Антигены вируса папилломы человека

Изобретение относится к области медицины, в частности к вирусологии. Способ обеспечивает повышение точности выявления антигена вируса папилломы человека. Проводят взятие биопсийного материала со слизистой гортани, фиксацию его, заливку в парафин, обработку раствором Н₂О₂, промывку в буферном растворе, нанесение поликлональных антител, далее нанесение конъюгированных антител к вирусу папилломы человека и окрашивание гемотоксилином, при этом берут мазки со слизистой гортани "эпителиальной щеточкой", фиксируют их в ацетоне в течение 10-15 мин, затем обрабатывают 1% бычьим сывороточным альбумином, содержащим 0,5% ТРИТОН Х-100, в течение 20-25 мин, после чего наносят моноклональные антитела к вирусу папилломы человека, а антиген вируса папилломы человека выявляют в световом микроскопе по наличию светло- и темно-коричневых гранул в клетках слизистой оболочки. 1 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике респираторного папилломатоза, и может быть использовано для выявления и лечения данной патологии.

Респираторный папилломатоз - тяжелейшее заболевание в оториноларингологии, интерес к которому не только не снижается, но и постоянно растет. Значимость проблемы респираторного папилломатоза связана с тем, что, поражая гортань, папилломатозный рост приводит к сужению ее просвета, нарушению жизненно важных функций органа - дыхательной и голосообразования. Развивающаяся в связи с этим хроническая респираторная гипоксемия - стенотическая болезнь - имеет место в несформировавшемся растущем организме, являясь причиной нарушений физического, психомоторного и эмоционального развития ребенка, дисфункций различных органов и систем. Папилломы являются самой частой доброкачественной опухолью гортани у взрослых и почти единственной опухолью этого органа у детей. Будучи по гистоморфологическому строению доброкачественным образованием, у детей они чаще всего отличаются упорным рецидивированием, бурным ростом, приводящим к резкому сужению дыхательной трубки, вплоть до полного ее закрытия, угрожая тем самым жизни ребенка. В настоящее время в этиопатогенезе респираторного папилломатоза вирусная природа заболевания не вызывает сомнения и связывается с вирусом папилломы человека - ВПЧ (ДНК-содержащему из рода паповавирусов). Выявление экспрессии антигена вируса папилломы человека (ВПЧ) для идентификации ВПЧ в свежевыделенном клиническом материале, позволяет проследить связь между ВПЧ инфекцией и развитием папилломатоза гортани.

В связи с этим не вызывает сомнения необходимость выявления антигена вируса папилломы человека в слизистой оболочке гортани для подтверждения этиологии заболевания в каждом конкретном случае и осуществления контроля за эффективностью проводимого лечения.

Известным методом выявления ВПЧ является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), описанный [Маниатисом Т., Фрич Э., Сэмбруком Дж. Методы клеточной инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир - 1984]. Суть полимеразной цепной реакции заключается в возможности многократного копирования определенного участка ДНК с помощью ДНК-полимеразы, что дает возможность визуализировать продукты реакции в электрофорезе. Использование термостабильной ДНК-полимеразы, выделенной из Termus thermofilus, позволяет автоматизировать процедуру. Для выполнения ПЦР под наркозом при прямой ларингоскопии производят забор материала (во время оперативного вмешательства). Затем из этого материала выделяют определенный фрагмент ДНК и синтезируют фрагменты длиной 500 пар оснований при помощи праймеров определенного состава, которые отвечают за начало репликации вируса. Реакция состоит из 30 трехступенчатых циклов, протекающих при следующих условиях: 1-я ступень - 60'' при 94 o С, 2-я ступень - 60'' при 58 o С, 3-я ступень - 90'' при 72 o С. Реакцию проводят на амплификаторе в микроцентрифужных пробирках типа "Эппендорф" объемом 500 мкл, содержащих рабочий буфер. Продукты реакции визуализируют в электрофорезе в 6% полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием.

Однако данный метод является достаточно дорогостоящим и трудоемким, так как связан с необходимостью использования специальных реагентов и проведения множества циклов. Поскольку для данного метода необходимо наличие специальной дорогостоящей аппаратуры, то данный метод может быть использован только в крупных медицинских центрах. Способ не обладает достаточной точностью.

Наиболее близким к предлагаемому нами методу является способ определения антигена вируса папилломы человека иммунопероксидазным методом, описанным [Ernest E. Lack et al. - Intervirology 14: 148-154 (1980)]. Берут парафиновые срезы с биоптатов папиллом, производят депарафинизацию срезов, обрабатывают 0,5% раствором Н₂О₂ в течение 30 минут, затем промывают в буфере, обрабатывают 20% нормальной сывороткой в течение 30 минут, наносят кроличьи антитела к вирусу ВПЧ на 45-60 минут, промывают в буфере, далее наносят коньюгированную сыворотку на 60 минут, обрабатывают диаминобензидином в течение 5-8 минут и окрашивают гематоксилином, препараты смотрят при помощи световой микроскопии.

В данном способе имеются следующие недостатки: биоптаты возможно взять только в процессе оперативного вмешательства, обработка папиллом производится в достаточно агрессивной среде (депарафинизация в ксилоле), проведение всех этапов способа достаточно длительно во времени. Взятие биоптата, его фиксация, заливка в парафин, приготовление гистологических срезов занимает 6-10 часов и 3-4 часа уходит на проведение иммунопероксидазной реакции. Недостаточная точность, вследствие использования поликлональных антител не позволяет определять отдельные серотипы вируса, что имеет значение для прогноза течения заболевания. Также имеются особенности работы с парафиновыми срезами - высокая вероятность фонового окрашивания, что затушевывает истинные результаты.

Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении точности. Этот результат достигается тем, что при осуществлении непрямой иммунопероксидазной реакции согласно изобретению берут мазки со слизистой гортани "эпителиальной щеточкой", фиксируют в ацетоне в течение 10-15 минут, обрабатывают 1% бычьим сывороточным альбумином, содержащим 0,5% ТРИТОН Х-100 в течение 20-25 минут, наносят моноклональные антитела к вирусу папилломы, выявление проводят в световом микроскопе по наличию светло- и темно-коричневых гранул в клетках слизистой оболочки.

Забор материала "эпителиальной щеточкой" со слизистой гортани при непрямой ларингоскопии является неинвазивным и позволяет многократно в течение лечения контролировать наличие ВПЧ в очаге поражения.

Фиксация в ацетоне позволяет сохранить структуры и устранить фоновое окрашивание при пероксидазой реакции. Обработка в 1% БСА, содержащим 0,5% Тритон Х - 100 позволяет адсорбировать загрязняющие антитела и антигены, находящиеся в тканях, а также способствует повышению проницаемости клеточных мембран, что обеспечивает лучшие условия взаимодействия моноклональных антител с антигеном ВПЧ, что еще больше повышает точность.

Использование моноклональных антител позволяет выявлять как общий антиген ВПЧ, так и отдельные серотипы (6, 11, 18), что обеспечивает высокую точность диагностики.

Сущность способа заключается в следующем: мазок берут с помощью специально приспособленной "эпителиальной щеточки" со слизистой оболочки гортани, затем фиксация в ацетоне 10-15 минут, обработка в фосфатно-солевом буфере 10 минут, далее обработка 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА), содержащим 0,5% ТРИТОН Х-100 в течение 20-25 минут, нанесение моноклональных антител к ВПЧ в течение 45 минут при 37 o С, трехкратная промывка в буфере, по три минуты в каждом, затем нанесение вторых антител, связанных с пероксидазой, в течение 40 минут, промывка в буфере, обработка раствором, содержащим 0,05% диаминобензидин и 0,03% Н₂О₂ в течение 1-2 минут, двукратная промывка в дистилированной воде, докраска метиленовой синькой, микроскопия.

Выявление проводят в световом микроскопе по наличию темно- и светло-коричневых гранул в клетках слизистой оболочки.

Для получения достоверных результатов и исключения возможности неспецифических реакций обязательным условием является проведение контролей на качество реактивов и специфичность антисыворотки.

1. Для проведения контроля специфичности антисыворотки в качестве первого слоя наносят неиммунную сыворотку или буфер (результаты должны быть отрицательными).

2. Неспецифичность сыворотки устраняют посредством максимального разведения высококонцентрированной сыворотки и укорочения времени инкубации.

Описанный способ подкреплен примерами конкретного выполнения. Было произведено исследование мазков 20 детей с рецидивирующим папилломатозом гортани. В случаях резко положительной экспрессии антигена вируса папилломы человека клинически наблюдалось частое рецидивирование и распространенность процесса (14 случаев), а при отрицательном ответе (6 человек) - увеличение межрецидивного промежутка и переход в устойчивую ремиссию (Таблица).

Больная Р. О., 15 лет, истории болезни 16273 от 23.11.1999 года с диагнозом распространенный рецидивирующий папилломатоз глотки, гортани, трахеи. Из анамнеза: больна с двухлетнего возраста, рецидивы заболевания в среднем 1 раз в 4 - 6 месяцев, в последнее время 1 раз в год. Трахеостома наложена в 6 лет. При поступлении состояние средней тяжести, дыхание через естественные дыхательные пути резко затруднено. При непрямой ларингоскопии папилломы единичные в области передней комиссуры, в трахее - на уровне края трахеотомической трубки. При непрямой ларингоскопии щеточкой взят мазок из гортани. Материал нанесен на предметное стекло, высушен и зафиксирован в ацетоне в течение 10-15 минут. Затем обработан в фосфатно-солевом буфере 10 минут, далее обработан 1% бычьим сывороточным альбумином, содержащим 0,5% ТРИТОН Х-100 в течение 20-25 минут, после этого были нанесены моноклональные антитела на 45 минут при 37 o С, троекратно промыт в буфере по три минуты в каждом, затем были нанесены вторые антитела, связанные с пероксидазой на 40 минут, промыты в буфере, обработаны раствором, содержащим 0,05% диаминобензидин и 0,03% H₂O₂ в течение 1-2 минут, затем двукратно промыт в дистилированной воде, докрашен метиленовой синькой и после этого выполнена микроскопия в световом микроскопе. При этом в мазках со слизистой гортани с помощью предлагаемого способа была выявлена четкая экспрессия антигена ВПЧ (фото 1). В настоящее время наблюдаются рецидивы в среднем один раз в год.

В результате проведенных нами исследований можно сделать следующие выводы: 1. Предложенный способ обладает высокой точностью, так как в отличие от прототипа позволяет определять отдельные серотипы вируса, отсутствует фоновое окрашивание и исключается возможность ложноотрицательных и ложноположительных результатов.

2. Обеспечивается быстрое выявление антигена (2,5-3 часа), в то время как в прототипе требуется 9-14 часов.

Таким образом, исследование 20 случаев (см. таблицу) в течение полутора лет показало хорошую воспроизводимость предлагаемого способа, что свидетельствует о его достаточной надежности. Высокая чувствительность и специфичность данного способа подтверждалась результатами ПЦР исследований и данными клинических наблюдений.

Метод достаточно прост, возможно его широкое применение в практическом здравоохранении для быстрого определения экспрессии антигена ВПЧ и соответственно оценки тяжести течения заболевания и своевременного назначения противорецидивной терапии.

Способ выявления антигена вируса папилломы человека, включающий взятие биопсийного материала со слизистой гортани, фиксацию его, заливку в парафин, обработку раствором Н₂О₂, промывку в буферном растворе, нанесение поликлональных антител, далее нанесение конъюгированных антител к вирусу папилломы человека и окрашивание гемотоксилином, отличающийся тем, что берут мазки со слизистой гортани “эпителиальной щеточкой”, фиксируют их в ацетоне в течение 10-15 мин, затем обрабатывают 1% бычьим сывороточным альбумином, содержащим 0,5% ТРИТОН Х-100, в течение 20-25 мин, после чего наносят моноклональные антитела к вирусу папилломы человека, а антиген вируса папилломы человека выявляют в световом микроскопе по наличию светло- и темно-коричневых гранул в клетках слизистой оболочки.

Общий тест на качественное выявление вирусов папилломы человека следующих типов: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66 методом полимеразной цепной реакции.
Папилломавирус человека (HPV — Human Papillomavirus) — вирус из рода папилломавирусов, семейства паповавирусов. Передаётся только от человека к человеку и приводит к изменению характера роста тканей. В настоящее время известно уже более 100 типов (штаммов) папилломавируса, обнаруженных у человека. Большинство представителей обладает онкогенными свойствами и вызывает доброкачественные или злокачественные опухоли (папилломы). Доказана этиологическая роль папилломавируса в развитии рака шейки матки. Папилломавирусы имеют видоспецифические и некоторые типоспецифические антигены. Не культивируются в клеточных системах.

Вирус папилломы человека (ВПЧ) может быть причиной возникновения рака гениталий у женщин и плоскоклеточного рака у мужчин и женщин. Доказано, что этот вирус является причиной возникновения остроконечных кондилом, кондилом и новообразований шейки матки. Различные виды ВПЧ являются причиной различных поражений. Некоторые из них являются факторами высокого онкогенного риска.

Папилломавирусы являются антропонозными возбудителями, т. е. передача их возможна только от человека к человеку.

• Есть вероятность сохранения вирусов в отшелушивающих клетках кожи определённое время — поэтому для некоторых заболеваний, вызываемых вирусом, вероятен контактно-бытовой путь заражения (бородавки) при условии микроповреждений кожи.
• Основным путём заражения аногенитальными бородавками (остроконечными кондилломами) является половой путь заражения (включая орально — генитальные контакты и анальный секс).
• Возможно заражение папилломавирусом новорожденных при родах, что является причиной возникновения ларингеального папилломатоза у детей и аногенитальных бородавок у младенцев.

Попав в организм, вирусы папиллом инфицируют базальный слой эпителия, причём наиболее поражённым участком является зона перехода многослойного плоского эпителия в цилиндрический эпителий. В зараженной клетке вирус существует в двух формах — эписомальной (вне хромосом клетки), которая считается доброкачественной формой, и интросомальной — интегрированной (встраиваясь в геном клетки) — которую определяют как злокачественную форму паразитирования вируса.

Инкубационный период длительный: от половины месяца до нескольких лет, для папилломавирусной инфекции характерно скрытое (латентное) течение. Человек может одновременно заражаться несколькими типами папилломавирусов. Под влиянием различных факторов происходит активация вируса, его усиленное размножение, болезнь переходит в стадию клинических проявлений. В большинстве случаев (до 90%) в течение 6 - 12 месяцев происходит самоизлечение, в других случаях отмечается длительное хроническое рецидивирующее течение с возможной малигнизацией (озлокачествлением) процесса (в зависимости от типа вируса).

Условно все известные папилломавирусы можно разбить на три основные группы:

• неонкогенные папилломавирусы (HPV 1, 2, 3, 5);
• онкогенные папилломавирусы низкого онкогенного риска (в основном HPV 6, 11, 42, 43, 44);
• онкогенные папилломавирусы высокого онкогенного риска (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 68).

Аналитические показатели:для выявления ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) в соскобе эпителиальных клеток методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Определяемый фрагмент - уникальная последовательность ДНК (L-1 область вирусного генома). Специфичность определения - 100%. Чувствительность определения не менее 50 вирусных частиц в 5 мкл прошедшей обработку (выделение ДНК) пробе. Эффективность обнаружения ДНК ВПЧ методом ПЦР 98%.
Подготовка:
За 24 часа до процедуры необходимо воздержаться от применения всех видов (свечи, мази, спринцевания) местных лекарственных форм (бактерицидные и бактериостатические средства, контрацептивы и т. п.) и средств интимной гигиены, содержащих бактерицидные добавки.
Соскоб из уретры; перед взятием пациенту рекомендуют не мочиться в течение 1,5 - 2 часа. Перед взятием материала из цервикального канала необходимо удалить слизь ватным тампоном.

Показания:

• Проявления трансформирующей дисплазии в различной степени.
• Ослабление иммунитета.
• Профилактические скрининговые исследования.
• Наличие характерных изменений кожи и/или слизистых оболочек.

Референсные значения: отрицательно (не обнаружено).

Вирусы папилломы человека (ВПЧ) – широко распространенная и гетерогенная группа вирусов. В настоящее время идентифицировано 120 генотипов ВПЧ, 40 из которых ассоциированы с аногенитальным трактом человека.

Вирус папилломы относится к семейству паповирусов (Papoviridae). Филогенетически ВПЧ разделяют на роды (a, b, g), роды на виды, которые обозначаются цифрами (1, 2 и т. д.), а каждый вид, в свою очередь, содержит несколько типов вируса. Генитальные серотипы ВПЧ отнесены к роду a, видам a5, a6, a7, a8, a9, a11 (45 серотипов). По степени канцерогенного потенциала ВПЧ подразделяются на генотипы высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 и др.) и генотипы низкого риска (6, 11, 42, 43, 44 и др.).

Вирусы передаются при тесном контакте с пораженными участками кожи и слизистых оболочек. Основной путь передачи ВПЧ аногенитальной группы – половой. Это было неоднократно показано в эпидемиологических исследованиях по выявлению ВПЧ среди девственниц.

Методы выявления вирусов папилломы человека

Наиболее широко используемые методы выявления инфекционных агентов, в т. ч. вирусных, можно разделить на две группы – косвенные и прямые.

К косвенным относятся методы, позволяющие оценить эффект, который оказывает вирус на организм (клетки, ткани), – серологические, цитологические и гистологические методы. Серологические методы, направленные на выявление антител различных классов к антигенами вируса, в силу особенностей течения ВПЧ-инфекции и разнообразия вирусов, для рутинной диагностики не используются. Цитологические и гистологические методы, направленные на выявление клеток, измененных воздействием активного вируса (койлоциты) или трансформированных вирусом (раковые клетки), используются для установления степени изменения клеток, но не способны достоверно показать наличие или отсутствие вируса у обследуемого.

Прямые методы направлены на выявление самого вируса или его компонентов – белков, ДНК, РНК. Поскольку ВПЧ не может быть изолирован в культуре чувствительных клеток, основной подход, который широко применяют в настоящее время для обнаружения и изучения вируса, – выявление его нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) методами гибридизации, амплификации, секвенирования.

Выявление ВПЧ подгруппы низкого канцерогенного риска

Низкая степень опасности вируса для его носителей, невысокий процент клинических проявлений инфекции (не более 10% остроконечных кондилом в группе инфицированных вирусом), высокая доля спонтанной элиминации вируса в течение года, отсутствие специфической противовирусной терапии ставят под сомнение необходимость использования скринингового обследования для выявления ВПЧ у этой подгруппы лиц. Основным диагностическим признаком папилломавирусной инфекции низкого риска является выявление остроконечных кондилом при осмотре. Прямые методы лабораторной диагностики (обнаружение ДНК) могут служить вспомогательным инструментом для дифференциальной диагностики, например, от сифилитических перианальных кондилом или от злокачественной опухоли. В этом случае также значение имеет проведение биопсии и гистологического исследования. В случае использования молекулярно-биологических методов достаточно выявлять 6-й и 11-й генотипы ВПЧ, т. к. они ответственны более чем за 95% случаев остроконечных кондилом. Дополнительное выявление других типов (42–44) незначительно повысит чувствительность выявления, но удорожит исследования. Следует заметить, что для этой задачи необходимо брать соскоб эпителия именно с места поражения, иначе велик шанс “пропустить” вирус.

Выявление ВПЧ подгруппы высокого канцерогенного риска

Основная опасность, которую несет инфицирование вирусами данной подруппы, является риск развития рака шейки матки (РШМ). Этиологическая роль ВПЧ в развитии РШМ на сегодняшний день не вызывает сомнений. Эпидемиологические и вирусологические исследования показали, что ВПЧ является причиной РШМ в 100% случаев, рака заднего прохода – в 90%, рака вульвы и влагалища – в 40%, и только в 12% случаев – орофарингеального рака.

РШМ является значимой проблемой для здравоохранения России. В нашей стране ежегодно регистрируют около 12 тыс. новых случаев, а примерно 6 тыс. заболевших умирает. Заболеваемость составляет в среднем по стране 12 случаев на 100 тыс. женщин, что соответствует 5-му ранговому месту в структуре онкологических заболеваний у женщин. При этом прирост заболеваемости в возрастной группе до 29 лет за 10 лет составил более 150%.

Поскольку основной причиной РШМ является ВПЧ, первичная профилактика должна быть направлена на снижение распространения инфекции в популяции. Эффективный метод первичной профилактики – вакцинация. Вторичная профилактика предполагает раннее выявление и лечение лиц, имеющих предраковые изменения. Несмотря на успехи в разработке и внедрении вакцин против наиболее часто встречающихся канцерогенных типов ВПЧ, на сегодняшний день наиболее важным методом профилактики РШМ является скрининговое обследование женского населения на наличие маркера предраковой стадии папилломавирусной инфекции – цервикальной интраэпителиальной неоплазии (ЦИН, SIL). Хорошо известно, что в большинстве экономически развитых стран Европы и Северной Америки внедрение программ скрининга позволило значительно снизить заболеваемость РШМ. Однако в развивающихся странах, на долю которых приходится наибольшее количество случаев заболевания в мире, традиционные программы скрининга оказались неэффективными.

Следует отметить, что основное требование, которому должны отвечать программы скрининга, – высокая эффективность и низкая стоимость. Эффективность выявления женщин группы риска развития РШМ зависит от нескольких параметров: охват женского населения, чувствительность используемого метода и периодичность проведения исследований. При использовании цитологического метода скринингово исследования женщин с возраста 25–30 лет, с 3–5-летним интервалом и не менее чем 75%-ном охвате женского населения удается достичь снижения заболеваемости РШМ на 70–80%, при условии достаточно высокой чувствительности цитологического метода. Однако основным недостатком этого метода как раз является его низкая чувствительность, варьирующая в пределах 40–70%, составляя в среднем 50%. Причины такой низкой чувствительности метода обсуждаются. По одним данным, в 70– 90% случаев причиной ложноотрицательных цитологических ответов является некачественный забор материала для исследования и в 10–30% – ошибочная интерпретация цитологических данных. По другим данным, наоборот, отмечается низкая сопоставимость между лабораториями при тестировании одних и тех же препаратов – от 11 до 80%. Кроме того, высока доля сомнительных результатов (до 15% атипичных плоских клеток неясного значения – ASCUS), требующих повторных и подтверждающих исследований. Таким образом, предсказательная ценность отрицательного результата оказывается низкой, что требует более частого проведения исследований и приводит к удорожанию программы скрининга. В связи с этим в последние годы в скрининге все больше стали использоваться тесты, позволяющие выявлять ДНК ВПЧ (ВПЧ-тесты).

Многочисленные международные исследования продемонстрировали более высокую чувствительность ВПЧ-тестов в выявлении ЦИН в сравнении с цитологическими. Доказано, что получение отрицательного результата ВПЧ- теста позволяет значительно увеличить интервал между повторными тестированиями. На основании данных крупных международных исследований, ведущими специалистами международных организаций (ASCCP, EUROGIN, ESIDOG и др.) предложены алгоритмы диагностики с использованием ВПЧ- тестирования, сформулированы рекомендации по применению ВПЧ-теста в программах скрининга:

• на первом этапе скрининга у женщин старше 30 лет в дополнение к цитологическому исследованию;
• для разрешения сомнительных результатов цитологического исследования (ASCUS)на первом этапе скрининга для стран, где плохо организованы программы цервикального цитологического скрининга;
• для мониторинга терапии цервикальных поражений высокой степени (ЦИН 2/3, рак in situ, инвазивный рак).

Рис. 1. Алгоритм использования ВПЧ-теста на первом этапе скрининга

Во многих странах совместное применение ВПЧ-теста и цитологического ПАП-теста (рис. 1) позволило увеличить чувствительность выявления ЦИН до 99–100%, удлинить интервалы исследований до 5–7 лет, что, несмотря на использование дополнительного метода исследования, в конечном итоге привело к снижению затрат на программу скрининга. Разработан принципиально новый способ забора клеток цервикального эпителия в транспортно-фиксирующую среду для одновременного проведения цитологического исследования (жидкостная цитология) и ВПЧ-теста. Такой подход позволил, с одной стороны, повысить эффективность цитологического метода, а с другой – разрешать сомнительные результаты цитологического анализа без повторного забора клинического образца (рис. 2).

Рис. 2. Алгоритм использования ВПЧ-теста при сомнительных результатах цитологического исследования (ASCUS)

Диагностическая чувствительность рекомендованного для скрининга ВПЧ- теста, в среднем составляющая 88–100%, значительно превышает чувствительность цитологического исследования, а диагностическая специфичность скринингового ВПЧ-теста при использовании его в возрастной группе женщин старше 30 лет лишь немного уступает специфичности цитологического метода (78–99%). Прогностическая значимость отрицательного результата выявления ДНК ВПЧ приближается к 100%. Это является основанием для использования ВПЧ-теста на первом этапе скрининга. Алгоритмы применения ВПЧ-теста, как самостоятельного исследования на первом этапе скрининга были предложены еще в 2003 г. (рис. 3), но широкое применение в программах скрининга они нашли позднее.

Рис. 3. Алгоритм использования ВПЧ-теста как самостоятельного исследования на первом этапе скрининга

Главное условие эффективного цервикального скрининга – оптимальный баланс между диагностической чувствительностью и специфичностью в выявлении предраковых поражений шейки матки (ЦИН 2/3) и рака. На основании многолетнего мирового опыта применения молекулярно-биологических методов для выявления ДНК ВПЧ в скрининговых программах к настоящему времени сформулированы четкие требования к ВПЧ-тестам, которые могут быть использованы в скрининге.

Требования к аналитическим характеристикам теста

Во-первых, ВПЧ-тест должен выявлять только типы вируса, которые относятся к группе высокого канцерогенного риска, т. к. выявление всех типов вируса, включая группу низкого онкогенного риска, которые не вызывают трансформации эпителиальных клеток, будет приводить к значительному снижению специфичности теста. В то же время, ВПЧ-тест должен выявлять широкий спектр типов вируса высокого канцерогенного риска – не менее 10–13 (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 типы), т. к. это обеспечивает не менее чем 90% чувствительность теста. Выявление ВПЧ только 16-го и 18-го типов будет приводить к значительному снижению чувствительности скрининга, поскольку эти два типа ответственны не более чем за 70% случаев предраковых поражений (ЦИН 2/3).

Во-вторых, ВПЧ-тест должен обладать высокой диагностической чувствительностью и специфичностью выявления ЦИН 2/3. Это обеспечивается способностью теста выявлять только клинически значимую концентрацию вируса или дифференцировать клинически значимую концентрацию и клинически незначимую. Исследования голландских ученых показали, что критическое значение вирусной нагрузки, при которой может развиться дисплазия тяжелой степени, находится в интервале 104–105 копий ДНК ВПЧ в 1 мл клинического образца (в соскобе клеток цервикального канала, взятом в 1 мл транспортной среды). Стандартные общепринятые ВПЧ-тесты, используемые для скрининга, откалиброваны на выявление клинически значимой концентрации ВПЧ.

Клиническая валидация теста

Новый ВПЧ-тест должен быть валидирован в клинических испытаниях относительно стандартного ВПЧ-теста, уже прошедшего клиническую валидацию. Таким тестом на сегодняшний день считается Hybrid Capture 2 High Risk HPV DNA Test, разработанный компанией Digene (США). Этот тест был одобрен FDA в 2003 г., а затем, после проведения широких испытаний в разных странах мира, рекомендован для скрининга. В основе теста лежит методика гибридизации ДНК ВПЧ со специфическими РНК-пробами в растворе с последующим захватом ДНК-РНК гибридов с помощью моноклональных антител.

Новый ВПЧ-тест должен быть валидирован в клинических испытаниях на гистологически верифицированных образцах. Диагностическая чувствительность ВПЧ-теста определяется как способность выявлять образцы с дисплазией тяжелой степени (ЦИН 2/3), а диагностическая специфичность – как способность не выявлять образцы с гистологической нормой.

ВПЧ-тесты в России

Тесты для выявления и генотипирования ВПЧ, основанные на методах гибридизации и/или методах амплификации нуклеиновых кислот, к которым относится полимеразная цепная реакция (ПЦР), начали применять еще более 10 лет назад. В настоящее время в литературе описано достаточно большое число методов выявления и генотипирования ВПЧ. Однако очевидно, что в программах скрининга могут быть использованы только стандартизованные тесты, удовлетворяющие заданным требованиям по чувствительности и специфичности и прошедшие клиническую апробацию. Общепринятый международный стандарт Hybrid Capture 2 High Risk HPV test в настоящее время разрешен для применения в России. Но высокая стоимость теста ограничивает возможность использовать его в российских программах скрининга. Тем не менее, поскольку этот тест удовлетворяет практически всем требованиям ВПЧ-теста, он в обязательном порядке должен использоваться для валидации вновь разработанных отечественных ВПЧ-тестов.

Российскими производителями в настоящее время разработано и выпуска- ется большое количество тестов для выявления ВПЧ как низкого, так и высокого канцерогенного риска. Но, несмотря на то, что многие выпускаемые тесты зарегистрированы и разрешены к применению, большинство из них не удовлетворяют требованиям, предъявляемым к ВПЧ-тестам для скрининга. Спектр выявляемых генотипов вируса, аналитическая чувствительность и специфичность отечественных ВПЧ-тестов сильно варьируют в широком диапазоне. И, несмотря на повсеместное применение российских ПЦР-тестов, используемых для диагностики ВПЧ-инфекции, нельзя признать, что все они стандартизованы и прошли должную клиническую апробацию.

Учитывая, что международный стандартный ВПЧ-тест недоступен многим российским производителям тест-систем для валидации собственных разработок, назрела необходимость создания стандартной панели контрольных образцов как для оценки качества работы самих тестов, так и лабораторий, использующих эти тесты. Согласно международному опыту создания панелей контрольных образцов, необходимо, чтобы разработанные панели удовлетворяли условиям работы всех тест-систем, представленных на рынке, и были валидированы с помощью стандартного международного теста (www.QCMD.org). Поскольку ВПЧ невозможно вырастить в культуре клеток, контрольная панель может состоять из рекомбинантных ДНК, содержащих полные геномы различных типов ВПЧ. Необходимость использования полноразмерных ДНК ВПЧ продиктована тем, что в разных тест-системах используются разные гены вируса в качестве мишени для амплификации. Таким образом, контрольные панели количественно охарактеризованных образцов могут служить для контроля выпускаемых серий тест-систем, а также для проведения контроля качества лабораторных исследований.

Особенности преаналитического этапа

Важным условием эффективного применения ВПЧ-тестов является стандартизация всех этапов исследования, прежде всего – процедуры получения клинического материала и сбора данных. Необходимо четко представлять, кому, как и зачем проводить исследование. Согласно международным рекомендациям по ВПЧ-тестированию, исследование по выявлению ВПЧ высокого канцерогенного риска проводят только у женщин. Материалом для исследования служит соскоб цервикального канала и/или зоны трансформации, выполненный цервикальной цитологической щеточкой. При взятии материала щетку обламывают и сохраняют рабочую часть щетки в транспортной среде до доставки в лабораторию.

ВПЧ-тесты, разработанные на основе ПЦР, позволяют контролировать адекватность клинического образца по наличию в нем ДНК человека.ВПЧ-тестирование мужчин с целью скрининга или выявления носи- тельства не рекомендуется. Инфицированность мужчин ВПЧ сходна с инфицированностью женщин, но при этом рак полового члена – крайне редкое заболевание. Поэтому мужчины являются бессимптомными носителями инфекции. С учетом того, что опасность развития ассоциированной с ВПЧ онкологической патологии у мужчин невелика, а существующие формы рака не имеют 100% ассоциации с ВПЧ, проводить скрининговое выявление папилломавирусной инфекции у мужчин не следует. Исследование возможно лишь по эпидемиологическим показаниям и при проведении дифференциальной диагностики клинической формы папилломавирусной инфекции с другими патологиями.

В заключение следует отметить, что в нашей стране на сегодняшний день созданы все условия для стандартизации и масштабного использования ВПЧ- тестов в лабораторной службе, т. к. доступны тест-системы, удовлетворяющие международным требованиям, создана сеть лабораторий для работы с этими тест-системами, налажена система обучения специалистов и разработаны панели для контроля качества работы лабораторий.