Альфафетопротеин против гепатита с

Альфа-фетопротеин (АФП) ‒ белок сыворотки крови развивающегося эмбриона человека и млекопитающих животных. У взрослых особей он почти полностью исчезает из крови вскоре после рождения, но появляется при развитии гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), а также раке яичка и яичников. В этих случаях АФП используется как специфический маркер этих опухолей для их диагностики и оценки эффективности лечения [1, 4].

Экспрессия гена АФП в печени происходит при процессах некроза и воспаления в печени, сопровождающихся нарушением межклеточного взаимодействия гепатоцитов [1]. Исследование, проведенное группой авторов в США, показывает, что нормальная регенерация печени не стимулирует синтез АФП [1].

В наибольшей степени клеточно-матриксные взаимодействия в печени нарушаются при ГЦК, что подтверждается тем, что самые высокие сывороточные уровни АФП регистрируются именно при этой патологии, а его концентрация зависит от объема и темпов роста опухоли [5, 14, 15]. Кроме этого, повышенные уровни АФП являются фактором риска развития ГЦК у больных циррозом печени (ЦП) [6, 7]. Повышение уровня АФП характерно и для ЦП [1], поскольку при этом заболевании также нарушаются клеточно-матриксные взаимодействия гепатоцитов вследствие усиления фиброзообразования в печени.

При хронических вирусных гепатитах выявлена прямая корреляция между степенью фиброза в печени и уровнем АФП [12]. В одном из исследований [8] сообщается о том, что у больных хроническим гепатитом В с повышенным уровнем АФП в течение 8 лет чаще развивался ЦП и ГЦК, а также выше была летальность по сравнению с больными хроническим гепатитом В с нормальным уровнем АФП. В другом исследовании повышенный уровень АФП при компенсированном HCV-ЦП ассоциировался с меньшей выживаемостью больных [11].

Таким образом, по литературным данным, имеются предпосылки для использования АФП в качестве прогностического маркера выживаемости при ЦП, особенно с учетом того факта, что определение АФП в сыворотке крови можно отнести к рутинным биохимическим исследованиям. Нерешенными остаются вопросы определения пороговых прогностических уровней АФП при ЦП и временных периодов, на которые этот прогноз распространяется.

Цель исследования ‒ определить прогностическое значение уровня альфа-фетопротеина крови больных циррозом печени вирусной и алкогольной этиологии.

Материал и методы исследования

Исследование обсервационное, проспективное (когортное), с оценкой конечной твердой точки – наступления летального исхода от ЦП. В исследование были включены 107 больных ЦП вирусной (В, С, В + С), алкогольной и смешанной (алкогольно-вирусной) этиологии. Возраст больных от 18 до 72 лет (Me = 50,8 лет), 50 мужчин и 57 женщин. Период наблюдения за больными составлял от 1 до 36 месяцев. За все время наблюдения умерли 43 из 107 пациентов. Данные о дате смерти пациентов, умерших вне стационара, получены по результатам телефонных опросов родственников. Диагноз ЦП подтвержден морфологически (лапароскопия с биопсией) у 8 больных, остальным выставлен на основании наличия признаков диффузного повреждения печени с деформацией сосудистого рисунка по данным УЗИ, наличия синдрома печеночно-клеточной недостаточности и инструментально доказанного синдрома портальной гипертензии (варикозное расширение вен желудка и пищевода, асцит). Вирусная этиология установлена по данным вирусологического исследования сыворотки крови на маркеры HBV (HBsAg, а/т классов M и G к HBcAg, ДНК HBV), HCV (а/т классов M и G к HCV, РНК HCV) и HDV (а/т к HDV). Алкогольная этиология ЦП определена указанием в анамнезе на многолетнее злоупотребление алкоголем.

Все пациенты проживали на территории Томской области. У всех включенных в исследование пациентов получено добровольное информированное согласие на участие в исследовании, а также всем больным вручен информационный листок испытуемого. Никакие исследования не проводились, если была вероятность развития серьезных осложнений и предполагаемая польза от исследования была меньше возможного вреда, причиняемого здоровью пациентов.

Критерии включения больных в исследование: верификация в Томской областной клинической больнице диагноза ЦП или поступление в стационар в связи с декомпенсацией (асцит, кровотечение или острый алкогольный гепатит) ЦП вирусной, алкогольной и смешанной этиологии; согласие больного на участие в исследовании.

Критерии исключения: тяжелая сопутствующая патология − правожелудочковая сердечная недостаточность, сахарный диабет тяжелого течения, онкопатология, туберкулез, аутоиммунные заболевания, болезни почек с почечной недостаточностью, хроническая обструктивная болезнь легких, бронхиальная астма, психические заболевания; острые инфекционные заболевания; отказ больного от участия в исследовании.

Основные этиологические варианты ЦП – это алкогольный ЦП (41,4 %) и алкогольно-вирусный ЦП (40,5 %). Доля вирусных ЦП – 18,1 %.

Больные были разделены на 2 группы (умершие – 1-я группа и выжившие – 2-я группа) по периодам: 1, 3, 6, 12, 18, 24 и 36 месяцев. Группы умерших и выживших больных ЦП по указанным периодам были сопоставимы по полу и возрасту. На первом этапе проанализирована ассоциация этиологического варианта ЦП с выживаемостью больных, находящихся на одной стадии болезни (одного класса ЦП по Чайлду‒Пью). Поскольку не было получено статистически значимых различий по частотам распределения различных этиологических вариантов ЦП в группах умерших и выживших больных по всем периодам, в дальнейшем группы сравнивались между собой по указанным периодам без учета этиологических вариантов заболевания.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы Statistica v6.0 (StatSoft, США). Проверка групп на нормальность распределения признаков проведена с помощью критерия Лиллиефорса. Распределение признаков в сравниваемых группах не подчинялось законам нормального распределения (p Примечания : * – число больных, ** – медиана, ^ – нижний квартиль, ^^ – верхний квартиль.

Медиана уровня АФП у больных класса А (n = 16) составила 3,60 МЕ/мл, 95 % ДИ [2,08; 5,96]. Медиана уровня АФП у больных класса В (n = 60) составила 7,55 МЕ/мл, 95 % ДИ [5,50; 10,10]. Медиана уровня АФП у больных класса С (n = 31) составила 7,40 МЕ/мл, 95 % ДИ [4,96; 10,50]. Тест Краскела‒Уоллиса показал наличие статистически значимых различий (р = 0,024) уровня АФП между классами ЦП. Попарный анализ тестом Манна‒Уитни уровней АФП между классами ЦП выявил наличие статистически значимых различий между классом А и классом В (р = 0,007), а также между классом А и классом С (р = 0,025). Статистически значимых различий между классами В и С не выявлено (р = 0,78).

Вычитая области пересечения 95 % ДИ уровня АФП между классом А, с одной стороны, и классами В и С, с другой, получаем пороговый уровень АПФ, равный 5,96 МЕ/мл, превышение которого свидетельствует о развитии декомпенсации ЦП (чувствительность 0,58; специфичность 0,81). Прогностичность положительного теста составляет 95 %, а прогностичность отрицательного теста – 25 %, из чего следует, что данный тест можно рекомендовать для верификации декомпенсированного ЦП при уровнях АФП, превышающих пороговый, а не для определения компенсированного ЦП при уровнях АФП, меньших порогового. Не получено статистически значимых корреляций уровня АФП с активностью индикаторных ферментов цитолиза − АсАТ и АлАТ (p > 0,05), что позволяет сделать вывод о том, что повышение уровня АФП в основном обусловлено стадией ЦП, а не его активностью.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что уровень АПФ позволяет дифференцировать компенсированный ЦП (класс А) от декомпенсированного (классы В и С).

Известно, что нарушение клеточно-матриксных отношений в печени является лучшим индуктором синтеза АФП гепатоцитами [1]. При ЦП степень нарушений клеточно-матриксных отношений увеличивается в результате процессов фиброзообразования в печени, ведущих к разобщению гепатоцитов, что наблюдается при прогрессировании заболевания. По данным литературы, уровень АФП прямо коррелирует со степенью фиброза в печени [12]. Поэтому утяжеление стадии ЦП, проявляющееся усилением фиброзообразования в органе, сопровождается увеличением синтеза АФП. Соответственно декомпенсацию заболевания, исходя из наших результатов, можно установить по превышению обозначенного порогового уровня АФП. Очень перспективным представляется изучение взаимосвязи синтеза АФП и прогрессирования фиброзообразования в печени, которое можно мониторировать по высокой активности нейтрофильной эластазы, альфа-1-протеиназного ингибитора и низкой концентрации фибронектина и пептид-связанного гидроксипролина сыворотки крови [2, 3].

Имеется исследование, в котором изучалась связь достижения устойчивого вирусологического ответа и уровня АФП при проведении противовирусной терапии при HCV-инфекции (при гепатите и ЦП). Установлено, что при уровне АФП менее 5,7 МЕ/мл устойчивый вирусологический ответ был достигнут у 58,7 % больных, а при превышении установленного уровня только у 19,2 % пациентов [13]. Эти данные в определенной степени подтверждают связь повышенного уровня АФП с утяжелением заболевания печени, при котором противовирусная терапия оказывается менее эффективной [9, 10].

По нашим данным, активность ЦП не влияет на уровень АФП, что подтверждается отсутствием корреляции уровня АФП с активностью аминотрансфераз. Поэтому можно утверждать, что стадия заболевания, а не его активность, вносит основной вклад в повышение уровня АФП при ЦП.

Отсутствие связи уровня АФП с выживаемостью при ЦП отчасти можно объяснить тем, что в нашем исследовании не принимали участие больные ЦП, осложненным развитием ГЦК, которая, несомненно, увеличивает летальность.

Таким образом, контроль уровня АФП как при первичном обследовании больных ЦП, так и в динамике позволяет оценивать стадию ЦП, однако не позволяет независимо от других клинических данных прогнозировать риск развития летального исхода. В связи с полученными нами результатами, а также с тем обстоятельством, что больные ЦП относятся к группе высокого риска развития ГЦК, необходимо у них 2 раза в год контролировать уровень АФП. При выявлении повышенного уровня АФП необходимо проведение компьютерной или ядерно-магнитно-резонансной томографии печени для скринингового обследования на ГЦК.

Рецензенты:

Черкасов В.А., Черешнев В.А., Заривчацкий М.Ф., Родионов С.Ю., Цой Г.М.

Введение

Нарушения иммунного ответа являются важнейшим патогенетическим звеном хронических гепатитов различной этиологии, во многом определяющим прогрессирование этого заболевания, вплоть до трансформации в цирроз печени [14].

При хроническом, активном гепатите В снижение функции Т-супрессоров приводит к высокой сенсибилизации Т-лимфоцитов к вирусным антигенам, антигенам мембраны печени и печеночному специфическому липопротеину, гиперпродукции к ним антител и развитию активного иммуновоспалительного процесса в печеночной ткани [2; 3]. Повышение функции Т-киллеров обусловливают развитие выраженного синдрома цитолиза [6]. Внепеченочные проявления заболевания развиваются по иммунокомплексному механизму [14]. У больных хроническим гепатитом В наблюдается повышение CD21+ и О-лимфоцитов, снижение CD3+ и CD8+. Последнее и способствует интенсификации гуморальных реакций, особенно при гаплотипе DR3 [3]. Развитию осложнений при хронических вирусных гепатитах В и С способствует повышение в сыворотке крови фактора некроза опухолей альфа, являющегося индуктором программированной гибели клеток (апоптоза) [6; 7; 9; 12]. Отмечено повышение в сыворотке крови больных хроническим гепатитом В индуцирующих апоптоз CD95+ клеток [2]. Изменения в балансе иммунорегуляторных медиаторов в пользу цитокинов Тх2 типа (ИЛ-4) при хронических формах гепатита С, а также при микст-формах (В и С) свидетельствуют о преобладании гуморального звена иммунитета [7; 11] В патогенезе циррозов печени иммунным расстройствам также принадлежит ключевая роль. Так, в развитии вирусного цирроза печени основополагающее значение имеют обусловленный персистированием вирусной инфекции иммуновоспалительный процесс, гепатотоксическое действие вирусов В и С, развитие аутоиммунных реакций. В патогенезе аутоиммунного цирроза печени последним, принадлежит основная роль [14].

Несмотря на ключевую роль иммунных расстройств в патогенезе гепатитов и циррозов печени различной этиологии, иммунокорригирующая терапия при этих нозологических формах имеет ограниченное применение и сводится в основном к использованию иммунодепрессантов (глюкокортикоидов и цитостатиков) при высокой степени активности процесса [14].

Таким образом, ключевая роль в развитии патогенеза гепатитов и циррозов печени принадлежит нарушениям иммунного ответа. Одной из наиболее актуальных задач в лечении заболеваний, протекающих с явлениями аутоиммунной агрессии, является поиск и применение биологически активных соединений для селективного подавления патологических аутоиммунных механизмов [4; 5; 8; 10; 13; 15].

Природным аналогом подобной специфической иммунорегуляции является фетальный белок альфа-фетопротеин (АФП) [1].

Экспериментальные данные свидетельствуют об иммуносупрессорной активности этого белка [16]. Видимо поэтому, в первую очередь, его попытались применить для блокирования аутоиммунных реакций в эксперименте, где установлена способность АФП снижать реакции Т-зависимого гуморального и клеточного иммунитета [17].

Материалы и методы исследования

Основной целью проведенных клинических исследований служила оценка безопасности и эффективности препарата АФП (регистрационное удостоверение МЗ РФ № 99/136/12 от 19.04.99) в комплексном лечении больных хроническими гепатитами и циррозом печени.

Проведено двойное слепое, рандомизированное, плацебоконтролируемое исследование препарата АФП, где в основных группах больные получили в комплексной терапии АФП, а в контрольных группах - "Плацебо" в аналогичных дозировках и путях введения.

В исследование были вовлечены больные с циррозом печени, вызванным вирусными и химическими этиологическими факторами.

Возраст больных варьировал от 36 до 72 лет. Общее количество пациентов, вовлеченных в испытание, составило 43 человека.

Из всех больных, включенных в исследование, у 15 был диагностирован хронический гепатит и цирроз печени в результате вирусной инвазии, у 18 - токсикогенный, у 6 - первичный биллиарный, у 2 - неясной этиологии.

Пациентам, включенным в исследование, проведено обследование в начале исследования (0 день лечения) и на 2 день после его окончания. Обследования имели целью оценку состояния органов и систем по комплексу клинических, лабораторных, специальных и инструментальных показателей и включали: физикальные; лабораторные (клинический и биохимический анализ крови, иммунограмму, вирусологическое исследование); специальные и инструментальные (УЗИ органов брюшной полости, изотопное сканирование печени).

В ходе клинического исследования препарата было выделено 2 группы больных.

Больные с хроническими гепатитами и циррозом печени (основная группа 22 человека), получающие комплексную терапию, включавшую: диету богатую белками; витамины группы В, никотинамид, фолиевую кислоту, витамин С, липоевую кислоту; легалон, спазмолитики; препараты, восстанавливающие флору кишечника, мочегонные средства и преднизолон - ежедневно в течение 30 суток дополнительно внутривенно получали препарат АФП в суточной дозе 4 мкг/кг массы тела один раз в сутки.

В соответствующей контрольной группе (хронические гепатиты и цирроз печени 21 человек) проведено аналогичное комплексное лечение в сочетании с "Плацебо". В качестве "Плацебо" использован лиофильный препарат "Реополиглюкин", который является напол-нителем в препарате АФП. Плацебо в контрольных группах вводили с адекватной дозой, кратностью и путем введения, как и в основной группе пациентов, включенных в исследование.

У всех больных хроническими гепатитами и циррозом печени, включенных в исследование мы выделили несколько общих синдромов.

В основной и контрольной группе пациентов присутствовал болевой синдром, связанный с дискинезией желчных путей, некробиотическими изменениями в печени. Синдром желтухи был обусловлен как механическими нарушениями оттока желчи, вследствие внутрипеченочного холестаза, так и некротическими изменениями паренхимы и всасыванием связанного билирубина в кровь. У всех больных присутствовал синдром гепато и спленомегалии, синдром портальной гипертензии с кровотечениями у 30% обследованных из вен прямой кишки и пищевода. Кроме этого определялся гепатопанкреатический синдром, сопровождающийся диспепсическими расстройствами. У большинства больных выявлена лейкопения, тромбоцитопения, анемия, гипопротеинемия, нарушения водно-солевого обмена, увеличение содержания аминотрасфераз, лактатдегидрогеназы и щелочной фосфатазы. Как правило, печень при осмотре пациентов была плотной, бугристой. Более чем у половины больных обнаружены телеангиэктазии, пальмарная эритема, побледнение ногтей и умеренные явления геморрагического диатеза. У 40% больных выявлены изменения в сердечно-сосудистой системе, выражавшиеся в стойкой гипотонии и тахикардии. Ультразвуковым обследованием у 40 % больных выявлено наличие асцитической жидкости в брюшной полости (иногда в весьма значительных объемах).

Все больные на протяжении всего периода заболевания получали различное медикаментозное лечение без улучшения, а более чем в половине случаев был получен прогресс заболевания на фоне лечения.

Результаты и их обсуждение

В группе пациентов, включенных в исследование с диагнозом: хронический гепатит и цирроз печени, сравнительный анализ результатов обследования по лабораторным и специальным и инструментальным методам не позволил выявить достоверных (р > 0,05) отличий в группах сравнения (таблицы 1; 2).

При анализе динамики изучаемых иммунологических показателей группах сравнения нами выявлена картина выраженного вторичного иммунодефицитного состояния, характерного для хронического воспалительного процесса. Так, по отношению к условной физиологической общим для обеих групп сравнения являлось снижение общего количества Т-лимфоцитов (CD3+ и Е-РОК) с нарушением их функциональных свойств и субпопуляционного состава, что проявлялось сниженным содержанием ранних и теофиллинрезистентных Е-РОК, CD4+ Т-лимфоцитов. Несмотря на высокий уровень сывороточного IgG, число В-лимфоцитов с рецепторами для эритроцитов мыши (М-РОК) было сниженным, а количество CD72+ клеток не отличалось от нормальных значений. В то же время и в основной группе (АФП) и контрольной ("Плацебо") наблюдалось увеличение количества CD95+ - лимфоцитов и значений показателей активности фагоцитирующих клеток. Следует отметить, что перечисленные изменения характеристик иммунного статуса у больных хроническими гепатитами и циррозами печени достоверно не отличались между основной (АФП) и контрольной (Плацебо) группами сравнения (р > 0,05).

Применение АФП в основной группе пациентов улучшало лабораторные показатели, достоверно (Р

Дата публикации: 27 июня 2017 .

Врач лабораторной диагностики
(заведующий клинико-
диагностической лабораторией)
Лавицкая Т.В.

Для диагностики различных заболеваний исследуются десятки показателей крови, которые позволяют определить неблагополучие в организме не только у взрослых и детей, но и на этапе внутриутробного развития у плода. Одним из таких маркеров считается АФП, уровень которого возрастает при пороках развития. Кроме того, АФП отражает наличие некоторых опухолей. Альфа-фетопротеин представляет собой особый белок, образующийся тканями эмбриона (желточный мешок, клетки кишечника, гепатоциты). У взрослых людей в крови можно обнаружить лишь его следы, а у плодов концентрация АФП значительна, что обусловлено выполняемыми им функциями. У развивающегося организма АФП подобен альбумину взрослых, он связывает и переносит различные вещества, гормоны, защищает ткани будущего малыша от иммунной системы материВажной способностью АФП является связывание им полиненасыщенных жирных кислот. Эти компоненты нужны для построения мембран клеток, синтеза биологически активных веществ простагландинов, но они не образуются ни тканями эмбриона, ни в организме матери, а поступают извне с пищей, поэтому доставка их в нужное место зависит только от специфических белков-переносчиков..

Оказывая важное влияние на рост зародыша, АФП должен присутствовать в необходимом количестве в соответствии со сроком беременности. На первых этапах развития плода АФП синтезируется желтым телом яичника матери, и уже к 13 неделе беременности его концентрация в крови и околоплодных водах становится значительной.

После закладки печени и кишечника у малыша, их клетки сами производят АФП для собственных нужд, но значительные его количества проникают через плаценту и в кровь матери, поэтому к третьему триместру гестации, на 30-32 неделе, АФП становится максимальным и у будущей мамы.

К моменту рождения ребенка, его организм начинает продуцировать альбумин, который берет на себя функции плодного белка, а концентрация АФП постепенно снижается в течение первого года жизни. У взрослых в норме можно обнаружить лишь следы АФП, а его повышение свидетельствует о серьезной патологии.

АФП — маркер, определяемый не только при беременности, но и при патологиях внутренних органов

Определение АФП используют как один из скрининговых показателей нормального течения беременности, который меняется при различных аномалиях развития, пороках, врожденных синдромах. Сразу же следует отметить, что результат не всегда точно говорит о наличии или отсутствии патологии, поэтому оценка его колебаний должна производиться в комплексе с другими исследованиями.

У взрослых людей нерезкое повышение альфа-фетопротеина обычно говорит о нарушениях в работе печени (цирроз, гепатит), значительное превышение нормы свидетельствует о злокачественных опухолях. Клетки рака при высокой степени злокачественности могут приобретать не только внешнее сходство с эмбриональными, но и особенности функционирования. Высокий титр АФП сопутствует низкодифференцированным и эмбриональным опухолям печени, яичников, предстательной железы.

Ни стадия опухоли, ни ее величина или скорость роста не влияют на степень увеличения АФП, то есть агрессивные опухоли могут сопровождаться менее значительным приростом количества этого белка, нежели более дифференцированные карциномы. Однако доказано, что около половины пациентов с раком печени имеют повышение АФП еще за 1-3 месяца до появления симптомов опухоли, что позволяет использовать этот анализ в качестве скрининга у предрасположенных лиц.

Когда нужно определять АФП и как это делается

Основными показаниями к определению уровня АФП в сыворотке крови считают:

Подозрение на пренатальную патологию: хромосомные заболевания, нарушения развития мозга, пороки других органов.
Исключение печеночноклеточного рака и диагностика метастазов других видов рака в печень.
Исключение опухолей половых органов (тератом, гермином, низкодифференцированных раков).
Контроль эффективности противоопухолевой терапии как до ее начала, так и после.

Определение альфа-фетопротеина проводят при заболеваниях печени (цирроз, гепатит), когда существует высокий риск развития рака. У таких пациентов анализ может помочь ранней диагностике новообразования. Стоит отметить, что для скрининга опухолей в целом этот тест не подходит ввиду неспецифичности, поэтому его проводят только при подозрении на определенные виды рака.

При беременности тест на АФП показан в качестве скринингового исследования, проводимого в период нарастания его уровня у женщины – между 15 и 21 неделей. Если в начале беременности пациентке проводился амниоцентез или биопсия ворсин хориона, то ей также необходим контроль уровня АФП.

Абсолютными показаниями к определению АФП у беременной женщины считают:

Кровнородственный брак;
Наличие генетически обусловленных заболеваний со стороны родителей и близких родственников;
Уже имеющиеся в семье дети с генетическими аномалиями;
Первые роды после 35-летнего возраста;
Прием токсичных препаратов или рентгенологическое исследование будущей мамы в ранние сроки беременности.

Эмбриональный белок, который указывает на состояние плода во время беременности и является онкомаркером для взрослого человека.

Синонимы английские

Alfa-Fetoprotein, AFP, Maternal Serum Alpha-Fetoprotein (MS-AFP), AFP Tumor Marker.

Твердофазный хемилюминесцентный иммуноферментный анализ ("сэндвич"-метод).

Диапазон определения: 0,5 - 50000 МЕ/мл.

МЕ/мл (международная единица на миллилитр).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Альфа-фетопротеин – гликопротеин, который вырабатывается в эмбриональном желточном мешке, печени и эпителии кишечника плода. Молекулярная масса белка – около 70 000 дальтон, период его полураспада составляет 5-7 дней. В организме плода он выполняет функции альбумина взрослого человека: осуществляет транспорт некоторых веществ, необходимых для развития плода, связывает эстрогены, ограничивая их влияние на развивающийся организм, и защищает от негативного воздействия иммунной системы матери.

Альфа-фетопротеин принимает активное участие в полноценном развитии плода, и его уровень должен соответствовать гестационному возрасту (возрасту плода с момента оплодотворения). Максимальное содержание данного белка в крови и амниотической жидкости плода отмечается на 13-й неделе, а в крови матери оно постепенно увеличивается с 10-й недели беременности и достигает максимума на 30-32-й неделях. Через 8-12 месяцев после рождения содержание АФП в крови ребенка снижается до следового количества, как у взрослых.

Альфа-фетопротеин проникает в организм матери через плаценту. Его уровень зависит от состояния желудочно-кишечного тракта, почек плода и плацентарного барьера. В связи с этим АФП используется как неспецифический маркер состояния плода и акушерской патологии. Совместные тесты на АФП, хорионический гонадотропин и эстриол (так называемый тройной тест) на 15-20-й неделях беременности применяются для проверки плода на дефекты развития и хромосомные аномалии, но не являются абсолютными показателями патологии или нормального развития плода. При этом очень важно точно знать гестационный возраст плода, так как уровень АФП в крови отличается на разных неделях беременности.

В организме взрослого человека альфа-фетопротеин отсутствует или обнаруживается в минимальных количествах. Умеренное повышение его уровня может быть вызвано патологией печени, а значительное – низкодифференцированной опухолью – это связано с тем, что некоторые раковые новообразования приобретают свойства эмбриональных тканей и, соответственно, способность к синтезу белков, которые характерны для ранних этапов развития организма. Резкое повышение АФП преимущественно выявляется при раке печени и половых желез.

При первичной гепатоцеллюлярной карциноме повышение АФП у половины больных можно обнаружить на 1-3 месяца раньше клинических проявлений заболевания. Хотя размеры опухоли, интенсивность роста, стадия процесса и степень злокачественности не пропорциональны количеству альфа-фетопротеина в крови. При прогрессирующей герминогенной несеминоме (опухоли половых желез) определение уровня АФП и хорионического гонадотропина является важным для оценки шансов выживания больных.

Для чего используется исследование?

Для пренатальной диагностики патологий развития плода: нарушения закладки нервной трубки, анэнцефалии (тяжелый порок развития, при котором у плода отсутствует часть головного мозга), хромосомных аномалий.
Для выявления первичной гепатоцеллюлярной карциномы (рака печени).
Для выявления тератобластомы яичка (герминогенной несеминомы).
Для диагностики низкодифференцированных опухолей.
Для диагностики метастазов опухолей различных локализаций в печень.
Для оценки эффективности лечения некоторых онкологических заболеваний и для наблюдения за их течением.

Когда назначается исследование?

При обследовании пациента с высоким риском развития опухоли (при циррозе печени, хроническом гепатите, дефиците альфа-антитрипсина).
При подозрении на метастазирование опухолей в печень.
При обследовании пациента с новообразованием половых желез.
До, во время и после лечения некоторых раковых заболеваний.
При наблюдении за состоянием в послеоперационный период больных, которым была удалена опухоль.
Во втором триместре беременности (между 15-й и 21-й неделями гестации).
При обследовании беременных, у которых проводились амниоцентез и биопсия хориона в ранний период беременности.

Что означают результаты?

Возраст

Фаза цикла/неделя беременности

Референсные значения, МЕ/мл

Альфа-фетопротеин принадлежит к семейству белков альбуминоидных генов, наряду с сывороточным альбумином, витамин Д-связывающим белком и, обнаруженным относительно недавно, альфа - альбумином (афамина). По химической структуре АФП является гликопротеином, содержащим до 3-5 % углеводов. Молекулярная масса этого белка колеблется в пределах 68-73 кДа, в зависимости от содержания углеводов и вида животного, из которого он был выделен. Первичная структура АФП установлена на основе анализа нуклеотидной последовательности его м-РНК, продукт трансляции которой у человека содержит 609 аминокислотных остатков (SwissProt P02771). В ходе процессинга отщепляется 18 аминокислотных остатков и в состав зрелой молекулы АФП человека входит 591 аминокислота. В составе АФП человека был также обнаружен один участок гликозилирования и 15 равномерно расположенных дисульфидных связей. Представители семейства белков альбуминоидных генов демонстрируют относительно высокую степень сходства первичной структуры (например, 39% идентичности наблюдается между аминокислотными последовательностями альфа - фетопротеина и сывороточного альбумина) с характерным расположением остатков цистеина. Они имеют также сходную α-спиральную вторичную структуру (так, до 65-67% α-спиральных участков характерно для АФП и около 50 % - для альбумина). Методом электронной микроскопии продемонстрировано существование U-образной структуры АФП с тремя областями плотности масс: одна на вершине и две по краям молекулы. На основании этих данных предложена трехдоменная пространственная организация его молекулы. Показано, что домены I и III имеют жесткую, компактно упакованную третичную структуру и связаны между собой протеолитически лабильным, гибким доменом II, конформация которого соответствует форме расплавленной глобулы (MGF-molten globule form). С-концевая часть домена II представляет собой гибкий шарнирный участок, который придает всем доменам подвижность и, тем самым, способствует взаимодействию АФП с лигандами или с другими белками. Несмотря на стабильность в растворе, АФП обладает достаточной конформационной подвижностью и изменяет конформацию под воздействием различных факторов, таких как высокие концентрации эстрогенов и жирных кислот, изменение рН среды и др. Изменение конформации молекулы сопровождается изменением антигенных и функциональных свойств АФП. Предполагается, что в нативной молекуле АФП часть биологически активных участков скрыты внутри белковой глобулы, которые выявляются, становясь доступными для взаимодействия, лишь при изменениях конформации молекулы.

До настоящего времени в связи трудностями, возникающими при кристаллизации альфа - фетопротеина, получение его трехмерной структуры (3D) с помощью экспериментальных методов (рентгеноструктурного анализа и ЯМР спектроскопии) представляет собой трудно разрешимую задачу. Наличие достаточно высокой степени сходства (39% идентичности) между аминокислотными последовательностями АФП и сывороточного альбумина, для которого трехмерная (3D) структура установлена с помощью рентгеноструктурного анализа, предоставляет возможность для компьютерного построения модели пространственной структуры АФП с помощью метода молекулярного моделирования на основе гомологии с альбумином. АФП и альбумин имеют общее происхождение и являются гомологичными белками. Для моделирования на основе гомологии важным является то обстоятельство, что трехмерная структура (способ укладки) гомологичных белков является в большей степени консервативной, чем их первичная структура.

Нами была предпринята попытка построения модели трехмерной организации молекулы АФП человека на основании гомологии с сывороточным альбумином, оптимизации полученной структуры с привлечением экспериментальных данных, оценки структуры и её анализа, включая расположение биологически активных участков. В международной базе данных PDB (protein data bank), содержащей все известные 3D структуры белков, было обнаружено 24 трехмерные структуры сывороточного альбумина человека. Из них для построения модели были отобраны шесть 3D структур (1AO6, 1BM0, 1E7A, 1GNI, 1HA2, 1UOR) которые были получены с высокой степенью разрешения (менее 3.0А) и отличались наличием или отсутствием в своем составе лиганда. Одна из них (1UOR) представляла собой кристаллическую структуру рекомбинантного сывороточного альбумина человека. Выравнивание аминокислотных последовательностей АФП и альбумина осуществляли с помощью компьютерной программы ClustalW. Для построения модели применяли программу MODELLER и использовали в качестве шаблона структуру 1GNI. Было построено пять моделей 3D структур АФП человека, из которых одна, с наименьшим objective function была отобрана для минимизации энергии. Расчет элементов вторичной структуры в полученной модели производили с использованием метода Кабаша-Сендера.

В настоящее время в составе альфа-фетопротеина разными группами авторов выявлен целый ряд участков с подтвержденной или предполагаемой биологической активностью. Одним из участков с изученной биологической активностью является гептапептид LDSYQCT в составе АФП человека (а.о. 14-20), обладающий иммуномодулирующими свойствами. Другим таким участком является пептид, ингибирующий рост (GIP - growth inhibitory peptide), включающий аминокислотные остатки 446-479, ответственный за способность АФП подавлять эстроген-зависимую пролиферацию клеток матки неполовозрелых самок мышей и рост эстроген-зависимых опухолей [Mizejewski G.J., MacColl R., 2003]. Срединный гидрофобный фрагмент пептида GIР, представляющий собой аминокислотную последовательность AADIIIGHLCIRHE (а.о.458-471), оказался способным связывать свободный 17-β-эстрадиол. Нами было выявлено, что в трехмерной структуре АФП гептапептид LDSYQCT располагается близко к поверхности молекулы, в то время как пептид GIР расположен внутри молекулы и занимает самый протяженный альфа-спиральный участок АФП человека.

Использование методов биоинформатики является ещё одним перспективным подходом для исследования АФП. С использованием программы ClustalW (версия 1.82) и баз данных первичных структур белков Swiss-Prot и TrEMBL нами проведено попарное и множественное выравнивание последовательностей белков семейства альбуминоидных генов, к которому, наряду с СА, афамином и витамин Д-связывающим белком, принадлежит АФП. На основе полученных данных осуществлен анализ филогенетических взаимоотношений этих белков и консервативных аминокислотных остатков в функционально активных участках, что может оказаться важным для понимания взаимосвязи структуры и функции не только АФП, но и других белковых молекул.

В составе АФП выявлен ряд участков с подтвержденной или предполагаемой биологической активностью: участки связывания эстрогенов, жирных кислот и билирубина, пептид, ингибирующий рост (GIP), мотивы гетеро- и гомодимеризации и др. Выявленный нами методами биоинформатики в составе АФП человека гептапептид LDSYQCT (АФП_14-20) обладает иммуномодулирующими свойствами. Нами изучаются конформационно-динамические свойства данного пептида и его аналогов, методами молекулярной динамики (МД), а также сконструирована модельная система и изучается взаимодействие эстрогенсвязывающих пептидов АФП с 17β-эстрадиолом. Метод МД основан на расчете классических (ньютоновских) траекторий движения молекулы в фазовом пространстве координат и импульсов ее атомов, и позволяет провести детальный (микроскопический) анализ конформационно-динамических процессов, происходящих в макромолекуле. Результаты анализа (данные о структуре и межмолекулярных взаимодействиях) можно сравнивать с экспериментально измеряемыми величинами, а также получать информацию о параметрах, которые трудно определить экспериментальными способами. Метод МД обеспечивает новым подходом к пониманию архитектуры и динамических свойств АФП и его пептидов, а также механизма их функционирования.

Обнаружение в составе альфа-фетопротеина (АФП) множества функционально важных участков позволяет сделать предположение о том, что альфа-фетопротеин является резервуаром биологически активных пептидов, которыми он обеспечивает растущие эмбриональные ткани. В этом может заключаться основное биологическое значение АФП в эмбриогенезе. Биологически активные пептиды АФП могут участвовать в регуляции различных физиологических процессов, в том числе: пролиферации клеток и роста тканей, половой дифференцировки и развития репродуктивных органов плода, развития и функционирования иммунной системы, транспорта гидрофобных лигандов (например, эстрогенов, необходимых для развития мозга) и др.

В течение последних десяти лет методами биоинформатики - путем сравнения первичных структур альфа-фетопротеина и ряда других белков в составе АФП выявлено более двадцати функционально важных участков. Часть пептидных фрагментов АФП человека получена синтетическим путем, и биологическая активность для них подтверждена экспериментально. Биологическая активность другой части пептидов лишь предсказана и требует эскпериментального подтверждения. Проведено картирование первичной структуры альфа-фетопротеина с указанием аминокислотных последовательностей и места в первичной структуре АФП, выявленных биологически активных участков [Терентьев А.А., Молдогазиева Н.Т., 2006].

Одним из пептидов с относительно изученной биологической активностью является гептапептид LDSYQCT (а.о. 14-20), выявленный в составе АФП человека методом сравнения аминокислотных последовательностей альфа-фетопротеина и ряда факторов роста, а также некоторых онкофетальных белков. Вышеназванный участок оказался сходен с последовательностью LDKYTC в составе ЭФР человека (а.о. 26-31), а также с последовательностью ENYCN (а.о. 17-21) в составе α-цепи инсулина. Пептидные фрагменты АФП и инсулина были получены синтетическим путем и изучены в различных тестах биологической активности. Гептапептид альфа-фетопротеина в концентрации 10 -5 М достоверно повышал утилизацию глюкозы эритроцитами больных инсулинозависимым и инсулинонезависимым сахарным диабетом. Пептид LDSYQCT обладает также иммуномодулирующими свойствами. В реакции бласттрансформации в концентрациях 10-7, 10-8 и 10-9 М гептапептид умеренно стимулировал пролиферацию неактивированных лимфоцитов и проявлял выраженное ингибирующее действие на пролиферацию лимфоцитов, активированных ФГА. Он дозозависимо стимулировал спонтанную пролиферацию лимфоцитов с максимальным эффектом (в 2,2 раза) при концентрации 10 мкг/мл. В культуре клеток К-562 гептапептид повышал в 1,5-2 раза цитотоксическую активность естественных киллеров (ЕК). Выяснилось также, что он обладает дозозависимым ингибирующим эффектом на пролиферативную активность лимфоцитов больных острым лимфолейкозом, а также спонтанную пролиферацию лимфоцитов больных хроническим лимфолейкозом с низкой чувствительностью к цитозару, т.е. пептид усиливает антипролиферативную активность этого препарата. В культуре клеток больных инфекционно-аллергическим миокардитом с естественно активированными лимфоцитами гептапептид достоверно понижает экспрессию позднего активационного антигена HLA-DR и индуцирует экспрессию рецептора Fas-опосредованного апоптоза (CD95). Увеличение количества CD95+ лимфоцитов свидетельствует в пользу предположения о том, что гептапептид LDSYQCT индуцирует апоптоз, так как этот процесс зависит от Fas/FasL клеточного взаимодействия.

О значительной роли альфа-фетопротеина в торможении канцерогенеза свидетельствует его способность индуцировать апоптоз и ингибировать рост эстроген-зависимых опухолей. Это подтверждается также обнаружением в его первичной структуре пептида, ингибирующего рост (GIP- growth inhibitory peptide), включающего аминокислотные остатки 446-479 и ответственного за способность АФП подавлять эстроген-зависимую пролиферацию клеток матки неполовозрелых самок мышей и рост эстроген-зависимых опухолей [Mizejewski G.J., MacColl R., 2003]. Было показано, что фрагмент пептида GIP, представляющий собой октапептид EMTPVNPG (а.о. 471-478), обладает максимальной биологической активностью. Его эффективность в тесте ингибирования эстрогензависимой пролиферации клеток матки у мышей составляет 49%, в то время как этот показатель для целого пептида Р447 равен 45%, а для интактного АФП - 35%. Также, в модели in vivo было показано, что этот пептид, как и интактная молекула АФП, снижает фетотоксичность эстрогенов и инсулина. Под воздействием альфа-фетопротеина и пептида GIP дефекты развития плода уменьшаются на 50%, а гибель плода во время внутриутробного развития - на 63-73%.

В составе альфа-фетопротеина обнаружены также аминокислотные последовательности, сходные с участками ряда цитокинов и белков индукции апоптоза (рецептора фактора некроза опухолей TNFRα, белка Bcl-2 и др.). Обнаружены также участки антигенов главного комплекса гистосоместимости II класса, белков экстрацеллюлярного матрикса, мотивы гомо- и гетеродимеризации, характерные для ядерных стероидных и тиреоидных рецепторов. Локализован также основной участок связывания полиненасыщенных жирных кислот, участки связывания эстрогенов и билирубина. Осуществлено эпитопное картирование АФП.

Однако и в норме в организме взрослых особей роль альфа-фетопротеина может оказаться значимой, в том числе в качестве предшественника биологически активных пептидов. В пользу этого предположения свидетельствует то обстоятельство, что содержание многих факторов роста и полипептидных гормонов, в частности инсулина, в организме взрослого человека находится в пределах тех концентраций, которые характерны и для АФП. В норме в сыворотке крови взрослых особей АФП обнаруживается лишь в небольших количествах - до 5-10 нг/мл (

10 -10 М). Однако эта концентрация может оказаться достаточной и функционально значимой.

Таким образом, можно констатировать, что применение новых подходов к изучению структуры и функции АФП, связанных с сочетанием методов компьютерного моделирования, молекулярной динамики и биоинформатики, с выявлением возможных биологически активных участков молекулы АФП, с последующим их химическим синтезом и проверкой их биологической активности, позволяет значительно глубже понять взаимосвязи структуры и функции этого белка.

Читайте также: