Андийский вирус крапчатости картофеля

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Рязанцев Д.Ю., Дробязина П.Е., Завриев С.К.

PCR-based diagnostics of the Andean potato viruses

ПЦР-диагностика андийских вирусов картофеля

П.Е. ДРОБЯЗИНА, С.К. ЗАВРИЕВ

Андийский (Южноамериканский) регион является центром происхождения как картофеля, так и его болезней. Здесь наблюдается наибольшее разнообразие патогенов картофеля, среди которых выделяют четыре вируса, внесенных в Перечень карантинных объектов РФ (Список отсутствующих на ее территории ). В их числе - андийский латентный вирус картофеля (АЛВК) и андийский вирус крапчатости картофеля (АВКК).

На дикорастущих видах картофеля, пораженных АЛВК, отмечают довольно четкие симптомы как при первичной,так и вторичной инфекциях, тогда как на культурном картофеле при первичной инфекции заболевание чаще протекает бессимптомно, иногда может наблюдаться мозаичность или сетчатое по-светление жилок, а при вторичной инфекции развивается мозаика, нередко с некротической крапчатостью, скручиванием и некрозом верхушки листьев. АЛВК переносится неперсистентным способом блошками из рода Epitrix, контактным путем от зараженных клубней, а также настоящими семенами [4].

Андийская крапчатость картофеля при первичной инфекции проявляется в виде слабой мозаичной окраски листьев, а при вторичной - в их ярко выраженной крапчатости. Иногда наблюдается деформация листьев, некротические поражения участков тканей, общее угнетение растения. Восприимчивые сорта могут реагировать первоначальным системным верху-

шечным некрозом, деформацией листьев и задержкой роста [2]. Вирус переносится насекомыми из родов 01аЬгоИаа и ЕрйгЫ, а также при контакте с зараженными клубнями и растениями.

В случае обоих вирусов симптомы инфекции в большей степени проявляются в прохладную погоду.

География ввоза в Россию семенного и продовольственного картофеля ежегодно расширяется. Картофель из зон распространения андийских вирусов (Гондурас, Чили, Никарагуа, Боливия, Колумбия, Эквадор, Перу и Бразилия)ввозится и как важный источник генов хозяйственно ценных признаков (содержание микроэлементов и важнейших антиоксидантов, например, витамина С, полифенолов, каротино-идов). Интенсивный международный обмен селекционным материалом и гермоплазмой в виде клубней, корневых черенков создает

риск заноса андийских вирусов. Опасность для нашей страны представляет не только зараженный андийскими вирусами семенной, но и продовольственный картофель, который может попасть с прилавков рынков и магазинов в качестве посадочного материала на приусадебные участки. Поэтому все клубни, предназначенные для посадки или прямого потребления, должны проходить досмотр и лабораторную экспертизу на наличие карантинных объектов, в том числе андийских вирусов.

Для реализации карантинных мер защиты от проникновения на территорию России АЛВК и АВКК необходимы быстрые, высокотехнологичные методы лабораторной экспресс-диагностики подкарантинной продукции.

Применявшиеся ранее методы диагностики этих вирусов имеют ряд ограничений. Метод растений-индикаторов [1] требует высокой квалификации персонала и значительных затрат времени, серологические методы детекции [3, 5] - дорогостоящих высококачественных антител, к тому же чувствительность обоих методов невысокая и ни один из них не может обеспечить контроль за постоянно растущими объемами ввозимой продукции. Альтернативой могут стать молекулярные методы детекции АЛВК и АВКК, например, на основе метода полимераз-ной цепной реакции (ПЦР). Они позволяют быстро, с высокой чувствительностью и специфичностью определять наличие анализируемого вируса даже при его низком содержании в образцах и при латентной инфекции.

ПЦР основана на способности фермента ДНК-полиме-разы проводить удвоение молекулы ДНК, начиная с двухцепочечного участка (затравки). В процессе ПЦР на первом этапе при температуре 94 °С происходит раз-

деление двойной спирали ДНК (денатурация), затем температуру понижают до 55-70 °С, при которой с одноцепочечной ДНК могут взаимодействовать специальные оли-гонуклеотиды - праймеры (так называемый отжиг праймеров), которые и обеспечивают затравку для ДНК-полимеразы. Правильность подбора праймеров определяет специфичность и чувствительность ПЦР. За этапами денатурации и отжига идет этап собственно полимеризации ДНК (при 60-72 °С). Эти три этапа (денатурация, отжиг и полимеризация) повторяются 2550 раз (циклов) путем последовательного выдерживания определенных температур в термоцикле-ре. За каждый цикл количество фрагмента ДНК, ограниченного праймерами, удваивается, и после прохождения ПЦР его можно обна-

увеличению уровня флуоресценции в пробирке.

Схема анализа образцов растительного материала на наличие АЛВК

Представляем уникальный комплекс тест-систем на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики и идентификации широкого спектра инфекционных заболеваний сельскохозяйственных культур компании АгроДиагностика. Для проведения анализа отработаны системы выделения нуклеиновых кислот из растительного материала и подготовки проб для ПЦР. Наборы производятся в трех форматах — в электрофоретическом, на основе технологии FLASH (FLuorescent Amplificationbased Specific Hybridization — специфическая флуоресцентная гибридизация в процессе амплификации) и в формате Real-Time PCR (Rt) (ПЦР в реальном времени). Комплекты реагентов в электрофоретическом формате позволяют проводить анализ полученных результатов после проведения электрофореза.

Поставляем полный перечень оборудования и реагнтов для ПЦР лабораторий.

Разработанные системы позволяют быстро, достоверно и с высокой чувствительностью выявлять наличие патогенов. Все комплекты реагентов прошли испытания в научно-исследовательских учреждениях и на специализированных предприятиях, как в России, так и за рубежом.

Для подбора наборов напишите запрос нашим менеджерам info@ld.ru

Наименование

Форматы

Форез

FLASH

Комплекты реагентов для диагностики болезней картофеля

Кольцевая гниль картофеля (Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus)

Бурая бактериальная гниль (Ralstonia solanacearum)

Вирус скручивания листьев картофеля (Potato Leafroll Virus)

M вирус картофеля (Potato Virus M)

S вирус картофеля (Potato Virus S)

Х вирус картофеля (Potato Virus X)

Вироид веретеновидности клубней картофеля (Potato Spindle Tuber Viroid)

Y вирус картофеля (Potato Virus Y)

A вирус картофеля (Potato Virus A)

Вирус метельчатости клубней картофеля (Potato Mop Top virus)

Андийский вирус крапчатости картофеля (Andean potato mottle virus)

Андийский латентный вирус картофеля (Andean potato latent virus)

Бледная картофельная цистообразующая нематода (Globodera pallida)

Золотистая картофельная цистообразующая нематода (Globodera rostochiensis)

Рак картофеля (Synchytrium endobioticum)

Вирус черной кольцевой пятнистости картофеля (Potato black ringspot virus)

T вирус картофеля (Potato virus T)

Вирус пожелтения картофеля (Potato yellowing virus)

Комплект реагентов для амплификации кДНК гена актина картофеля

Комплекты реагентов для диагностики болезней сахарной свеклы

Ризомания сахарной свеклы (вирус некротического пожелтения жилок сахарной свеклы, beet necrotic yellow vein virus)

Гниль сахарной свёклы (Pseudomonas syringae)

Комплекты реагентов для диагностики болезней огурцов и томатов, выращиваемых в закрытом грунте

Черная бактериальная пятнистость томатов (Xanthomonas euvesicatoria, ранее Xanthomonas campestris pv. vesicatoria тип А)

Некроз сердцевины стебля томата (Pseudomonas corrugata)

Угловатая пятнистость листьев(Pseudomonas syringae pv. Lacrimans, ранее Pseudomonas lacrimans)

Бактериальный рак томатов (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)

Водянистая гниль плодов (Pectobacterium carotovorum subsp. сarotovorum, син. Erwinia carotovora subsp. carotovora)

Аскохитоз огурца (Ascochyta cucumis; Phoma cucurbitacearum; Didymella bryoniae)

Аскохитоз томата (Ascochyta lycopersici, син. Didymella lycopersici)

* - данные наборы производятся только по предварительному заказу

Изобретение относится к области биохимии и касается применения концентрата культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № ВКПМ F-180, в качестве ингибитора Андийского вируса крапчатости картофеля. Изобретение позволяет снизить потери картофеля от заражения растений Андийским вирусом крапчатости. 2 пр.

Изобретение относится к биохимии и может найти применение в агробиотехнологии, микробиологии и растениеводстве.

В связи с ввозом в Россию большого количества импортного материала картофеля, существует опасность заражения здоровых растений картофеля Андийским вирусом крапчатости картофеля. Также большой риск распространения зараженного картофеля связан с увеличением международного обмена семенным и генетическим материалом как в форме клубней, так и в культуре in vitro и истинных семенах (3, 4).

Андийский вирус крапчатости картофеля (Andean potato mottle virus) широко распространен в высокогорье Анд в Чили, Эквадоре и Перу, а также в Бразилии. Он поражает главным образом картофель, однако может встречаться на баклажанах и некоторых других пасленовых культурах (3, 5).

Описание ингибиторов Андийского вируса крапчатости картофеля (Andean potato mottle virus) не обнаружено.

Техническим результатом изобретения является снижение потерь от заражения растений картофеля Андийским вирусом крапчатости картофеля.

Технический результат достигается тем, что предлагается применение концентрата культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № F-180, в качестве ингибитора Андийского вируса крапчатости картофеля.

Штамм является известным (6), депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № ВКПМ F-180 (Москва, Дорожный 1-й проезд, д.1. Институт генетики и селекции, 1987 г.).

Условия культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai.

Ферментация штамма производилась на оборудовании Опытной технологической установки ИБФМ РАН им. Г.К.Скрябина (г.Пущино).

Использовали ферментёр типа БИОР-01 производства ОКБ ТБМ, г. Кириши, объёмом 100 л с коэффициентом заполнения 0,6. Ферментёр оснащён магнитной мешалкой, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры и рН.

Питательную среду готовили непосредственно в аппарате. Для этого в аппарат заливали 60 л водопроводной воды, вносили 1% пшеничных отрубей, стимулятор-0,1 %, 1,3% сульфата аммония, значение рН 5,8-6,0 устанавливали 10% раствором НСl. Пшеничные отруби и стимулятор предварительно замачивали в 10 литрах воды в течение 4-х часов, стерилизовали в автоклаве 1 час при t° +125°C. Затем подготовленный ферментёр засевали посевным материалом из колб. Посевная доза не менее 5%. Культивирование проводили при температуре +26°С, расход воздуха на протяжении всей ферментации 30 л в минуту, скорость вращения мешалки 200 оборотов в минуту. Величину рН в процессе роста корректировали до 6,5. Продолжительность выращивания составила 94-98 часов, конечные значения рН от 5,3 до 7,5.

По окончании ферментации культуральную жидкость направляли на участок предварительной очистки, где мицелий гриба отделяли фильтрованием под вакуумом на нутч-фильтре. Вес полученной биомассы составил 3,5 кг. Полученный нативный раствор подвергали дополнительному сепарированию на сепараторе типа ОСБ при 9000 об/мин, в течение часа при температуре +2 - +4°С. Затем нативный раствор в объёме 55 л, полученный после отделения биомассы, концентрировали до 1,5 л (концентрат).

После проведения обратной транскрипции к образцам выделенной кДНК был добавлен фермент в концентрациях 1 Ед/мл, 2,5 Ед/мл и 5 Ед/мл. Также был взят контрольный образец кДНК, в который не был добавлен фермент. На электрофореграмме наличие темной полосы в контрольном образце свидетельствовало о сохранении вируса, отсутствие полосы означало его разрушение. При концентрации 1 Ед/мл и более кДНК вируса разрушается, при этом не наблюдается образования темной полосы.

После проведения обратной транскрипции к образцам выделенной кДНК был добавлен фермент в разных концентрациях (1, 0,1, 0,05, 0,025 Ед/мл). Также был взят контрольный образец кДНК без добавления фермента. На электрофореграмме наличие темной полосы в контрольном образце свидетельствовало о сохранении вируса, отсутствие полосы означало его разрушение. При концентрации более 1 Ед/мл кДНК вируса разрушалось, при этом не наблюдалось образования темной полосы. При большем разведении фермента (0,1, 0,05, 0,025 Ед/мл) вирусная кДНК сохраняется и наблюдается темная полоса.

1. Ингибитор вируса герпеса простого 1-го типа. Патент РФ № 2022012, 1994. Алексеев С.Б., Берёзов Т.Т., Анджапаридзе О.Г. и другие.

2. Ингибитор вируса иммунодефицита человека. Патент РФ № 2022011, 1994. Алексеев С.Б., Веса B.C., Смирнова И.П. и другие.

3. ЕРРО. Phytosanitary procedures PM 3/21 (2). Post-entry quarantine for potato // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 2004, vol.34, p.443-454.

4. Fribourg, C.E.; Jones, R.A.C.; Koenig, R. (1979) Andean potato mottle virus. CMI / AAB Descriptions of Plant Viruses No.203. Association of Applied Biologists, Wellesboume, UK.

5. Salazar, L.F.; Harrison, B.D. Particle properties and strains of Andean potato mottle virus. Journal of General Virology, 1978, 39, 171-178.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Применение концентрата культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № F-180, в качестве ингибитора Андийского вируса крапчатости картофеля.

Владельцы патента RU 2527899:

Известен ингибитор вируса герпеса простого 1-го типа (1), известен ингибитор вируса иммунодефицита человека (2). В качестве ингибитора использовался метаболит штамма Trichoderma harzianum Rifai - гомогенный фермент L-лизин-α-оксидаза.

Описание ингибиторов Андийского вируса крапчатости картофеля (Andean potato mottle virus) не обнаружено.

Условия культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai.

2. Ингибитор вируса иммунодефицита человека. Патент РФ № 2022011, 1994. Алексеев С.Б., Веса B.C., Смирнова И.П. и другие.

3. ЕРРО. Phytosanitary procedures PM 3/21 (2). Post-entry quarantine for potato // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 2004, vol.34, p.443-454.

4. Fribourg, C.E.; Jones, R.A.C.; Koenig, R. (1979) Andean potato mottle virus. CMI / AAB Descriptions of Plant Viruses No.203. Association of Applied Biologists, Wellesboume, UK.

5. Salazar, L.F.; Harrison, B.D. Particle properties and strains of Andean potato mottle virus. Journal of General Virology, 1978, 39, 171-178.

6. Смирнова И.П., Берёзов Т.Т., Чекунова Л.Н. Штамм Trichoderma harzianum Rifai продуцент L - лизино-α-оксидазы. Авторское свидетельство. 1991 г., №1044043.

Применение концентрата культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под №F-180, в качестве ингибитора Андийского вируса крапчатости картофеля.

Участники и результаты

44-ФЗ, Электронный аукцион

ИНН 7810323620 КПП 781001001

Классы МПК:	A01N63/04 плесневые грибы или экстракты из них C12N1/14 микробные грибки; питательные среды для них C12N9/02 оксидоредуктазы (1), например люцифераза
Автор(ы):	Смирнова Ирина Павловна (RU) , Шнейдер Юрий Андреевич (RU) , Березов Темирболат Темболатович (RU)
Патентообладатель(и):	Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов" (РУДН) (RU)
Приоритеты:

Набор для ИФА на Афлатоксин (2-50 ppb)В1 96 тестов