. В тяжелых случаях иммунная система может чрезмерно реагировать и начать атаковать клетки легких. Легкие закупориваются жидкостью и отмирающими клетками, что затрудняет дыхание. Небольшой процент инфекций может привести к острому респираторному дистресс-синдрому и, возможно, смерти.

Покидая тело

Кашель и чихание могут привести к попаданию вирусных капель на находящихся поблизости людей и поверхности, где вирус может оставаться заразным от нескольких часов до нескольких дней. Зараженные люди могут избежать распространения вируса, надев маску, но здоровым людям не нужно носить маску, если они не заботятся о больном человеке.

Как быть с возможной вакциной

Будущая вакцина может помочь организму вырабатывать антитела, которые нацелены на вирус SARS-CoV-2 и предотвращают его заражение человеческими клетками. Вакцина против гриппа работает аналогичным образом, но антитела, полученные из вакцины против гриппа, не защищают от коронавируса.

Лучший способ избежать заражения коронавирусом и другими вирусами - мыть руки с мылом, избегать прикосновения к лицу, держаться подальше от больных людей и регулярно чистить часто используемые поверхности.

Финляндия построит забор на границе с Россией для защиты от кабанов