|
Бластомикоз (англ. —Blastomicosis,NorthAmericanBlastomicosis; североамериканский бластомикоз, болезнь Джилькрайста — Стокса) — хронический висцеральный микоз, характеризующийся пиогранулематозными поражениями в различных тканях.
Историческая справка, распространение, степень опасности и ущерб. В 1894 г. Джилькрайст описал своеобразное поражение кожи у человека. В срезах из пораженных тканей автор обнаружил круглые и овальные микроорганизмы с двухконтурной оболочкой. Джилькрайст назвал это заболевание протозойным дерматитом и экспериментально воспроизвел его у собаки материалом, взятым с пораженной кожи больного человека. В 1896 г. Джилькрайст и Стоке наблюдали у человека после ранения аналогичный случай. Авторы впервые выделили чистую культуру возбудителя и воспроизвели бластомикоз у морской свинки, лошади, собаки и овцы. Гриб получил название Blastomyces dermatitidis. Бластоми-
490коз собак первым описал Мейер в 1912 г. Энзоотический бластомикоз встречается в США, Канаде и Англии. Болезнь была зарегистрирована также в Центральной Америке и в Африке. В РФ бластомикоз не зарегистрирован.
Возбудитель болезни. Возбудитель болезни — диморфный грибBlasto-mysesdermatitidis. При культивировании при температуре 37 °С развивается дрожжевая форма гриба в виде круглых колоний сметанообразной консистенции, не врастающих в питательную среду. Стареющие колонии становятся исчерченными и морщинистыми, восковидной консистенции. При микроскопировании наблюдают круглые почкующиеся клетки диаметром 5. 7 мкм. Встречаются также удлиненные почкующиеся клетки.
При температуре 25. 30 "С вырастают мицелиальные формы гриба. Колонии круглые гладкие, покрывающиеся сначала белым, потом желтым, а позднее желто-бурым пушком с короткими выростами (коремии), придающими культуре шиповатый вид. При микроскопировании в поле зрения обычно видны круглые почкующиеся клетки с обильными септи-рованными нитями мицелия и многочисленными круглыми или грушевидными конидиями диаметром 3. 5 мкм, располагающимися по бокам нитей. В старых культурах встречаются хламидоспоры размером 1. 18 мкм. На жидких средах культивируется в основном мицелиальная форма.
Возбудитель может находиться в почве как экзогенный агент.
Эпизоотология. В естественных условиях заболевают собаки. Болезнь распространена в США, Канаде, Центральной Америке и очень редко в других странах. В нашей стране бластомикоз собак не зарегистрирован, но отмечено несколько случаев заболевания бластомикозом человека. Считают, что больное животное является источником возбудителя, который передается прямым и косвенным путем, проникая в организм через поврежденную кожу и слизистую оболочку дыхательных путей.
Патогенез. Возбудитель проникает из почвы в организм человека и животных через поврежденную кожу, слизистые оболочки дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта.
При кожной форме болезни вначале появляются отдельные папулы, узелки и пустулы, которые по мере развития инфекционного и патологического процессов вскрываются с образованием язв. В некоторых случаях в результате их увеличения и слияния в различных участках кожного покрова образуются крупные изъязвления — очаги с бородавчатыми разрастаниями по периферии.
Висцеральная форма начинается обычно с заболевания легких. При диссеминации процесса поражаются ЦНС, кожа, слизистые оболочки, кости, суставы, глаза, предстательная железа, почки, другие органы и ткани. Болезнь сопровождается повышением температуры, бронхитом, угнетенным состоянием, снижением аппетита, одышкой.
Течение и клиническое проявление. Бластомикоз собак протекает с поражением кожи и внутренних органов. При кожной форме появляются отдельные папулы и узелки, которые вскрываются по мере развития процесса. Поражаются различные участки кожного покрова.
Висцеральная форма начинается обычно с заболевания легких, сопровождающегося повышением температуры тела, бронхитом, кашлем, угнетением, ухудшением аппетита, одышкой. При диссеминации процесса поражаются суставы, глаза. У заболевших собак наблюдают конъюнктивиты, иногда животные слепнут.
Патологоанатомические признаки. При вскрытии находят глубокие абс-цедирующие узлы в легких. В печени, селезенке, почках и лимфатических узлах встречаются участки некроза.
Диагностика и дифференциальная диагностика. Предварительный диагноз на бластомикоз подтверждается лабораторными исследованиями. При
491микроскопии исследуют гной, соскобы с кожных поражений, кровь, кусочки пораженных органов, спинномозговую жидкость. Окрашенные по Граму клетки просматриваются лучше. Для получения чистой культуры возбудителя патологический материал высевают на сусло-агар, кровяной агар, среду Сабуро и др.
Для экспериментального заражения патологическим материалом подопытных животных используют мышей, морских свинок, хомяков. При гистологическом исследовании органов павших животных наблюдают множественные абсцессы, состоящие из полиморфно-ядерных лейкоцитов, среди которых обнаруживают почкующийся гриб.
Из серологических методов исследования применяются РСК и РИД. В ветеринарной и медицинской практике широко применяется метод аллергической пробы с аллергеном — бластомицином.
При дифференциальной диагностике следует исключить туберкулез и другие глубокие микозы: кандидамикоз, кокцидиоидо-микоз, криптококкоз.
Специфическая профилактика. Не разработана.
Лечение. Не разработано.
Профилактика и меры борьбы. Больных собак целесообразно убивать, чтобы предотвратить дальнейшее заражение. Особое внимание следует обратить на тщательную и неоднократную дезинфекцию помещений, в которых находились пораженные животные.
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
03.02.97г. № 13-3-2/845
УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный
ветеринарный инспектор
В.М.Авилов
ИНСТРУКЦИЯ
по предупреждению и ликвидации сапа
1. Общие положения
1.1. Сап - инфекционная болезнь лошадей, ослов, мулов и других
непарнокопытных семейства лошадиных, вызываемая микробом, относящимсяк роду Рseudomonas, виду Р.mallei , и протекающая в основном хрони-
чески. В естественных условиях могут болеть также хищники семейства
кошачьих (при поедании мяса больных сапом животных), верблюды и че-
ловек.
1.2. Мероприятия против сапа заключаются в предупреждении заноса
возбудителя в страну, в систематическом контроле за благополучи-
ем поголовья лошадей (ослов, мулов), недопущении распространения бо-
лезни и ликвидации ее в случае появления.
2. Диагностика сапа
2.1. Диагноз на сап устанавливают на основании результатов клинического осмотра, серологических, аллергических, патологоанатомических, а также бактериологических и гистологических исследований с учетом эпизоотологических данных. Исследования проводят в соответствии с
Наставлением по диагностике сапа, утвержденным Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России, и в порядке, предусмотренном пунктом
3.9. настоящей инструкции.
2.2. Диагноз на сап считают установленным в следующих случаях:
- обнаружение характерных для сапа изменений во внутренних органах и тканях;
- выделение культуры из патологического материала со свойствами,
характерными для возбудителя сапа;
- получение положительных результатов биологического исследования, даже если культуры возбудителя из исходного материала не выделены;
2.3. Сап необходимо дифференцировать от эпизоотического лимфангита (африканского сала, бластомикоза), язвенного лимфангита и мыта.
Дифференцирующими признаками при возникновении этих болезней счи-
тают отрицательные результаты маллеинизации животных и серологических
исследований на сап, а также обнаружение криптококков (Сгурtococcus
farciminosus) в содержимом абсцессов при эпизоотическом лимфангите,
наличие стрептококков (streptococcus equi) в гное при мыте и Соryne-
Ьасtегium рseudotuberculesis при язвенном лимфангите.
3. Мероприятия по предупреждению заноса и распространения
сапа в Российской Федерации.
3.1. В целях предотвращения заноса на территорию страны сала допускается ввоз только здоровых лошадей (ослов, мулов) из хозяйств
( с территорий ), благополучных по этой болезни, с соблюдением ветеринарно-санитарных правил, устанавливаемых Департаментом ветеринарии
Минсельхозпрода России.
3.2. Импортируемые лошади (ослы, мулы) подлежат карантинированию и
обследованию на сап в стране поставщика в порядке и методами, предусмотренными Ветеринарными требованиями при импорте лошадей в Российскую Федерацию, что должно быть указано в ветеринарном сертификате
ввозимых животных.
3.3. Импортированных животных помещают в карантин на ЗО суток и
обследуют в начале и в конце срока карантинирования путем клинического осмотра, глазной маллеиновой пробой, исследованием сыворотки крови
в РА.
3.4. Экспортируемых животных обследуют в соответствии с требованиями страны-импортера. Животных, при обследовании которых подучен
положительный результат в РСК при отрицательных результатах других
исследований на сап, допускается использовать без ограничений внутри
страны, вывод их за пределы страны запрещен.
3.5. Всех взрослых лошадей (ослов, мулов) находящихся в собственности организаций (любой организационно-правовой формы), индивидуальных предпринимателей, в том числе глав крестьянского (фермерского) хозяйства и граждан субъектов Российской Федерации, расположенных
вдоль юго-восточной и южной границ страны, обследуют на сап не менее
двух раз в год - весной и осенью путем клинического осмотра и
исследования сыворотки крови в РА.
Плановые обследования на сап животных в других субъектах Российской Федерации проводят один раз в год.
3.6.На всей территории страны лошади (ослы, мулы) не ранее чем за
30 сут. до продажи (перевода) в другие хозяйства (организации)
должны подвергаться клиническому осмотру, и исследованию сыворотки
крови в РА.
3.7. Всех лошадей (ослов, мулов), поступающих в хозяйство, помещают в карантин на 30 сут. Животных подвергают клиническому осмотру и
исследуют сыворотку крови в РА в начале и в конце срока карантинирования.
3.8.При отрицательных результатах этих исследований животных используют без ограничений.
3.9. При положительном результате какого-либо исследования таких
животных считают подозреваемыми в заболевании сапом. В этом случае
всех лошадей (ослов, мулов) обследуемой группы изолируют в помещении,
в котором они содержались, или в специально выделенной конюшне. Животных, подозреваемых в заболевании, обследуют с применением подкожной маллеиновой пробы.
3.9.1.При отрицательном результате подкожной маллеиновой пробы
животных считают благополучными по сапу.
3.9.2. При положительном результате подкожной маллеиновой пробы с
целью уточнения диагноза реагирующих животных убивают и подвергают
патологоанатомическому исследованию на сап без снятия шкуры и с соблюдением условий, предотвращающих распространение возбудителя болезни.
3.9.2.1. В случае обнаружения характерных для сапа изменений во
внутренних органах и тканях убитых животных диагноз на сап считают
установленным, туши животных уничтожают сжиганием на месте убоя
(вскрытия). В хозяйстве проводят мероприятия в соответствии с разделом 4 настоящей инструкции.
3.9.2.2. При отсутствии на вскрытии характерных для сапа изменений для проведения бактериологического исследования отбирают от убитых животных пробы материала: подчелюстные, заглоточные, бронхиальные, средостенные лимфатические узлы, носовую перегородку, гортань,
глотку, трахею, а также измененные участки легкого, печени, селезенки, кожи с подкожной клетчаткой и укладывают их в водонепроницаемую
емкость с плотно закрывающейся крышкой.
Одновременно из этого материала вырезают кусочки размером 2 куб.см
для гистологического исследования, укладывают в банку и заливают
10%-ным раствором формалина в соотношении 1:5. Емкости плотно закрывают и опечатывают печатью главного ветеринарного врача района.
Материал срочно направляют с нарочным в ветеринарную лабораторию
для исследования на сап.
Помещения, окружающую территорию, оборудование, телеги, сани, упряжь, предметы ухода за животными, одежду и обувь обслуживающего
персонала дезинфицируют по п. 4.7. Туши сжигают.
Остальных животных обследуемой группы (табуна) содержат изолированно до получения результатов лабораторного исследования.
3.9.2.3. При отрицательных результатах лабораторных исследований
изоляцию животных прекращают.
3.9.3. В случае подтверждения диагноза на сап в очаге болезни
проводят мероприятия в соответствии с разделом 4 настоящей инструкции.
4 . Мероприятия по ликвидации сапа
4.1. При выявлении животных, больных сапом, немедленно сообщают
об этом ветеринарному управлению (Отделу, объединению) области, края,
республики и принимают меры к обнаружению источника возбудителя инфекции. В порядке, предусмотренном Законом Российской Федерации "О
ветеринарии", решением органов местного самоуправления районов и го-
родов по представлению соответствующих органов управления Государственной ветеринарной службы Российской Федерации населенный пункт
(при табунном содержании - табун) объявляют неблагополучным по сапу и
устанавливают карантин.
Ветеринарный специалист, обслуживающий населенный пункт, составляет план мероприятий по ликвидации сапа, согласовывает его с главным
ветеринарным врачом района и центром санэпиднадэора.
4.2. Всех лошадей, ослов, мулов и верблюдов неблагополучного по сапу пункта каждые 7-8 сут. подвергают клиническому осмотру и исследуют
сыворотку крови в РА.
4.3. В неблагополучном пункте всех животных с положительным результатом какого-либо исследования считают больными сапом и убивают,
туши сжигают на месте убоя без снятия шкуры и вскрытия.
Остальных лошадей (ослов, мулов) бывших в контакте с больными животными, отправляют автотранспортом с водонепроницаемым кузовом на
санитарную бойню мясокомбината. Продукты убоя используют в соответствии с действующими Правилами ветеринарного осмотра убойных животных
и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов.
4.4. Помещения, где содержались лошади (ослы, мулы), оборудование, автотранспорт после перевозки животных, окружающую помещения
территорию, телеги, сани, металлические предметы ухода за животными,
одежду и обувь обслуживающего персонала дезинфицируют по п.4.7., неметаллические предметы ухода, упряжь сжигают.
Грубые корма могут быть использованы для скармливания только невосприимчивым к сапу животным неблагополучного пункта.
4.5. В неблагополучном пункте запрещается:
-въезд на лошадях (ослах, мулах) и выезд за пределы населенного
пункта;
- пастьба, перегруппировка, ввод и вывод лошадей (ослов, мулов);
- вывоз за пределы пункта и откармливание лошадям (ослам, мулам)
грубых кормов, при заготовке и перевозке которых использовались больные сапом и бывшие с ними в контакте животные.
4.6. На дорогах, ведущих в неблагополучный населенный пункт, выставляют знаки, оповещающие о карантине, и устанавливают круглосуточные посты.
4.7. Дезинфекция.
4.7.1. Для дезинфекции помещений, оборудования, телег, саней, асфальтовых, бетонных и земляных покрытий, навоза, остатков корма, металлических предметов ухода за животными применяют раствор хлорной
извести, содержащей не менее 3% активного хлора, 20%-ную взвесь
свежегашеной извести, 4%-ный горячий раствор едкого натра, из расчета О,5 куб.дм на 1 кв.м. Экспозиция 2 ч. Жидкие сточные воды засыпают хлорной известью из расчета 200 г/куб.дм и перемешивают.
Помещения предварительно орошают дезраствором, затем их подвергают механической очистке и дезинфекции. Навоз, остатки корма после дезинфекции вывозят и сжигают. Помещения после дезинфекции подвергают
побелке 20%-ным раствором свежегашеной извести.
Почву обеззараживают 10%-ным горячим раствором едкого натра, 4%-ным
раствором формалина из расчета 5 куб.дм/кв.м или 5 %-ным осветленным
раствором хлорной извести из расчета 10 куб.дм/кв.м.
4.7.2.Защитную одежду, полотенца кипятят в течение 15 мин в
2%-ном растворе соды. Резиновые перчатки, фартуки погружают на 1 ч в
1-3%-ный раствор хлорамина.
Сапоги, галоши, упряжь протирают дважды с интервалом в 15 мин.
салфеткой, смоченной 1-3 %-ным раствором хлорамина.
Личную одежду обслуживающего персонала дезинфицируют в пароформалиновой камере.
4.7.3. Открытые части тела дезинфицируют 0,5-1 %-ным раствором
хлорамина, 80°-ным спиртом.
4.7.4.Транспорт дезинфицируют 1-3 %-ным раствором хлорамина из
расчета 300 куб.см/кв.м.
5. Меры личной профилактики.
5.1. Персонал, обслуживающий изолированных животных, должен быть
проинструктирован главным ветеринарным врачом района о технике безопасности при сапе и обеспечен защитной одеждой - комбинезонами, халатами, шапочками или косынками, рукавицами, резиновыми сапогами, а
также полотенцами.
Лиц, имеющих поражения к ссадины на открытых частях тела, к работе в изоляторе не допускают.
5.2. В помещении должны быть установлены умывальник, емкости с
дезраствором и пароформалиновая камера.
5.3. Вскрытие животных следует проводить обязательно в защитных
очках, ватно-марлевой маске, клеенчатом фартуке и резиновых перчатках.
5.4. В помещении запрещается принимать пищу, пить и курить. Каждый раз после выполнения той или иной работы в изоляторе подвергают
дезинфекции руки и другие открытые участки тела, спецодежду и спецобувь.
6. Населенный пункт объявляют благополучным по сапу в установленном порядке через 2 мес. после последнего случая выявления и убоя
больных и бывших с ними в контакте восприимчивых к сапу животных при
получении за этот период отрицательных результатов клинического осмотра и исследования сыворотки крови в РА, проводимых в соответствий
с п. 4.6, и выполнении комплекса заключительных мероприятий по уничтожению возбудителя болезни во внешней среде.
7. Должностные лица и граждане, несут персональную ответственность за правильность организации и проведения мероприятий по предупреждению и ликвидации сапа, предусмотренных настоящей Инструкцией, в
соответствии с Законом "О ветеринарии" и другими актами законодательства Российской Федерации.
С изданием настоящей инструкции на территории Российской Федерации не действует "Инструкция о мероприятиях против сапа", утвержденная Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства
СССР 24мая 1985года.
Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum в пробах как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований.
Гистоплазмоз - инфекционное заболевание, вызываемое диморфными грибами, относящимися к роду Н. capsulatum. В эндемичных областях условия окружающей среды представлены умеренным климатом с постоянной влажностью. Ареалами существования Н. capsulatum в естественных условиях служат многие азиатские страны, такие как Индонезия, Тайланд, Индия. Высокоэндемичные очаги Histoplasma capsulatum var. capsulatum - возбудителя классического (американского) гистоплазмоза, расположены вдоль реки Миссисипи (США), в Латинской Америке (Венесуэла, Эквадор, Бразилия, Парагвай, Уругвай, Аргентина). Histoplasma capsulatum var. duboisii - вариант африканского гистоплазмоза, эндемичен для тропических районов Африки. Еще один представитель рода Histoplasma, Histoplasma capsulatum var. farciminosum, вызывает эпизоотический лимфангоит у лошадей, ослов, мулов и в патологии людей какого-либо существенного значения не имеет. Ареал распространения включает средиземноморские страны, Северную Африку и государства Азии (Индия, Пакистан, Япония).
Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления ДНК данных микромицетов и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.
Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретных микроорганизмов, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителя гистоплазмоза.
Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для каждого типа возбудителей. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемых микромицетов.
Наиболее близким аналогом являются олигонуклеотидные зонды, разработанные для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени J. Martagon-Villamil с соавторами в 2003 году. Авторы используют 2 зонда с резонансным переносом энергии (LightCycler assay). Принцип метода основан на переносе энергии с одного флуорофора, находящегося на 3′-конце первого зонда, ко второму флуорофору, находящемуся на 5′- конце второго зонда. Излучение детектируется при одновременном связывании обоих зондов с ДНК-матрицей. В качестве ДНК-мишеней для выявления возбудителя гистоплазмоза были выбраны спейсерные области рибосомальных генов [Identification of Histoplasma capsulatum from culture extracts by real-time PCR / Martagon-Villamil J., Shrestha N., Sholtis M., et al. // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol.41, №3, - p.1295-1298].
S.J. Buitrago с соавторами в 2009 году предложили использование двух гибридизационных зондов для одновременного обнаружения ДНК Н. capsulatum и Paracoccidioides brasiïiensis методом ПЦР в режиме реального времени (патент №ЕР 2339026). В качестве ДНК-мишеней авторы выбрали спейсерные области рибосомальных генов. Однако, данные фрагменты генома, как правило, являются высококонсервативными у близкородственных микромицетов, что может приводить к ложноположительным результатам при проведении анализа.
Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидного зонда для флуоресцентной детекции результатов анализа методом полимеразной цепной реакции при идентификации H. capsulatum в режиме реального времени.
MS8 Flip-R5 / (ROX)-GGCCTGACCAGTATAACCAAGGCC-(BHQ2)3 /
Где ROX - карбокси-Х-родамин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого сотавляет 580 нм, а длина волны флуоресценции - 605 нм. BHQ2 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 550-650 нм.
Характеристика олигонуклеотидного зонда и ДНК-мишени для его гибридизации.
В качестве положительного контроля эксперименты проводили на штаммах H.capsulatum var. capsulatum 6650, 6651, 6652, H. capsulatum var. duboisii 630, 638, H. capsulatum var. farciminosum 12-89, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микромицета в концентрациях от 1×10 6 клеток/мл до 1×10 1 клеток/мл. Подсчет клеток дрожжевой фазы проводили в камере Горяева. Апробация флуоресцентного зонда была осуществлена на наборе штаммов возбудителя гистоплазмоза коллекционного центра МЖК ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.
Чувствительность реакции амплификации с флуоресцентно-меченым зондом MS8 Flip-R оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений чистых культур возбудителя гистоплазмоза, и составила- 1×10 2 -1×10 4 клеток/мл.
Для обнаружения возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР в режиме реального времени оценена возможность использования сконструированного олигонуклеотидного зонда для анализа биологического материала (кровь, суспензия органов, искусственно контаминированные клетками Н. capsulation). Показано, что использование разработанного зонда при постановке реакции амплификации позволяет выявлять ДНК возбудителей гистоплазмоза с чувствительностью 1×10 4 кл/мл.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Методика конструирования флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда MS8 Flip-R для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР с флуоресцентной детекцией.
На основе анализа in silico нуклеотидной последовательности фрагмента гена MS8 возбудителя гистоплазмоза, фланкированной праймерами HcMs8s/HcMs8as3 и имеющей длину 361 п.н., сконструирован гибридизационный зонд размером 24 п.н. (таблица 1).
Полученный олигонуклеотид был проанализирован с помощью компьютерной программы Vector NTI Express v.1.1.2 (Life Technologies, США) на предмет образования вторичных структур с праймерами HcMs8s/HcMs8as3, а также с использованием ресурса BLAST на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) для установления гомологии между ним и нуклеотидными последовательностями близкородственных возбудителей особо опасных микозов и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа, гомологии выявлено не было.
Пример 2. Детекция специфических фрагментов ДНК с помощью разработанного зонда MS8 Flip-R для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза методом ПЦР в режиме реального времени.
В состав реакционных смесей, помимо анализируемой ДНК, входили комплементарные специфическому фрагменту ДНК Н. capsulatum олигонуклеотидные зонды, меченые флуорофором ROX и гасителем флуоресценции (BHQ2), а также праймеры HcMs8s/HcMs8as3, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буферный раствор и фермент Taq-F-ДНК-полимераза. Праймеры и зонд для внутреннего контроля использовали при проверке тест-систем на специфичность и при анализе способов выделения ДНК. В качестве отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды.
Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации в режиме реального времени с помощью разработанного флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда для идентификации ДНК возбудителя гистоплазмоза.
Чувствительность реакции амплификации с разработанным гибридизационным зондом MS8 Flip-R оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений клеток чистых культур возбудителя гистоплазмоза.
Обеззараживание исследуемых проб производили добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1%, прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С и инкубированием при комнатной температуре 24 ч. Выделение ДНК из чистых культур микромицетов осуществляли с помощью метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом (Sandhu G.S. et al., 1995). Постановку реакции ПЦР осуществляли как описано в примере 2. При тестировании коллекции грибных культур Н. capsulatum ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора с использованием разработанного флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда MS8 Flip-R продукт амплификации детектировался с ДНК всех штаммов возбудителя гистоплазмоза с чувствительностью 1×10 2 -1×10 4 клеток/мл (рис.1). С другими видами близкородственных грибов и гетерологичных микроорганизмов в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат.
Таким образом, разработанный гибридизационный зонд может быть использован для идентификации возбудителя гистоплазмоза и позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать ДНК возбудителя гистоплазмоза в чистой культуре и биологическом материале.
| Таблица 1 | | Характеристика сконструированного флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда для идентификации возбудителя гистоплазмоза H. capsulatum | | Наименование зонда | Последовательность праймеров | Локализация | флуоресцентный краситель/гаситель флуоресценции | | MS8 Flip-R | GGCCTGACCAGTATAACCAAGGCC | ген MS8 (mold-specific MS8 protein) | ROX/BHQ2 | |
Олигонуклеотидный зонд MS8 Flip-R для флуоресцентной детекции возбудителя гистоплазмоза Histoplasma capsulatum методом полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными праймерами HcMs8s, HcMs8as3, имеющий следующую структуру: MS8 Flip-R 5'(ROX)-GGCCTGACCAGTATAACCAAGGCC-(BHQ2) 3',где ROX - флуоресцентный краситель карбокси-Х-родамин, BHQ2 - гаситель флуоресценции "Black Hole 2".
![]()
Читайте также:
 Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.
Copyright © Иммунитет и инфекции
|
