Секвенирование днк при диагностики туберкулеза

В 2004 году по инициативе д.м.н., профессора Михаила Александровича Владимирского, заведующего сектором молекулярной диагностики туберкулёза НИИ Фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М.Сеченова, мы начали разработки в области ПЦР-диагностики туберкулёза.

Выделение ДНК: использование оригинальных реагентов и магнитных частиц обеспечивает получение максимального количества чистой ДНК и позволяет автоматизировать процесс выделения ДНК.

ПЦР в реальном времени: одновременная детекция нескольких различных участков генома комплекса микобактерий туберкулёза (МБТ) увеличивает информативность и достоверность анализа.

I этап – Пробоподготовка, инактивация

II этап – Выделение ДНК

набор реагентов для выделения ДНК (на магнитных частицах)

набор реагентов для выделения ДНК микобактерий из клинических образцов и культур клеток на автоматизированных станциях TECAN

Снижение риска контаминации во время выделения ДНК практически до нуля.
Значительное уменьшение трудоёмкости процесса выделения ДНК.
Стандартизированное выделение ДНК из клинических образцов.
Экономическая выгода: низкий расход пластика и реактивов.

набор реагентов для ускоренной пробоподготовки и выделения ДНК микобактерий из образцов мокроты

III этап – ПЦР в реальном времени

Обнаружение и количественное определение комплекса МБТ

Набор реагентов АМПЛИТУБ-РВ — это:

высокая достоверность анализа благодаря одновременному обнаружению двух специфичных генов M.tuberculosis complex: IS6110 и regX3;
оценка пригодности образца ДНК для определения антибиотикоустойчивости;
высокая чувствительность (не более 100 КОЕ/мл мокроты или 1–10 копий фрагментов ДНК в реакции) и 100%‑ая специфичность, подтверждённые на панели QCMD (Quality Control for Molecular Diagnostics) Mtb EQA (UK).

Определение антибиотикоустойчивости МБТ к препаратам I и II ряда

Наборы реагентов АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ, АМПЛИТУБ-FQ-РВ — это:

диагностика форм туберкулеза с лекарственной устойчивостью, в том числе множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ);
быстрая детекция мутаций M.tuberculosis, ассоциирующихся с устойчивостью к антибиотикам первого и второго ряда (рифампицину, изониазиду, этамбутолу, фторхинолонам);
достоверность результатов, ежегодно подтверждаемая при проведении Федеральной службой внешней оценки качества (ФСВОК) Росздравнадзора испытаний шифрованных тест-культур и образцов.

Наборы АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ и АМПЛИТУБ-FQ-РВ основаны на использовании оригинальной мультиконкурентной аллель-специфичной методики ПЦР в реальном времени, позволяющей выявлять мутации в генах микобактерий туберкулеза, ответственных за устойчивость к конкретным антибиотикам.

Принцип мультиконкурентной аллель-специфичной методики ПЦР в реальном времени

В формате одной пробирки используются 5’-флуоресцентно-меченые аллель-специфичные праймеры с общим комплементарным им 3’-меченым олигонуклеотидом-гасителем и контрольный флуоресцентный зонд, комплементарный участку ДНК без мутаций.
При отсутствии мутаций в ДНК нарастание флуоресценции в ходе ПЦР-РВ наблюдается только по флуорофору зонда.
При наличии мутаций в ДНК нарастание флуоресценции в ходе ПЦР-РВ наблюдается как по флуорофору зонда, так и по флуорофору 5’-флуоресцентно-меченого аллель-специфичного праймера. Данный метод позволяет определить не только точку мутации, но и процент устойчивого мутантного штамма МБТ на фоне дикого.

Интерпретация результатов выявления мутаций на примере
531 кодона rpoB гена M.tuberculosis

Гены, кодоны, замены, используемые в наборах реагентов
АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ при определении антибиотикоустойчивости

Использование автоматизированных станций Freedom EVO (TECAN, Швейцария) для молекулярно-генетической диагностики туберкулёза

Трудозатраты — 1 час
Продолжительность выделения ДНК — не более 2 часов
Подготовка к амплификации и ПЦР-РВ — 1,5 часа

ИТОГО: результаты анализа будут готовы через 3,5 часа
Оператор затратит 1 час своего рабочего времени.

Полногеномное секвенирование (ПГС) позволяет определять видовую принадлежность микобактерий и устойчивость к антибиотикам. Годичное исследование, проведенное британскими учеными, показало, что эффективность ПГС сравнима с традиционными методами.

Колонии M. tuberculosis. Credit: Wikimedia Commons

В 2015 году по данным ВОЗ было зарегистрировано 10,4 миллиона новых случаев туберкулеза, 1,4 миллиона смертей связаны непосредственно с этим заболеванием. Около 3% новых случаев и 20% ранее выявленных вызваны штаммами, резистентными к одному или нескольким противотуберкулезным препаратам.

При подозрении на мультирезистентность ВОЗ рекомендует линейный анализ образцов (line probe assays, LPA) — это ПЦР и затем гибридизация, позволяющая идентифицировать гены устойчивости.

Молекулярные тесты более точны, чем фенотипические, в том числе биохимические. Однако из-за межвидового сходства некоторых генов, например рибосомных, близкородственные виды бывает трудно распознать. Сейчас вполне реально использовать для рутинной идентификации видов микобактерий (помимо Mycobacterium tuberculosis, существует 176 микобактериальных видов), а также для тестирования на чувствительность к лекарствам полногеномное секвенирование (ПГС).

Группа британских ученых сравнила результаты ПГС и стандартных лабораторных методик по идентификации микобактерий, прогнозированию резистентности к антибиотикам первой линии M. tuberculosis, а также оценила затраченное на анализы время. Исследования проводились в Национальной референсной службе по микобактериям в течение года. с апреля 2015 года по март 2016-го.

Виды определяли генотипированием (тест GenoType CM, затем GenoType Mycobacterium MTBC или GenoType Mycobacterium AS, Hain Lifescience GmbH, Nehran, Germany), устойчивость к антибиотикам — также генотипированием (GenoType MTBDRplus ) либо фенотипически (Becton Dickinson MGIT 960 system).

Из 2039 изолятов, определенных до вида методами LPA, для 74 (3,6%) не удалось определить вид методом секвенирования или ПГС, таким образом, для сравнения остались 1965. Клинически значимые виды были идентифицированы методом LPA и полногеномным секвенированием в 1902 изолятах, причем в 1825 (96,0%) результаты совпали.

По резистентности к препаратам первой линии — изониазиду и рифампину — в общей сложности были получены 2215 результатов LPA в 728 изолятах комплекса M. tuberculosis (группа близкородственных видов микобактерий, способных вызвать туберкулез). Исключая 216 (10,0%) случаев, когда данных не хватило для ПГС, общая согласованность составила 99,3%, чувствительность — 97,6%, специфичность — 99,5%.

Всего было зарегистрировано 2982 фенотипических результата по резистентности для 777 изолятов комплекса M. tuberculosis. Из них 356 (11,9%) не имели параллельных результатов ПГС, а в 154 (5,2%) случаях результат был неопределенным из-за обнаружения новых, ранее не охарактеризованных мутаций. За исключением этих данных, общая согласованность составила 99,2%, чувствительность — 94,2%, а специфичность — 99,4%. Медианное время обработки для обычных лабораторных тестов по сравнению с ПГС было близким — 20 и 21 день соответственно.

Показано, таким образом, что полногеномное секвенирование с большой точностью определяет виды и восприимчивость к лекарственным средствам.

T. Phuong Quan et al. // Evaluation of Whole-Genome Sequencing for Mycobacterial Species Identification and Drug Susceptibility Testing in a Clinical Setting: a Large-Scale Prospective Assessment of Performance against Line Probe Assays and Phenotyping. // J. Clin. Microbiol. February 2018, 56:14 e01480-17; Accepted manuscript posted online 22 November 2017, DOI: 10.1128/JCM.01480-17

Еще о микобактериях и молекулярной диагностике в Journal of Clinical Microbiology (2018, февраль)

Туберкулез - хроническая инфекция с длительным периодом выделения возбудителя, многообразием клинических проявлений, поражением различных органов и систем - представляет непростую задачу для лабораторной диагностики. Молекулярно-биологические методы (ПЦР) используются для выявления, видовой дифференциации и определении лекарственной устойчивости микобактерий туберкулезного комплекса.

Ввиду биологических особенностей возбудителя и иммунного ответа человека диагностика туберкулеза не может ограничиваться каким-либо одним методом и должна проводиться комплексно.

Возбудители туберкулеза могут быть обнаружены в различных биоматериалах, природа которых определяет выбор наборов реагентов для экстракции ДНК. Ключевой принцип выбора биоматериала для диагностики туберкулеза методом ПЦР: необходимо выбирать биоматериал, соответствующий клинической форме туберкулезной инфекции.

Например, для диагностики туберкулеза мочеполовой системы нужно исследовать мочу или менструальную кровь, рекомендуется также исследовать биоптаты из подозрительного очага. Для диагностики туберкулеза легких используется мокрота, бронхо-альвеолярный лаваж.

Реагенты и оборудование для предобработки биоматериалов и экстракции ДНК

Наборы реагентов для экстракции ДНК из мокроты, бронхо-альвеолярного лаважа, мочи, синовиальной жидкости и смывов с объектов окружающей среды	АмплиПрайм ДНК-сорб-В и АмплиПрайм РИБО-преп
Реагент для разжижения мокроты и синовиальной жидкости	Муколизин
Набор для экстракции ДНК, используемый при исследовании биоптатов (легкие, лимфатические узлы, почки, печень, мозг, селезенка)	ДНК-сорб-С
Оборудование для гомогенизации биоптатов	TissueLyser LT или TissueLyser II
Парафиновые блоки нарезают на микротоме или вырезают фрагмент ткани одноразовым скальпелем, а затем проводят экстракцию ДНК, например, с помощью набора реагентов QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (50)	QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (50)

Наборы реагентов для ПЦР-диагностики туберкулеза

Применение молекулярно-биологических методов (в частности, выявление ДНК методом ПЦР) в диагностике туберкулеза регламентировано Приказом Минздрава РФ от 21.03.2003 № 109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" (ред. от 29.10.2009).

Выявление микобактерий туберкулезного комплекса

Набор реагентов АмплиСенс® МТС-FL предназначен для обнаружения ДНК микобактерий туберкулеза – Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), включающий в себя виды микобактерий разной степени вирулентности, вызывающих туберкулез у человека (M.tuberculosis, M.bovis, M.africanum, M.microti, M.canetti, М.pinipedii).

Микобактерии туберкулеза выявляются без видовой дифференциации; микобактерии, не относящиеся к MTC (например, M.avium и M.paratuberculosis) - не выявляются. Данный набор реагентов используется в топической диагностике туберкулеза и позволяет быстро (за несколько часов) с высокой чувствительностью и специфичностью (близким к 100%) определять наличие микобактерий туберкулеза в образце биоматериала.

Благодаря высокой скорости и информативности в диагностике туберкулеза, методы амплификации нуклеиновых кислот (в том числе ПЦР) в 2010 году были предложены CDC США для подтверждения диагноза туберкулеза наряду с культуральным методом.

Видовая дифференциация микобактерий туберкулеза методом ПЦР

Не менее важно дифференцирование до вида внутри группы MTC. Это связано с необходимостью определения источника заболевания, определения тактики противотуберкулезной терапии, а также для подтверждения случаев поствакцинальных осложнений.

С этой задачей позволяет справиться набор реагентов АмплиСенс® МТС-diff-FL, предназначенный для дифференцирования видов микобактерий туберкулеза внутри MTC: человеческого (M.tuberculosis), бычьего (M.bovis) и вакцинного штамма (M.bovis BCG) – в клиническом материале и культурах микроорганизмов.

Актуальность видовой дифференциации определяется, например, тем, что разные виды микобактерий отличаются профилем лекарственной устойчивости. Например, M.bovis и её вакцинный штамм M.bovis BCG отличаются природной резистентностью к одному из основных противотуберкулезных препаратов - пиразинамиду. Поэтому при туберкулезе, вызванной M.bovis, и БЦЖите пиразинамид не назначается.

Приказом Минздрава РФ от 21.03.2003 № 109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" (ред. от 29.10.2009) регламентировано применение наборов реагентов, дифференцирующих M.bovis от ее вакцинного штамма M.bovis BCG, для диагностики БЦЖита.

Определение лекарственной устойчивости туберкулеза

Распространение штаммов туберкулеза с лекарственной устойчивостью, в том числе с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ, или MDR) составляет одну из серьезнейших проблем современного здравоохранения. Определение лекарственной устойчивости туберкулеза с помощью молекулярно-биологических методов всё шире применяется ввиду высокой скорости получения результатов (1-2 дня), что становится возможным благодаря использованию не только первичной культуры, но и непосредственно клинического материала.

Важно понимать, что наборы реагентов, основанные на разных молекулярно-биологических методах, характеризуются разными показателями диагностической чувствительности и специфичности.

Наименование набора реагентов	АмплиСенс® MTC-Rif-Seq	АмплиСенс® MTC-PZA-Seq
Исследуемый ген	rpo B	pnc A
Препараты, к которым определяется устойчивость	рифампицин	пиразинамид
Кол-во выявляемых мутаций	более 200	более 500

Наборы включают реагенты для амплификации фрагментов ДНК микобактерий туберкулеза, очистки продуктов амплификации (сорбентным методом), определения концентрации очищенного продукта амплификации и праймеры для секвенирования. Наборы для экстракции ДНК (АмплиПрайм РИБО-преп или ДНК-сорб-С ) и реагенты для проведения реакции секвенирования приобретаются отдельно.

Нормативные документы, публикации, информационные материалы >>

Туберкулез — проблема не только социальная.

кандидат биологических наук
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва

Динамика заболеваемости туберкулезом в России
(вверху — всего населения, в середине — детей) и смертности от него.

По данным ВОЗ, туберкулезом инфицирована одна треть жителей нашей планеты. Ожидается, что к 2010 г. будет около 1 млрд вновь инфицированных, более 200 млн заболевших, а 70 млн умрет от этой болезни. К сожалению, таковы печальная статистика и не менее пессимистический прогноз. Однако не надо забывать, что впечатляющие успехи в научных разработках по молекулярной биологии туберкулеза могут быть реально использованы для точной диагностики и производства более эффективных вакцин и новых лечебных средств.

Особенности строения и функционирования возбудителя туберкулеза

В конце 1998 г. усилиями огромного коллектива молекулярных биологов из Великобритании, США, Франции и Дании полностью расшифрован геном Mycobacterium tuberculosis H37Rv — наиболее изученного лабораторного штамма (Cole S.T., Brosch R., Parkhill J. et al. // Nature. 1998. V.393. №6685. P.537—544). Этот самый медленно растущий на искусственных средах микроорганизм имеет довольно большой геном (4 411 529 пар нуклеотидов), 65.6% которого составляют гуанин и цитозин, что соответствующим образом отражается на аминокислотном составе бактериальных белков, которые в свою очередь определяют специфические особенности заболевания. Из 4000 генов 60 кодируют функциональные компоненты РНК: уникальный рибосомальный РНК оперон, 10Sа РНК, участвующий в деградации белков с нетипичной матричной РНК, РНК компонент фермента РНК-азы Р, а также 45 транспортных РНК (тРНК).

Причиной медленного роста микобактерий на искусственных средах, вероятно, служит необычайно большое расстояние между оперонами rrn и сайтами репликации oriC . Гены, кодирующие тРНК, которые узнают 43 из 61 возможных смысловых кодонов, распределены по всему геному. Интересно, что ни одна из многочисленных тРНК туберкулеза не узнает аденин в первой позиции антикодона, что в конечном итоге влияет на ход трансляции. Помимо большого количества гуанина и цитозина в геноме M. tuberculosis имеется множество вставок, повторяющихся по всему геному: IS 6110 — 16 раз, IS 1081 — 6 раз, а также другие повторы с меньшим числом копий. Устойчивость бактериальных клеток к лизису в культуральной среде определяют две профаговые последовательности. Выяснилось, что бактериальная клетка синтезирует все необходимые для своего обмена компоненты — незаменимые аминокислоты, витамины, ферменты и кофакторы. В ее геноме представлены гены самых разных ферментов: липидного обмена, гликолиза, цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного пути. По сравнению с другими видами бактерий у M. tuberculosis повышена активность ферментов липогенеза. Имеются два гена, которые кодируют гемоглобинподобные белки, играющие роль антиокислительных протекторов или ловушек избытка клеточного кислорода. Эти особенности способствуют быстрой адаптации туберкулезных бацилл к резким изменениям окружающей среды.

Несмотря на полную расшифровку структуры генома палочки Коха, пока не ясен механизм ее патогенности. Понятно только, что в патогенезе играют роль не единичные гены и даже не согласованное действие двух или же нескольких факторов. Ранее было известно, что за вирулентность микобактерий туберкулеза ответственны: ферменты каталаза и пероксидаза, нейтрализующие действие активного кислорода, который продуцируют фагоциты; ген mce , кодирующий макрофаг-колониобразующий фактор и sigma -фактор sig A ( aka rpoV ), мутация которого может привести к ослаблению жизнеспособности бактерий, а кроме того, клеточная стенка бактерии. Сложность ее состава не позволила пока выяснить механизм вирулентности. Анализ секрета микобактерий показал, что помимо протеаз патогенными свойствами могут обладать фосфолипаза С, липаза и эстераза — ферменты, атакующие клеточные и вакуолярные мембраны тканей человека.

Иммунологические аспекты туберкулеза

В борьбе с туберкулезом, как и со всякой другой серьезной инфекцией, немаловажная роль отводится своевременной и эффективной вакцинации, а также созданию более действенных лекарств, в частности препаратов нового поколения. В настоящее время наметились основные направления получения новых высокоэффективных средств. Это, во-первых, многообещающая ДНК-вакцина, а также использование в качестве иммуногенных препаратов секретируемых или поверхностных белков возбудителя. Благо, что структура этих белков после полного прочтения генома M. tuberculosis стала известна. Все еще широко распространены традиционные методы вакцинации рекомбинантными формами и ослабленными штаммами M. tuberculosis .

По ходу расшифровки генома микобактерии определены более 90 липопротеинов, среди которых есть ферменты и другие компоненты транспортной системы. Одним из сюрпризов геномного проекта вообще стало открытие обширного семейства двух основных богатых глицином белков, которые, судя по предсказанному нуклеотидному составу их генов, имеют интересные иммунологические особенности и высокополиморфны. Гены этих белков составляют примерно 10% кодирующего сектора всего генома и объединены в компактные кластеры — всего 167 членов обоих семейств. Субклеточная локализация таких белков неизвестна (они вездесущи), как и функции многих белков этого семейства, и поэтому не стоит спекулировать и списывать на них все загадочные метаморфозы с туберкулезной палочкой. Однако в настоящее время установлено, что богатые глицином кислые белки служат причиной антигенной вариации микобактериальной клетки и играют ключевую роль во взаимодействии с иммунной системой хозяина, ингибируя иммунный ответ.

Устойчивость к лекарствам

M. tuberculosis по своей природе нечувствительны ко многим антибиотикам. Это свойство в первую очередь связано с тем, что высоко гидрофобная клеточная поверхность служит своего рода физическим барьером для гидрофильных терапевтических агентов и антибиотиков. Устойчивость микобактерии к антибиотикам и другим терапевтическим средствам обеспечивается также активностью гидролаз, модифицирующих ферментов, таких как бета-лактамаза и аминоглюкозидацетилтрансфераза, и многих других ферментных систем, взаимодействующих с лекарственными препаратами. Однако главная причина устойчивости все же закодирована в структуре генома туберкулезной палочки.

Неожиданно резкий скачок смертности от туберкулеза — результат действия многих факторов, один из которых — непомерно интенсивное и бесконтрольное использование антибиотиков, с одной стороны, и пренебрежительное отношение к достижениям мировой практики лечения туберкулеза, халатность и низкое качество медицинской культуры — с другой. А о множестве других социальных факторов сегодня можно прочесть почти в каждой газете.

Современная медицинская наука имеет дело не просто с опасным возбудителем туберкулеза, а с целым набором штаммов, устойчивых к разным лекарствам. Естественно, что важно не только обнаружить туберкулезную палочку, а параллельно определить ее резистентность, причем достаточно быстро — в течение двух-трех дней, чтобы вовремя назначить эффективный препарат. По традиционным методам выращивания в культуре M. tuberculosis на получение чистого штамма требуется от трех до восьми недель, для определения его резистентности еще три-шесть недель. Более быстрый радиометрический метод дает результаты не раньше чем через 20 дней.

Но в конце 80-х годов в руках исследователей появился метод, значительно сокращающий время такого анализа. Новая диагностика основана на избирательной амплификации нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) in vitro с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (За ее разработку К.Муллис получил в 1993 г. Нобелевскую премию. Подробнее см.: Берлин Ю.А., Белянова Л.П. Лауреаты Нобелевской премии 1993 года // Природа. 1994. №1. С.104—109). Метод имеет фантастические возможности и лежит в основе точной ДНК-диагностики, которая позволяет идентифицировать любой штамм туберкулезной микобактерии и определять первопричину той или иной устойчивости к лекарствам.

Лабораторные исследования показали, что это свойство связано с нуклеотидными заменами (мутациями) в генах, кодирующих различные ферменты, которые непосредственно взаимодействуют с лекарственными средствами. Так, мутации гена rpoB, кодирующего бета -субъединицу РНК-полимеразы (во фрагменте длиной 81 пару нуклеотидов), в 96% случаев приводят к устойчивости M. tuberculosis к рифампицину. Мутации в гене katG , приводящие к замене некоторых аминокислот в ферментах каталазе и пероксидазе, и нуклеотидные замены в регуляторной и смежной кодирующей областях локуса inhA ассоциированы с резистентностью некоторых штаммов микобактерий к изониазиду. Устойчивые к флюорохинолону штаммы имеют аминокислотные замены в альфа -субъединице ДНК-гиразы. Нечувствительность M. tuberculosis к стрептомицину связана с миссенс-мутацией в гене rpsL , кодирующем S12 митохондриальный белок, или с нуклеотидными заменами в гене rrs , кодирующем 16S РНК.

Сравнение генетической структуры нескольких штаммов показало, что устойчивость к рифампицину, обусловленная мутацией в гене rpoB , может служить маркером для определения множественной резистентности — к трем и более противотуберкулезным препаратам.

Открытие функционального значения тысяч генов и молекулярных механизмов действия множества ферментов стало революционным событием в биологии, оказавшим и продолжающим оказывать огромное влияние на развитие медицины XXI в. Перед учеными и медиками открылись уникальные возможности для выяснения причин многих инфекционных и наследственных заболеваний, а также разработки эффективных методов их лечения. В свою очередь, развитие новых диагностических методов потребовало и создания новых технологий многопараметрического анализа биологических образцов, с помощью которых можно одновременно исследовать множество белковых и ДНК-маркеров различных заболеваний, функционально-значимых биологических макромолекул и их комплексов. Так появилась технология биологических микрочипов, способных, подобно микрочипам электронным, извлекать и обрабатывать огромные массивы информации из одного небольшого образца биологического материала, полученного от конкретного пациента

За последние десятилетия был накоплен огромный объем знаний о молекулярных основах биохимических процессов в живых организмах. Это дало возможности не только точно диагностировать то или иное заболевание, но и оценить вероятность его возникновения еще до проявления у пациента клинических симптомов, а также подобрать эффективную терапию. Подавляющую часть такой информации получают с помощью лабораторной диагностики, на которую в мире ежегодно расходуется свыше 100 млрд долларов. В России в 1970 г. она насчитывала 81 биохимический / молекулярный тест, в 2000 г. – 170, а сегодня число тестов измеряется тысячами!

Сегодня ведущие научные журналы регулярно публикуют обзоры, посвященные биологическим микрочипам, которые производят многие десятки компаний, а объем продаж составляет сотни миллионов долларов в год. Вместе с тем сама идея создания биочипов родилась лишь четверть века назад, и одним из мест рождения этой технологии стал Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук.

С самого начала подход российских исследователей отличался удачным выбором ключевых технологических решений, благодаря которым технологии биочипов ИМБ РАН продолжают оставаться конкурентоспособными в мировой науке. Многие из этих подходов (например, замена радиоактивных меток на флуоресцентные, применение гидрогеля и элементов сферической формы) стали использовать в своей работе другие исследователи, занимающиеся разработкой биочипов. А с 2000 г. в ИМБ РАН при поддержке Международного научно-технического центра начались работы по созданию биочипов для медицинской диагностики возбудителей социально значимых заболеваний.

Биочипы в деле

Для регистрации результатов анализа используют флуоресцентные метки, которые вводят в молекулы образца. Если зонд специфично распознает и свяжется с мишенью, в ячейке возникает флуоресценция. Интенсивность свечения ячеек биочипа измеряется с помощью специальных аппаратно-программных комплексов-анализаторов, которые и выдают отчет о присутствии в исследуемом образце специфичных молекулярных мишеней, информирующих о наличии микроорганизмов или генных мутаций, онкомаркеров или аллергенов и т. п.

Оригинальная технология создания таких гелевых чипов, разработанная в ИМБ РАН, была запатентована и сертифицирована по европейским стандартам. Биочипы, созданные по этой технологии, занимают отдельную нишу диагностических микроматриц и применяются в российских клиниках. Коммерческие микроматрицы, произведенные ведущими научно-производственными корпорациями Германии и США применяются, в основном, в исследовательских целях.

Туберкулез и лекарственная устойчивость

Почему внимание исследователей привлек именно туберкулез? Дело в том, что многие десятилетия для борьбы с этой болезнью использовали комбинированное лечение сразу несколькими химиопрепаратами, чтобы повысить его эффективность. При монотерапии больные быстро приобретали устойчивость к лекарству. Однако такая стратегия привела к тому, что уже в конце прошлого века в мире, в том числе и в России, начал повсеместно распространяться туберкулез со множественной лекарственной устойчивостью. Именно этот фактор в наши дни чаще всего является причиной неудачного исхода лечения и возникновения рецидива болезни, от которой ежегодно в мире умирает более 3 млн человек.

От гепатита до рака и аллергий

Еще одной актуальной проблемой мирового здравоохранения является лечение больных гепатитом С. Возбудитель этого вирусного заболевания может долгое время размножаться в печени, ничем не выдавая себя, а первые признаки болезни обнаруживаются лишь спустя пару месяцев после заражения. Еще недавно гепатит С считался практически неизлечимой болезнью, а основным терапевтическим средством служила комбинация из интерферона и рибавирина, которая зачастую оказывалась неэффективной и имела много негативных побочных эффектов.

Сегодня созданы новые антивирусные препараты, обладающие так называемым прямым противовирусным действием и блокирующие ключевые внутриклеточные этапы размножения возбудителя. Но вся сложность в том, что вирус гепатита С имеет 7 вариантов генотипа, при этом каждый генотип имеет еще несколько подтипов. Более того, разные генотипы/подтипы обладают и разной чувствительностью к традиционным и новым препаратам, и выбор противовирусной терапии должен проводиться в соответствии с генотипическими особенностями возбудителя.

Важнейшим направлением приложения технологии гидрогелевых биочипов служит анализ мутаций и полиморфизмов ДНК самого человека: ДНК-маркеров, ассоциированных с возникновением различных неинфекционных заболеваний.

Важно, что для анализа антител на 30 и более аллергенов на биочипе требуется очень небольшой (всего 60 мкл) объем сыворотки крови – ровно столько, сколько требуется для анализа на один аллерген традиционным иммуноферментным методом! Такое отличие особенно значимо в педиатрии. Лабораторный вариант этой тест-системы уже проходит доклинические испытания в Детской городской клинической больнице № 13 им. Н. Ф. Филатова (Москва).

Двенадцать специализированных тест-систем, созданных на основе технологии гидрогелевых биочипов в ИМБ РАН, получили разрешение к применению как медицинские изделия для лабораторной диагностики. Эти тест-системы успешно используются более чем в 50 научно-исследовательских и медицинских центрах РФ, стран СНГ и ЕС.

Технологии биочипов, разработанные в ИМБ РАН, защищены 42 отечественными и международными патентами. И эти технологии продолжают интенсивно развиваться. Разрабатываются новые подходы, позволяющие упростить и ускорить методики, интегрировать в единую процедуру все стадии проведения анализа: от обработки биологического образца до количественной идентификации в режиме реального времени.

Грядунов Д. А., Зименков Д. В., Михайлович В. М. и др. Технология гидрогелевых биочипов и ее применение в медицинской лабораторной диагностике // Медицинский алфавит. 2009. № 3. С. 10—14.

Заседателев А. С. Биологические микрочипы для медицинской диагностики // Наука и технологии в промышленности. 2005. № 1. С. 18—19.

Колчинский А. М., Грядунов Д. А., Лысов Ю. П. и др. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы // Молекулярная биология. 2004. Е. 38 № 1. С. 5—16.

Arenkov P., Kukhtin A., Gemmell A., et al. Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reactions // Analytical Biochemistry. 2000. V. 278. N. 2. P. 123—131.

Emelyanova M., Ghukasyan L., Abramov I. et al. Detection of BRAF, NRAS, KIT, GNAQ, GNA11 and MAP2K1/2 mutations in Russian melanoma patients using LNA PCR clamp and biochip analysis // Oncotarget. 2017. V. 32. N. 8. P. 52304—52320.

Feyzkhanova G., Voloshin S., Smoldovskaya O. et al. Development of a microarray-based method for allergen-specific IgE and IgG4 detection // Clinical proteomics. 2017. doi: 10.1186/s12014-016-9136-7.

Gryadunov D., Dementieva E., Mikhailovich V. et al.Gel-based microarrays in clinical diagnostics in Russia // Expert review of molecular diagnostics. 2011. N. 11 P. 839—853.

Khrapko K. R., Lysov Yu. P., Khorlyn A. A. An oligonucleotide hybridization approach to DNA sequencing // FEBS Letters. 1989. V. 256. N. 1-2. P. 118—122.

Zimenkov D. V., Kulagina E. V., Antonova O. V., et al. Simultaneous drug resistance detection and genotyping of Mycobacterium tuberculosis using a low-density hydrogel microarray // Journal of antimicrobial chemotherapy. 2016. V. 71. N. 6. P. 1520—1531.

Читайте также:

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.