Посев туберкулеза на жидких средах

В соответствии с современными программами ВОЗ, основой выявления туберкулёза за рубежом считают проведение микроскопии мазков мокроты, полученной от кашляющих больных, обратившихся к врачам общей практики; мазки окрашивают по Цилю-Нильсену. Эта методика входит в отечественный поликлинический и клинический минимум обследования пациента, выделяющего мокроту. В 1995 г. Минздравмедпром России в приказе № 8 "О развитии и совершенствовании деятельности лабораторной клинической микробиологии (бактериологии) лечебно-профилактических учреждений" подтвердил эту обязанность клинико-диагностических лабораторий. Обязательное бактериологическое исследование мокроты на М. tuberculosis должно быть организовано для нетранспортабельных больных, больных хроническими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящей системы, а также для работников неблагополучных по туберкулёзу животноводческих хозяйств. Этот старейший метод полностью сохраняет свое значение вследствие доступности для практических клинико-диагностических лабораторий, низкой стоимости и быстроты выполнения.

При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 - 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии, что и является большим минусом этого метода. Только при идеальном выполнении всех требуемых условий, указанных в Приказе № 109 МЗ РФ,-исследование не менее трех проб диагностического материала, правильный сбор мокроты, наличие современного бинокулярного микроскопа и высококачественных реактивов, просмотр до 300 полей зрения - возможно повышение чувствительности до 10000 микробных клеток.

Микобактерии туберкулёза имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке (рисунок 1,а) Окрашенные по Цилю-Нильсену мазки микроскопируют с иммерсионной системой не менее 10 мин.

Люминесцентная микроскопия

Метод основан на проникновении в микробную клетку карболового производного флюоресцентного красителя (аурамина, родамина). При окраске флюоресцентным красителем аурамином-родамином микобактерии можно видеть при неиммерсионном 100-кратном увеличении. Более точен результат при окраске по Цилю-Нильсену карболфуксином и иммерсионной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Именно окраска мазка по Цилю-Нильсену рекомендована при применении технологий DOTS. Микобактерии в этом случае выглядят светящимися желтыми палочками (рисунок 1, б). Метод имеет неоспоримые преимущества, так как позволяет при меньшем увеличении микроскопа просмотреть фактически весь мазок, так же этот метод экономически более эффективен, так как уменьшается время, затрачиваемое на просмотр мазков.

К недостаткам метода ЛМ следует отнести значительно более высокую стоимость люминесцентного микроскопа, при процедуре окрашивания- соблюдение и коррекция pH мазка, а также освобождение микобактерий в диагностическом материале (особенно в мокроте) от окружающей их слизи, которая препятствует проникновению флуоресцентного красителя в микробную клетку. Поэтому нецелесообразно использование ЛМ для нативной мокроты, но применять этот метод рекомендуется при исследовании мазков, приготовленных после центрифугирования из осадка материала, обработанного для культурального исследования и нейтрализованного после деконтаминации. Поэтому метод ЛМ следует применять в бактериологических лабораториях, где культуральное и микроскопическое исследование может быть произведено из одной и той же порции диагностического материала.

При гистологическом или цитологическом исследовании иногда можно обнаружить характерные для туберкулёза клетки, являющиеся результатом защитной реакции организма на внедрение туберкулёзной палочки. Наличие в цитограмме гигантских клеток Лангханса с несомненностью решает диагноз туберкулёза. Эти клетки имеют очень большие размеры (80 - 90 мкм и более в диаметре). Цитоплазма окрашена в серо-голубой цвет. По её периферии расположено в ряд большое количество ядер (до 20), расположенных в форме кольца (рисунок 1, в).

Другим признаком туберкулёза является присутствие в препарате так называемых эпителиоидных клеток, из которых и развиваются клетки Лангханса. Это происходит при увеличении количества ядер без разделения цитоплазмы, которая только увеличивается в размерах (рисунок 1, г).

Микроскопия позволяет быстро получить результат, но обладает низкой чувствительностью и специфичностью, невозможностью дифференциации кислотоустойчивых микобактерий.

Рисунок 1

Микобактерии туберкулеза
а - метод окраски по Цилю-Нельсену
б - метод люминисцентной микроскопии
в - клетки Лангхаса
г - эпителиоидные клетки

Наиболее распространенным методом выявления микобактерий туберкулеза в нашей стране является культуральный метод. Это "золотой стандарт" бактериологической диагностики туберкулеза, так как чувствительность метода существенно выше микроскопического и дает возможность получить чистую культуру микобактерий для её последующей идентификации и исследования лекарственной устойчивости. Этот метод дает положительные результаты при наличии в исследуемом материале от 20 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл. Однако он трудоемок и длителен в связи с тем, что микобактерии туберкулеза растут очень медленно и их обнаружение может быть зарегистрировано только через 3 недели культивирования.

Исторически сложилось, что питательные среды на яичной основе (Левенштейна-Йенсена, Финна-2, Огавы, Аникина, "Новая", Попеску) получили наибольшее распространение среди плотных питательных сред, применяемых для выделения МБТ. Посев материала на среду Левенштайна-Йенсена проводят в бактериологической лаборатории. Рост первых колоний на классических средах отмечают через 4 - 8 недель. Однако появившиеся в последние годы агаровые среды Миддлбрука (7Н10, 7Н11) позволяют быстрее обнаружить рост микобактерий (от двух до четырех недель) и обеспечивают лучшие возможности для изучения морфологии колоний, чем на яичных средах. Недостатком агаризованных питательных сред является необходимость инкубации посевного материала в термостате с углекислым газом, поэтому агаризованные среды в России практически не применяются.

Следует отметить, что в связи с высокой избирательностью различных штаммов микобактерий и потребностью в полноценных белках до сих пор нет универсальной питательной среды, способной заменить все остальные. В Приказе № 109МЗ РФ для посева диагностического материала на МБТ рекомендуется использовать по одной пробирке международной питательной среды Левенштейна-Йенсена и Финна-2. Однако практика показывает, что кроме указанных сред целесообразно использовать и какую-либо из дополнительных, а посев на три пробирки питательной среды также повышает эффективность культуральной диагностики.

Для полноценной культуральной диагностики туберкулеза необходимо иметь соответствующие помещения и оборудование. Особенно важно наличие центрифуги и антиаэрозольной защитой и способностью обеспечить ускорение 3000g. А также шкафов биологической безопасности для предотвращения внутрилабораторного инфицирования.

Основным недостатком культуральной диагностики туберкулеза является длительность исследования - от трех недель до трех месяцев. Поэтому остаются актуальными дальнейшие исследования по разработке методов ускорения роста микобактерий.

Культуральная диагностика туберкулеза переживает в настоящее время принципиальные изменения, связанные с внедрением в практику полностью автоматизированных систем культивирования МБТ. Главное отличие этих методов - применение жидких питательных сред для культивирования с последующей радиометрической (BACTEC 460), колорометрической (Mb-Bact, Вас- tALERT) и люминесцентной детекцией роста (BACTEC MGIT 960). Рост МБТ на жидкой питательной среде в этих системах удается обнаружить уже через 1 - 2 недели в зависимости от их исходного количества в диагностическом материале. Частота выявления микобактерий так же несколько выше, чем на плотных питательных средах. Автоматизированные системы BACTEC с использованием соответствующих флаконов, содержащих различные противотуберкулезные препараты, позволяют сократить время исследования лекарственной устойчивости микобактерий до 10 - 14 суток.

Из перечисленных автоматизированных систем наиболее эффективна в настоящее время система BACTEC MGIT 960BD. Флаконы MGIT с жидкой питательной средой 7Н9 содержат в придонной части под силиконом флуоресцентный индикатор, "погашенный" высокими концентрациями кислорода. При наличии роста микобактерий в процессе поглощения кислорода индикатор начинает светиться, регистрация флуоресценции в сисиеме BACTEC MGIT производится автоматически. Использование флаконов MGIT возможно и "вручную", тогда регистрацию свечения производят с помощью трансиллюминатора на флаконах MGIT составляет 11 суток.

Основным недостатком BACTEC MGIT, как и других систем BACTEC, является высокая стоимость оборудования (до 100000 долларов США) и флаконов с питательной средой - посев одной пробы диагностического материала стоит до 400 рублей.

Так называемые дефектные по клеточной стенке L-формы микобактерий и других инфекционных патогенов являются результатом изменчивости и основным видом персистирования, то есть переживания в неблагоприятных условиях. Посев на L-формы особенно эффективен при внелегочном туберкулезе, поскольку вегетация МБТ в очагах ВЛТ при повышенном ацидозе и анаэробиозе приводит к снижению их жизнеспособности и ферментативной активности.

Диагноз не может быть поставлен только на основании выявления L-форм микобактерий, но их обнаружение, особенно при верификации методом ПЦР, является весомым аргументом в пользу туберкулезной природы заболевания. В очагах внелегочного туберкулеза наблюдается ранняя L-трансформация микобактерий, поэтому их обнаружение позволяет поставить диагноз на начальных стадиях заболевания.

Для культивирования микобактерии туберкулеза используют различные питательные среды: плотные, полужидкие, жидкие (синтетические и полусинтетические). Однако ни одна из них не обладает качествами, предъявляемыми к ним современной бактериологической диагностикой туберкулеза. В связи с этим для повышения результативности культурального метода рекомендуется применять посев патологического материала одновременно на несколько (2-3) питательных сред. Для выделения чистых культур микобактерии туберкулеза чаще всего применяют различные по составу плотные питательные среды. В качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя и определения его лекарственной чувствительности ВОЗ рекомендована среда Левенштейна-Йенсена. Это плотная яичная среда, на которой хороший рост микобактерии туберкулеза получают на 15-25-й день после посева бактериоскопически положительного материала.

В последние годы широкое распространение в нашей стране получила яичная среда II, предложенная Э.Р. Финном (среда Финна-II). Она отличается от среды Левенштейна-Йенсена тем, что вместо b-аспарагина в ней используется глутамат натрия. На этой среде рост микобайтерий туберкулеза появляется на несколько дней раньше, чем на среде Левенштейна-Йенсена. Процент выделения культур на этой среде на 6—8% выше, чем на среде Левенштейна-Йенсена.

Для повышения вероятности получения роста микобактерии рекомендуется засевать патологический материал на 2—3 различные по составу питательные среды одновременно. В настоящее время, кроме безаспарагиновой среды Финна-И, в практику внедряется еще одна безаспарагиновая среда, разработанная В.А. Аникиным. По данным Московского НИИ туберкулеза, применение сред, сбалансированных по солевому составу и источникам азотистого питания иначе, чем среда Левенштейна-Йенсена, культуральная диагностика туберкулеза улучшается в среднем на 6,7%. Это особенно важно при таких формах туберкулеза, при которых возбудитель паразитирует в условиях ацидоза и анаэробиоза, в частности, при туберкулезе мочеполовых органов.

Для повышения результативности культурального метода наряду с применением одновременно нескольких различных по составу питательных сред для посева рекомендуется повторное многократное исследование материала, так как в настоящее время отмечается состояние олигобациллярности у большинства больных даже со свежевыявленными деструктивными поражениями в легких. Олигобациллярность проявляется не только малым количеством возбудителей в диагностическом материале, но и транзиторностью, эпизодичностью их выделения. Поэтому часто посев даже на 3 различные питательные среды не обеспечивает полной информации о состоянии бактериовыделения.

Для повышения информативности культурального метода практикуется повторное многократное исследование материала от больных. По данным Центрального НИИ туберкулеза, методика 3-кратного первичного комплексного исследования бактериоскопическими и культуральными методами у впервые выявленных больных деструктивным туберкулезом легких дает дополнительно 3,4% положительных результатов, а у больных хроническим деструктивным туберкулезом, лечившихся до поступления в стационар, — 5,8% по сравнению с данными одноразового исследования. Однако, по данным ряда авторов, и 3-кратные посевы недостаточны для выявления истинной картины бактериовыделения. Так, установлено, что при обследовании нелечившихся больных максимальный прирост информации о бактериовыделении можно получить при 6-кратных повторных посевах материала, при этом количество положительных результатов возрастает на 36—37% по сравнению с данными 3-кратного посева. У больных после 3-месячного лечения ценность многократного исследования патологического материала методом посева возрастает и при 6-кратном исследовании показатель прироста положительных результатов может достигать 70%, а после 6 мес лечения он возрастает до 82%.

Таким образом, кратность исследования и состав питательных сред имеют важное значение для культуральной диагностики туберкулеза.

В связи с тем что в процессе интенсивной химиотерапии происходит повреждение различных метаболических систем микробной клетки, ряд микроорганизмов в микобактериальной популяции утрачивает способность нормально развиваться на питательных средах. Отмечается снижение жизнеспособности микобактерий, что может проявляться отсутствием роста на общепринятых питательных средах, а также возникновением способности расти только на осмотически сбалансированных (полужидкие или даже жидкие) питательных средах. Так, по данным И.Р. До рожковой, в процессе интенсивной противотуберкулезной химиотерапии часть микобактериальной популяции, утрачивая способность расти на плотных питательных средах, в то же время приобретает свойство расти на полужидких питательных средах, образуя микроколонии в верхнем наиболее аэрируемом участке питательной среды. Эта потребность в повышенной аэрации четко проявляется также при культивировании микобактерий в жидких питательных средах с увеличенной аэрацией, которая достигается при культивировании посевов во вращающемся термостате (Н.М. Макаревич).

После посева и закрытия пробирок материал должен быть распределен по всей поверхности питательной среды, для этого пробирки наклоняют. Пробирки должны находиться в горизонтальном положении в течение 24—48 ч, после чего их следует перевести в вертикальное положение.

Посевы нужно просматривать еженедельно. При этом обязательно регистрируются параметры:

• а) появление роста — срок появления, начиная со дня посева;
• б) интенсивность роста — число колоний, этот показатель имеет большое диагностическое и прогностическое значение, особенно если посевы производятся в динамике;
• в) загрязнение посева посторонней микрофлорой или грибами;
• г) отсутствие роста.

При первичном посеве бактериоскопически отрицательного материала на плотные среды средняя продолжительность роста составляет 20—46 дней. Отдельные штаммы растут 60 и даже 90 дней. Это заставляет выдерживать посевы в термостате в течение 3 мес, еженедельно проверяя появление роста.

Обычно вирулентные культуры микобактерий туберкулеза растут на плотных питательных средах в виде R-форм колоний различной величины и вида. Колонии сухие, морщинистые, цвета слоновой кости, но в случае диссоциации могут встречаться и влажные, слегка пигментированные колонии, розовато-желтый пигмент которых резко отличается от оранжевого или желтого пигмента сапрофитных или атипичных микобактерий. Последние обычно растут в S-форме. Следует отметить, что на среде Финна-II колонии микобактерий туберкулеза могут быть более влажными.

После курса химиотерапии от больных туберкулезом могут выделяться гладкие колонии с влажным ростом (S-формы). Гладкие колонии характерны также для Mycobacterium bovis, которые также патогенны для человека.

Интенсивность роста обозначают по 4-балльной системе: + единичные колонии; ++ от 20 до 100 колоний; +++ от 100 до 200 колоний; мм несосчитываемое число колоний (сливной рост). В двух последних случаях имеется обильное бактериовыделение, которое является показателем активности процесса и/или неэффективности лечения.

Если морфология колоний или палочек вызывает сомнения в их туберкулезной природе или культуры выделены из материала, который может содержать кислотоустойчивые сапрофиты (моча, гной из ушей и др.), мазки дополнительно обесцвечивают спиртом (в течение 45—60 мин) или жавелевой водой (в течение 1—2 ч). Следует учитывать, что молодые культуры микобактерий туберкулеза могут обесцвечиваться спиртом и жавелевой водой, так как они еще слабо кислотоустойчивы. В таких случаях культуры следует выдержать еще несколько дней (5—10) в термостате и вновь повторить микроскопическое исследование, чтобы убедиться в их кислотоустойчивости.

Авирулентные сапрофитные и атипичные микобактерий обычно грубее, толще, иногда менее интенсивно окрашены и, как правило, не образуют жгутообразных сплетений (корд-фактор отсутствует). Однако некоторые виды атипичных микобактерий (фотохромогенные) могут расти в R-форме. Многие атипичные и сапрофитные микобактерий имеют кислотоустойчивые зерна, весьма сходные с таковыми у вирулентных микобактерий туберкулеза.

В тех случаях, когда выделяются культуры, вызывающие сомнения в плане их принадлежности к микобактериям туберкулеза, их изучают, используя комплекс специальных исследований, позволяющих дифференцировать типичные микобактерий туберкулеза от нетуберкулезных (атипичных) микобактерий и кислотоустойчивых сапрофитов.

Как отмечалось выше, в случае появления на питательных средах роста колоний и установления с помощью микроскопии окрашенных по Цилю — Нильсену мазков факта, что выросшая культура относится к кислотоустойчивым микобактериям, производится количественная оценка результатов посева. С этой целью применяют различные схемы оценки (одна из них приведена выше). В Центральном НИИ туберкулеза используют количественную оценку бактериовыделения методом посева по 3 степеням:

1. скудное — на плотных питательных средах вырастает 1—20 колоний во всех пробирках, использованных для данного посева;
2. умеренное — от 21 до 100 колоний во всех пробирках;
3. обильное — обнаруживается рост более 100 колоний во всех пробирках.

ДИАГНОСТИКА В МЕДИЦИНЕ

Поступила 02.09.2009 г.

Т. Р. ВОЗЯКОВА, О. Е. СТЕБЛОВСКАЯ,

В. Н. МАКСИМОВА, Ж. В. ЕЛЕНКИНА,

МЕТОД УСКОРЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

Республиканский противотуберкулезный диспансер,

Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова, Чебоксары

Представлены результаты сравнения диагностических возможностей автоматизированной системы BACTEC MGIT 960 с использованием жидкой питательной среды для выделения МБТ и определения лекарственной чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам с традиционными методами культуральный диагностики на плотных питательных средах Левенштейна - Йенсена. Автоматизированная система ВАСТЕС MGIT 960 сокращает сроки выделения МБТ из диагностического материала в среднем до 10-20 дней, уменьшает длительность определения лекарственной чувствительности МБТ до 6-15 дней с момента выделения культуры и имеет специальный набор реактивов для тестирования чувствительности МБТ к пиразинамиду.

These are the comparison results of diagnostic possibilities of automated system BACTEC MGIT 960 using liquid TB medium and detection of MTB susсeptibility to TB drugs and traditional methods of cultural diagnostics with solid medium . Automated system BACTEC MGIT 960 reduces the terms of MTB growth up to 10-20 days in average and the terms of detection of MTB susсeptibility to TB drugs up to 6-15 days from the date of culture detection. There is a special range of reagents for MTB susceptibility topyrazinamid.

Принципиально новый уровень бактериологической диагностики туберкулеза достигнут внедрением в практику автоматизированных систем бульонного культивирования для ускоренного выявления микобактерий BACTEC MGIT 960 ("Becton Dickinson") и MB/BacT ("Organon Teknika"), позволяющих выявлять рост культуры в диагностическом материале в течение 10 - 20 дней [7; 4].

Автоматизированная система BACTEC MGIT 960 зарекомендовала себя надежным методом микробиологической диагностики туберкулеза как в мире, так и во многих регионах России [1, 2, 4, 5, 7, 10, 11, 13]. Эталонные исследования эффективности использования автоматизированных систем культивирования на жидких питательных средах BACTEC MGIT 960 и их преимуществ по сравнению с традиционным методом посева на плотные среды проведены в Московском городском научно - практическом Центре борьбы с туберкулезом под руководством доктора медицинских наук В. И. Литвинова [4, 7].

По данным авторов, чувствительность автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 по выделению культур МБТ оказалась на 10% выше традиционного способа посева на среду ЛЙ. Система BACTEC MGIT 960 продемонстрировала также более высокую высеваемость МБТ из бактериоскопически негативного материала, примерно на 15%, по сравнению с плотными средами. Для бактериоскопически позитивного материала чувствительность жидких и плотных сред для культивирования оказалась идентичной [4].

По данным зарубежных исследователей, в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960 удалось получить примерно на 2,2 - 4% больше изолятов МБТ из образцов мокроты, чем на плотной среде ЛЙ [10, 13]. Внедрение в практику бактериологических систем типа BACTEC MGIT 960 позволило сократить сроки выделения культуры МБТ. В среднем период культивирования образца на ВАСТЕС MGIT 960 составил 11 - 15, на плотной среде - 20 - 28 дней [2, 8, 13].

Автоматизированная система BACTEC MGIT 960 позволила за относительно короткий период времени - в среднем за 2 недели − исследовать выделенные культуры микобактерий туберкулеза на чувствительность к противотуберкулезным препаратам (ПТП) первого ряда, в том числе к пиразинамиду [5, 7, 8]. Традиционным для определения лекарственной чувствительности (ЛЧ) к основным ПТП в России являлся метод абсолютных концентраций на плотной среде ЛЙ [9]. Система BACTEC MGIT-960 показывала значительное совпадение результатов тестирования чувствительности МБТ к антибактериальным препаратам с результатами, полученными методом абсолютных концентраций. Для рифампицина и изониазида совпадение данных о наличии чувствительных или резистентных форм МБТ составило 98,5 и 98,25% соответственно, для стрептомицина - 97,26, для этамбутола - 93,77%. При этом сроки получения результатов теста ЛЧ в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 составили от 4 до 13, тогда как по методу абсолютных концентраций - от 21 до 26 суток, что очень важно для своевременного и правильного выбора схемы противотуберкулезной терапии [4, 6].

Цель исследования: сравнить диагностические возможности автоматизированной системы BACTEC MGIT 960 по выделению МБТ и определению лекарственной чувствительности МБТ к ПТП с традиционными методами культуральный диагностики на плотных питательных средах ЛЙ, на основе данных, полученных в микробиологической лаборатории Республиканского противотуберкулезного диспансера в 2008 году и первом полугодии 2009 года.

Материалы и методы.В 2007 году микробиологическая лаборатория Республиканского противотуберкулезного диспансера в соответствии с проектом Международного банка реконструкции и развития была оснащена автоматизированной системой для экспресс - диагностики МБТ BACTEC MGIT 960 ("Becton Dickinson", США). Прибор BACTEC MGIT 960 состоит из трех секций, вмещающих 960 пробирок, это позволяет исследовать в течение года примерно 8 тыс. образцов диагностического материала. Прибор весит 351 кг и имеет небольшие габариты (92X135X85 см).

Возбудитель в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 выделяется на основе постоянного компьютерного мониторинга состояния бактериальной популяции. Основным компонентом системы является пробирка MGIT (Mycobacterial Growth Indicator Tube) с флюоресцентным индикатором роста, который находится под силиконом на дне пробирки и погашается высокими концентрациями кислорода, растворенного в среде. В системе используется обогащенная жидкая питательная среда Middlebrook 7H9. Размножающаяся микробная популяция активно поглощает кислород, высвобождая флюоресцентный компонент, который начинает светиться при ультрафиолетовом облучении. Технология MGIT предполагает периодическое (1 раз в час) ультрафиолетовое тестирование индикаторных пробирок с диагностическим материалом при помощи встроенного компьютера. На жидкокристаллическом дисплее в каждой секции специальные индикаторы высвечивают информацию о наличии положительных и отрицательных посевов. Прибор BACTEC MGIT 960 оценивает пробирку как позитивную, если количество живых микробов ней достигло 100 тыс. на 1 мл среды.

В системе BACTEC MGIT 960 для определения лекарственной чувствительности культур МБТ к ПТП используется набор индикаторных пробирок, содержащих препараты, которые крепятся на специальном носителе со штрих-кодом для непрерывного мониторинга скорости размножения культуры. Прибор оценивает рост микробной популяции, фиксируя его в специальных единицах роста GU (Grownth Unit), и определяет её статус: R (Resistant) - устойчивый и S (Susceptible) - чувствительный.

Лекарственная чувствительность в системе BACTEC MGIT 960 определяется как к низким, так и к высоким концентрациям основных ПТП: изониазид (INH), рифампицин (RIF), этамбутол (EMB) и стрептомицин (STR). Благодаря использованию в системе модифицированного бульона Middlebrook 7H9, который поддерживает рост МБТ при сниженной до 5,9 рН, система BACTEC MGIT 960 позволяет получить данные о чувствительности к пиразинамиду, который также является препаратом первого ряда, но не доступен для тестирования на плотных средах.

Для оценки диагностических возможностей автоматизированной системы BACTEC MGIT 960 исследовано 3310 клинических образцов на наличие МБТ, полученных из мокроты, промывных вод бронхов, плевральной жидкости больных, проходивших обследование и лечение в Республиканском противотуберкулезном диспансере в 2008 году и первом полугодии 2009 года.

Метод абсолютных концентраций на плотной среде ЛЙ для определения ЛЧ M. Тuberculosis использовали в соответствии с приказом Минздрава России №109 от 21.03.2003 [5].

Результаты и обсуждение.За указанный период из исследованных клинических образцов всеми методами получено 1313 культур МБТ, причем 94% выделены в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960, 76% показали рост на плотной среде ЛЙ (табл. 1).

Результативность системы ВАСТЕС MGIT 960 и плотных сред

Левенштейна - Йенсена по выделению культур МБТ

Система культивирования	Количество изолятов с положительным результатом посева	Количество изолятов с ложноотрицательным результатом посева
абс.	%	абс.	%
Все системы	1313	100
BACTEC 960	1234	94	79	6
Плотная среда Левенштейна - Йенсена	998	76	317	24

Таким образом, ложноотрицательные результаты по выделению культуры МБТ в системе ВАСТЕС MGIT 960 имели место в 6% случаев, что в 4 раза меньше, чем классическим методом на среде ЛЙ, в которой данный показатель составил 24%. В результате сравнения данных культивирования чувствительность системы ВАСТЕС MGIT 960 оказалась в среднем на 18% достоверно выше, чем на плотной среде ЛЙ (p

ПУТИ ОПТИМИЗАЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА В ПУЛЬМОНОЛОГИЧЕСКОМ ОТДЕЛЕНИИ

Цель: оптимизировать выявление туберкулеза в пульмонологическом отделении. В пульмонологическом отделении пациентам с подозрением на туберкулез проводили диагностический минимум: ставили пробу с аллергеном туберкулезным рекомбинантным, проводили анализ мокроты (трехкратно) и жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛЖ) методами микроскопии по Цилю - Нильсону, в лаборатории противотуберкулезной службы диагностический материал исследовали с помощью GeneXpert MTB/RIF, Bactec MGIT. Проанализировали результаты диагностического процесса у 70 больных с этиологически подтвержденным диагнозом. Целенаправленный опрос, сбор анамнеза были информативными в 4%, проба с АТР - в 27,1%, GeneXpert MTB/RIF - в 100%, Bactec MGIT - в 97,1%. Внедрение ускоренных методов диагностики в пульмонологическом отделении сокращает средний койко-день от поступления до установления диагноза туберкулеза и перевода в противотуберкулезный стационар до 9,80 ± 4,72 дня. Молекулярно-генетический метод можно рекомендовать в общую лечебную сеть как диагностический минимум при обследовании пациентов с высоким риском подозрения на туберкулез. Своевременное выявление больных туберкулезом в первичном звене здравоохранения является определяющим фактором как в выздоровлении пациента, так и эпидемической обстановки по туберкулезу в целом. Средние сроки диагностики туберкулеза в общей лечебной сети составляют 1,5-2,0 мес. Наиболее часто с проблемой диагностики туберкулеза сталкивается врач-пульмонолог стационарного отделения. Обнаружение микобактерий туберкулеза (МБТ) имеет решающее значение не только для диагностики туберкулеза, оно чрезвычайно важно при прогнозировании течения процесса, выборе рациональной схемы лечения и правильной оценке его эффективности. Наиболее надежным способом подтверждения диагноза туберкулеза легких является обнаружение Mycobacterium tuberculosis в мокроте или бронхо-альвеолярной жидкости (БАЛЖ). Основными методами подтверждения диагноза туберкулеза остаются сочетание микроскопического и бактериологического методов выявления МБТ. Бактериоскопическое исследование является доступным, быстрым и дешевым методом выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУМ). Однако метод эффективен в основном у пациентов с прогрессирующим, деструктивным туберкулезом. Бактериоскопические методы имеют такие недостатки, как низкая чувствительность, невозможность дифференцировать микобактерии туберкулезного комплекса от нетуберкулезных микобактерий и определить жизнеспособность микобактерий. В последнее десятилетие получили распространение молекулярно-генетические методы (МГМ) выявления ДНК МБТ, самый применяемый в настоящее время - GeneXpert MTB/RIF. Основными недостатками этого метода являются высокая стоимость, необходимость хорошо оснащенных лабораторий, высокая квалификация персонала. Эти ограничения не позволяют широко использовать методику в первичном звене здравоохранения, возможности применения GeneXpert MTB/RIF имеются только в специализированных лабораториях противотуберкулезных учреждений. Методика GeneXpert MTB/RIF не определяет жизнеспособность выявляемых микобактерий, в результате чего возможны ложноположительные результаты. В настоящее время в практике диагностических лабораторий противотуберкулезных учреждений используют GeneXpert MTB/RIF как экспресс-метод для поиска МБТ при обязательном параллельном применении классических методов диагностики. Цель: оптимизировать выявление туберкулеза в пульмонологическом отделении. Исследование проводилось в 2 пульмонологических отделениях (150 коек) городской больницы, принимающей ежедневно больных пульмонологического профиля по экстренной помощи. При поступлении пациентов с легочной патологией и с подозрением на туберкулез проводилась консультация фтизиатра с обязательным выполнением диагностического минимума. При опросе выяснялись наличие контакта с больным туберкулезом, перенесенный туберкулез в анамнезе, отягощенная наследственность. Уже в приемном отделении всем проводили рентгенограмму в прямой и боковой проекции, анализ мокроты на МБТ методом микроскопии по Цилю - Нильсену. В стационаре в течение первых 2 сут ставилась кожная пpoбa с аллергеном туберкулезным рекомбинантным (АТР), 3-кратно повторялась микроскопия мокроты с обязательным взятием утренней порции. При отрицательном результате проводили забор БАЛЖ при бронхоскопии и ее исследование. Диагностический материал направляли на МГМ GeneXpert MTB/RIF и на посев (Bactec MGIT) в лабораторию противотуберкулезной службы. В анализ включены только случаи туберкулеза с подтвержденным положительным анализом на МБТ. В пульмонологическом отделении за 10 мес. 2017 г. из 1 900 госпитализированных пациентов подозрение на туберкулез было у 350 больных. Туберкулез, подтвержденный бактериологически, выявлен у 70 пациентов. Среди пациентов с установленным диагнозом туберкулеза легких мужчин было 72,8% (51/70), женщин - 27,2% (19/70), соотношение 3:1, возраст от 18 до 70 лет (36,4 ± 9,3). При проведении диагностического минимума при поступлении контакт с больным туберкулезом выяснен при опросе только в 4 (5,7%) случаях, в 1 случае пациент вернулся из мест лишения свободы. Относились к группам риска по соматическим заболеваниям 78,5% (55), из них пациенты с ВИЧ-инфекцией составили 68,5% (48). По данным рентгенологического обследования инфильтраты, характерные для туберкулезного поражения, были в 62,8% (44) случаях, все они описывались рентгенологом как негомогенные, с нечеткими контурами, с дорожкой к корню легкого. В 11,4% (8) диагностировался плевральный выпот. В 24,2% (17) выявлена двусторонняя диссеминация, чаще мелкоочаговая, по всем легочным полям. В 1 случае установлено наличие деструкции, фиброза легочной ткани, смещение органов средостения в пораженную сторону. Всем пациентам ставилась проба с АТР. Положительный результат был в 27,1% (19), при этом папула более 15 мм -в 89,4% (17), гиперемия - 2 случая. Отрицательный результат - в 72,9% (48). ВИЧ-инфекция была выявлена у 72,9% (48) пациентов, из них состояли на учете в СПИД-центре 45,8% (22) в течение 3-5 лет, принимали АРТВ-терапию 50% (11), выявлена ВИЧ-инфекция впервые при данной госпитализации у 54,2% (26). При проведении анализа мокроты методом микроскопии по Цилю - Нильсену КУМ выявлены в 24,3% (17), эти пациенты переведены в противотуберкулезный стационар, кроме 1 больного, перевод которого был невозможен из-за тяжести состояния, он умер на 3-й сут поступления в отделение реанимации и интенсивной терапии. Пациентам с положительным анализом на КУМ по совокупности клинико-рентгенологических и лабораторных данных поставлен диагноз: фиброзно-кавернозный туберкулез в 8,3% (1), диссеминированный туберкулез в 23,5% (4), инфильтративный туберкулез в стадии распада - в 70,5% (12) случаев. Бронхоскопия со взятием БАЛЖ на БК проведена в 74,2% (52), отказались от обследования 25,7% (18). По результатам исследования БАЛЖ методом бактериоскопии обнаружены КУМ в 21,1% (11/52). У этих пациентов по данным клинико-рентгенологического обследования поставлены диагнозы: инфильтративный туберкулез - у 91% (10/11), плеврит туберкулезной этиологии с туберкулезом бронхов - у 9% (1/11). Сроки постановки диагноза для этих пациентов составили 7,2 ±1,3 койко-дня. Пациенты с обнаружением КУМ в БАЛЖ были переведены в противотуберкулезный стационар, кроме 1 больного ВИЧ-инфекцией с инфильтративным туберкулезом, который умер в отделении реанимации и интенсивной терапии на 5-е сут после поступления. Полученный в первые 3 сут поступления в пульмонологическое отделение диагностический материал от больного (мокрота, БАЛЖ, плевральная жидкость) направляли на исследование с помощью GeneXpert MTB/RIF и Bactec MGIT в лабораторию противотуберкулезной службы. Отрицательные анализы на КУМ при бактериоскопии и БАЛЖ среди направленных анализов составили 60% (42). При исследовании с помощью GeneXpert MTB/RIF получены в 100% положительные результаты. За это время в ОРИТ умер еще 1 пациент с диагнозом диссеминированного туберкулеза, в переводе которого в профильное учреждение было отказано из-за отрицательного анализа мокроты и БАЛЖ на КУМ, по результатам патолого-анатомического обследования у пациента диагностирован мили-арный туберкулез. При посеве всех образцов диагностического материала на жидкие среды (Bactec MGIT) получен рост микобактерий в 97,1% (68) случаев. По результатам обследования поставлены диагнозы: инфильтративный туберкулез - 62,2% (44), диссеминированный туберкулез - 22,2% (16), экссудативный плеврит туберкулезной этиологии - 11,4% (8), но 1 (2,1%) случаю милиарный и фиброзно-кавернозный туберкулез. Направлены на лечение в противотуберкулезное лечебное учреждение 67 (95,7%) пациентов, умерло в отделении реанимации и интенсивной терапии 3 (4,2%). Средний койко-день от поступления до установления диагноза туберкулеза и перевода в противотуберкулезный стационар составил 9,80 ± 4,72 дня. Сложившаяся многолетняя практика по выполнению стандартного диагностического минимума при подозрении на туберкулез у пациента в пульмонологическом отделении показывает низкую эффективность, метод бактериоскопии, наиболее доступный в общей лечебной сети, позволяет выявить туберкулез только в 24,2% от всех случаев с бактериологическим подтверждением туберкулеза. Анамнез и выявление возможного контакта оказываются информативными на момент поступления пациента только в 4%, кожная проба с АТР положительна в 27,1%. Применение экснресс-метода GeneXpert MTB/RIF позволило выявить МБТ в течение 2 нед. от начала госпитализации с подтверждением положительного результата на жидких средах (Bactec MGIT) в 97,1%. Целесообразно рекомендовать в первичное звено здравоохранения МГМ GeneXpert MTB/RIF для обследования пациентов с подозрением на туберкулез. Применение GeneXpert MTB/RIF как экспресс-метода в выявлении ДНК МБТ позволит значительно сократить сроки выявления туберкулеза.