Строение фага кишечной палочки

Действительно, полвека назад антибиотики победно распространились по миру. Тогда казалось, что уже не нужны никакие другие средства, в том числе и бактериофаги, раз существуют надежные антибиотики. Вот как написано об этом в Большой советской энциклопедии, вышедшей в семидесятые годы прошлого века: "Антибиотики и другие химиотерапевтические средства оказались эффективнее фагов, в связи с чем их применение с лечебной целью сузилось". Сегодня в разных изданиях можно прочесть обратное: антибиотики, спасшие миллионы и миллионы человеческих жизней, теряют свою силу. Болезни все более упорно им сопротивляются: каждое новое поколение микробов накапливает устойчивость к этого рода лекарствам, вырабатывая своеобразный иммунитет.

Не случайно в недавнем обращении Всемирной организации здравоохранения говорится, что прогресс в медицине будет сведен на нет, если не удастся найти лекарства, способные справиться с самыми устойчивыми носителями болезней.

Науке известно примерно четыре тысячи антибиотиков, но лишь 60 из них широко применяются как лекарства. Три десятилетия назад, когда казалось, что с их помощью болезнетворные бактерии окончательно побеждены, дальнейший поиск природных антибиотиков шел уже не столь интенсивно. Правда, сегодня антибиотики создают и синтетическим путем - примером может служить синтезированный в последние годы "Линезолид", показавший себя с лучшей стороны при подавлении устойчивых бактерий. В частности, он уничтожает некоторые разновидности стафилококков - возбудителей воспалительно-гнойных заболеваний, против которых природные антибиотики бессильны.

И тем не менее надежных лекарственных средств для борьбы с такими видами микробов, как энтерококки и стафилококки, так и не найдено. По данным врачебной статистики, от этих возбудителей серьезных инфекционных заболеваний и в наши дни погибает немало людей: только в США ежегодно от них умирают 14 000 человек.

ВРАГ ТВОЕГО ВРАГА.

Помните пословицу: "Враг твоего врага - твой друг"? Если врагами человека считать болезнетворные микробы, то, оказывается, у каждого из видов бактерий есть свой враг - фаг (его еще называют вирусом бактерий, поскольку он на них паразитирует). Он атакует бактерию, прикрепляется к ней, прокалывает ее оболочку и впускает внутрь свой генетический материал - действует, как всем знакомый шприц. Однако изучение под микроскопом строения одной из разновидностей фага, известного в медицине как Т2 кишечной палочки, показало, насколько природная конструкция превосходит шприц, созданный инженерами. Первое. Шприц вводится в тело с помощью длинной иглы. Фаг самостоятельно прикрепляется к бактерии множеством нитей и острыми зубцами, находящимися на его конце. Там же, на конце, расположена так называемая базальная пластинка, обеспечивающая плотное примыкание фага к бактерии S. Второе. У фага нет поршня, как у шприца, с помощью которого выдавливалось бы его содержимое в тело бактерии. Это делают белковые нити, подобные мышечным волокнам: сокращаясь, как пружинки, они заставляют молекулы ДНК покидать тело фага. Все это устройство укладывается в миллионные доли миллиметра.

Форма фагов очень разнообразна - округлые, палочковидные, нитеподобные. Типичный фаг напоминает головастика. Но всех их объединяет суть воздействия на бактерию: ДНК фага, оказавшись в бактериальной клетке, подавляет ее ДНК. Происходит разрушение организма микроба, и из этих обломков фаг строит по плану, заложенному в его ДНК, свое потомство. Цикл размножения фагов внутри бактерии длится 30-40 минут. Таким образом умерший микроорганизм превращается в фабрику, производящую фаги, и на месте возбудителя болезни возникает сотня защитников заболевшего организма. Их присутствие в крови человека совершенно безвредно.

Микробиология познакомилась с фагами в конце XIX века. В 1898 году русский ученый Н. Ф. Гамалея открыл вещества, вызывающие разрушение бактерий, - бактериолизины. Он и его сотрудники ставили опыты с носителями "сибирской язвы". Несомненно, Н. Ф. Гамалея имел дело с лизисом - распадом бактерий при действии на них веществ, содержащихся в цитоплазме бактериофага. Но у ученого тогда не было технического оснащения для детального раскрытия этого явления.

Во времена Первой мировой войны канадскому исследователю Ф. Д'Эрелле и англичанину Ф. Туорту впервые удалось увидеть под микроскопом бактериофаги. Но детально изучать этих обитателей невидимого мира тогдашними методами было практически невозможно. Однако главную их особенность - "пожирать", а вернее - разрушать бактерии, ученые заметили. Именно поэтому в публикации об открытии Д'Эрелле дал им название "бактериофаги" - пожиратели бактерий. К тому же времени относятся и первые попытки применить их в медицине.

Применение фагов в качестве лекарств врачи встретили с большим интересом. В тридцатых годах прошлого века американский концерн "Эли Лилли" основал даже клинику, где начали лечить фагами. Пропагандисты нового метода сулили исцеление от всех болезней. Однако действительность оставляла желать лучшего: научные основы такой терапии были еще так скудны, что новое средство применяли практически вслепую. Считалось, что все фаги одинаковы и побеждают любую бактерию. Одним и тем же бактериофагом начинали лечить разные заболевания, а болезнь все не уходила - так метод был серьезно скомпрометирован. Мнение о малой эффективности фагов задержалось в кругах медиков на многие годы, живет оно еще и сегодня.

КАВКАЗСКАЯ НИТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

В годы Первой мировой войны врачом на Трапезундский фронт (северо-восток Турции) попал грузинский биолог Г. Элиава. До него дошла информация об открытии Ф. Д'Эрелле, и он увлекся возможностями бактериофага как мощного оружия медицины. Г. Элиава и Ф. Д'Эрелле встречались после войны и вместе отстаивали взгляд на бактериофаг как на живое существо. Им противостояли сторонники неживой, кристаллический природы этих обитателей микромира - к неживым они относили и все вирусы. Этот спор ученых имел принципиальное, мировоззренческое значение. В нем решался вопрос: где наука должна провести границу между живой и неживой материей?

В 1923 году Г. Элиава основал в Тбилиси Институт для изучения бактериофагов, благодаря которому нить исследования этих микроорганизмов, оборвавшаяся в западных лабораториях, здесь, на Кавказе, протянулась до наших дней. Усилиями энтузиастов, работающих в институте и сегодня, многое прояснилось в биологии фагов. Теперь новейшими исследованиями подтверждено, что фаги, уничтожающие бактерии, ближе к живому миру, нежели к неживому. Установлено, что разновидность фагов в микромире огромна и каждый из них способен умерщвлять только определенные виды бактерий. Для большинства микробов найдены "свои" бактериофаги, в том числе и для возбудителей болезней, сопротивляющихся антибиотикам.

По сравнению с антибиотиками у фагов есть к тому же и определенные преимущества. Известно, что применение антибиотиков часто вызывает нежелательные побочные воздействия на организм человека, - иногда такие серьезные, как аллергия. Или другое осложнение: попадая в кишечник больного, антибиотики зачастую губят там всю микрофлору, вредную и полезную, тем самым открывая дорогу вредоносным микробам (недаром в последнее время такое распространение получил дисбактериоз). Фаги же убивают только определенные виды бактерий, не затрагивая жизнь нужной человеку микрофлоры.

Второе достоинство фагов. Их действия в организме точно укладываются в тот срок, который необходим для уничтожения вторгшейся в него инфекции. С антибиотиками сложнее: врач должен сам определять курс приема лекарства, что не всегда просто. А фаги делают это автоматически. Они размножаются в организме больного за счет материала, взятого из тела бактерии (см. схему), которая ими атакована. Если в крови растет число возбудителей болезни, то и растет число фагов. Когда же такие бактерии уничтожены, воспроизводство фагов прекращается само по себе.

С исследованиями, вот уже 70 лет ведущимися в тбилисском Институте имени Элиавы, сегодня знакомы и ученые на Западе. Американский микробиолог К. Мерилл в 1996 году ставил опыты на мышах, которым в лабораторных условиях вводилась смертельная доза салмонеллы - распространенного и опасного вида бактерий. С помощью фагов животные были спасены. Ученый и сегодня продолжает работать с фагами. В берлинском Институте имени Р. Коха в последние годы стали исследовать влияние фагов на ход излечения некоторых заболеваний внутренних органов человека. Руководитель этого направления Б. Аппель уверен, что именно фаги дадут "новую опору для лечения инфекционных болезней".

Результаты, накопленные за десятилетия усилиями 250 преданных делу специалистов, дают грузинским микробиологам возможность продолжать работу, несмотря на сложности нынешнего существования института: государство прекратило финансирование, оборудование частью изношено, частью уже бездействует, штат сотрудников сократился в несколько раз.

И тем не менее разработана композиция из пяти разновидностей штаммов фагов. Это "пожиратели" тех бактерий, которые, как правило, поселяются на обожженной коже. В отделениях больниц, где исцеляют ожоги, больше всего опасаются заражения обожженных мест стафилококками, что ведет к сепсису крови, который почти не поддается лечению. Теперь в Грузии создано лекарство "пирофаг" - надежный помощник именно в таких случаях. Оно составлено из смеси различных фагов. Гнойные раны, обработанные фаговым препаратом, излечиваются в течение 5-10 дней. Антибиотики, если и побеждают такие инфекции, то только в месячный срок.

В холодильниках института хранится целый арсенал фагов - 3000 штаммов, способных встать на защиту здоровья человека. Раньше, до раздела СССР, институт был Всесоюзным центром фаготерапии. Из больниц, клиник всей страны сюда присылали образцы бактерий, с которыми было сложно справиться, либо вовсе незнакомых врачам микробов. В институте подбирали для неизвестной инфекции фаг, способный подавить ее. Если в институтском собрании фагов такой вид не находился, начинался поиск его в природе. И теперь ученые продолжают изыскивать фаги для разных случаев. (Один из сотрудников с гордостью сказал: "Мы вылечили английского посла!") Продажа лекарств - главный доход, позволяющий институту работать дальше. Здесь не страшатся будущего и верят в то, что их усилия успешно послужат медицине.

В заключение - о появившейся недавно публикации исследователей из Рокфеллеровского университета в Нью-Йорке об успехах терапии с помощью фагов. Ученые нашли новый путь к уничтожению болезнетворных микробов. Главную роль в этом играет один из биологических катализаторов - лизин, получаемый из фагов. Лизин способен разрушать стенки клеток стафилококков, убивая тем не поддающуюся до сих пор стойкую бактерию. (К сожалению, американские ученые не вспомнили о работах русского ученого Н. Ф. Гамалеи, еще в конце XIX века открывшего свойство лизина разрушать бактерии, да и о многолетних работах тбилисского института.)

Как уже говорилось, бактериофаги проникают внутрь бациллы и из "деталей" погибшей бактерии строят новые фаги. Этому молодому поколению фагов лизин также нужен, чтобы разрушить оболочку бактерии и выйти из нее.

Новое, что отмечает работу ученых из Нью-Йорка, - они освободились от самого бактериофага, а действуют на носителя инфекции лишь лизином. Достаточно одной миллиардной части грамма этого вещества, чтобы в течение пяти секунд уничтожить культуру стафилококков. Мыши, которым ввели в кровь эти бактерии, через два часа после инъекции лизина были свободны от них. Исследователи надеются, что биокатализаторы помогут справиться даже с такими болезнями, как чума и туберкулез.

А совсем недавно журнале "Sсience" опубликовал статью об успешной работе биологов из Техаса под руководством доктора Инг-Нанг Вонга. Его словами и завершим статью: "Бактериофаги - поистине золотая жила для создания белковых антибиотиков".

Вопрос о том, что является носителем наследственных признаков – белки или ДНК – решался Многие биологи считали, что химическое строение ДНК слишком просто для хранения большого количества наследственных признаков, белки же, более сложно устроенные, казались более подходящим для этих целей материалом. Доказательства того, что генетическим материалом живых организмов является ДНК, были получены при изучении бактериофагов (или сокращенно фагов) – вирусов, поражающих бактериальные клетки.

В 1952 г. Альфред Херши и Марта Чейз провели блестящий эксперимент, доказав, что наследственным материалом бактериофага T2 является ни что иное, как ДНК.

Бактериофаг T2 – один из наиболее изученных фагов кишечной палочки (). Его ДНК заключена в белковую оболочку, образующую головку вирусной частицы. В состав белков вирусной оболочки входят две аминокислоты (метионин и цистеин), содержащие серу, которая отсутствует в ДНК. А вот 99 % всего фосфора бактериофага T2 заключено именно в молекуле ДНК.

Херши и Чейз размножали фага T2 на бактериях , которые культивировались на питательной среде, содержащей радиоактивные изотопы 35 S и 32 P. Таким образом, белковая оболочка фага метилась изотопом 35 S, а ДНК фага – изотопом 32 P. Это позволило проследить пути белка и ДНК при инфицировании клеток .

Херши и Чейз готовили суспензию фаговых частиц, а затем смешивали ее с культурой живых бактерий в полужидком агаре, содержащем сульфат кальция (CaSO₄) с изотопом 35 S и диводородфосфат калия (KH₂PO₄) с изотопом 32 P. Полученная смесь выливалась в чашку Петри с твердой питательной средой, на которой она застывала. После инкубации бактерии размножались, образуя в чашке Петри сплошной слой клеток (т. н. газон), хорошо заметный невооруженным глазом. В местах, куда попали частицы фага, образовались небольшие проплешины, или бляшки. Их количество соответствовало количеству фаговых частиц, изначально попавших в бактериальную культуру.

После этого, Херши и Чейз заражали фагами, помеченными изотопами 35 S и 32 P, свежую бактериальную культуру, содержащуюся на агаре без радиоактивных меток. Годом раньше Андерсон исследовал процесс заражения клетки фагами под электронным микроскопом, и показал, что фаги прикрепляются к клетке, и если помешать фагам прикрепиться, заражения не будет. Херши и Чейз предположили, что белковая оболочка фага остается вне клетки, а внутрь клетки проникает ДНК.

Действительно, фаговые частицы осаждались при центрифугировании вместе с бактериями, это подтверждало данные Андерсона о прикреплении фагов к бактериям. Херши и Чейз проверили гипотезу о том, что пустая белковая оболочка остается снаружи клетки. Для этого они перемешивали взятые из культуры пробы на магнитной мешалке, после чего центрифугировали их. Оказалось, что вскоре после инфицирования бактериальной культуры бóльшую часть белка фага, помеченного 35 S, можно было таким способом отделить от бактериальных клеток. В образовавшемся осадке и фильтрате разделяли серу и фосфор и измеряли радиоактивность. Выяснилось, что фильтрате в большом количестве содержатся изотопы серы 35 S, и в более чем вдвое меньше изотопов фосфора 32 P. Напротив, в осадке содержался почти исключительно изотоп фосфора 32 P.

Это ещё не означало, что внутрь бактериальной клетки попадет только изотоп фосфора 32 P, то есть исключительно ДНК клетки – из графика следует, что около 20 % меченой серы остаётся на (или в) бактериях.

Из проведенного опыта Херши и Чейз сделали вывод, что для образования копий фага достаточно лишь его ДНК, а белковая оболочка воспроизводится заново. Это позволило высказать предположение, что белковая оболочка всего лишь защищает молекулу ДНК от действия ферментов, обеспечивает прикрепление фага к клетке и попадание ДНК в бактериальную клетку. Собственно вещество наследственности представляет собой именно ДНК.

Результаты эксперимента А. Херши и М. Чейз были сразу же приняты в качестве решающего доказательства генетической роли ДНК.

Во-первых, их опыт был поставлен на бактериофаге, про который было известно, что по характеру наследования признаков он аналогичен многоклеточным живым организмам.

Во-вторых, в результате проведенных за период химических исследований было установлено, что ДНК обладает достаточной химической сложностью, чтобы служить веществом наследования. Во всяком случае, было доказано, что ее молекула не является простым полимером, в которой многократно повторяется один нуклеотид.

Проведенные в дальнейшем опыты на вирусе табачной мозаики подтвердили гипотезу А. Херши и М. Чейз.

БАКТЕРИОФАГИ - вирусы бактерий, которые обладают способностью лизировать бактериальную клетку или изменять ее свойства. Фаги размножаются в клетках чувствительных к ним бактерий.

С
редние размеры фагов - 25-110 нм.

По характеру взаимодействия с чувствительной клеткой фаги различают:

а) вирулентные (дают литическую продуктивную инфекцию);

б) умеренные (вызывают лизогенизацию клетки). По специфичности различают:

а) полифаги (лизируют несколько видов бактерий);

б) монофаги (лизируют только один вид бактерий);

в) типовые фаги (лизируют не все штаммы данного вида, а лишь некоторые, принадлежащие к одому фаговару).

Этапы взаимодействия вирулентного фага с клеткой:

Адсорбция фага на специфических рецепторах клеточной стенки (с участием фибрилл и отростка).

Проникновение нуклеиновой кислоты фага внутрь бактериальной клетки (лизоцим отростка фага растворяет клеточную стенку бактерии в месте адсорбции, чехол сокращается, стержень проходит сквозь клеточную стенку и нуклеиновая кислота фага поступает внутрь бактериальной клетки, оболочка головки остается снаружи).

Синтез в клетке компонентов фага (проникшая нуклеиновая кислота фага вызывает полную перестройку метаболизма клетки; на рибосомах синтезируются белки фага, а в других участках клетки реплицируется его нуклеиновая кислота).

Сборка фаговых частиц и лизис клетки (нуклеиновая кислота наполняет белковые головки пристраивается отросток; лизоцим фага растворяет клеточную стенку бактерии, клетка лизируется, и из нее выходят 100-300 новых фагов; они внедряются в соседние клетки и также лизируют их; в результате мутная культура бактерий на жидкой среде просвегляется, а на плотной среде образуется колония фага - "стерильное пятно").

Взаимодействие умеренного фага с клеткой

Адсорбция фага и проникновение нуклеиновой кислоты происходит аналогично. Но проникшая в клетку ДНК фага встраивается в хромосому клетки, где может находиться в неактивном состоянии (под действием белка-репрессора) и наследоваться дочерними клетками после репликации хромосомы. Этот процесс называется лизогенизацией, а клетки, содержащие неактивный геном фага (профаг), называются лизогенными. Чтобы обнаружить в клетке профаг, надо подействовать индуцирующими агентами физическими (УФО, рентгеновскими лучами) или химическими. Они разрушают репрессор, с профага считывается информация, в клетке синтезируются компоненты фага и клетка лизируется. Этот процесс называется индукцией. В процессе лизогенизации может произойти конверсия фагом (изменение свойств бактериальной клетки). Так, если нетоксичную дизентерийную палочку (не продуцирующую экзотоксин) обработать умеренным дифтерийным фагом, некоторые клетки станут лизогенными и приобретут способность продуцировать экзотоксин.

Активность препарата фага определяется его титром. Титр фага - наибольшее его разведение, еще вызывающее лизис чувствительной культуры бактерий.

Фаги титруют следующими методами.

/. Титрование фага на жидкой среде

Готовят последовательные десятикратные разведения испытуемого фага в жидкой питательной среде; 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , и т.д. В эти разведения вносят чувствительную культуру бактерий. Пробирки инкубируют в термостате при 37°С 18-20 часов. Затем отмечают наибольшее разведение фага, ещё вызывающее лизис внесённой культуры (рост бактерий в этой пробирке отсутствует). Это разведение, и является титром фага. Например: "титр фага - 10 -6 "

2. Титрование фага на плотной среде

Чашку с плотной средой делят на несколько зон. Культуру чувствительных бактерий высевают сплошным газоном на поверхность среды. Затем в соответствующие зоны наносят по капле различных десятикратных разведений фага. После инкубации в термостате при 37°С 18-20 часов отмечают наибольшее разведение фага, ещё вызывающее лизис (образование "стерильного пятна").

Практическое применение фагов.

I. Вирулентные фаги применяют:

1) для лечения и экстренной профилактики (при угрозе заражения). Например:

Содержание

Русское название

Латинское название вещества Бактериофаг коли

Фармакологическая группа вещества Бактериофаг коли

Типовая клинико-фармакологическая статья 1

Фармдействие. Обладает способностью специфически лизировать бактерии энтеропатогенной кишечной палочки.

Показания. Гнойно-воспалительные заболевания ЛОР-органов, дыхательных путей, легких (синусит, отит, ангина, фарингит, ларингит, трахеит, бронхит, пневмония, плеврит) и ЖКТ (гастроэнтероколит, холецистит, дисбактериоз кишечника); хирургические инфекции (гнойные раны, ожог, мастит, абсцесс, флегмона, карбункул, гидраденит, панариций, парапроктит, бурсит, остеомиелит); урогенитальные инфекции (уретрит, цистит, пиелонефрит, кольпит, эндометрит, сальпингооофорит);гнойно-воспалительные заболевания новорожденных и детей грудного возраста (омфалит, пиодермия, конъюнктивит, гастроэнтероколит, сепсис), генерализованные септические заболевания. Для профилактики — обработка послеоперационных и свежеинфицированных ран, а также для профилактики внутрибольничных инфекций по эпидемическим показаниям.

Дозирование. Внутрь. Энтероколит, заболевания внутренних органов, дисбактериоз кишечника — 3 раза в день за 1 ч до еды. На 1 прием до 6 мес — 5мл, 6–12 мес — 10 мл, от 1 года до 3 лет — 15 мл, от 3 до 8 лет — 20 мл, от 8 лет и старше — 30 мл.

Ректально 1 раз в день (в виде клизмы) в сочетании с двукратным приемом внутрь. На 1 прием до 6 мес — 10 мл; 6–12 мес — 20 мл; от 1 года до 3 лет — 30 мл; от 3 до 8 лет — 40 мл; от 8 лет и старше в клизме — 50 мл.

Местно в течение 7–20 дней при терапии гнойно-воспалительных заболеваний с локализованными поражениями.

В случае обработки полости гнойного очага химическими антисептиками перед применением бактериофага полость промыть стерильным 0,9% раствором NaCl.

Гнойные раны — в виде орошения, аппликаций, повязок, введение через дренаж не менее 1 раза в день. При абсцессах после вскрытия и удаления гнойного содержимого препарат вводят в количестве меньшем, чем объем удаленного гноя. В дренированные полости ежедневно 1 раз в день — 20–200 мл.

Остеомиелит — 10–20 мл в полость раны через турунду, дренаж.

Введение в полости (плевральная, суставная и др. ограниченные полости) — до 100 мл бактериофага, оставляя капиллярный дренаж, через который в течение нескольких дней бактериофаг вводится повторно.

Гнойно-воспалительные гинекологические заболевания — 5–10 мл ежедневно 1 раз в день в полость вагины, матки. Гнойно-воспалительные заболевания ЛОР-органов — 2–10 мл 1–3 раза в день в полости среднего уха, носа. Бактериофаг используют для полоскания, промывания, закапывания, введения смоченных турунд (оставляя их на 1ч).

Цистит, пиелонефрит, уретрит — 20–50 мл в мочевой пузырь и 5–7 мл в почечную лоханку через цистостому или нефростому.

Детям до 6 мес. Сепсис, энтероколит новорожденных, включая недоношенных детей, 2–3 раза в сутки в виде высоких клизм (через газоотводную трубку или катетер). При отсутствии рвоты и срыгивания препарат применяют внутрь, смешивая с грудным молоком. Возможно сочетание ректального и перорального применения препарата. Курс лечения — 5–15 дней, при рецидивирующем течении заболевания возможно проведение повторных курсов лечения. Для профилактики сепсиса и энтероколита при внутриутробном инфицировании или опасности возникновения внутрибольничной инфекции у новорожденных детей бактериофаг применяется в виде клизм 2 раза в день в течение 5–7 дней.

Омфалит, пиодермия, инфицированные раны — 2 раза в день ежедневно в виде аппликации (марлевую салфетку смочить бактериофагом и наложить на пупочную ранку или пораженный участок кожи).

Побочное действие. Не описаны.

Взаимодействие. Применение бактериофага не исключает применение др. ЛС , в том числе антибактериальных и противовоспалительных препаратов.

Важным условием эффективной фаготерапии является предварительное определение фагочувствительности возбудителя.

[1] Государственный реестр лекарственных средств. Официальное издание: в 2 т.- М.: Медицинский совет, 2009. - Т.2, ч.1 - 568 с.; ч.2 - 560 с.

Химический состав фагов

Проблема бактериофагии на пищевых производствах

Список используемых источников

Одним из первых, кто наблюдал и детально описал явление лизиса у бактерий, был один из основоположников отечественной медицинской микробиологии - Н. Ф. Гамалея. В 1896 - 1898 гг. появились его работы, посвященные изучению явления лизиса у сибиреязвенной палочки. Фактор, вызвавший лизис этой бактерии, он назвал бактериолизином.

Для развития исследований в области бактериофагии особое значение имели работы французского ученого Д'Эрелля. В 1917 г. он сообщил, что из фекальных масс больных дизентерией ему удалось выделить особый литический фактор (вирус), способный проходить через бактериальные фильтры, размножаться на дизентерийных бактериях и вызывать при этом их лизис. Для обозначения этого вируса Д'Эрелль впервые предложил название бактериофаг. Для обозначения фагов (вирусов микроорганизмов), вызывающих лизис актиномицетов, применяется термин актинофаг, микобактерий - микофаг, кишечной палочки - колифаг, водорослей - цианофаг и т. д.

Применение современных электронных микроскопов, а также усовершенствование методов приготовления препаратов для электронной микроскопии позволили более детально изучить тонкую структуру фагов. Оказалось, что она весьма разнообразна и у многих фагов более сложна, чем структура вирусов растений и ряда вирусов человека и животных.

Рис.1 Морфологические типы фагов.

Разные фаги отличаются друг от друга не только по форме, величине и сложности своей организации, но и по химическому составу. Оказалось, что фаги, лизирующие микроорганизмы различных групп, могут быть вполне идентичными по своей морфологии. В то же время фаги, активные против одной и той же культуры, могут резко различаться по своей структуре. Так, например, среди фагов, способных лизировать разные штаммы кишечной палочки, выявлены все известные морфологические типы фагов.

Рис.2 Палочковидные, или нитевидные фаги увел. *400 000

Частицы (или вирионы) большинства известных фагов имеют форму сперматозоида. Они состоят из головки (или капсида) и отростка. Наряду с этим есть фаги, которые состоят из одной головки, без отростка, и фаги, имеющие форму палочки (палочковидные или нитевидные фаги).

Рис.3 Фаги второго морфологического типа,частица состоит из одной головки увел.*600 000

По форме частиц фаги делятся на шесть основных морфологических типов (групп): палочковидные или нитевидные фаги; фаги, состоящие из одной головки, без отростка; фаги, состоящие из головки, на которой имеется несколько небольших выступов; фаги, состоящие из головки и весьма короткого отростка; фаги, имеющие головку и длинный отросток, чехол которого не может сокращаться; фаги, имеющие головку и длинный отросток, чехол которого может сокращаться.

На рис.1 показано схематическое изображение частиц всех шести типов фагов. Размеры фагов принято обозначать в мили-микрометрах или в ангстремах.

Фаги первого морфологического типа - палочковидные или нитевидные - выявлены у кишечной, синегнойной, чудесной палочек и других бактерий. Средние размеры их: длина - от 7000 до 8500 А, ширина - от 50 до 80 А (рис.2). Эти фаги отличаются от всех остальных не только большой специфичностью, но и рядом других важных свойств.

Рис.4 Фаги третьего морфологического типа, от головки отходят небольшие выступы увел. *400 000

Фаги второго морфологического типа. Частица их состоит из одной головки гексагональной (шестигранной) формы на плоскости. Частицы очень мелкие, средний размер их 230-300 А в диаметре (рис.3).

У фагов третьего морфологического типа форма и размеры головки такие же, как у фагов второго типа, но у их головок имеются обычно несколько очень коротких выступов (рис.4). Возможно, эти выступы являются аналогами отростков.

Рис.5 Фаг четвертого морфологического типа, частица состоит из головки и короткого отростка увел. *600 000

Фаги второго и третьего морфологических типов отличаются постоянством формы и размеров, независимо от того, против каких микроорганизмов они активны. Эти фаги относятся к мелким формам.

Фаги четвертого морфологического типа. Частица состоит из головки, размеры которой варьируют от 400 до 640 А в диаметре, и очень короткого отростка (рис.5). Длина и ширина отростка от 70 до 200 А.

Фаги пятого морфологического типа наиболее широко распространены. Головка у частиц гексагональной, формы различных размеров - от 500 до 4250 А в диаметре. Размеры отростка: длина - от 1700 до 5000 А, ширина - от 70 до 120 А (рис.6). Чехол отростка не способен сокращаться.

Фаги шестого морфологического типа также широко распространены. Головка частицы различной формы и размеров - от 600 до 1500 А в диаметре, гексагональная. Размеры отростка: длина - от 800 до 2890 А, ширина - от 140 до 370 А. Важной особенностью фагов этой группы является то, что чехол, окружающий отросток, способен сокращаться, в результате чего становится видимым внутренний стержень отростка (рис.7).

Головки всех фагов состоят из внутреннего содержимого - нуклеиновой кислоты и окружены белковой оболочкой. Отросток фагов весьма сложен. Он обычно состоит из следующих структур: наружного чехла (или оболочки), внутреннего стержня с канальцем, базальной пластинки, оканчивающейся выступами (типа шипов) и нитевидными структурами. Чехол отростка состоит из субъединиц белковой природы, собранных в спираль. В результате этого он приобретает вид гофрированной трубки. В верхней части отростка многих фагов имеется образование, которое называется воротничком. На рис.8 схематически изображена тонкая структура фаговой частицы.

Химический состав фагов

Изучение химического состава фагов стало возможно лишь тогда, когда были усовершенствованы методы получения в больших количествах очищенных препаратов фага. В настоящее время изучен химический состав фагов, принадлежащих к разным морфологическим типам и поражающих микроорганизмы почти всех систематических групп.

Основными компонентами фагов являются белки и нуклеиновые кислоты. Важно отметить, что фаги, как и другие вирусы, содержат только один тип нуклеиновой кислоты - дезоксирибонуклеиновую (ДНК) или рибонуклеиновую (РНК). Этим свойством вирусы отличаются от микроорганизмов, содержащих в клетках оба типа нуклеиновых кислот.

Рис.6. Разные фаги пятого морфологического типа, частица состоит из головки и длинного отростка чехол которого не способен сокращаться. 1,2- увел. X 225 000, 3 - увел. X250 000

Нуклеиновая кислота находится в головке. Внутри головки фагов обнаружено также небольшое количество белка (около 3%).

Таким образом, по химическому составу фаги являются нуклеопротеидами. В зависимости от типа своей нуклеиновой кислоты фаги делятся на ДНК-овые и РНК-овые. Количество белка и нуклеиновой кислоты у разных фагов разное. У некоторых фагов содержание их почти одинаковое и каждый из этих компонентов составляет около 50%. У других фагов соотношение между этими основными компонентами может быть различно.

Рис.7. Фаг шестого морфологического типа, частица состоит из головки и длинного отростка, чехол которого способен к сокращению. Увел, около 400 000.

Кроме указанных основных компонентов, фаги содержат в небольших количествах углеводы и некоторые преимущественно нейтральные жиры.

Рис.8. Схема строения фаговой частицы.

Все известные фаги второго морфологического типа РНК-овые. Среди фагов третьего морфологического типа встречаются как РНК-овые, так и ДНК-овые формы. Фаги остальных морфологических типов - ДНК-овые.

Взаимоотношения между фагом и чувствительной к нему клеткой очень сложны и не всегда завершаются лизисом клетки и размножением в ней фага. Мы рассмотрим такую инфекцию клетки, которая заканчивается гибелью клетки и размножением в ней фага. Такая инфекция называется продуктивной.

Важнейшей особенностью размножения фага является то, что оно может происходить только в живых клетках, находящихся в стадии роста.

В мертвых клетках, а также продуктах клеточного обмена размножение фага не происходит. Процесс размножения фага весьма сложный и состоит из следующих последовательно протекающих этапов (рис. 9):

1) адсорбция фаговой частицы на поверхности микробной клетки; 2) проникновение содержимого головки фаговой частицы (нуклеиновой кислоты) в микробную клетку; 3) внутриклеточное развитие фага, заканчивающееся образованием новых фаговых частиц; 4) лизис клетки и выход из нее новых фагов.

Время с момента инфицирования клетки фагом до лизиса клетки называется латентным или скрытым периодом. Продолжительность этого периода различна для разных типов фага, зависит от окружающей температуры, состава среды и других факторов. Латентный период фагов, специфичных для одних бактерий, 15-40 мин, для других - 5 ч и более. У фагов актиномицетов латентный период может быть еще продолжительнее. При низкой температуре латентный период значительно увеличивается.

Рис.9. Схема размножения фага.

Из всех этапов размножения фага наиболее изучен первый - адсорбция.

Адсорбция фага на клетке - реакция весьма специфичная. В клеточной стенке бактерий имеются особые структуры (рецепторы), к которым могут прикрепиться фаги. Адсорбируются на рецепторах только те фаги, к которым чувствительна клетка. Фаги, имеющие отростки, прикрепляются к микробной стенке свободным концом отростка. Нитевидные фаги, а также фаги, не имеющие отростков, адсорбируются не на микробной стенке, а на нитевидных структурах, окружающих стенку, - фимбриях. Описаны фаги, которые прикрепляются отростком к бактериальным жгутикам. У некоторых фагов процесс адсорбции может осуществляться лишь в том случае, когда в среде имеются определенные вещества - кофакторы: аминокислоты (триптофан, тирозин и др.) или соли (кальциевые, магниевые).

На конце фагового отростка имеется особый фермент типа лизоцима. После адсорбции фага под влиянием этого фермента происходит растворение стенки микробной клетки и содержимое головки фага - нуклеиновая кислота - перекачивается в микробную клетку. Этим завершается второй этап процесса размножения фага.

Остальные структуры фаговой частицы - оболочка головки, отросток и его субструктуры - внутрь инфицированной фагом клетки не попадают. Их роль заключается в обеспечении сохранности фаговой частицы, находящейся вне клетки, и содействии проникновению фаговой нуклеиновой кислоты в клетку при инфекции.

Рис.10. Мелкие (едва видимые) негативные колонии актинофага. Увел. 6 : 10.

У нитевидных фагов, в отличие от других видов фагов, внутрь клетки проникает весь белок или его часть. После проникновения нуклеиновой кислоты фага в клетку начинается сложный процесс внутриклеточного размножения фага. Под влиянием нуклеиновой кислоты фага резко изменяется весь обмен микробной клетки. Основные процессы, протекающие в инфицированной клетке, направлены на образование новых фаговых частиц. Вначале формируются отдельно головки и отростки, которые затем объединяются в зрелые фаговые частицы. К этому времени внутри клетки образуется особый литический фермент, который вызывает лизис клетки изнутри. Клетка распадается, и новые зрелые частицы фага выходят наружу

Рис. 11 Мелкие негативные колонии актинофага Увел. 8 : 9.

Количество новых фаговых частиц, образуемых одной клеткой при фаговой инфекции, называют выходом фага или его урожайностью. Выход фага зависит от свойств данного фага и не зависит от клетки-хозяина и ее размеров. Одни фаги отличаются очень низким выходом (5-50 частиц на клетку), у других выход значительно выше (от 1000 до 2500). Особенно высоким выходом отличаются мелкие РНК-овые фаги (свыше 20 000 частиц на клетку). Если большое количество бактериальных клеток смешать с небольшим количеством фаговых частиц, то процесс размножения фагов проходит несколько циклов. Вначале инфицируется часть клеток. Первое потомство фага инфицирует оставшиеся клетки - происходит второй цикл, за ним может следовать третий и т. д., пока не будут лизированы все чувствительные к данному фагу клетки. Среди фагов встречаются такие, размножение которых возможно лишь при наличии в среде определенных кофакторов. Одни из этих веществ, как уже указывалось, необходимы для адсорбции фага; другие - для внутриклеточного размножения фага.

Рис.12. Негативные колонии бактериофага средней величины. Увел. 1:1.

Большинство фагов вызывают при размножении лизис клетки и ее гибель. Лишь в последнее время было установлено, что при инфицировании клетки нитевидными фагами возможно размножение их без гибели клетки.

Если произвести рассев по поверхности агаризованной питательной среды в чашках Петри смеси фага и чувствительных к нему микробов и чашки выдержать в термостате, то происходит лизис клеток в результате размножения фага. Если взять большое количество частиц фага, то лизируется большая часть или весь выросший газон культуры. Если количество фаговых частиц таково, что они распределяются только на отдельных участках газона, лизируя в этих местах культуру, то возникает колония фага.

Эти колонии фага получили название бляшек, стерильных пятен. Правильнее их называть негативными колониями. Каждая негативная колония состоит из десятков и сотен миллионов фаговых частиц. Размер негативных колоний и их форма зависят в первую очередь от свойств фага, а также от состава среды и культуры микробов. У одних фагов негативные колонии очень мелкие и еле видимы невооруженным глазом, другие достигают 10 мм в диаметре и более. Колонии бывают светлые и четкие, когда лизировалась вся культура, или мутноватые, когда лизировались не все клетки. Вокруг негативных колоний некоторых фагов могут возникнуть различной формы и величины ореолы. На рисунках 10-14 показаны негативные колонии разных фагов.

Морфология негативных колоний служит одним из признаков, которым пользуются при дифференциации фагов.

В настоящее время найдены, фаги, лизирующие клетки микроорганизмов, принадлежащих ко всем систематическим группам, как патогенных для человека, животных и растений, так и сапрофитных (непатогенных).

До недавнего времени не было ясно, существуют ли фаги против плесневых грибов и дрожжей. В последние годы найдены фаги, активные против грибов родов пенициллов, аспергиллов и других, а также против некоторых дрожжей. Интересно отметить, что вирус удалось выявить и у тех видов пенициллов, которые применяются в промышленности для получения пенициллина. Не выявлены вирусы, активные против простейших животных, а также истинных спирохет.

Рис.13. Крупные негативные колонии актинофага. Увел. 1:1.

В природных условиях фаги встречаются в тех местах, где есть чувствительные к ним бактерии. Чем богаче тот или иной субстрат (почва, вода, выделения человека и животных и т. д.) микроорганизмами, тем в большем количестве в нем встречаются соответствующие фаги. Так, фаги, лизирующие клетки всех видов почвенных микроорганизмов, находятся в почвах. Особенно богаты фагами черноземы и почвы, в которые вносились органические удобрения. Фаги, активные против разных видов кишечной, дизентерийной, тифозной и паратифозной палочек, часто встречаются в содержимом кишечника человека и животных, сточных водах и загрязненных водоемах. Фаги фитопатогенных микроорганизмов успешнее всего выделяются из остатков растений, пораженных этими микробами.

Рис.14. Негативные колонии актинофага, окруженные ореолом угнетенного роста тест-культуры. Увел. 10 : 8.

Фаги молочнокислых стрептококков в большом количестве встречаются в молочных продуктах.

Итак, те субстраты, на которых развиваются определенные формы микроорганизмов, также благоприятны для существования соответствующих фагов.

Проблема бактериофагии на пищевых производствах

Широкому распространению фагов молочнокислых бактерий способствует то, что они являются лизогенными, т. е. содержат внутри клеток фаги. В результате этого в молоке сразу же после доения уже есть фаги. Молоко, поступающее на молочные заводы, часто содержит фаги в значительном количестве (1 млн. и более частиц в 1 мл молока). Следует отметить, что все фаги, даже активные против патогенных микробов, совершенно безвредны для людей и животных.

Современное производство сыра основано на применении пастеризованного молока. Однако пастеризация не убивает всех имеющихся в молоке фагов. Охлажденное после пастеризации молоко разливают в специальные ванны, в которые вносится закваска, состоящая из чистых культур молочнокислых стрептококков. Стрептококки вызывают сквашивание молока. Получаемый сгусток молока подвергается дальнейшей переработке. Работники сыродельных заводов давно обратили внимание на то, что в ряде случаев активность молочнокислых микробов закваски резко снижается, что приводит к плохому сбраживанию молока. Это явление может быть вызвано разными причинами. Но чаще всего оно вызывается фагами, которые лизируют полностью или частично культуры заквасок. В результате этого процесс молочнокислого брожения полностью останавливается или интенсивность его резко снижается.

На сыродельных заводах, как правило, применяют закваски, состоящие не из одной культуры, а из смеси различных культур молочнокислых стрептококков. При применении смешанной закваски под влиянием фага лизируется одна или две культуры, другие же продолжают процесс молочнокислого брожения.

Явление бактериофагии фактически превратилось в самостоятельную область биологии со своими специфическими разделами.

Бактериофаги применяют в качестве индикаторов загрязнения воды патогенными энтеровирусами. Бактериофаги по своим биологическим свойствам стоят к энтеровирусам ближе, чем бактерии группы кишечных палочек или другие санитарно-показательные микроорганизмы.

Список использованных источников

Сыроделие: технологические, биологические и физико-химические аспекты. Под редакцией С.А. Гудкова. - М.: ДеЛи, 2003. - 800 с

Методы выделения, изучения и культивирования микроорганизмов: Учебник для вузов. Т. И. Громовых, КрасГУ, 2006. - 159 с

Читайте также:

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.