Возбудитель холеры относится к группе тест

1. Укажите неправильное утверждение в отношении холеры:

а) холера склонна к эпидемическому распространению

б) восприимчивость к холере высокая

в) известно много сероваров холерных вибрионов

г) относится к конвенционным болезням

д) в РФ имеют место только завозные случаи

2. Укажите неправильное утверждение относительно возбудителя холеры:

а) относится к классу бактерий

б) Эль-Тор и 0139 устойчивы во внешней среде

в) образует экзотоксин

г) локализуется у больных в крови

д) хорошо сохраняется в воде водоемов

3. Источником возбудителя холеры не могут быть:

а) больные тяжелой формой холеры

б) больные легкой формой холеры

в) больные стертой формой холеры

д) дикие перелетные птицы

4. Укажите неправильное утверждение в отношении холеры:

а) перенесенное заболевание оставляет пожизненный иммунитет

б) механизм передачи холерного вибриона фекалыю-оральный

в) пути его реализации - водный, пищевой, контактно-бытовой

г) главный путь передачи - водный

д) холерный вибрион выделяется во внешнюю среду с испражнениями

5. Укажите неправильное утверждение. Основными звеньями патогенеза холеры являются:

а) адгезия холерных вибрионов на энтероцитах

б) взаимодействие экзотоксина с энтероцитом

в) гиперсекреторные процессы

г) десквамация эпителия ворсинок тонкой кишки

д) активизация ферментных систем энтероцита

6. Укажите правильное утверждение. При холере имеет место:

а) серозный энтерит

б) язвенно-геморрагический колит

в) геморрагический энтерит

г) эрозивный гастрит

7. Укажите неправильное утверждение в отношении холеры:

а) тяжесть заболевания определяется степенью обезвоживания

б) различают 4 степени обезвоживания у взрослых

в) дегидратация I степени встречается наиболее часто

г) при дегидратации III степени отмечается состояние устойчивой компенсации

д) дегидратацию IV степени называют алгидной

8. Укажите правильное утверждение. В основе классификации степеней обезвоживания лежит:

а) частота стула и рвоты

б) степень нарушения гемодинамики

в) выраженность нарушения функции почек

г) величина потери жидкости относительно массы тела

д) степень нарушения электролитного баланса

9. Укажите правильное утверждение. При обезвоживании III степени про­ цент потери массы тела составляет:

10. Свидетельство против диагноза холеры:

а) внезапное начало в ночные или утренние часы с появления жидкого стула

б) рвота появляется вслед за поносом, без предшествующей тошноты

в) отсутствие симптомов интоксикации

г) обезвоживание развивается на 2-3 сутки

д) испражнения и рвотные массы водянистые, без запаха, типа рисового отвара

11. Укажите неправильное утверждение. Тяжелому течению холеры свойственны:

б) потеря сознания

в) артериальная гипотензия

12. Укажите неправильное утверждение. При обезвоживании III—IV степени наиболее типичны следующие признаки:

а) выраженная гемоконцентрация

б) метаболический алкалоз

в) декомпенсированный метаболический ацидоз

г) сгущение крови, проявляющееся эритроцитозом и лейкоцитозом

д) электролитные нарушения в виде гипокалиемии

13. Укажите неправильное утверждение. При подозрении на холеру дифференциальную диагностику необходимо проводить со следующими заболеваниями:

б) пищевые токсикоинфекции

в) ротавирусыый гастроэнтерит

г) отравление солями тяжелых металлов

д) отравление бледной поганкой или условно съедобными грибами

14. С целью ранней диагностики холеры следует использовать:

а) посев крови на желчный бульон

г) посев рвотных масс

д) серологические исследования крови

15. Укажите правильное утверждение. С целью регидратации при холере могут применяться:

а) 5% раствор глюкозы

д) изотонический раствор натрия хлорида

16. Укажите неправильное утверждение в отношении принципов лечения холеры:

а) этиотропная терапия не играет определяющей роли

б) основу лечения составляет восстановление и поддержание водно-электро­литного равновесия в организме

в) объем вводимой жидкости зависит от степени обезвоживания и массы те ла больного

г) регидратация осуществляется любыми растворами для внутривенного введения

д) при обезвоживании III—IV степени регидратация проводится только струйно в крупные венозные сосуды

17. Укажите правильное утверждение. В рамках этиотропной терапии холеры применяют:

д) дыхательные аналептики

18. Укажите правильное утверждение. При проведении патогенетической терапии холеры используют:

б) сердечные гликозиды

в) полиионные солевые растворы

19. Укажите неправильное утверждение в отношении лиц, перенесших холеру:

а) больных сразу же выписывают на работу

б) выписка осуществляется после трехкратного отрицательного результата посева испражнений

в) обязательно последующее диспансерное наблюдение в кабинете инфекционных заболеваний поликлиники и бактериологический контроль

г) у лиц из декретированной категории дополнительно проводится бактериологическое исследование дуоденального содержимого

д) выписка больных декретированных групп осуществляется после четырех кратного отрицательного результата посева кала

Основные факты

• Холера представляет собой острое диарейное заболевание, которое при отсутствии лечения может через несколько часов закончиться смертельным исходом.
• По оценкам исследователей, во всем мире ежегодно происходит от 1,3 до 4,0 миллионов случаев заболевания холерой и 21 000–143 000 случаев смерти от холеры (1).
• У большинства инфицированных симптомы либо отсутствуют, либо проявляются в мягкой форме, и болезнь успешно лечится с помощью оральных регидратационных растворов.
• Тяжелые случаи требуют быстрого лечения с использованием внутривенных вливаний и антибиотиков.
• Обеспечение безопасной воды и средств санитарии имеет решающее значение для борьбы с распространением холеры и других болезней, передающихся через воду.
• Безопасные оральные вакцины против холеры должны использоваться в сочетании с мерами по улучшению водоснабжения и санитарии в целях борьбы со вспышками холеры и для профилактики в районах, подверженных высокому риску распространения холеры.
• В 2017 г. была принята глобальная стратегия по борьбе с холерой, призванная сократить смертность от холеры на 90%.

Холера

Симптомы

Холера — чрезвычайно опасная болезнь, которая может вызывать тяжелую острую водянистую диарею. Между попаданием в организм зараженных пищевых продуктов или воды и появлением симптомов у заболевшего проходит от 12 часов до 5 дней 2 . Холера поражает как детей, так и взрослых и при отсутствии лечения может за несколько часов приводить к смерти.

У большинства людей, инфицированных бактерией V. cholerae, не развивается никаких симптомов, хотя в течение 1–10 дней после инфицирования в их фекалиях присутствуют бактерии, которые, поступая обратно в окружающую среду, потенциально могут инфицировать других людей.

Среди людей, у которых развиваются симптомы, в большинстве случаев болезнь протекает с легкими и умеренными симптомами, в то время как у меньшинства заболевших развивается острая водянистая диарея с тяжелой степенью обезвоживания. При отсутствии лечения это может приводить к смерти.

История

В XIX веке холера распространилась по всему миру из своего первоначального резервуара в дельте реки Ганг в Индии. В дальнейшем произошло шесть пандемий, которые унесли жизни миллионов людей на всех континентах. Текущая (седьмая) пандемия началась в 1961 году в Южной Азии, в 1971 году распространилась на Африку, а в 1991 году — на Америку. В настоящее время холера является эндемической болезнью во многих странах.

Штаммы Vibrio cholerae

Существует много серогрупп V. cholerae, но только две из них — O1 и O139 — вызывают вспышки болезни. Причиной всех недавних вспышек стал штамм V. cholerae O1. Штамм V. cholerae O139, который был впервые выявлен в Бангладеше в 1992 году, вызывал вспышки в прошлом, но в последнее время выявляется только в спорадических случаях. Он никогда не был зарегистрирован за пределами Азии. Болезнь, вызванная любой из двух серогрупп, протекает одинаково.

Эпидемиология, факторы риска и бремя болезни

Передача холеры может носить эндемический или эпидемический характер. Эндемичный по холере район — это район, где подтвержденные случаи холеры выявлялись в течение трех последних лет и имеются фактические данные, подтверждающие местную передачу болезни (то есть, случаи не завезены откуда-либо извне). Вспышка/эпидемия холеры может возникать как в эндемичных странах, так и в странах, где холера обычно отсутствует.

В эндемичных по холере странах вспышка может иметь сезонный или спорадический характер и определяется как превышение ожидаемого числа случаев заболевания. В стране, где холера не возникает регулярно, вспышка определяется как появление не менее одного подтвержденного случая холеры с фактическим подтверждением местной передачи в районе, где холера обычно отсутствует.

Передача холеры тесно связана с отсутствием надлежащего доступа к чистой воде и средствам санитарии. К типичным районам повышенного риска относятся примыкающие к городским кварталам трущобы, где отсутствует основная инфраструктура, а также лагеря для внутренне перемещенных лиц или беженцев, где не удовлетворяются минимальные потребности в чистой воде и средствах санитарии.

Последствия гуманитарных кризисов, такие как разрушение систем водоснабжения и санитарии или перемещение населения в переполненные и ненадлежащим образом оборудованные лагеря, могут повышать риск передачи холеры при наличии или внедрении бактерий. Трупы людей, не инфицированных холерой, никогда не являлись причиной эпидемий.

Число случаев заболевания холерой, сообщения о которых поступали в ВОЗ за последние несколько лет, остается по-прежнему высоким. В 2017 году сообщалось о 1 227 391 случае в 34 странах, 5654 из которых закончились смертельным исходом 3 . Расхождения между этими численными данными и оцениваемым бременем болезни объясняются тем фактом, что многие случаи заболевания не регистрируются из-за ограниченных возможностей систем эпиднадзора и из-за опасений, связанных с негативными последствиями для торговли и туризма.

Профилактика и борьба

Решающую роль в профилактике холеры, борьбе с ней и снижении смертности от это болезни играет многосторонний подход. В нем используется сочетание таких мер, как эпиднадзор, мероприятия по улучшению водоснабжения, санитарии и гигиены, мобилизация общественности, лечение и оральные вакцины против холеры.

Эпиднадзор

Эпиднадзор за холерой должен осуществляться в составе комплексной системы эпиднадзора за болезнями, включающей в себя обратную связь на местном уровне и обмен информацией на глобальном уровне.

Случаи холеры выявляются на основе клинических подозрений у пациентов с тяжелой острой водянистой диареей. Далее подозрение подтверждается путем выявления бактерий V. cholerae в образцах кала соответствующих пациентов. Выявление случаев может быть упрощено за счет применения диагностических экспресс-тестов (ДЭТ), при котором положительный результат тестирования одного или более образцов служит основанием для оповещения о вспышке холеры. Образцы направляются в лабораторию на посев в целях подтверждения диагноза. Местные возможности для выявления (диагностики) и мониторинга (сбора, компиляции и анализа данных) заболеваемости холерой играют центральную роль в обеспечении эффективной работы системы надзора и планировании мер борьбы.

Странам, расположенным по соседству с пострадавшими от холеры районами, рекомендуется укреплять эпиднадзор за болезнью и повышать национальную готовность к быстрому выявлению вспышек и реагированию на них на тот случай, если холера распространится через границы. В соответствии с Международными медико-санитарными правилами, уведомление обо всех случаях заболевания холерой более не является обязательным. Тем не менее события в области общественного здравоохранения, связанные с холерой, следует всегда оценивать по критериям, приведенным в Правилах, чтобы определить, существует ли необходимость в официальном уведомлении.

Мероприятия в области водоснабжения и санитарии

В долгосрочной перспективе решение проблемы по установлению контроля над холерой заключается в экономическом развитии и обеспечении всеобщего доступа к безопасной питьевой воде и надлежащей санитарии.

Действия в отношении окружающей среды включают в себя внедрение адаптированных долгосрочных решений в области водоснабжения, санитарии и гигиены для обеспечения того, чтобы наиболее подверженные риску холеры группы населения пользовались безопасными источниками воды, базовыми средствами санитарии и надлежащими методами соблюдения гигиены. Такие мероприятия позволяют предупредить не только холеру, но и широкий диапазон других болезней, передающихся с водой, а также способствуют достижению целей, касающихся нищеты, неполноценного питания и образования. Решения WASH для борьбы с холерой соответствуют Целям в области устойчивого развития (ЦУР 6).

Многие из этих мероприятий требуют значительных долговременных инвестиций и непрерывного технического обслуживания, что усложняет их финансирование и обеспечение со стороны наименее развитых стран, где такие мероприятия особенно необходимы.

Лечение

Холера представляет собой легко излечимую болезнь. Большинство людей можно с успехом лечить, своевременно предоставляя им оральные регидратационные соли (ОРС). Стандартный пакет ОРС ВОЗ/ЮНИСЕФ разводят в 1 литре (л) чистой воды. В первый день для лечения обезвоживания средней степени взрослым пациентам может потребоваться до 6 л ОРС.

Пациентам с тяжелой степенью обезвоживания грозит дегидратационный шок, и необходимы срочные внутривенные вливания. В ходе лечения взрослому, весящему 70 кг, требуется не менее 7 л внутривенных вливаний, а также ОРС. Кроме того, таким пациентам назначают и соответствующие антибиотики для сокращения длительности диареи, уменьшения объема необходимых регидратационных жидкостей и сокращения количества и периода выделения V. cholerae в фекалиях.

Массовое применение антибиотиков не рекомендуется, так как оно не оказывает подтвержденного воздействия на распространение холеры и может способствовать повышению устойчивости к противомикробным препаратам.

Во время вспышки холеры ключевая роль отводится быстрому доступу к лечению. Возможность оральной регидратации должна обеспечиваться в общинах, наряду с существованием более крупных центров, где есть возможности для проведения внутривенных вливаний и оказания круглосуточной помощи. При своевременном и надлежащем лечении летальность не должна превышать 1%.

Важной дополнительной терапией для детей в возрасте до пяти лет служит прием препаратов цинка, которые также сокращают длительность диареи и могут предупреждать дальнейшие эпизоды возникновения других причин острой водянистой диареи.

Следует также поощрять грудное вскармливание.

Повышение уровня соблюдения правил гигиены и мобилизация общественности

Кампании по просвещению в области здравоохранения, адаптированные к местной культуре и верованиям, должны способствовать выполнению надлежащих правил гигиены, таких как мытье рук с мылом, безопасное приготовление и хранение пищевых продуктов и безопасное удаление детских фекалий. Похороны людей, умерших от холеры, должны быть организованы так, чтобы избежать инфицирования присутствующих.

Помимо этого, во время вспышек болезни следует организовывать кампании по повышению осведомленности и предоставлять общинам информацию о потенциальном риске и симптомах холеры, профилактических мерах во избежание заражения, а также о том, куда и когда необходимо сообщать о выявленных случаях, а при возникновении симптомов без промедления обращаться за медицинской помощью. Следует также распространять информацию о местоположении соответствующих пунктов оказания медицинской помощи.

Ключевым условием долгосрочных изменений в поведении людей и успешной борьбы с холерой является участие общественности в этой деятельности.

Оральные вакцины против холеры

В настоящее время существуют три пероральные вакцины против холеры, прошедшие предварительную квалификацию ВОЗ: Dukoral®, Shanchol™ и Euvichol-Plus®. 5 Для обеспечения полной защиты от болезни все три упомянутые вакцины должны предоставляться в двухдозовом режиме. 4

Dukoral® предоставляется в забуференном растворе, для приготовления которого требуется 150 мл чистой воды, если речь идет о взрослых пациентах. Dukoral® можно назначать всем лицам старше двух лет. Интервал между приемами каждой дозы должен составлять как минимум семь дней и не более шести недель. Дети в возрасте от двух до пяти лет должны получить третью дозу. Dukoral® используется в основном среди путешественников. Две дозы Dukoral® обеспечивают защиту от холеры в течение двух лет.

Shanchol™ и Euvichol-Plus®, по сути, представляют собой одну и ту же вакцину, выпускаемую двумя разными производителями. Для их применения не требуется забуференного раствора, в связи с чем их проще распространять среди большого числа людей в чрезвычайных ситуациях. Они предоставляются всем лицам в возрасте старше одного года. Интервал между приемами каждой дозы этих двух вакцин должен составлять не менее двух недель. Две дозы Shanchol™ и Euvichol-Plus® обеспечивают защиту от холеры в течение двух лет, а одна доза обеспечивает кратковременную защиту.

Вакцины Shanchol™ и Euvichol-Plus® в настоящее время предоставляются для кампаний массовой вакцинации из Глобального запаса оральных вакцин против холеры. Этот запас поддерживается Альянсом по вакцинам ГАВИ.

На основании имеющихся фактических данных в документе ВОЗ с изложением позиции по холерным вакцинам, выпущенном в августе 2017 г., отмечается следующее:

• оральные вакцины против холеры должны использоваться в районах, где она эндемична, в гуманитарных кризисных ситуациях с высоким риском заболеваемости холерой и во время вспышек холеры; всегда в сочетании со стратегиями по профилактике и борьбе с инфекцией;
• вакцинация не должна нарушать хода других высокоприоритетных мероприятий в области здравоохранения по борьбе со вспышками холеры и их предотвращению.

Деятельность ВОЗ

В 2014 году Глобальная целевая группа по борьбе с холерой, Секретариат которой работает на базе ВОЗ, получила новый импульс для активизации своей деятельности. Глобальная целевая группа представляет собой объединение, включающее в себя более 50 партнеров, участвующих в борьбе с холерой на глобальном уровне, в том числе академические учреждения, неправительственные организации и учреждения Организации Объединенных Наций.

Силами Глобальной целевой группы по борьбе с холерой и при поддержке доноров ВОЗ осуществляет деятельность в следующих областях:

• оказание поддержки разработке и осуществлению глобальных стратегий, направленных на содействие наращиванию потенциала для профилактики холеры и борьбы с ней в глобальных масштабах;
• предоставление платформы для обмена техническими знаниями, координации и сотрудничества по вопросам, связанным с холерой, для укрепления потенциала стран в области профилактики холеры и борьбы с ней;
• оказание поддержки странам в деле внедрения эффективных стратегий борьбы с холерой и мониторинга прогресса;
• распространение технических руководящих принципов и оперативных руководств;
• поддержка разработки программы научных исследований с акцентом на оценку инновационных подходов к профилактике холеры и борьбе с ней в пострадавших странах;
• привлечение дополнительного внимания к холере как важной проблеме глобального общественного здравоохранения путем распространения информации о профилактике холеры и борьбе с ней и проведение информационно-разъяснительной работы и мероприятий по мобилизации ресурсов в поддержку профилактики холеры и борьбы с ней на национальном, региональном и глобальном уровнях.

Глобальная дорожная карта имеет три стратегических приоритета:

Чтобы обеспечить действенное и эффективное распространение материалов, необходимых для расследования и подтверждения вспышек холеры, а также для лечения пациентов, заболевших холерой, ВОЗ разработала набор комплектов для борьбы с холерой.

После консультации с партнерами по осуществлению в 2016 году ВОЗ пересмотрела комплекты для борьбы с холерой, чтобы они в большей степени соответствовали потребностям на местах. В общей сложности имеется 6 комплектов:

• 1 для проведения исследований
• 1 с лабораторными материалами для подтверждения
• 3 для общинного, периферийного и центрального уровня
• 1 комплект с вспомогательными материалами, такими как солнечные лампы, заграждения, резервуары и краны для воды.

Каждый комплект для лечения содержит материалы, которых достаточно для лечения 100 пациентов. Пересмотренные комплекты для борьбы с холерой предназначены для оказания поддержки в подготовке к потенциальной вспышке холеры и помощи первичным мерам реагирования в течение первого месяца их осуществления.

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Шашкова А. В., Горяев А. А., Заднова С. П., Краснов Я. М., Смирнова Н. И.

Разработана мультилокусная ПЦР тест система, позволяющая идентифицировать штаммы Vibrio cholerae О1 серогруппы при выделении чистой культуры на основе выявления гена rfbO, определять их биовар классический или эльтор при тестировании соответственно генов cas3 и rtxC и одновременно проводить дифференциацию эльтор вибрионов на типичные токсигенные штаммы, содержащие в геноме ген ctxBEltor, и генетически измененные варианты , имеющие ctxBClass. Эффективность и специфичность тест-системы экспериментально доказана при анализе 64 природных штаммов V.cholerae разных серогрупп и биоваров и 13 штаммов энтеробактерий и других видов рода Vibrio. Принадлежность изученных штаммов V. cholerae биовара эльтор к типичным или измененным вариантам подтверждена секвенированием гена ctxB.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Шашкова А. В., Горяев А. А., Заднова С. П., Краснов Я. М., Смирнова Н. И.

Construction of the PCR Test-System for the Detection of Vibrio cholerae O1 Toxigenic Strains, for Indication of Their Biovar and for Differentiation between Typical and Altered El Tor-Vibrio Strains

Worked out is the multilocus PCR test-system which makes it possible to identify Vibrio cholerae O1 strains on the basis of rfb gene detection, to determine their biovar either Classical or El Tor by testing cas3 or rtxC genes respectively, and at the same time to differentiate them into typical (which carry ctxBEltor gene) and genetically altered (which carry ctxBClass gene) variants. Efficacy and specificity of the test-system is demonstrated by the analysis of 64 natural V. cholerae strains of various serogroups and biovars, and 13 strains of enterobacteria and other species of Vibrio genus. Relation of the studied V. cholerae El Tor isolates to the typical or altered vibrio variants is proved out by ctxB gene sequencing.

А.В.Шашкова, А.А.Горяев, С.П.Заднова, Я.М.Краснов, Н.И.Смирнова, В.В.Кутырев

конструирование пцр тест-системы для идентификации тоКсигЕнных штаммов ViBRiO CHOLERAE о1, определения их БиовАрА и дифференциации штаммов эльтор вибрионов на типичные и измененные

Разработана мультилокусная ПЦР тест система, позволяющая идентифицировать штаммы Vibrio cholerae О1 серогруппы при выделении чистой культуры на основе выявления гена rfbO, определять их биовар - классический или эльтор при тестировании соответственно генов cas3 и rtxC и одновременно проводить дифференциацию эльтор вибрионов на типичные токсигенные штаммы, содержащие в геноме ген ctxBEltor, и генетически измененные варианты, имеющие ctxBClass. Эффективность и специфичность тест-системы экспериментально доказана при анализе 64 природных штаммов Vcholerae разных серогрупп и биоваров и 13 штаммов энтеробактерий и других видов рода Vibrio. Принадлежность изученных штаммов V. cholerae биовара эльтор к типичным или измененным вариантам подтверждена секвенированием гена ctxB.

Ключевые слова: Vibrio cholerae, мультилокусная ПЦР тест-система, идентификация и дифференциация, генетически измененные варианты.

A.V.Shashkova, A.A.Goryaev, S.P.Zadnova, Ya.M.Krasnov, N.I.Smirnova, V.V.Kutyrev

Construction of the PCR Test-System for the Detection of Vibrio cholerae O1 Toxigenic Strains, for Indication of Their Biovar and for Differentiation between Typical and Altered El Tor-Vibrio Strains

Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov

Worked out is the multilocus PCR test-system which makes it possible to identify Vibrio cholerae O1 strains on the basis of rfb gene detection, to determine their biovar - either Classical or El Tor by testing cas3 or rtxC genes respectively, and at the same time to differentiate them into typical (which carry ctxBEltor gene) and genetically altered (which carry ctxBClass gene) variants. Efficacy and specificity of the test-system is demonstrated by the analysis of 64 natural V. cholerae strains of various serogroups and biovars, and 13 strains of enterobacteria and other species of Vibrio genus. Relation of the studied V. cholerae El Tor isolates to the typical or altered vibrio variants is proved out by ctxB gene sequencing.

Key words: Vibrio cholerae, multilocus PCR test-system, identification and differentiation, genetically altered vibrio variants.

Холера - особо опасное инфекционное заболевание с диарейным синдромом, возбудителем которого являются токсигенные штаммы Vibrio cholerae. Несмотря на то, что существуют более 200 различных серогрупп холерных вибрионов, эпидемии и пандемии холеры способны вызывать только токсигенные штаммы V. cholerae О1 серогруппы классического и эльтор биоваров, а также V.cholerae О139 серогруппы. Холерные вибрионы классического биовара считаются возбудителями первых шести пандемий азиатской холеры (1817-1923 гг.). Возбудителем 7-й пандемии холеры, начавшейся в 1961 г. и продолжающейся до сих пор, являются штаммы V. cholerae биовара эльтор. Токсигенные штаммы V.cholerae О139 серогруппы вызывают спорадические случаи холеры. Холерные вибрионы классического и эльтор биоваров отличаются по ряду фенотипических и генетических свойств [1, 4, 11]. Одним из основных генетических отличий холерных классических и эльтор вибрионов является различие нуклеотидных последовательностей гена ctxB из оперона ctxAB, кодирующего биосинтез холерного токсина (ХТ). Разная нуклеотидная последовательность генов ctxB классического и эльтор вибрионов определяет неодинаковую аминокислотную последовательность В-субъединиц их токсинов, вследствие чего различают ХТ классического (или 1-го) типа, продуцируемый класси-

ческими вибрионами, и ХТ эльтор (или 2-го) типа, характерный для вибрионов эльтор [15].

Несмотря на широкое распространение типичного возбудителя 7-й пандемии холеры на ее первом этапе (1960-1990 гг.), в последние годы в процессе эволюции возникли и заняли доминирующее положение новые варианты V. ско1егае биовара эльтор с повышенной вирулентностью, получившие обозначение генетически измененных вариантов. Геном типичных токсигенных штаммов эльтор вибрионов содержит ген с^Бв1‘ог, тогда как у измененных вариантов присутствует ген с^Б01^' [5, 8, 13]. Продукция измененными вариантами V. ско1егае 01 биовара эльтор ХТ классического типа приводит к повышению их вирулентности по сравнению с типичными штаммами. Именно с холерными вибрионами, относящимися по всем фенотипическими признакам к биовару эльтор. но несущими классический аллель гена сиБ, связана в настоящее время эпидемия холеры на Гаити [9].

Для генной диагностики холеры разработано значительное количество ПЦР тест-систем, позволяющих не только выявлять токсигенные штаммы холерного вибриона, но и определять их серогруппу, биовар и эпидемическую значимость. Для детекции ДНК вирулентных штаммов V. ско1егае на основе амплификации фрагмента с^Л гена, кодирующего биосинтез А-субъединицы холерного токсина,

Taким образом, в связи с возникновением высоковирулентных измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, продуцирующих XT классического типа, и опасностью их завоза на территорию Российской Федерации и граничащих с ней стран, актуальна разработка мультилокусной ПЦР тест-системы для быстрой и достоверной идентификации штаммов V. cholerae 01 серогруппы, определения их биовара и дифференциации токсигенных штаммов V. cholerae 01 биовара эльтор на типичные изоляты и измененные варианты.

Материалы и методы

Анализ и оценку результатов осуществляли путем сравнения полученных в ПЦР ампликонов с аналогичными фрагментами типичных токсигенных штаммов V. cholerae классического и эльтор биова-ров методом электрофореза в агарозном геле.

Результаты и обсуждение

При конструировании мультилокусной ПЦР тест-системы были использованы как применяемые ранее праймеры, так и разработанные впервые. С целью определения принадлежности выявленного штамма V. cholerae к 01 серогруппе были выбраны праймеры на локус rfbO, кодирующий синтез 01 антигена [12]. Для дифференциации типичных изоля-тов и генетически измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор использовали аллельспецифичные праймеры на ген ctxB [14]. Как известно, ген ctxB входит в состав оперона ctxAB, кодирующего продукцию холерного токсина, и выявление гена ctxB также указывает на токсигенность изучаемого штамма. Дифференциацию биоваров проводили с помощью праймеров на ген rtxC, который определяется только в штаммах V. cholerae эльтор биовара [10], и на ген cas3, кодирующий хеликазу и присутствующий у холерных вибрионов классического биовара.

В ходе работы было экспериментально установлено соотношение всех компонентов реакционной смеси, а также подобрано сочетание праймеров, позволяющее получать четкие и легко интерпретируемые результаты ПЦР анализа. Для проведения анализа использовали ПЦР параллельно в двух реакционных смесях. Первая смесь содержала праймеры к генам классических вибрионов, вторая - эльтор. В качестве контрольных штаммов использовали типичные токсигенные штаммы классического и эльтор биоваров соответственно - V. cholerae 569В (rfbO1+, cas3+, ctxBClass+ и rtxC-, ctxBEltor-) и V. cholerae М818 (rfbO1+, rtxC+, ctxBEltor+ и cas3-, ctxBClass ).

Специфичность разработанной тест-системы была подтверждена на основе использования штаммов близкородственных видов - V. mimicus, V. anguillarum, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginoliticus, V. al-bensis, а также энтеробактерий - E. coli, S. enteritidis, Sh. flexneri, A. hydrofilae. При проведении ПЦР тестирования указанных штаммов был получен отрицательный результат (отсутствие ампликонов). При анализе штаммов V. cholerae 0139 и не01/не0139 серогрупп отсутствовали фрагменты, соответствующие локусу rfbOl (638 п.н.). Полученные данные подтверждают специфичность разработанной тест-системы в отношении штаммов V. cholerae 01 серогруппы.

Для определения эффективности сконструированной тест-системы исследовали 47 клинических штаммов V. cholerae 01 серогруппы, выделенных в разные годы на территории России и сопредельных государств. Данные по определению специфичности и эффективности сконструированной тест-системы с использованием некоторых штаммов энтеробактерий и видов рода Vibrio приведены в таблице и на рис. 1. У всех исследованных штаммов присутствовал ам-пликон размером 638 п.н., соответствующий локусу

Специфичность и эффективность сконструированной мультилокусной ПЦР-тест-системы

Вид Серогруппа и биовар Штамм Место выделения Год выделения Реакционная смесь № 1 Реакционная смесь № 2

г(Ь01 саэЗ сґхБсіа' ф01 НхС сїхБЕІіог

Е. соїі М17 н/и н/и -

S. enteritidis ВОЗ н/и н/и -

V тітісиз АТСС 33653 Институт Пастера н/и -

V шіпфсш АТСС27562 Калифорнийский унив. н/и + -

V. рагакаєтоііґісш 745 Новороссийск н/и -

V аіЬєпхіх 37263 Ставрополь н/и + -

V скоієгає 037 1322-69 Коллекция Саказаки н/и + -

V скоієгає 020 10332-62 Коллекция Саказаки н/и -

V скоієгає 062 КМ3 Узбекистан 1971 + + -

V скоієгає 041 14520 Астрахань 1976 + -

V скоієгає 042 13030 Астрахань 1976 + -

V скоієгає 09 Р-16140 Узбекистан 1990 + + -

V скоієгає 0139 М028 Индия 1993 + +

V скоієгає 0139 55 Франция 1994 + +

V скоієгає О1 классический М8 Волгоград 1942 + + + + -

V скоієгає О1 классический 569В Индия 1950 + + + + -

V скоієгає О1 эльтор М295 Туркменистан 1965 + + + +

V скоієгає О1 эльтор М818 Саратов 1970 + + + +

V скоієгає О1 эльтор М1013 Башкирия 1972 + + + +

V скоієгає О1 эльтор Р13762 Узбекистан 1988 + + + + -

V скоієгає О1 эльтор М 1259 Пермь 1990 + + + +

V скоієгає О1 эльтор Р15384 Украина 1991 + + + + -

V скоієгає О1 эльтор М1264 Краснодар 1993 + + + + -

V скоієгає О1 эльтор М1293 Дагестан 1994 + + + + -

V скоієгає О1 эльтор Р17644 Ачинск 1997 + + + + -

V скоієгає О1 эльтор М1344 Казань 2001 + + + + -

V скоієгає О1 эльтор М1429 Башкирия 2004 + + + + -

V скоієгає О1 эльтор М1430 Тверь 2005 + + + + -

V скоієгає О1 эльтор Р18899 Мурманск 2006 + + + + -

т^01 и свидетельствующий о принадлежности этих штаммов к 01 серогруппе. При этом было показано, что 5 из этих 47 изолятов относятся к токсигенным штаммам классического биовара, так как у них происходила амплификация фрагментов ДНК размером 415 и 189 п.н. в первой реакционной смеси, что указывает на присутствие в их геноме соответственно биовароспецифического гена саз3, а также гена с1хЕС1а33, связанного с продукцией ХТ классического типа (рис. 1, дорожки 11-14).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Рис. 1. Электрофореграмма типичных изолятов и измененных вариантов V. ско1егае, полученная с использованием разработанной мультилокусной ПЦР тест-системы:

Измененные варианты эльтор вибрионов: 1, 2 - V сИо1егае М1266,

5, 4 - М1293, 5, 6 -- V Метав М1349, 7, § - V ско1етае М1430; типичные штаммы эльтор вибрионов: 9, 10 - V ско1етае М1013,

15, 16- V. ско1етае М818; типичные штаммы классических вибрионов: 11, 12 - V сИоЬетае J89, 13, 14 - V сИо1етае 569В.

Нечетные числа - ампликоны, полученные в первой реакционной смеси, содержащей праймеры к генам классических вибрионов; четные - ампликоны, полученные во второй реакционной смеси, содержащей праймеры к генам эльтор вибрионов

У 42 штаммов V. ско1етае при ПЦР-анализе наблюдалась иная картина. В их геноме присутствовал биовароспецифический ген т^С, выявляемый с помощью второй реакционной смеси, поскольку во всех случаях формировался ампликон размером 265 п.н. (тЫС), что указывает на их принадлежность к холерным вибрионам биовара эльтор. При этом 20 штаммов относились к типичным токсигенным штаммам V. ско1етае 01 биовара эльтор, так как для них было характерно наличие ампликона размером 189 п.н во второй реакционной смеси, что указывает на наличие в их геноме гена с^Бв1‘от (рис. 1, дорожки 9-10, 15-16). В то же время у 22 изолятов обнаружено присутствие в геноме гена с^Б классического типа (ctxБC1ass), о чем свидетельствует образование ампликона к гену с1хЕС1а33 в первой реакционной смеси (рис. 1, дорожки 1-8).

Для подтверждения полученных с помощью сконструированной мультилокусной ПЦР тест-системы результатов был секвенирован ген ^Б некоторых штаммов. В результате проведенного анализа в последовательности гена ^Б у 13 взятых для анализа изолятов обнаружены две нуклеотидные замены тимина (Т) на цитозин (С) в положениях 115 и 203, что указывает на присутствие в их геноме гена сХхБ классического типа (с^хБС1а3'), рис. 2. Данные секвенирования полностью подтвердили результаты, полученные с использованием разработанной муль-

N818 AATATATACG CTAAATGATA AGATATTTTC CTATACAGAA ТСТСТАССТС GAAAAACAGA GATGGCTATC ATTACTTTTA AGAATCCTCC ААТТТТТСАА GTACAAGTAC

Рис. 2. Фрагменты секвенированной последовательности гена ctxB. Очками отмечены одинаковые нуклеотиды

тилокусной ПЦР тест-системы, указав на принадлежность выявленных 13 штаммов холерного вибриона биовара эльтор к измененным вариантам.

Таким образом, полученные данные свидетельствует о том, что исследование природных штаммов холерных вибрионов с помощью сконструированной мультилокусной ПЦР тест-системы позволяет не только идентифицировать штаммы V. скоієгає О1 серогруппы, определять их биовар и токсигенность, но и дифференцировать штаммы V. скоієгає биовара эльтор на типичные изоляты и измененные варианты, несущие в геноме ген сїхБ классического типа.

На созданную мультилокусную ПЦР тест-систему подана заявка на получение патента на изобретение (№ 2011109469 от 14.03.2011 г.).

1. Бароян О.В. Холера Эль-Тор. М.: Медицина; 1971. 254 с.

2. Заднова С.П., Ливанова Л.Ф., Крепостнова И.М., Захарова Т.Л., Осин А.В., Смирнова Н.И. Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов О1 и О139 серогруппы и оценки их вирулентности. Патент РФ № 2404257.

3. Осина Н.А., Бугоркова Т.В., Коннова С.С., Куклев В.Е., Кутырев В.В. Способ детекции и определения биотипа, серогруппы и токсигенности возбудителя холеры и набор для его осуществления. Патент РФ 2360972.

4. Смирнова Н.И., Кириллина О.А., Челдышова Н.Б., Кутырев В.В. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae eltor по их эпидемической значимости с помощью новых диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx- и ctx+ и полимеразной цепной реакции. Журн. эпидемиол., микробиол. и иммунобиол. 2001; 6:11-6.

5. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Эволюция генома возбудителя холеры. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2004; 4:3-13.

6. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Горяев А.А., Лозовский Ю.В., Кутырев В.В. Эволюция генома Vibrio cholerae: пути формирования атипичных штаммов. Пробл. особо опасных инф. 2008; 3(97):3-12.

8. Bhattacharya T., Chatterjee S., Maiti D. et al. Molecular analysis of the rstR and orfU genes of the CTX prophages integrated in the small chromosomes of environmental Vibrio cholerae non-O1, non-O139 strains. Environ. Microbiol. 2006; 8:526-34.

9. Chin C.-S., Sorenson J., Harris J.B. et al. The origin of the Haitian cholera outbreak strain. N. Engl. J. Med. 2010; 364:33-42.

10. Chow K.H., Ng T.K., Yuen K.Y., Yam W.C. Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholerae by PCR. J. Clin. Microbiol. 2001; 39:2594-7.

11. Faruque S.M., Albert M.J., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics an ecology of toxigenic Vibrio cholerae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998; 62:1301-14.

12. Goel A.K., Ponmariappan S., Kamboj D.V., Singh L. Single multiplex polymerase chain reaction for environmental surveillance of toxigenic-pathogenic O1 and non-O1 Vibrio cholerae. Folia Microbiol (Praha). 2007; 52:81-5.

13. Kumar P., Jain M., Goel A. K., Bhadauria S., Sharma S. K., Kamboj D. V et al. A large cholera outbreak due to a new cholera toxin variant of the Vibrio cholerae O1 El Tor biotype in Orissa, Eastern India. J. Med. Microbiol. 2009; 58:234-8.

14. Morita M., Ohnishi M., Arakawa E., Bhuiyan N.A., Nusrin S., Alam M. et al. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCR assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor. Microbiol. Immunol. 2008, 52:314-7.

15. Olsvik Q., Wahlberg J., Petterson B., Uhlen M., Popovic T., Wachsmuth I.K. et al. Use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit B in Vibrio cholerae O1 strains. J. Clin. Microbiol. 1993; 31:22-35.

References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)