Диагностикум эритроцитарный туберкулезный антигенный
СПОСОБ ЦОЛУЧЕЙИЯ. ТУБЕРКУЛЕЗНОГО даАГНОСТИКУMA, включающий культивирование микобактерий туберкулеза , вьвделение и очистку фосфатидного антигена из микробной массы ацетоном и метанолом с последующей сенсибилизацией им сорбента, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, культивируют микобактерий Dt/St и Valu, после мйтаноловой очистки фосфатидный антигенвыпаривают до появления осадка, обрабатывают хлороформом и сенсибилизируют эритроциты из расчета 0,4 1 ,0 мг антигена на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов.
РЕСПУБЛИК (5в А 61 В 10/00
К ABTOPCHOlVIV СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3413780/28-13
Красного Знамени педиатрический медицинский институт (53) 615.375(088.8) (56) 1.Takahashi Y. and Katsuo О.
Study on the Passive Hemagglutination Reaction ду the Phosphatide
of М. Tuberculosos, 2 Conditions
of the Reaction. — Amer. Rev. Resp.
Dis. 1961, Р 83, р. 386-393.
„„SU„„.106 78 А (54 ) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ. ТУБЕРКУЛЕЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА, включающий культивирование микобактерий туберкулеза, выделение и очистку фосфатидного антигена из микробной массы ацетоном и метанолом : с последующей сенсибилизацией им сорбента, отличающийся тем, что, с целью повьпаения активности целевого продукта, культивируют микобактерии Dt/St и Valu, после метаноловой очистки фосфатидный антиген выпаривают до появления осадка, обра« батывают хлороформом и сенсибилизируют эритроциты из расчета 0,4
1,0 мг антигена на 1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения антигенного эритроцитарного туберкулезного диагностикума.
Известен способ получения туберкулезного диагностикума, включающий культивирование микобактерий туберкулеза, выделение и очистку фосфатидного антигена из микробной массы ацетоном и метанолом с последующей сенсибилизацией им каолина (1 .
Однако известный способ не позволяет получить диагностикум с высокой активностью и, кроме того, сложен в исполнении.
Цель изобретения - повышение активности диагностикума.
Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения туберкулезного диагностикума, включающему культивирование микобактерий 20 туберкулеза, выделение и очистку фосфатидного антигена иэ микробной массы ацетоном и метанолом с последующей сенсибилизацией им сорбента, культивируют микобактерии Dt/St и UBlu, после метаноловой очистки фосфатидный антиген выпаривают до появления осадка, обрабатывают хлороформом и сенсибилизируют эритроциты из расчета 0,4-1,0 мг анти- 3О гена на 1 мл 10Ъ-ной взвеси эритроцитов.
Способ осуществляют следующим образом.
Иикобактерии туберкулеза Dt/St и Ualu выращивают в отдельных матрицах, заполненных средой Линниковой и Могилевского (состав среды: вода дистиллированная 200 л, гликокол 1,7 кг, аммоний лимоннокислый однозамещенный 1,0 кг; натрий углекислый безводный О,б кг, натрий хлористый 0,4 кг, магний сернокислый 0,2 кг, железо лимоннокислое окисное 0,01 кг; глицерин 14 кг, ортофосфорная кислота 60-90 мл; калий фосфорнокислый двузамещенный
О,б кг), в течение 6-8 недель при
38 С. После этого проводят стерилизацию микробных культур автоклавированием текучим паром в течение 1 ч. 50
Затем микробные культуры смешивают в равных объемах, после чего для получения микробных тел. культуральную жидкость удаляют путем фильтрации через асбестовые пластины. .55
Полученные микробные клетки высушивают обработкой ацетоном.
Обработанные ацетоном клетки заливают метанолом из расчета 0,5 л метанола на 50 r клеток и встряхивают в течение 5 ч при 37 С, после чего микробные клетки отделяют центрифугированием. Эту операцию также проводят два раза.
Кетаноловые экстракты первого и второго извлечения (по укаэанной операции) объединяют и помещают в вакуум-сушильный шкаф, в котором проводят выпаривание метанолового экстракта до появления осадка фосфатидного антигена. Выпаривание целесообразно проводить при разрежении 0,8-0,6 кгс/см и температуре
48-52 С. Окончание операции выпаривания устанавливают либо визуально по выпадению осадка (для чего вакуумсушильный шкаф должен иметь прозрачное окно для наблюдения), либо по времени, предварительно установленного в зависимости от используемой аппаратуры и конкретного режима выпаривания из расчета выпаривания до
1/3 объема. Выпаривание до 1/3 исходного объема метанолового экстракта достаточно для выпадания осадка фосфатидного антигена без соосаждения примесей.
Образовавшийся осадок фосфатидного антигена отделяют центрифугированием и растворяют в хлороформе.
К этому раствору добавляют два объема ацетона для осаждения фосфатидного антигена. Осажденный антиген промывают ацетоном и высушивают в вакуум-эксикаторе.
Полученный полуфабрикат (фосфатидный антиген) до проведения операции сенсибилизации эритроцитов хранят в ампулах, запаянных под азотом.
Навеску фосфатидного антигена растворяют в метаноле. Этот раствор добавляют по каплям в физраствор, после чего производят выпаривание метанола при 50 С на магнитной мешалке до первоначального объема физраствора.
Таким путем получают рабочий раствор фосфатидного антигена для сенсибилизации им эритроцитов, поскольку непосредственно в физрастворе фосфатидный антиген не растворяется.
Объем физраствора при приготовлении фосфатидной эмульсии зависит от требуемой концентрации фосфатидного антигена, обеспечивающей высокий титр противофосфатидных антител в соответствующих иммунных сыворотках и экономное расходование- фосфатидного антигена. Целесообразно брать такое количество физраствора, чтобы весовая концентрация фосфатидного антигена в нем составила 0,4
1,0 мг/мл. При этом для сенсибилизации используют 10%-ную взвесь формалинизированных эритроцитов в объеме, равном объему использованного для
1069783 приготовления фосфатидной эмульсии физраствора. Этим сараям обеспечивается сенсибилиэация эритроцитов при соотношении ингредиентов: О, 41,0 мг фосфатидного антигена на
1 мл 10%-ной взвеси эритроцитов.
9перацию сенсибилизации проводят соединением равных объемов фосфатидной эмульсии и 10%-ный формалинизированных эритроцитов с последующим выдерживанием данной смеси в течение 14 ч при 37ОС при постоянном перемешивании ° Эатем производят центрифугирование и отмывание осадка физраствором. Из осадка отмытых
Титр антител в иммунной кроли туберкулезными диагностиками, эритроцитов различными дозами. сенсибилизировацных эритроцитов приготавливают 10а-нyю взвесь добавлением защитной среды. В качестве защитной среды может применяться
5%-ный раствор сахарозы, сахарозожелатиновый стабилизатор, 5%-ный пептон или Мясопептонный бульон (MIB> с добавлением сахарозы и баратно-янтарного буфера. В выбранной защитной среде целевой продукт подвергают лиофилизации.
Сведения о предпочтительности режима сенсибилизации эритроцитов и выбора защитной среды прриведены в табл. 1 и 2.
Таблица 1 чьей сыворотке в РНГА с. полученными сенсибилизацией фосфатидного aBmHreна
Доза антигена, мг на 1 мл
10%-ной взвеси эритроцитов
1 8 1:16 1:32 1г64 1:128 1 256 1 512
Титр антител в иммунной кроличЬей сыворотке в РНГА с эритроцитарным диагности кумом, лиофилизированным в различных защитных средах
Титры антител в зависимости от сроков храненйя препарата при 20 С
0,5-r 1г 1,5 г 2 г 2,5 г ЗГ
1:128 0 Сахарозо-желатиновый стабилизатор
ПРодолжение табл 2
Титры антител в зависимости от сроков хранения препарата при 20 С
0,5 r 1 г 1,5 r 2 г 2,5 г 3 г
1164 1:32 1:8 0 0 0
Остальное 1:128 1:128 1:128 1:128 1:64 1:64
Данные табл. 1 иллюстрируют проведение операции сенсибилизации эритроцитов барана различными дозами фосфатидного антигена. Как видно из табл. 1 оптимальной сенсибилизирующей дозой является 0,4-0,6 мг/мл, так как .меньшая доза не обеспечивает достаточного выявления антител, .а большие дозы приводят в неэкономному расходованию антигена. 3(Как видно из табл. 2, наиболее предпочтительной для лиофилизации и хранения препарата является защитная среда следующего состава:
Иясопептонный бульон, 35 об. В
Боратно-янтарный.: буфер Остальное
Лиофилизированный в этой среде 4п препарат может храниться 3 года, тогда как при использовании других защит, ных сред срок хранения не более
Используемые в предлагаемом спосо-4 бе штавмы являются новыми только по отношению к выбранному прототипу.
Они используются в укаэанной технологии получения туберкулина. При этом штамм 0 78с является штаммом человеческого типа. Он получен иэ США (r.Вашингтон, комиссия земледелия) и хранится в коллекции ГИСК им. Л.A.ÒàðàcåÜè÷à. Штамм Valu является штаммом бычьего типа. Он по лучен из ЦНИИ туберкулеза и хранится в коллекции ГИСК им. Л.A.Тарасевича. Ксерокопии паспортов штаммов прилагаются.
Замена штаммов произведена в связи с тем, что использовавшиеся в 60 способе-прототипе штаммы, особенно
ВС4,приводили к выявлению антител, характеризующих, главным образом, поствакцинальный иммунитет, что снижает специфичность этого серологиI E l 1 ческого теста. Кроме того, достигнутое использование одних и тех же штаммов как для приготовления туберкулина, так и предлагаемого туберкулезного диагностикума, дает возможность осуществить.безотходное производство одновременно обоих препаратов: при этом в технологической схеме их получения общей стадией будет культивирование продуцентов после чего из культуральной жидкости извлекают туберкулин, а из микробной массы (которая ранее являлась отходом производства) выделяют фосфатидный антиген для предлагаемого получения туберкулезного диагностикугла.
Использование только одного из этих штаммов в предлагаемом способе так же, как и при получении туберкулина, недостаточно для полного выявления соответствующих антител у больных туберкулезом.
Обработка фосфатндного антигена хлороформом введена для растворения целевого продукта, что позволяет освободить его от нерастворимых в хлороформе балластных веществ, нродуцируемых используемыми штаммами микобактерий туберкулеза. При этом важным является выпаривание метанолового экстракта не полностью, а только до появления осадка (в котором содержится фосфатидный антиген(. Экспернментально установлено, что в противном случае (т.е. при полном выпаривании метанолового экстракта до получения сухого осадка) осадок приобретает темную окраску, что свидетельствует о соосаждении балластных пигментированных веществ, и не поддается растворению в хлороформе. Возможно, что это требование обусловлено использованием названных штаммов.
Использование в качестве сорбента эритроцитов позволяет получить препарат в виде эритроцитарного туберкулезного диагностикума, так как его применяют не в РКА, а в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА). 5
Кроме того, эритроцитарный диагностикум подлежит лиофилизации, что увеличивает срок его годности.
Пример. Матрацы, предварительно простерилизованные температурной обработкой, емкостью 1,5 л стерильно заполняют синтетической питательной средой Линниковой и Могилевского из расчета по 600 мл на 1 матрац. „. рН среды равен 6,9-7,1. Одну половину матрацев засевают штаммом Dt/st, а другую - штаммом Valu.. Выращивание микобактерий туберкулеза в этих матрацах производят при 38 С в течение
6-8 недель. В течение этого срока ежедневно посевы просматривают для выявления матрацев с ростом посторонней флоры, которые отбраковывают и обеззараживают, Матрацы с 6-8-недельными хорошо выросшими туберкулезными культурами помещают в оцинкованные ящики, в которых обеззараживают эти культуры автоклавированием текучим паром в течение 1 ч при 120 С..
Обеззараженные культуры смешивают ЗО поштаммно путем сливания их в 20литровые бутыли 1в равных объемах для каждого штамма). Для приготовле.ния фосфатидного антигена берут 1012 л смешанной культуры обоих штам- 35 мов.
Смешанную культуру фильтруют через асбестовые пластины для получения микробных клеток, которые затем . промывают 7 л дистиллированной воды 4р и 3 л ацетона.
После этого производят экстрагирование ацетонорастворииых компонентов путем обработки одного объема микробной массы двумя объемами ацетона при 38 С в течение 3 ч, по истечении которых ацетон сливают °
Данную операцию проводят дважды.
Обработанные ацетоном клетки заливают метанолом из расчета 0,5 л метанола на 50 г клеток и помещают на шуттель-аппарат в термостат при
37.С, осуществляя встряхивание реакционной смеси в течение 5 ч. Осадок отделяют центрифугированием при факторе разделения F = 1500 в течение 20 мин, после чего производят повторное экстрагирование метанолом при тех же условиях.
Метаноловые экстракты первого и второго извлечений объединяют и выпаривают в вакуум-сушильном шкафу при 0,7 кгс/см и 50 С в течение 5 ч. За это время происходит упаривание раствора до 1/3 от первоначального объема, что достаточно 65 для выпадения осадка фосфатидного антигена без соосаждения примесей.
Осадок фосфатидного антигена отделяют центрифугированием при указанном режиме, затем промывают ацетоном при 40"С, вновь центрифугируют и растворяют в хлороформе из расчета на один объем использованного метанола 0,1 объема хлороформа. К хлороформенному раствору фосфатидного антигена добавляют двойной объем предварительно охлажденного до +4ОС ацетона. Выпавший осадок фосфатидного антигена отделяют центрифугированием при том же режиме, промывают 3 раза ацетоном и высушивают. в вакуум-эксикаторе при комнатной температуре в течение 48 ч.
Выход сухого фосфатидного антигена составляет 2-2,5 г из 50 г микробных клеток.
Фосфатидный антиген )расфасосывают в ампулы по 10 мг и запаивают последние под азотом. Установлено, что в таком виде фосфатидный антиген может храниться 5 лет.
Для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана взятую из ампулы навеску фосфатидного антигена е,0 мг растворяют в 3,0 мл метанола. Этот раствор добавляют по каплям к 12 мп 0,85%-ного изотонического раствора хлористого натрия, после чего производят выпаривание метанола на магнитной мешалке при
50ОС до первоначального объема физраствора (т.е. до 12 мп ).
Полученные 12 мл фосфатидной эмульсии соединяют с 12 мл 10%-ных формалинизированных эритроцитов при постоянном перемешивании. При этом концентрация фосфатидного антигена составляет 0,5 мг на 1 мл 10%-ных формалинизированных эритроцитов (барана). Приготовленную смесь выдерживают 1 ч в водяной бане при
37 С и при постоянном перемешивании.
Затем производят центрифугчрование взвеси при факторе разделения F =
2000, после чего осадок дважды отмывают от избытка антигена физраствором рН 7,0-7,2.
Из осадка отмытых сенсибилизированных эритроцитов приготавливают
104-ную взвесь добавлением 12 мл защитной среды следующего состава:
Мясопептонный бульон, об.%- 25
Сахароза, вес.Ъ 5
Боратно-янтарный буфер Остальное
Полученный жидкий препарат эрнтроцитарного туберкулезного диагностикума разливают по 1,0 мл в ампулы и замораживают до -70 С, после чего препарат лиофилизируют °
При указанном соотношении ингредиентов получают 12 ампул сухого
1069783 агностики туберкулеза применяют, как правило, туберкулин, наиболее принципиальным является сравнение эффективности использования полученного препарата с туберкулином. Данные для сравнительного анализа приведены в табл. 3.
Результаты серологических реакций по основным группам обследования
РНГА с применением эритроцитарного туб. ди агности кума
Обследо- Полоиитель вано ная реакчеловек ция, Ъ
Бесплатная горячая линия юридической помощи
- Главная
- ПРИКАЗ Минздрава РФ от 21.03.2003 N 109 (ред. от 29.10.2009) "О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ"
II. ПРЕПАРАТЫ ТУБЕРКУЛИНА
Туберкулиновые препараты - препараты из антигенов МБТ или их культуральных фильтратов, обработанных различными способами.
Допускается использование только зарегистрированных в Российской Федерации препаратов туберкулина.
Туберкулиновые препараты используют для туберкулинодиагностики (очищенные туберкулины) и для выявления антител к МБТ (диагностикум эритроцитарный туберкулезный антигенный сухой и ИФА тест-системы).
Изготавливают из смеси убитых нагреванием фильтратов культуры МБТ человеческого и бычьего видов, очищенных ультрафильтрацией, осажденных трихлоруксусной кислотой, обработанных этиловым спиртом и эфиром. Используют два вида очищенного туберкулина.
Аллерген туберкулезный очищенный жидкий (очищенный туберкулин в стандартном разведении) - готовые к употреблению растворы туберкулина. Препарат представляет собой раствор очищенного туберкулина в фосфатном буфере с твином-80 в качестве стабилизатора и фенолом в качестве консерванта, бесцветная прозрачная жидкость. Препарат выпускают в ампулах в виде раствора, содержащего 2 ТЕ ППД-Л в 0,1 мл. Возможен выпуск 5 ТЕ, 10 ТЕ в 0,1 мл и других дозировок препарата. Срок годности - 1 год. Выпуск готовых к употреблению разведений ППД-Л (модификация Линниковой) позволяет использовать в стране для массовой туберкулинодиагностики стандартный по активности препарат и избежать ошибок при разведении туберкулина на местах его применения.
Аллерген туберкулезный очищенный сухой (сухой очищенный туберкулин) - это растворенный в фосфатном буфере с сахарозой лиофильно высушенный очищенный туберкулин. Препарат имеет вид сухой компактной массы или порошка белого (слегка сероватого или кремового) цвета, легко растворяющегося в прилагаемом растворителе - карболизированном изотоническом растворе натрия хлорида. Выпускается в ампулах, содержащих 50000 ТЕ. Срок годности - 5 лет. Сухой очищенный туберкулин используют для диагностики туберкулеза и туберкулинотерапии только в противотуберкулезных диспансерах и стационарах.
Специфическая активность туберкулиновых препаратов устанавливается и контролируется относительно национального стандарта туберкулина ППД.
В каждой коробке с туберкулинами имеется инструкция по применению препаратов с подробной их характеристикой. Ознакомление с этой инструкцией врача и медицинской сестры перед туберкулинодиагностикой обязательно.
Диагностикум эритроцитарный туберкулезный антигенный сухой - бараньи эритроциты, сенсибилизированные фосфатидным антигеном МБТ, пористая масса или порошок красновато-коричневого цвета. Предназначен для выявления в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) специфических антител к антигенам МБТ. В клинике туберкулеза используют как иммунологический тест для определения активности процесса и эффективности лечения. Тест-система иммуноферментная для определения антител к возбудителю туберкулеза. Представляет собой набор ингредиентов для проведения иммуноферментного анализа на твердофазном носителе. Предназначена для выявления антител к возбудителю туберкулеза в сыворотке крови больных. Используют для лабораторного подтверждения диагноза "туберкулез различной локализации", оценки эффективности лечения, назначения специфической иммунокоррекции. Чувствительность иммуноферментного анализа при туберкулезе составляет 60 - 70%, а специфичность около 90%, что не позволяет использовать тест-систему для скрининга туберкулезной инфекции.
ФСП 42-0010-4099-03 рег. № 002971/01
Диагностикум представляет собой 3 % взвесь формалинезированных, танизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных очищенным концентрированным дифтерийным анатоксином.
Имеет вид гомогенной жидкости коричневого цвета. При стоянии разделяется на осадок, легко разбивающийся при встряхивании, и надосадочную жидкость.
Препарат предназначен для определения уровня дифтерийного антитоксина в сыворотке крови человека в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) микрометодом и макрометодом.
Определение содержания дифтерийного анатоксина в сыворотке крови человека осуществляют в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) микрометодом и макрометодом.
1).В 12 лунок полистироловой пластины с V -образными лунками микротитратора системы Такачи или отечественного производства вносят по 0,025мл (1 кап) разведенного ФБР с твином.
2).В первую лунку вносят 0,025мл разведенной в 5 раз испытуемой прогретой, адсорбированной сыворотки, тщательно перемешивают, получают разведение 1:10. 3).Переносят по 0,025 мл раствора из предыдущей лунки в последующую, делают двукратные разведения до 10 лунки включительно.
4).Из 10 лунки 0,25 раствора удаляют.
5).Флаконы с разведенным диагностикумом встряхивают до образования однородной взвеси и в каждую лунку вносят по 0,025 мл (одной капле) диагностикума.
Проведение реакции сопровождают следующими контролями:
1. испытуемой сыворотки на отсутствие агглютининов к эритроцитам барана:
· В 11 лунку каждого ряда вносят 0,025 мл испытуемой сыворотки, разведенной 1:5,прогретой, адсорбированной.
· 0,025 мл переносят в 12 лунку и добавляют в обе лунки по 0,025 мл разведенной в 8 раз 3% взвеси эритроцитов барана контрольных.
2. контроль на активность диагностикума и отсутствие спонтанной агглютинации. РПГА проводят с сывороткой противодифтерийной контрольной, разведенной в 100раз.
· В 2 ряда по 12 лунок полистироловой пластины наливают по 0,025мл разведенного ФБР с твином.
· В первую лунку каждого ряда добавляют по 0,025 мл разведенной сыворотки, получают разведение 1:200,содержимое лунок тщательно перемешивают и, переносят по 0,025 мл раствора из предыдущей лунки в последующую, делают двукратные разведение до 10 лунки включительно.
· Из 10 лунки 0,025 раствора удаляют.
· Флакон с разведенным диагностикумом тщательно встряхивают до образования взвеси эритроцитов и вносят по 0,025мл (1кап) разведенного диагностикума в каждую лунку до конца ряда. 11 и 12 лунки являются контролем диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации.
1). В 12 лунок полистироловой пластины наливают по 0,4 мл раствора разведенного ФБР с твином.
2).В первую лунку вносят 0,4мл разведенной в 5 раз испытуемой прогретой, адсорбированной сыворотки.
3).получают разведение 1:10,тщательно перемешивают и переносят по 0,4 мл раствора из предыдущей лунки в последующую, делают двукратные разведения до 10 лунки включительно.
4).Из 10 лунки 0,4 мл раствора выливают.
5)флакон с диагностикумом тщательно встряхивают до образования однородной взвеси эритроцитов.
6).Вносят по 0,05 мл 3% взвеси диагностикума в каждую лунку с разведенной сывороткой.
Реакцию сопровождают следующими контролями:
1. испытуемой сыворотки на отсутствие агглютининов к эритроцитам барана:
· В 11 лунку каждого ряда вносят 0,4 мл разведенной в 5 раз, прогретой, адсорбированной, содержимое лунки перемешивают.
· Переносят по 0,4мл разведенного ФБР с твином.
· В первую лунку каждого ряда добавляют по 0,4 мл разведенной сыворотки, получают разведение 1:200.
· Содержимое лунок тщательно перемешивают и переносят по 0,4 мл раствора из предыдущей лунки в последующую.
· делают двукратные разведения до 10 лунки включительно.
· из 10 лунки 0,4 мл раствора выливают.
· Флакон с диагностикумом тщательно встряхивают до образования однородной взвеси эритроцитов.
· Вносят по 0,05мл диагностикума в каждую лунку до конца ряда. 11 и 12 лунки являются контролем диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации.
Пластины остаются на ровной поверхности в течение 2,5 – 3,5 часов при температуре от 20-22 °С. Допускается учет реакции через 18-22 часов.
++++ - агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают все дно лунки, образуя по форме повернутый купол; края купола иногда заворачиваются
+++ - в верхней части агглютината отмечается более широкое плотное кольцо из эритроцитов барана, но меньшее по диаметру.
++ - в верхней части агглютината отмечается более широкое плотное кольцо из эритроцитов барана с признаками агглютинации по краю осадка.
- - на дне лунки образуется плотный диск или плотное широкое кольцо с полностью гладким краем.
Выпускают диагностикум в виде комплектов:
Для микрометода. Рассчитан комплект на 160 анализов. В состав комплекта входят:
1) диагностикум эритроцитарный дифтерийный жидкий–2 флакона по 5,0 мл;
2) эритроциты барана формалинизированные 50% - 2 флакона по 5,0 мл;
3) эритроциты барана контрольные – 1 фл. - 5,0 мл;
4) фосфатно-солевой буферный раствор без твина – 4 фл. по 3,2 мл;
5) фосфатно-солевой буферный раствор с твином – 4 фл. по 6,4 мл;
6) сыворотка противодифтерийная контрольная – 1 фл. - 1 мл.
Для макрометода – на 80 анализов. В комплект входят:
1) диагностикум эритроцитарный дифтерийный жидкий – 5 фл. по 20 мл;
2) эритроциты барана формалинизированные 50 %– 1 фл - 20 мл;
3) эритроциты барана контрольные – 1 фл. - 20 мл;
4) фосфатно-солевой буферный раствор с твином – 4 фл. по 6,4 мл;
5) сыворотка противодифтерийная контрольная – 1 фл. - 1 мл;
Препараты хранят в защищенном от света месте при температуре от 2 до 8°С.
Васильева Е.В. 1 , Вербов В.Н. 1 , Беклемишев А.Б. 2 , Перемолотова И.А. 3 , Тотолян А.А. 1
- 1 ФГУН научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Роспотребнадзора, Санкт-Петербург.
- 2 НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск.
- 3 ФГУП "Гос.НИИ ОЧБ" ФМБА России, Санкт-Петербург, E-mail: alenalenkina@gmail.com.
Основная цель иммунологических исследований при туберкулезе - оценка состояния и выявление возможных изменений в иммунной системе, которые могут быть использованы для дифференциальной диагностики. Учитывая многокомпонентность и сложность структуры иммунного ответа, для его оценки необходимо использовать комплекс тестов, отражающих интенсивность как клеточного, так и гуморального иммунитета [1].
Цель работы заключалась в сравнении туберкулезных антигенов, используемых в непрямом варианте ИФА при обнаружении IgG - антител к возбудителю туберкулеза, для оценки гуморального иммунитета. Были изучены два антигена: первый антиген - PPDN-3, который представляет собой ультрафильтрат культур возбудителя туберкулеза штаммов DТSТ и Valee и используется в тест-системе "ИФА-анти-ТУБ", выпускаемой НИИЭМ имени Пастера (г.Санкт-Петербург); второй антиген - специфический рекомбинантный антиген P38 M. tuberculosis, полученный одним из авторов методом генетической инженерии в НИИ биохимии СО РАМН (г.Новосибирск). Сорбцию антигенов в лунках полистирольных планшетов проводили при следующих концентрациях: 2,5 мкг/мл для P38 и 40 мкг/мл для PPDN-3. Методика постановки ИФА - согласно инструкции по применению "ИФА-анти-ТУБ". Для каждого антигена было исследовано в диагностическом разведении 97 сывороток крови, полученных от больных с активным туберкулезным процессом, и 45 сывороток крови от здоровых доноров.
При этом у 12,5 % больных был ответ только на антиген Р38 и у 17,5 % - только на антиген PPDN-3, 52,5 % больных имели антитела к обоим белкам. Из полученных данных следует, что совместное использование микобактериальных антигенов P38 и PPDN- 3 в серодиагностике туберкулеза позволит достигнуть чувствительности 82,5% и специфичности 93,2% (табл. 1). Отсутствие антител у 17,5% больных туберкулезом позволяет предположить, что у них гуморальное звено иммунного ответа не является преимущественным.
Таблица 1.
В качестве маркера для оценки напряженности клеточного иммунного ответа используют гамма-интерферон [2]. Количественное измерение гамма-интерферона (ИФН-гамма) позволяет диагностировать не только острые формы туберкулезной инфекции, протекающие преимущественно с клеточным типом иммунного ответа, но и латентную туберкулезную инфекцию (ЛТБИ). В качестве индуктора гамма-интерферона используют микобактериальный белок ESAT-6, секретируемый микобактериями на ранней стадии роста. Этот белок содержит эпитопы, распознаваемые протективными Т-клетками [3].
Иммунодоминантный белок ESAT-6 был разбит на отдельные, 15-ти членные фрагменты с перекрыванием в 9 аминокислотных остатков с помощью программы PeptGen. Для выделенных фрагментов были синтезированы 15 пептидов длиной 13-15 аминокислотных остатков. Синтез пептидов проводили на многоканальном синтезаторе пептидов Apex 396 на TentaGel полимерах (Rapp Polymere, GmbH) с использованием Fmoc-технологии твердофазного синтеза. В качестве временной защитной группы использовали флюоренилметилоксикарбонильную группу, для защиты боковых цепей трифункциональных аминокислот применялись защиты третбутильного и тритильного типов. После сборки полипептидной цепи полученные пептиды отщепляли от полимера с одновременным удалением постоянных защитных групп под действием трифторуксусной кислоты в присутствии скавенджеров. Чистоту полученных соединений определяли с помощью аналитической обращено-фазовой хроматографии. Масс-спектральный анализ выявил наличие пика молекулярного иона с расчетной молекулярной массой в каждом продукте синтеза.
Для предварительной оценки диагностической значимости полученных пептидов было обследовано 7 больных в возрасте 27-55 лет, проходивших лечение в СПб НИИ Фтизиопульмонологии. Из них с установленными диагнозами: фиброзно-кавернозный туберкулез легких, МБТ(+) - 6 пациентов; туберкулема S6 правого легкого, МБТ(-) - 1 пациент. Обследовано также 3 здоровых донора.
Образцы цельной венозной гепаринизированной крови были разлиты по 1 мл в 3 разные маркированные пробирки: контрольная проба без антигена и 2 опытные пробы, в одну из которых вносили 10 мкл фитогемаглютинина (ФГА) с концентрацией 25 мкг/мл, а в другую - 10 мкл исследуемых пептидов с концентрацией 10 мкг/мл. Лунки с ФГА использовали в качестве положительного контроля. Образцы крови инкубировали при 37 °С в течение 20-24 ч на ротаторе. Затем отбирали по 200 мкл образцов полученной плазмы, в которых определяли концентрацию ИФН-гамма методом твердофазного ИФА. Для оценки продукции ИФН-гамма использовали следующий коэффицент:
ИС = Кинд/Кспн, где ИС - индекс стимуляции, Кинд - значение индуцированной продукции цитокина (пг/мл), Кспн - значение спонтанной продукции цитокина (пг/мл).
Были получены следующие результаты. У больных туберкулезом наблюдается резкое увеличение спонтанной продукции ИФН-гамма (343,5 пг/мл - среднее значение, 289-398 пг/мл - разброс) по сравнению с группой здоровых (111,5 (58-165)). При оценке ИС индуцированной продукции ИФН-гамма у больных туберкулезом наблюдается угнетение продукции ИФН-гамма (1,162 (0,78-1,544)) в присутствии ФГА по сравнению с группой здоровых доноров (3,69 (1,38-6,00)). В случае стимуляции пептидами наблюдается обратная закономерность: у больных туберкулезом имеет место увеличение продукции ИФН-гамма (2,31 (0,58-4,04)) по сравнению с группой здоровых доноров (0,93 (0,68-1,18).
Таким образом, комплексное определение наличия антител в диагностическом разведении и количественное определение гамма-интерферона до и после стимуляции иммунокомпетентных клеток крови специфическими митогенами позволит с большей уверенностью ставить диагноз заболевания и, возможно, прогнозировать его тяжесть и излечиваемость.
- Чернушенко Е. Ф., Кадан Л. П., Панасюкова О. Р., Петишкина В.Н. Цитокиновая регуляция и развитие вторичных иммунодефицитных состояний при туберкулезе легких (научный доклад на заседании Ученого совета ДУ "Национальный институт фтизиатрии и пульмонологии имени Ф.Г. Яновского АМН Украины" 16.06.2009 года).
- Г.-Р. Бурместер, А. Пецутто Наглядная иммунология // Пер.с англ. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2007. - С. 230-231.
- Doherty TM, Demessie A, Olobo J, et al // Immune responses to the Mycobacterium tuberculosis-specific antigen ESAT-6 signal subclinical infection among contacts of tuberculosis patients.J Clin Microbiol 2002. - P. 704-06.
Читайте также:
