Полиморфизм генов и туберкулез

Полный текст:

Заболеваемость туберкулезом легких (ТБ) приобретает широкие масштабы в связи с расширением спектра резистентности Mycobacterium tuberculosis (МБТ) к противотуберкулезным средствам и высокой вирулентностью инфицирующих штаммов МБТ. Антигены МБТ способны вызывать дисфункцию рецепторного аппарата и модулировать цитокинсекреторную функцию иммунокомпетентных клеток. Полиморфизм генов провоспалительных цитокинов, которые вовлечены в механизмы защитных реакций врожденного иммунитета, определяет степень резистентности индивида к микобактериальной инфекции, а также тяжесть и продолжительность заболевания в случае его клинической манифестации. Цель работы: исследование связи аллельного полиморфизма генов TNFA, IL2, IFNG c изменениями in vitro секреции TNFα, IL-2, IFNγ мононуклеарными лейкоцитами у пациентов с впервые выявленным туберкулезом легких в зависимости от клинической формы заболевания.

Обследовано 334 больных (220 мужчин и 114 женщин) в возрасте от 23 до 50 лет с впервые выявленным инфильтративным ТБ (ИТБ) и диссеминированным ТБ (ДТБ). Группу сравнения составили 183 здоровых донора (130 мужчин и 53 женщины) аналогичного возраста. Материалом исследования являлись ДНК, экстрагированная из цельной крови, и супернатанты культуральных суспензий мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из венозной крови у здоровых добровольцев и больных ТБ. Оценку секреции цитокинов осуществляли путем измерения их концентрации в культуральных супернатантах мононуклеарных лейкоцитов методом твердофазного иммуноферментного анализа (ЕLISА). Для исследования полиморфных участков генов цитокинов использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Анализ полученных данных осуществляли с помощью программы Statistica for Windows Version 6.0 (StatSoft Inc., США).

Дисбаланс секреции провоспалительных цитокинов у больных TБ ассоциирован с носительством полиморфных вариантов их генов. Продемонстрировано, что гипосекреция IL-2 определяется носительством аллеля G и генотипа GG (T-330G) гена IL2 как в контрольной группе, так и у больных ТБ вне зависимости от клинической формы. У больных ДТБ – носителей гомозиготного генотипа ТТ (T-330G) гена IL2 – установлена повышенная секреция белка. Максимальная секреция TNFα регистрировалась у лиц с генотипом АА (G-308A) гена TNFA в контрольной группе и у больных ИТБ, минимальная концентрация TNFαсвязана с носительством гомозиготного генотипа GG (G-308A) гена TNFA во всех обследованных группах. У больных ИТБ и ДТБ повышение секреции IFNγ мононуклеарными лейкоцитами крови не связано с носительством полиморфизма +874A/T гена IFNG.

Снижение секреции IL-2 и TNFα у больных ТБ ассоциировано с полиморфизмами их генов – (T-330G) гена IL2 и (G-308A) гена TNFA соответственно. Полиморфизм (+874A/T) гена IFNG не оказывает модулирующего влияния на секрецию IFNγ при ТБ вне зависимости от клинической формы болезни.

д.м.н., профессор кафедры патофизиологии; профессор кафедры органической химии, ведущий научный сотрудник лаборатории трансляционной клеточной и молекулярной биомедицины

634050, г. Томск, Московский тракт, 2.

Тел.: 8 (3822) 90-11-01 (доп. 1742).

д.м.н., профессор, член-корр. РАН, заведующая кафедрой патофизиологии

д.м.н., профессор, академик РАН, заслуженный деятель науки России, профессор кафедры патофизиологии

аспирант кафедры патофизиологии

к.м.н., доцент кафедры патофизиологии

1. Абрамов Д.Д., Кофиади И.А., Уткин К.В., Трофимов Д.Ю., Хаитов P.M., Алексеев Л.П. Полиморфизм одиночных нуклеотидов в генах цитокинов и их рецепторов: биологический эффект и методы идентификации // Иммунология, 2011. № 5. С. 275-280. [Abramov D.D., Kofiadi I.A., Utkin K.V., Trofimov D.Yu., Khaitov R.M., Alekseev L.P. Single nucleotide polymorphism in the genes of cytokines and their receptors: biological effects and methods of identification. Immunologiya = Immunology, 2011, no. 5, pp. 275-280. (In Russ.)]

2. Тарабаева А.С., Ракишева А.С., Абильбаева А.А., Омельяненко С.М., Ли В. Роль цитокинов Т-хелперов в патогенезе туберкулеза // Цитокины и воспаление, 2016. Т. 15, № 2. С. 140-147. [Tarabayeva A.S., Rakisheva A.S., Abilbayeva A.A., Omelyanenko S.M., Li V. The role of helper T-cell cytokines in the tuberculosis pathogenesis. Tsitokiny i vospalenie = Cytokines and Inflammation, 2016, Vol. 15, no. 2, pp. 140-147. (In Russ.)]

3. Ates O., Mussellim B., Ongen G., Topal-Sarikaya A. Interleukin-10 and Tumor Necrosis Factor-αgenes polymorphisms in tuberculosis.J. Clin. Immunol., 2008, Vol. 28, pp. 232-236.

4. Bream J.H., Carrington M., O’Toole S., Dean M., Gerrard B., Shin H.D., Kosack D., Modi W., Young H.A., Smith M.W. Polymorphisms of the human IFNGgene noncoding regions. Immunogenetics, 2000, Vol. 51, pp. 50-58.

5. Churina E.G., Urazova O.I., Novitskiy V.V. The role of Foxp3-expressing regulatory T-cells and T-helpers in immunopathogenesis of multi-drug resistant pulmonary tuberculosis.Hindawi Publishing Corporation, Tuberculosis Research and Treatment, 2012, Vol. 2012, 931291, p. 9. doi: 10.1155/2012/931291.

6. Henao M.I., Montes C., Paris S.C., Garcia L.F. Cytokine gene polymorphisms in Colombian patients with different clinical presentations of tuberculosis. Tuberculosis, 2006, Vol. 86, pp. 11-19.

7. Kalsotra A., Cooper Т.A. Functional consequences of developmentally regulated alternative splicing. Nat. Rev. Genet., 2011, Vol. 12, no. 10, pp. 715-729.

8. Lerner T.R., Griffiths G., Gutierrez M.G. Lymphatic endothelial cells are a replicative niche for Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Invest., 2017, Vol. 126, no. 3, pp. 1093-1108.

9. Mansouri F., Heydarzadeh R., Yousefi S. The association of interferon-gamma, interleukin-4 and interleukin-17 single-nucleotide polymorphisms with susceptibility to tuberculosis. APMIS, 2018, Vol. 126, no. 3, pp. 227-233.

10. Saini A., Mahajan S., Ahuja N., Bhagyaraj E., Kalra R., Janmeja A.K., Gupta P. An accord of nuclear receptor expression in M. tuberculosisinfected macrophages and dendritic cells. Scientific Reports, 2018, Vol. 8, 2296. doi:10.1038/s41598-018-20769-4.

11. Wang S., Wei M., Han Y., Zhang K., He L., Yang Z., Su B., Zhang Z., Hu Y., Hui W. Roles of TNF-αgene polymorphisms in the occurrence and progress of SARS-Cov infection: A case-control study. BMC Infectious Diseases, 2008, Vol. 8, no. 27 (2), pp. 1-10.

12. Yang R., Yang E., Shen L., Modlin R.L., Shen H., Chen Z.W. IL-12+IL-18 cosignaling in human macrophages and lung epithelial cells activates cathelicidin and autophagy, inhibiting intracellular mycobacterial growth. J. Immunol., 2018, pii: ji1701073. doi:10.4049/jimmunol.1701073.

Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.

Полный текст:

Целью работы явилось исследование связи аллельного полиморфизма генов IL10 и TGFВс изменениями базальной и BCG-индуцированной продукции соответствующих иммуносупрессорных цитокинов IL-10 и TGF-β мононуклеарными лейкоцитами in vitro у пациентов с впервые выявленным туберкулезом легких (ТБ) в зависимости от клинической формы заболевания. Оценку продукции цитокинов осуществляли путем измерения их концентрации в культуральных супернатантах методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).Для исследования полиморфных участков генов цитокинов использовали аллельспецифичную амплификацию специфических участков генома. Материалом исследования являлись ДНК и супернатанты культуральных суспензий мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из периферической венозной крови у здоровых добровольцев и больных ТБ. В ходе проведенных исследований выявлено, что базальная и BCG-индуцированная гиперпродукция IL-10 in vitro определяется при ТБ вне зависимости от генотипа локуса С-592А гена IL10. Наряду с этим у больных инфильтративным и диссеминированным ТБ генотип АА полиморфизма гена IL10 ассоциирован с максимальной, а генотип CC – с минимальной продукцией IL-10 in vitro. Анализ продукции TGF-β in vitro у больных ТБ показал ее увеличение только в случае носительства аллеля Т(С-509Т) гена TGFB. При этом у больных диссеминированным ТБ с гомозиготным генотипом ТТ фиксировалось увеличение как базальной, так и BCG-индуцированной продукции TGF-β, а у больных инфильтративным ТБ – только при индукции клеток антигеном BCG.

Таким образом, гиперпродукция цитокинов с ингибирующей активностью у больных ТБ является генетически детерминированной и способствует формированию супрессорного режима иммунорегуляции. При этом выраженное увеличение секреции цитокинов IL-10 и TGF-β in vitro у больных ТБ ассоциировано с носительством аллеля А и генотипа АА (С-592A) гена IL10 и аллеля Т и генотипа ТТ (С-509Т) гена TGFB.

1. .1. Gonzalo X., Ambroggi M., Cordova E., Brown T., Poggi S., Drobniewski F. Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis, Buenos Aires, Argentina // Emerging Infectios Diseases. 2011. V. 17, № 3. Р. 528–531. doi: 10.3201/eid1703.100394.

2. Churina E.G., Urazova O.I., Novitskiy V.V. The role of Foxp3-expressing regulatory T-cells and T-helpers in immunopathogenesis of multi-drug resistant pulmonary tu-berculosis // Hindawi Publishing Corporation, “Tuberculosis Research and Treatment”. 2012. Vol. 2012. Article 931291. 9 p. doi: 10.1155/2012/931291.

3. Чурина Е.Г., Уразова О.И., Новицкий В.В., Есимова И.Е. Вторичная иммунологическая недостаточность у больных туберкулезом легких. Иммунодиагностика и иммунотерапия. Томск: Печатная мануфактура, 2013. 84 с.

4. Кофиади И.А., Ребриков Д.В. Методы детекции одно-нуклеотидных полиморфизмов: аллель-специфическая ПЦР и гибридизация с олигонуклеотидной пробой // Генетика. 2006. Т. 42, № 1. С. 22–32.

5. Абрамов Д.Д., Кофиади И.А., Уткин К.В., Трофимов Д.Ю., Хаитов Р.М., Алексеев Л.П. Полиморфизм одиночных нуклеотидов в генах цитокинов и их рецепторов: биологический эффект и методы идентификации // Иммунология. 2011. № 5. С. 275–280.

6. Kalsotra A., Cooper T.A. Functional consequences of developmentally regulated alternative splicing // Nat. Rev. Genet. 2011. V. 12, № 10. P. 715–729. doi: 10.1038/nrg3052.

7. Симбирцев А.С. Интерлейкин-1: физиология, патология, клиника. М.: Фолиант, 2011. 480 с.

8. Sakaguchi S., Vignali D.A., Rudensky A.Y., Niec R.E., Waldmann H. The plasticity and stability of regulatory T cells // Nat. Rev. Immunol. 2013. V. 13, № 6. P. 461–467. doi: 10.1038/nri3464. Epub. 2013. May 17.

9. Sheppard D. Transforming growth factor beta: a central modulator of pulmonary and airway inflammation and fibrosis // Proc. Am. Thorac. Soc. 2006. V. 3, № 5. P. 413–417.

10. Fichtner-Feigl S., Strober W., Kawakami K., Puri R.K., Kitani A. IL-13 signaling through the IL-13alpha2 receptor is involved in induction of TGF-beta1 production and fibrosis // Nat. Med. 2006. V. 12, № 1. P. 99–106.

11. Co D.O., Hogan L.H., Kim S.I., Sandor M. Mycobacterial granulomas: keys to a long-lasting host-pathogen relation-ship // Clin. Immunol. 2004. V.113, № 2. P. 130–136.

Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.

В статье отмечено, что для определения взаимосвязи между SNPs гена TNF и предрасположенностью к туберкулезу впервые было проведено генотипирование частоты встречаемости SNPs -308 G/A TNFa и -238 G/A у больных туберкулезом легких представителей русской популяции Челябинской области. Установлено, что развитие возникшей инфекции M. tuberculosis в значительной степени обусловлива­ется наследуемыми факторами предрасположенности к туберкулезу. Показано, что аллель TNF-238*A, генотип TNF-238*G/A и гаплотип -308G/-238A являются факторами предрасположенности к туберкулезу легких в русской популяции Челябинской области.

Туберкулез является одной из наиболее социально значимых инфекций. Рассматривая проблему туберкулеза на молекулярном и клеточном уровнях, вероятно, нельзя четко разграничить значение биологических свойств M. tuberculosis и иммунной системы макроорганизма. Исследование генети­ческих основ подверженности туберкулезу — одна из наиболее активно разрабатываемых в настоя­щее время проблем. На данный момент выявлен ряд генетических маркеров повышенной чувстви­тельности к туберкулезной инфекции — дефекты генов системы воспаления: рецептора IFNy, генов IL12, TNFa, IL10, IL1, генов иммунного ответа: HLA, TLR, а также системы метаболизма: VDR, NRAMP [1].

Ген TNFa расположен на 6 хромосоме в локусе, внутри кластера генов III класса HLA между HLA B и HLA DR генами в позиции 6р23чД2 и находится в неравновесном сцеплении с генами HLAII класса. Ген TNFa является одним из самых полиморфных генов цитокинов. Его промоторно-энхансерная область содержит от 9 до 13 полиморфных сайтов типа SNPs. Однако наиболее значи­мые для человека — это замены гуанина на аденин в положениях -308 и -238. Позиции -308 и -238 приходятся на промотор, что сказывается на возможности транскрипционных факторов связы­ваться с этой частью гена и, таким образом, влиять на скорость транскрипции [5]. Данные нуклеотид-ные замены — явление достаточно распространенное, к примеру, среди европейцев около 27-33 % в своем генотипе содержат полиморфный (редкий) аллель TNFa-308*A и около 7-10 % — редкий аллель TNFa-238*A. Аллель TNFa-308*A является более сильным активатором транскрипции с 6-7-кратным повышением индуцируемого уровня транскрипции гена TNFa [6]. Наряду с этим для другого полиморфного варианта гена TNFa-238, аллель A ассоциирован с понижением продукции TNFa [5].

Исследования, посвященные связи генотипа TNFa с инфекционным процессом, вызванным ми-кобактериями, дали противоречивые результаты. Полиморфный аллель TNFa-308*A является факто­ром риска при туберкулезе у башкир [7] и среди азиатов [8]. В исследованиях Correa P. et al. обнару­жена ассоциация с заболеванием туберкулезом низкопродуктивных аллелей TNFa-308*G и TNFa-238*A и доказана протективная роль гаплотипа TNFa -308*A/ -238*G в развитии данного заболева­ния в Колумбии [9]. TNFa-308*A полиморфизм отмечен как протективный против туберкулеза в Си­цилии [10], но не ассоциирован с заболеванием в исследованиях в Турции [11] и Камбодже [12]. По данным мета-анализа, проведенного Z.Zhang et al., не обнаружена ассоциация TNFa-238*G/A с туберкулезом [13].

В исследованиях Selvaraj обнаружено, что варианты -238*А и -308*А сами по себе не только не играют никакой роли в развитии туберкулеза, но даже оказывают протективное действие в сочетании с вариантом гена HLA В*17[14]. Однако автор отмечает, что сочетание соответствующих гаплотипов защищает человека от развития легочного туберкулеза только на первых этапах заболевания. На ста­дии иммунного ответа наличие подобного гаплотипа у пациентов способствует ухудшению состоя­ния и возникновению рецидивов.

Цель

Необходимо оценить распределение частот встречаемости аллелей, генотипов и гаплотипов SNPs гена TNFa -308 G/A и -238 G/A у больных туберкулезом легких русских Челябинской области.

Материалы и методы

Для статистической обработки использовались стандартные генетические методы: расчет непа­раметрического критерия % 2 , с поправкой Йетса для двух групп сравнения. При абсолютных значени­ях меньше 5 использовали точный двухсторонний критерий Фишера. Расчет непараметрического критерия X 2 для 2 степеней свободы. Расчет отношения шансов (OR) с 95 %-ным доверительным ин­тервалом. Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р 0,10; для промежуточных значений р (0,05 2 = 4,11, р = 0,043) и аллеля А (9,30 % и 3,53 %, X 2 = 3,81, р = 0,050) у больных по сравнению с контролем. По некоторым источникам аллельTNFa-238*A связан с пониженной продукцией цито-кина [4]. Кроме того, обнаружено достоверное понижение гомозиготного генотипа G/G (81,40 % и 92,94 %, X 2 = 5,08, р = 0,024) и аллеля G (90,70 % и 96,47 %, X 2 = 4,73, р = 0,029) у больных по сравне­нию с контролем.

Распределение аллелей и генотипов SNPs в генах -238TNFa и -308TNFa у больных туберкулезом легких и здоровых лиц русской популяции. У женщин, больных туберкулезом выше частота встречаемости низкокопродуцирующего аллеля TNFa-238*A (10,34 % и 1,39 %, X 2 = 5,06, р критерий Фишера = 0,044, OR = 8,192 и 95 % CI 1,009^69,679) и гетерозиготного генотипа G/A (20,7 % и 2,8 %, X 2 = 5,36, р критерий Фише­ра = 0,0388, OR = 9,130 и 95 % CI 1,031^80,357), чем у здоровых. У мужчин различий в распределе­нии TNFa не обнаружено.

На следующем этапе мы рассмотрели гаплотипы TNFa -380G/A / -238G/A.

Сравнительный анализ распределения частот гаплотипов гена TNFa -308/ -238 показал, что у больных туберкулезом по сравнению со здоровым контролем достоверно повышена частота встре­чаемости гаплотипа -308*G/ -238*A (0,093 и 0,027 соответственно, X 2 = 4,73, р = 0,030, OR = 2,80), отвечающего за низкую продукцию TNFa. Наши данные согласуются с данными литературы в том, что содержание TNFa у больных туберкулезом легких имеет тенденцию к снижению [19].

Низкая продукция TNF альфа у носителей аллеля TNFa -238*A, генотипа TNFa-238*G/A и гап-лотипа TNFa-308*G/ -238*A, вероятно, ведет к нарушению иммунного ответа: не происходит кисло­родного взрыва, снижается активация макрофагов и не происходит образование гранулемы. Все это способствует распространению инфекции и прогрессированию туберкулезного процесса. Таким об­разом, данные полиморфизмы гена TNFa являются предрасполагающими к развитию клинических форм туберкулеза легких.

У больных туберкулезом легких достоверно снижена частота гомозиготного гаплотипа TNFa-308*G/-238*G (0,727 и 0,843, X 2 = 5,88, р = 0,015, OR = 0,52). Гаплотип TNFa-308*A/-238*A обнару­жен не был, что соответствует литературным данным [20].

Таким образом, в нашей работе показаны особенности распределения частот SNPs TNFa у боль­ных туберкулезом легких русской популяции. Установлена ассоциация туберкулеза с генотипами, содержащими низкопродуктивные аллели и гаплотипы TNFa. Можно предположить, что для боль­ных с клиническими формами туберкулеза легких, представителей русской популяции Челябинской области, характерна тенденция к снижению продукции TNFa, что препятствует процессу ограниче­ния очага воспаления и способствует распространению инфекционного процесса и развитию некро­зов.

Вариабельность результатов иммуногенетических исследований может быть связана как с гене­тической гетерогенностью исследованных популяций, так и с патофизиологическими особенностями в патогенезе туберкулеза легких у представителей разных этнических групп. По всей видимости, в процессе расо- и этногенеза частоты аллелей и генотипов приобрели свою специфику у разных на­родов и это, в свою очередь, могло внести определенный вклад в наследственную компоненту диф­ференциальной подверженности туберкулезу в разных популяциях. Кроме того, важной проблемой низкой результативности картирования генов предрасположенности к туберкулезу является уникаль­ность индивидуальных сочетаний аллелей генов предрасположенности, формирующих риск заболе­вания различных популяций, недостаточный объем исследуемых выборок, что не позволяет оценить комплексный характер взаимодействия генов и их конкретную роль в детерминации полигенной предрасположенности к туберкулезу. Несмотря на очевидную практическую значимость, перечис­ленные выше вопросы недостаточно освещены в литературе. Крайне актуальной является комплекс­ная оценка вовлеченности различных полиморфных вариантов генов-кандидатов в формирование туберкулеза в различных популяциях мира.

Вывод

Для пациентов с клиническими формами туберкулеза легких, европеоидов Челябинской области, характерно следующее распределение частот SNPs гена TNFa: повышена частота встречаемости ал-леля TNFa-238*A, генотипа TNFa-238*G/A и гаплотипа TNFa-308*G/-238*A.

480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ', MOUSEOFF, FGCOLOR, '#FFFFCC',BGCOLOR, '#393939');" onMouseOut="return nd();"> Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно , доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников

Кудряшов, Алексей Владимирович. Полиморфизм ферментов метаболизма ксенобиотиков и антиоксидантной защиты и развитие гепатотоксических реакций у больных туберкулёзом легких : диссертация . кандидата биологических наук : 03.01.04 / Кудряшов Алексей Владимирович; [Место защиты: Науч.-исслед. ин-т биохимии СО РАМН].- Новосибирск, 2011.- 140 с.: ил. РГБ ОД, 61 12-3/129

Введение к работе

Актуальность темы. По данным ВОЗ ежегодно в мире заболевают туберкулёзом 9,4 миллиона и умирают 1,3 миллиона человек (http://www.who.int/tb/publications/global_report/2010/en/index.html). Заболеваемость туберкулёзом органов дыхания в России в 2010 году составила 67,31 на 100 тысяч населения (http://12.rospotrebnadzor.ru/diretions/profilaktika/48877/). Одной из основных проблем, связанных с лечением больных туберкулёзом, является рост распространенности лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий туберкулёза (МБТ), достигающей в России 30% у больных с впервые выявленным туберкулёзом легких и 60% у больных с рецидивами (Стрелис и соавт., 2009). Распространение устойчивых штаммов МБТ требует усиления режимов терапии, что приводит к росту числа побочных реакций на противотуберкулезные препараты (ПТП). Наиболее частыми побочными реакциями является гепатотоксические (ГТР), их частота развития достигает 47% (Huang, 2007). Проявления ГТР варьируют от повышения уровня трансаминаз до развития тяжелого гепатита, заканчивающегося смертельным исходом (Полунина, 2005). Поражения печени c функциональной недостаточностью часто развиваются на фоне дозозависимого повышения уровня трансаминаз (Russmann et al., 2009). При исследовании причин возникновения ГТР большое внимание придаётся метаболизму ПТП. Биологические эффекты химических соединений в значительной мере зависят от их структурных изменений, возникающих в результате метаболизма. Последний, осуществляемый ферментами биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), характеризуется большой межиндивидуальной вариабельностью, достигающей 10 3 -10 4 (Guengerich, 2003), которая главным образом обусловлена генетическим полиморфизмом ФБК. Поэтому прилагаются активные усилия по поиску полиморфных вариантов генов ФБК, обусловливающих риск побочных эффектов лекарств.

Изониазид является основным препаратом при лечении туберкулеза. В его метаболизме важную роль играет N-ацетилтрансфераза 2 (NAT2). Большинство исследователей сходятся во мнении, что пациенты с генотипом медленного ацетилирования более предрасположены к ГТР, по сравнению с быстрыми ацетиляторами (Ohno et al., 2000; Huang et al., 2002; Higuchi et al., 2007; Lee et al., 2010). Тем не менее, существуют работы, обозначившие фенотипически быстрых ацетиляторов как группу риска развития ГТР при лечении туберкулеза (Mitchell et al., 1976), либо не обнаружившие ассоциаций с генотипом NAT2 (Roy et al., 2001; Yamada et al., 2009). Противоречия могут быть следствием популяционных различий и внешних условий, поэтому необходимо анализировать эти ассоциации в каждой конкретной популяции. Кроме того, показано неполное соответствие генотипа NAT2 фенотипу ацетилирования (Cascorbi et al., 1995, Le Marchand et al., 1996). Поэтому существует проблема выбора между генетическими и фенотипическими маркерами в прогнозировании ГТР.

Кроме NAT2 важную роль в метаболизме изониазида играет цитохром P450 2E1 (CYP2E1). CYP2E1 окисляет метаболит изониазида – ацетилгидразин – с образованием токсических метаболитов (Roy, 2008). Показана связь отдельных полиморфизмов CYP2E1 с ГТР. Однако имеющиеся в литературе данные противоречивы (Huang et al., 2003; Bose et al., 2010), а в популяциях России эта связь остается неизученной.

Поскольку образование реактивных метаболитов и вызываемый ими окислительный стресс в клетках печени является конечным результатом взаимодействия противотуберкулёзных препаратов с ФБК, большую роль в защите от гепатотоксичности могут играть ферменты антиоксидантной защиты, в частности, глутатион S-трансферазы (GST). Из экспрессируемых в печени изоферментов GST потенциально важными могут быть GSTM1 и GSTT1, для которых описан нуль-полиморфизм, проявляющийся полным отсутствием белков (Seidegrd et al., 1988; Pemble et al., 1994). Также важна GSTA2 как представитель наиболее экспрессируемого в печени подсемейства (более 3 % цитозольного белка), для которой установлен полиморфизм, проявляющийся изменением экспрессии (Ning, 2004), и GSTP1, представленная в печени в небольшом количестве (Nishimura et al., 2006), но играющая важную роль в регуляции ответа организма на окислительный стресс и апоптоза через пути сигнальной трансдукции. (Adler et al., 1999; Bernardini et al., 2000). В литературе мы не обнаружили исследований связи полиморфизма GSTA2 и GSTP1 с токсичностью ПТП, а полиморфизм GSTA2 в популяциях России не определялся вообще. В немногочисленных работах по изучению связи с гепатотоксичностью ПТП нуль-полиморфизма GSTM1 и GSTT1 авторы выявляют ассоциации либо для делеции GSTM1 (Roy et al., 2001; Huang. et al., 2007), либо GSTT1 (Leiro et al., 2008).

Таким образом, развитие ГТР зависит от функционального взаимодействия ферментов, участвующих в наработке токсических метаболитов и детоксификации их и/или устранении последствий вызванного ими окислительного стресса. Изучение роли фармакогенетических и фенотипических особенностей пациента расширит возможности прогнозирования и профилактики лекарственных осложнений при терапии туберкулеза.

Цель исследования - выявление полиморфных вариантов генов ферментов, участвующих в биотрансформации противотуберкулёзных препаратов и антиоксидантной защите, а также особенностей фармакокинетики, ассоциированных с гепатотоксическими реакциями при лечении больных туберкулёзом.

Задачи:

Охарактеризовать активность N-ацетилтрансферазы 2 и амидазы по фармакокинетике изониазида и пиразинамида у больных туберкулёзом легких.

Определить частоты полиморфных вариантов генов NAT2, CYP2E1, GSTA2, GSTM1, GSTT1, GSTP1 в исследуемой выборке больных.

Определить соотношение генотипов NAT2 и фенотипов ацетилирования.

Проанализировать связь сывороточных активностей аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы с фармакокинетическими параметрами изониазида и пиразинамида.

Проанализировать связь полиморфных вариантов генов NAT2, CYP2E1, GSTA2, GSTM1, GSTT1 и GSTP1 с повышением уровней аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы.

Научная новизна исследования. Впервые в России охарактеризована частота встречаемости полиморфных вариантов 63G>C 5 экзона, 83A>C 7 экзона гена GSTA2 и -71G>T, C>T (F421F) гена CYP2E1.

Предложен новый метод определения полиморфизмов 313A>G и 341C>T гена GSTP1 с использованием аллель-специфичной ПЦР с последующим ПДРФ-анализом. Данный метод позволяет определить сцепление локусов 313 и 341. Разработаны новые способы определения полиморфизмов 63G>C 5 экзона, 83A>C 7 экзона гена GSTA2 и -71G>T, 7632T>A , C>T (F421F) гена CYP2E1 c помощью ПДРФ-анализа. Предложен новый способ определения полиморфизма 341T>C гена NAT2 с использованием аллель-специфичной ПЦР.

Впервые путем анализа связи полиморфных вариантов генов ферментов, участвующих в метаболизме противотуберкулезных препаратов и антиоксидантной защите с гепатотоксическими реакциями в условиях интермиттирующего и ежедневного приема ПТП показано, что эта связь меняется в зависимости от режима терапии. Впервые в мире показано, что генотип 63СС 5 экзона GSTA2 предрасполагает к развитию гепатотоксических реакций при интермиттирующем приеме противотуберкулезных препаратов, при ежедневном приеме этот генотип напротив связан с устойчивостью к развитию гепатотоксических реакций. Впервые в мире показано, что генотип GSTP1*A/B предрасполагает к развитию гепатотоксических реакций у больных с интермиттирующим режимом терапии, при ежедневном режиме терапии этот генотип не проявляет себя. Впервые в России показано, что генотип СYP2E1*7632TA связан с усилением гепатотоксических реакций. Также впервые в России показано, что гомозиготная делеция GSTT1 предрасполагает к гепатотоксическому действию противотуберкулёзных препаратов при их ежедневном приеме.

Практическая значимость работы. Предложены новые способы определения полиморфизмов генов NAT2, CYP2E1, GSTA2, GSTP1, которые могут применяться в исследованиях, связанных с изучением функциональных проявлений полиморфизмов, а также в популяционно-генетических и генетико-эпидемиологических исследованиях.

Найденные достоверные ассоциации генетических и фенотипических маркеров с гепатотоксическими реакциями при лечении туберкулёза могут быть использованы для прогнозирования и профилактики лекарственного поражения печени у пациентов с интермиттирующим и ежедневным режимом терапии. Результаты работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов.

Основные положения, выносимые на защиту:

Медленный метаболизм пиразинамида и изониазида предрасполагает к гепатотоксическому действию противотуберкулёзных препаратов при ежедневном режиме терапии.

Носители генотипов NAT2, кодирующих фенотип медленного ацетилирования, и генотипа -7632TA CYP2E1 более подвержены гепатотоксическому действию противотуберкулёзных препаратов.

Наличие полиморфных вариантов генов глутатион S-трансфераз, уменьшающих их экспрессию и активность, усиливает гепатотоксическое действие противотуберкулёзных препаратов. Их значение более выражено при интермиттирующем приеме и уменьшается при увеличении дозовой нагрузки при ежедневном приеме.

Сочетание полиморфных вариантов N-ацетилтрансферазы 2 и цитохрома Р450 2Е1, усиливающих генерацию токсичных метаболитов противотуберкулёзных препаратов и вариантов глутатион S-трансфераз A2 и P1, ослабляющих антиоксидантную защиту, способствует развитию гепатотоксических реакций.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 2 в рекомендованных ВАК журналах и 1 статья в сборнике.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы, включающий 28 отечественных и 206 иностранных источников. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками, содержит 27 таблиц.