Внутривидовое типирование дизентерийных бактерий зонне

Если роль бактериофага, как средства терапии и профилактики некоторых инфекционных заболеваний, в настоящее время невелика, то значения для лабораторной диагностики ряда инфекции этот биологический объект не только не утратил, а, наоборот, начал привлекать к себе всё более пристальное внимание исследователей. С каждым годом повышается значимость бактериофагов как высоко специфического диагностического средства, позволяющего надёжно дифференцировать возбудителей бактериальных видов, а порой проводить более детальную дифференциацию отдельных типов и вариантов внутри данного вида. Возможность фагоидентификации вытекает из специфичности действия фагов, которая может быть настолько выражена, что позволяет дифференцировать не только отдельные виды, но и серологически неотличимые штаммы в пределах одного вида.

Известно, что ведущее место в определении заболеваемости животных и человека принадлежит своевременной и точной диагностике болезни, основным звеном которого является правильная идентификация возбудителя. Поэтому всё большее число исследователей предпочитают обращаться к фаговым тестам, как единственному средству, способному дифференцировать близкородственные штаммы. Фагодиагностика основана на специфической способности фагов взаимодействовать с определёнными видами (идентификация) или типами (фаготипирование) бактерий, в результате чего происходит их лизис. Феномен лизиса является основой для использования фага в диагностических целях, Метод фагодиагностики широко используется в лабораторной практике для идентификации различных видов микроорганизмов.

Об успешном применении дизентерийного бактериофага при массовых исследованиях сообщила В.Н. Кузнецова (1956), которая идентифицировала 576 культур из 630.

Для ускоренной диагностики брюшного тифа З.С. Островская, Б.Н. Паякова (1951) предложили V1-бактериофаг, с помощью которого в течение 48 часов можно идентифицировать брюшнотифозные гемокультуры.

Аврех В.В. (1954) предлагал использовать фаги специфические по отношению к различных видам сальмонелл, считая данный метод более надёжным, чем реакция с монорецепторными сыворотками. Для быстрой диагностики В.А. Килессо (1960) применяла сальмонеллёзный О-фаг с широким спектром действия, лизирующий 40 различных серотипов сальмонелл. Л.И. Адельсоном с соавт. (1957) были получены фаги, активные по отношению к энтеропатогенным кишечным палочкам серотипов 026: 055: 0111, и с успехом применявшиеся ими для идентификации этих бактерий.

Попхадзе М.З. (1968) в своей работе указывал, что применение активного поливалентного бруцеллёзного бактериофага, обладающего строгой видовой специфичностью, позволяет идентифицировать 93-99% культур бактерий, включая атипичные формы, чем и определяется его высокая диагностическая ценность.

Одним из первых в ветеринарной практике фагоидентификация была предложена Цветковым (1941) при паратифозном аборте у кобыл. П.В. Лихачев в 1948 году провёл испытание фага при диагностике паратифа свиней. Дальнейшие работы в этой области исследований подтвердили значимость выбранного направления.

Н.И. Николаенко, И.К. Тутов (1970) отмечает перспективность использования бактериофага, лизирующего Salmonella abortus ovis и позволяющего сократить сроки диагностики до 4-6 часов.

По данным И.И. Ревенко (1978) коли-гертнер-фаг обладает довольно широким диапазоном литической активности. При испытании 206 культур S. enteritidis, выделенных от телят и коров в разное время и в различных местностях, этот фаг лизировал 164 культуры (79,6%). Кроме того, он лизировал значительное количество культур S. suipestifer и S. cholerae suis, выделенных от поросят. В отношении культур E. coil, выделенных от телят, коров и свиней различного возраста, коли-гертнер-фаг оказался малоактивным: из 270 культур он лизировал только 15,7% штаммов.

В широкой практике ветеринарных лабораторий рекомендуются сибиреязвенные бактериофаги К – ВИЭВ и g – МВА для идентификации сибиреязвенных бактерий(.

Находят применение и листериозные фаги, позволяющие идентифицировать свыше 85% культур листерий (Н.А. Капырина, И.А. Бакулов, 1972).

По мнению указанных выше авторов, проба с бактериофагом, в силу его специфичности и избирательности действия, является наиболее надёжным методом идентификации инфекционных болезней животных и человека из доступных рядовой лаборатории.

В эпидемиологической и эпизоотологической практике всё большее распространение получает метод фаготипирования бактерий. Практическая ценность этого метода определяется относительной стабильностью фаготипов бактерий. Как указывает В.Б. Аврех (1959), фаготип бактерий отражает то тонкое антигенное строение бактерий, которое не улавливается серологическими реакциями и может быть определено только при помощи бактериофагов. Установление этих тонких различий и даёт возможность определять эпидемиологические или эпизоотологические связи, так как при наличии таких связей выделяются штаммы бактерий, характеризующиеся одинаковой фагомозаикой.

Метод фаготипирования бактерий может быть использован не только для повышения качества эпидемиологического и эпизоотологического исследования, но и с целью улучшения лабораторной диагностики, как метод ускоренной идентификации микроорганизмов.

Фаготипирование микроорганизмов можно проводить двумя методами. Первый метод фаготипирования, наиболее часто применяемый в практике, основан на определении чувствительности исследуемой культуры к стандартным препаратам специфических бактериофагов, взятых в определённом разведении. Второй метод фаготипирования бактерий заключается в разделении их на группы по характеру выделяемых из культур умеренных фагов. В медицинской практике этот метод используется очень редко, а в ветеринарной – вообще не применяется.

Впервые фаготипирование с помощью так называемых Vi- фагов предложили в 1938 году J. Craigie, C. Yan для культур возбудителя брюшного тифа. В 1947 г. J. Craigie, А. Felix была отработана методика типирования брюшнотифозных бактерий, с помощью которой можно было определять 53 типа брюшнотифозных культур.

Практическая ценность типирования брюшнотифозных бактерий с помощью Vi- фагов была доказана большим количеством исследователей. Типирование брюшнотифозных бактерий проводится в настоящее время по стандартной схеме, разработанной J. Craigia, A. Felix, (1947). Большинство исследователей подчёркивает стабильность фаготипов брюшнотифозных бактерий.

Фаготипирование, как метод идентификации, разработан в отношении широкого спектра возбудителей: брюшнотифозных и паратифозных А и Б бактерий, палочек Бреслау (Craigie J. et all. 1938., Гордина Р.В. 1954, Гуторова Л.Д. 1958.). Разработаны схемы типирования дизентерийных бактерий Зонне (III), известны попытки типирования плазмокоагулирующего стафилококка, энтерококка, дифтерийных бактерий). Ряд диагностических фагов: типовые паратифозные А и B, Vi-брюшнотифозные, типовые дизентерийные фаги к Sh.Sonne, колифаги, стафилококковые и другие, предлагают применять для внутривидовой дифференциации бактерий (Кац – Чернохвостова Л.Я. 1947, Крылова М.Д. 1961, 1963., Наурызгалиев С.Н. 1978.). Оригинальную схему для фаготапирования S.thyphimurium разработали Л.Г.Чиракадзе с соавт. (1974). Литическую реакцию изучали у 2708 штаммов S.thyphimurium как эталонных и музейных, так и выделенных из разных источников при помощи 16 типовых фагов.

Крыловой М.Д. (1963, 1970, 1974) одной из первых удалось с помощью прямого метода подразделить культуры E.coil серотипа 0111 за 4 фаготипа. Изучая лизогению 104 штаммов дифтерийных бактерий, она установила наличие лизогенного состояния у 103. В 1974 году ею разработаны рекомендации к построению схем фаготипирования, в основу которых положен принцип обозначать фаготипы не цифрами, а заглавными буквами латинского алфавита: А, В, С, D и т.д. Это даёт возможность регистрировать в названии фаготипа слабые и сильные реакции: фаги, обусловливающие сильные реакции, указываются в виде заглавных букв; фаги, дающие слабые реакции – в виде строчных букв. Например, штамм, лизирующийся фагом А, В, С и D – сливным лизисом, а фагами F и G – в виде единичных бляшек, получает название фаготип ABCDfg.

Ценность метода фаготипирования состоит в том, что фаготип – самый тонкий из маркеров, и определение фаготипа маркирует штамм сразу по нескольким меткам в строго определённом сочетании.

В ветеринарной практике одними из первых применили фаготипирование Давиденко Т.А. 1972, Никитюк Н.М. 1970, Архангельский И.И., Степанов Б.А. 1966, Ивашура А.И. 1967, Байрак Б.А. 1970, Петрушина Л.И. 1967. В своих исследованиях они указывают на эффективность фаготипирования сальмонелл, которые выделяются от различных видов животных, из мяса и других субстратов; фаготипирования стафилококков, выделяемых из молока при маститах у коров, для выяснения связей между этими заболеваниями и пищевыми токсикоинфекциями у людей. И.П. Ревенко (1970) установил, что метод фаготипирования позволяет отличать культуры эризипелотриксов, выделяемых из различных источников, и может быть использован в эпизоотологической практике для выяснения связей между отдельными случаями заболевания рожей различных животных и человека.

Следует отметить, что методы фагодиагностики, включая идентификацию и фаготипирование, базировались на регистрации лизиса выделяемых культур, вызванного фагом с известным диапазоном действия. Таким образом, фаг в этих случаях представляет собой индикатор, устанавливающий видовую или типовую принадлежность микроба, выделенного из исследуемого материала при помощи обычных методов. Иными словами, при данном принципе использования фага частота получения положительных ответов не возрастает, и фаг в данном случае выполняет функцию вспомогательного теста, устанавливающего природу выделенного возбудителя. Вместе с тем фаг может быть использован для обнаружения возбудителя без выделения чистых культур.

На возможность использования фагов для обнаружения патогенных бактерий без выделения их в чистом виде независимо друг от друга указали ряд авторов. В 1936 году Ф.И. Сергиенко пытался применить этот метод путём посева материала в определённые разведения фага с последующим учётом нарастания его титра для обнаружения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий. Katznelson H., Sutton M., (1951) использовали фаг для выявления фитопатогенных бактерий в семенах бобов, I. Sechter, (1962) – для обнаружения брюшнотифозных бактерий. Однако перечисленные выше работы носили чисто эмпирический характер. В них отсутствовало надлежащее теоретическое обоснование принципа. И лишь В.Д. Тимаков и Д.М. Гольдфарб (1955), основываясь на специфичности действия бактериофага и сравнительной простоте количественного учёта его, теоретически обосновали и экспериментально разработали принципиально новый метод для обнаружения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий, названный ими реакцией нарастания титра фага (РНФ), который, в отличие от существующих методов фагодиагностики, позволяет выявлять возбудителя непосредственно в исследуемом материале без выделения чистой культуры.

Купить бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
Курьерская доставка (7 дней)
Самовывоз из московского офиса
Почта РФ

Метод основан на определении характера действия колицинов, продуцируемых исследуемыми штаммами бактерий Зонне, на 15 индикаторных культур, из которых 13 - шигеллы Зонне, I - Sh. Dysenteriae 2 (Штуцер-Шмитца) и I - вариант E. coli K-12 Row

Дата введения	01.02.2020
Добавлен в базу	01.02.2017
Актуализация	01.02.2020

10.03.1971	Утвержден	Зам. Начальника Главного санитарно-эпидемиологического управления Министерства здравоохранения СССР
Издан	Министерство здравоохранения СССР	1971 г.
Разработан	Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии МЗ СССР

Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:

ВНУТРИВИДОВОЕ ТИПИРОВАНИЕ ДИЗЕНТЕРИЙНЫХ БАКТЕРИЙ ЗОННЕ ПО КОЛИЦИНОГЕННОСТИ И КОЛИЦИНОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

Для республиканских, областных и городских бактериологических лабораторий

Кандидат мед. наук

Ю. П. Солодовников М. В. Турчинская Ю. В. Толмачева

Кандидат мед. наук Кандидат мед. наук Кандидат мед. наук Кандидат мед. наук

П. И. Емельянов М. А. Смирнова-Мутушева Б. А. Годованный С. Д. Татаринова

блюдают один и тот же порядок их размещения, что позволяет, при достаточном навыке, не производить нумерацию штаммов на чашке. При использовании всех 15 индикаторных культур, как показано на рисунке 2, на одной половине чашки сеют 8 штаммов (с 31 по 38), а па другой — остальные 7 штаммов (с 39 по 44). При применении 10 индикаторных штаммов сеют, соответственно, 6 и 4 культуры. Такое распределение также позволяет не нумеровать нанесенные штаммы.

После посева индикаторных штаммов чашки помещают в термостат еще на 18—20 часов при 37° С.

4. Учет результатов.

Если исследуемая культура является колициногенной, наблюдается торможение роста индикаторных штаммов, чувствительных к продуцируемым колицинам. При этом линия роста чувствительного штамма прерывается в том месте, где она пересекает зону диффузии колицина в питательную среду. Штаммы, устойчивые к определенному колицину, растут в виде сплошных непрерывных штрихов. Такими же штрихами растут все 15 индикаторных штаммов в том случае, когда исследуемая культура не продуцирует колицинов.

Штамм E.coliRow (№ 44) чувствителен к колицинам всех известных в настоящее время колицнногенотипов шигелл Зон-не, за исключением типа 7.

Величина зоны торможения роста зависит от концентрации и степени диффузии колицина в агар и выраженности чувствительности индикаторных штаммов.

Учет результатов производят по наличию или отсутствию зон торможения роста индикаторных .культур. Культура считается чувствительной, если зона торможения составляет более 4 мм. В некоторых случаях в зоне торможения роста чувствительного штамма наблюдается рост отдельных резистентных колоний или островков индикаторной культуры. При определении размеров зоны торможения эти колонии и островки не принимают во внимание, учитывают всю ширину зоны от одного ее края до другого.

Установленный спектр действия колицинов исследуемой культуры на индикаторные штаммы сопоставляют со схемой типировання (табл. 3 или 4) и определяют колициногенотип изученного штамма шигелл Зонне.

Схема хода исследования по методу Абботта и Шеннона.

В некоторых случаях установленный тип может не совпадать ни с одним из известных типов. Такие культуры обозначают как нетипируемые. Следует учитывать также возможность обнаружения новых колициногенотипов.

Регистрацию результатов типирования наиболее удобно производить по приведенной ниже форме (табл. 5).

Форма рабочего журнала для регистрации результатов типирования шигелл Зонне по Абботту и Шеннону (пример регистрации)

Е.соП СА — 18 продуцирует колицин В;

Е. соП СА —23 продуцирует колицин Д

Е.соП СА —38 продуцирует колицин Е 4* 1

Е.соП СА — 42 продуцирует колицин F

Е.соП СА — 53 продуцирует колицин I Е.соП К — 235 продуцирует колицин К

Е.соП СА — G2 продуцирует колицин J + I

Е.соП СА — 7 продуцирует колицин V Sh. boydii Р — 1 продуцирует колицин Si

Sfi. sonnei P — 9 продуцирует полиции S₃-fI В. dispar P—>14 продуцирует полиции Ss

Перечисленные колицины дают четкие зоны угнетения роста бактерии Зонне и позволяют подразделять их на определенные колншшотипы.

Накануне опыта в чашки Петри разливают по 20—25 мл 1,5%. мясопептониого агара, подкрашенного ген циан виол етом до слегка синего цвета (2—4 капли 0,1% водного раствора на 100 мл среды). Слабые растворы генцианвиолета угнетают рост воздушной микрофлоры и способствуют повышению колицииопродукции эталонных штаммов.

Чашки со средой подсушивают в термостате. Затем дно чашек делят восковым карандашом (чернилами) на 11 квадратов (по числу эталонных культур). Квадраты обозначают номерами: 1, 2, 3, 4 и т. д. При известном навыке, если ко-лицнногенные штаммы постоянно употреблять в одном и том же порядке, можно вообше ограничиться обозначением только начала посева культур. Описанным способом для каждого штамма шигелл, который подлежит испытанию на чувствительность к колицииам, готовят две чашки со средой, т. е. число чашек со средой должно быть в два раза больше, чем число штаммов исследуемых шигелл Зонне.

Эталонные колишшогеиные штаммы суточной давности, выросшие на среде Ресселя, наносят уколом петли в соответствующий квадрат чашки. После посева каждой эталонной культуры петлю прожигают на пламени горелки.

В целях экономии времени целесообразно, без ущерба для результатов опыта, производить последовательный посев соответствующего эталонного штамма одновременно на 5— 7 чашек, размещенных в ряд, при однократном заборе материала со среды Ресселя.

Чашки, засеянные колнцнногеиными культурами, помещают в термостат на 22—24 часа при 37° С, после чего выросшие колонии бактерий стерилизуют парами хлороформа. С этой целью чашки помещают на столе вверх дном и на внутреннюю поверхность крышки наносят 8—12 капель хлороформа. Через 40—50 минут бактерии погибают, а хлороформ улетучивается из чашек.

Затем в пробирку с 2,5 мм расплавленного полужидкого 0,7 %\ агара, охлажденного до 46—48 D (пробирка не должна обжигать тыльную сторону кисти .руки), вносят 2 капли 6-ти часовой бульонной культуры исследуемого штамма и после встряхивания смесь наслаивают равномерным слоем в чашку поверх агара с колониями нанесенных ранее колициноген-ных культур. Каждый штамм испытывают на двух чашках.

На крышке записывают номер исследуемого штамма. После 1G—20 часового роста при 37° вокруг колоний, к колицинам которых исследуемый штамм бактерий Зонне чувствителен, образуются зоны задержки роста,— подобно зонам задержки роста вокруг диска с антибиотиками. Культура считается чувствительной к колицину, если ширина зоны задержки роста бактерий составляет более 2 мм. Величину зоны подавления роста измеряют от края м а проколок и к эталонного коли-'циногенного штамма до наружного края зоны и оценивают в плюсах: ширина зоны до 2 мм + , 2—5 мм ++, 5—10 мм + + + и более 10 мм + + + + . Такое обозначение позволяет сравнивать степень чувствительности культур к колицинам. Однако необходимо иметь в виду, что ширина зоны угнетения роста бактерий зависит также от характера питательной среды, концентрации агара: чем плотнее среда, тем медленнее идет процесс диффузии колицнпа в агар вокруг колоний и тем уже зона торможения роста бактерий чувствительного штамма.

Необходимо подчеркнуть, что наслоение чрезмерно густой взвеси бактерий может исказить результаты исследования. В чашке должен быть равномерный, но не чрезмерно густой рост испытуемого штамма.

Результаты типнровання культур записывают в виде характеристики спектра их чувствительности к соответствующим колицинам. Например, штамм Sh. sonnei N2 1210 коли-цинотип: В, Д, F, К, V, S3 + 1; если на обеих чашках спектр чувствительности штамма однотипен, опыт можно считать законченным. При расхождении результатов чувствительности в чашках при изучении одного и того же штамма, исследование повторяют.

Необходимо также учитывать, что наиболее четкие и достоверные результаты колицинотипирования получаются при исследовании свежевыделенных культур и особенно при одновременном испытании культур, полученных из одного очага, т. к. при этом соблюдаются равные условия для всех испытываемых штаммов.

ОРГАНИЗАЦИЯ И МАТЕРИАЛЬНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ

Целесообразно, чтобы постоянное выполнение работы было поручено определенным лицам (врачу и лаборанту), поскольку такая организация исследований способствует повышению их качества и обеспечивает определенную стандартизацию учета результатов исследования, снижая вероятность технических ошибок.

При проведении коЛициногенотнпирования и коЛициноТй-пнровання не требуется специального сложного оборудования.

Помимо термостата, который является обязательным для любых бактериологических исследований, лаборатория, в которой производится колициногенотипироваине, должна иметь холодильник с обычным режимом работы и свертыватель для приготовления среды Дорсэ (см. ниже).

В зависимости от расписания работы лаборатории (пятнили шестидневная рабочая неделя) постановку опытов можно производить один или два раза в неделю в соответствии го схемой типировання, приведенной выше.

Ниже приведен примерный расчет материалов, необходимых для типировання шигелл Зонне (100 штаммов):

Количество материалов, необходимое для колицнногенотипирования 100 штаммов шигелл Зонне

1. Сухой питательный агар Д 100 г

2. Сухой питательный агар 120 г

3. Гидролизат Хоттингера для приготовления

питательного бульона 100 г

4. Хлороформ 100 мл

Условия хранения индикаторного набора Абботта и Шеннона

Индикаторные культуры следует хранить на плотной яичной среде Дорсэ или на столбиках 0,5% питательного агара на гидролизате Хоттингера с содержанием аминного азота 130—150 мг% под слоем стерильного вазелинового масла.

Среду Дорсэ готовят по следующей прописи:

3 части — цельные куриные яйца и 1 часть физиологического раствора поваренной соли смешивают до гомогенного состояния в стерильной посуде с бусами, разливают по 3—4 мл в стерильные пробирки с ватными пробками и стерилизуют в свертывателе в скошенном положении при 85° два дня

Заместитель начальника Главного санитарно-эпидемиологического Управления М3 СССР

В. ПОПОВ 10 марта 1971 г.

МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ Внутривидовое типирование дизентерийных бактерий Зонне по колициногенности и колициночувствительности

В этнологической структуре бактериальной дизентерии на большей части территории Советского Союза преобладают в настоящее время заболевания, вызываемые шнгеллами Зонне. В связи с отсутствием методов серологического типи-ровання данных возбудителей весьма актуальным является внедрение других методов внутривидового подразделения дизентерийных бактерий Зонне.

Возможность дифференциации возбудителя на достаточное число четко характеризующихся стабильных типов, установление типового состава шигелл Зонне в масштабах страны или на отдельных территориях могут способствовать изучению закономерностей эпидемического процесса дизентерии, углубленному проведению эпидемиологического анализа заболеваемости, уточнению данных эпидемиологического обследования очагов инфекции с целью разработки эффективных противоэпидемических мероприятий.

Согласно литературным данным (Фредерик, 1953, 1960; Аббот и Шеннон, 1958; Папависсилиу с соавт., 1964; Д. Г. Куд-лай с соавт., 1964; Д. Г. Кудлай и В. Г. Лиходед, 1966 и др.), а также результатам собственных исследований составителей настоящих методических материалов, для тнпнрования патогенных энтеробактерий, в том числе шигелл Зонне, могут быть использованы методы, основанные на феномене коли-циногении.

Явление колнциногении было впервые обнаружено Грациа в 1925 г. Колниины — это вещества белковой природы, про*

1 Разработаны Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии Л\ииистерстса здравоохранения СССР.

дуцируемые некоторыми видами бактерий семейства кишечных и тормозящие рост чувствительных к ним культур того же или филогенетически родственного вида бактерий. Колицнны различаются между собой как по спектру действия на чувствительные бактерии, так и по ряду физико-химических свойств. В настоящее время известно 24 типа колнцинов. обозначаемых буквами латинского алфавита А; В1; В2; С; Д; El; Е2; ЕЗ; Е4; G; Н; I; К; L; М; N; О; Р; X; VI; V2; V3; V4; V5.

Бактериальная клетка, как правило, бывает резистентна (иммунна) к действию колицина того типа, который она сама вырабатывает.

Способностью к колицинопродукции обладают не все бактерии семейства кишечных: не все культуры являются также колициночувствительнымн. В связи с этим внутривидовое тн-пированне бактерий на основе феномена колициногенни целесообразно только для тех видов, у которых эти свойства выражены в достаточной степени. К таким видам относятся кишечные палочки, шнгеллы Зонне, Флекснера, Ньюкасл, Бойда •и др.

Колициногенность отмечается у 60—95% выделяемых штаммов шигелл Зонне; чувствительны к колнцинам— 90— 95% этих бактерий.

В процессе роста колицнногенного штамма колицин диффундирует в окружающую питательную среду. Присутствие колнцина в среде может быть выявлено с помощью так называемых универсальных индикаторных штаммов, чувствительных ко всем или подавляющему большинству известных колнцинов. Наиболее часто с этой целью употребляют индикаторные штаммы Е. coli 1

При получении коллекции колициногенных эталонных культур нх отвивают в столбики 1,5% мясо-пептонного агара и хранят под вазелиновым маслом в рефрижераторе. Одновременно субкультуры испытывают на способность к продукции колнцинов по их действию на универсальные индикаторные штаммы Е. toli 2

Род Shigella включает более 40 серотипов. Они представляют из себя короткие неподвижные грамотрицательные палочки, не образующие спор и капсул, которые хорошо растут на обычных питательных средах, не растут на голодной среде с цитратом или малонатом в качестве единственного источника углерода; не образуют H2S, не имеют уреазы; реакция Фогеса-Проскауэра отрицательна; глюкозу и некоторые другие углеводы ферментируют с образованием кислоты без газа (кроме некоторых биотипов Shigella flexneri: S. manchester и S. newcastle); как правило, не ферментируют лактозу (за исключением шигелл Зонне), адонит, салицин и инозит, не разжижают желатин, обычно образуют каталазу, не имеют лизин-декарбоксилазы и фенилаланиндезаминазы. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 49-53 мол %. Шигеллы — факультативные анаэробы, температурный оптимум для роста 37 °С, при температуре выше 45 °С не растут, оптимальная рН среды 6,7-7,2. Колонии на плотных средах — круглые, выпуклые, полупрозрачные, в случае диссоциации образуются шероховатые колонии R-формы. Рост на МПБ в виде равномерного помутнения, шероховатые формы образуют осадок. Свежевыделенные культуры шигелл Зонне обычно образуют колонии двух типов: мелкие круглые выпуклые (I фаза), крупные плоские (II фаза). Характер колонии зависит от наличия (I фаза) или отсутствия (II фаза) плазмиды с м. м. 120 МД, которая определяет также вирулентность шигелл Зонне.

Международная классификация шигелл построена с учетом их биохимических признаков (маннит-неферментирующие, маннит-ферментирующие, медленно ферментирующие лактозу шигеллы) и особенностей антигенной структуры.

Шигеллы имеют различные по специфичности О-антигены: общие для семейства Enterobacteriaceae, родовые, видовые, групповые и типоспецифические, а также К-антигены; Н-антигенов у них нет.

В классификации учитываются только групповые и типоспецифические О-антигены. В соответствии с этими признаками род Shigella подразделяется на 4 подгруппы, или 4 вида, и включает 44 серотипа. В подгруппу А (вид Shigella dysenteriae) включены шигеллы, не ферментирующие маннита. Вид включает в себя 12 серотипов (1-12). Каждый серотип имеет свой особый типовой антиген; антигенные связи между серотипами, а также с другими видами шигелл выражены слабо. К под группе В (вид Shigella flexneri) относятся шигеллы, обычно ферментирующие маннит. Шигеллы этого вида серологически родственны друг другу: они содержат типоспецифические антигены (I-VI), по которым подразделяются на серотипы (1-6/' и групповые антигены, которые обнаруживаются в разных составах у каждого серотипа и по которым серотипы подразделяются на подсеротипы. Кроме того, этот вид включает два антигенных варианта — X и Y, у которых нет типовых антигенов, они различаются по наборам групповых антигенов. Серотип S.flexneri 6 не имеет подсеротипов, но его разделяют на 3 биохимических типа по особенностям ферментации глюкозы, маннита и дульцита.

Липополисахаридный антиген О у всех шигелл Флекснера содержит групповой антиген 3, 4 как главную первичную структуру, его синтез контролируется хромосомным геном, локализованным около his-локуса. Типоспецифические антигены I, II, IV, V и групповые антигены 6, 7, 8 являются результатом модификации антигенов 3, 4 (гликозилирования или ацетилирования) и определяются генами соответствующих конвертирующих профагов, место интеграции которых располагается в районе lac-pro хромосомы шигелл.

Появившийся на территории страны в 80-х гг. XX в. и получивший широкое распространение новый подсеротип S.flexneri 4 (IV:7, 8) отличается от подсеротипа 4а (IV;3,4) и 4b (IV:3, 4, 6), возник из варианта S.flexneri Y (IV:3, 4) вследствие лизогенизации его конвертирующими профагами IV и 7, 8.

К подгруппе С (вид Shigella boydix) относятся шигеллы, обычно ферментирующие маннит. Члены группы серологически отличаются друг от друга. Антигенные связи внутри вида выражены слабо. Вид включает 18 серотипов (1-18), каждый из которых имеет свой главный типовой антиген.

В подгруппу D (вид Shigella sonnet) включены шигеллы, обычно ферментирующие маннит и способные медленно (через 24 ч инкубации и позже) ферментировать лактозу и сахарозу. Вид 5. sonnei включает один серотип, однако колонии I и II фаз обладают своими типоспецифическими антигенами. Для внутривидовой классификации шигелл Зонне предложено два метода:

деление их на 14 биохимических типов и подтипов по способности ферментировать мальтозу, рамнозу и ксилозу;

деление на фаготипы по чувствительности к набору соответствующих фагов.

Эти способы типирования имеют главным образом эпидемиологическое значение. Кроме того, шигеллы Зонне и шигеллы Флекснера с этой же целью подвергают типированию по способности синтезировать специфические колицины (колицино-генотипирование) и по чувствительности к известным колицинам (колицинотипирование). Для определения типа продуцируемых шигеллами колицинов Дж. Абботом и Р. Шеноном предложены наборы типовых и индикаторных штаммов шигелл, а для определения чувствительности шигелл к известным типам колицинов используют Набор эталонных колициногенных штаммов П. Фредерика.

Возбудителями собственно дизентерии является большая группа биологически сходных бактерий , объединенных в род Shigella. Впервые возбудитель был обнаружен в 1888 г. А. Шантемесом и Ф. Видалем; в 1891 г. он был описан А. В. Григорьевым, а в 1898 г. К. Шига с помощью полученной им от больного сыворотки идентифицировал возбудителя у 34 больных дизентерией , окончательно доказав этиологическую роль этой бактерии . Однако в последующие годы были обнаружены и другие возбудители дизентерии : в 1900 г. — С. Флекснером, в 1915 г. — К. Зонне, в 1917 г. — К. Штуцером и К. Шмитцем, в 1932 г. — Дж. Бойдом, в 1934 г. — Д. Ларджем, в 1943 г. — А. Саксом.

Резистентность шигелл

Шигеллы обладают достаточно высокой устойчивостью к факторам внешней среды. Они выживают на хлопчатобумажной ткани и на бумаге до 0-36 дней, в высохших испражнениях — до 4-5 мес, в почве — до 3-4 мес, в воде — от 0,5 до 3 мес, на фруктах и овощах — до 2 нед., в молоке и молочных продуктах — до нескольких недель; при температуре 60 С погибают через 15-20 мин. Чувствительны к растворам хлорамина, активному хлору и другим дезинфектантам.

Важнейшее биологическое свойство шигелл, обусловливающее их патогенность, — способность внедряться в эпителиальные клетки, размножаться в них и вызывать их гибель. Этот эффект может быть обнаружен с помощью кератоконъюнктивальной пробы (введение под нижнее веко морской свинки одной петли культуры шигелл (2-3 млрд бактерий) вызывает развитие серозно-гнойного кератоконъюнктивита), а также путем заражения культур клеток (цитотоксическое действие) или куриных эмбрионов (их гибель), или интраназально белых мышей (развитие пневмонии). Основные факторы патогенности шигелл можно разбить на три группы:

факторы, определяющие взаимодействие с эпителием слизистой оболочки;

факторы, обеспечивающие устойчивость к гуморальным и клеточным механизмам защиты макроорганизма и способность шигелл размножаться в его клетках;

способность продуцировать токсины и токсические продукты, которые обусловливают развитие собственно патологического процесса.

Первая группа включает в себя факторы адгезии и колонизации: их роль выполняют пили, белки наружной мембраны и ЛПС. Адгезии и колонизации способствуют ферменты, разрушающие слизь, — нейраминидаза, гиалуронидаза, муциназа. Вторая группа включает факторы инвазии, которые способствуют проникновению шигелл в энтероциты и их размножению в них и в макрофагах с одновременным проявлением цитотоксического и (или) энтеротоксического эффекта. Эти свойства контролируются генами плазмиды с м. м. 140 МД (она кодирует синтез белков наружной мембраны, обусловливающих инвазию) и хромосомными генами шигелл: кср А (обусловливает кератоконъюнктивит), cyt (отвечает за разрушение клеток), а также другими генами, еще не идентифицированными. Защита шигелл от фагоцитоза обеспечивается поверхностным К-антигеном, антигенами 3,4 и липополисахаридом. Кроме того, липид А эндотоксина шигелл обладает иммуносупрессивным действием: подавляет активность клеток иммунной памяти.

К третьей группе факторов патогенности относятся эндотоксин и обнаруженные у шигелл два типа экзотоксинов — экзотоксины Шига и шигаподобные (SLT-I и SLT-II), цитотоксические свойства которых наиболее сильно выражены у S. dysenteriael. Шига- и шигаподобные токсины обнаружены и у других серотипов S. dysenteriae, их образуют также S.flexneri, S. sonnei, S. boydii, EHEC и некоторые сальмонеллы. Синтез этих токсинов контролируется tox-генами конвертирующих фагов. Энтеротоксины типа LT обнаружены у шигелл Флекснера, Зонне и Бойда. Синтез LT у них контролируется плазмидными генами. Энтеротоксин стимулирует активность аденилатциклазы и отвечает за развитие диареи. Токсин Шига, или неиротоксин, не реагирует с аденилатциклазной системой, а оказывает прямое цитотоксическое действие. Токсины Шига и шигаподобные (SLT-I и SLT-II) имеют м.м. 70 кД и состоят из субъединиц А и В (последние из 5 одинаковых малых субъединиц). Рецептором для токсинов служит гликолипид мембраны клетки. Вирулентность шигелл Зонне зависит также от плазмиды с м. м. 120 МД. Она контролирует синтез около 40 полипептидов наружной мембраны, семь из них связаны с вирулентностью. Шигеллы Зонне, имеющие эту плазмиду, образуют колонии I фазы и обладают вирулентностью. Культуры, утратившие плазмиду, образуют колонии II фазы и лишены вирулентности. Плазмиды см. м. 120-140 МД обнаружены у шигелл Флекснера и Бойда. Липополисахарид шигелл является сильным эндотоксином.

Как показали наблюдения над обезьянами, после перенесенной дизентерии остается прочный и достаточно длительный иммунитет. Он обусловлен антимикробными антителами, антитоксинами, повышением активности макрофагов и Т-лимфоцитами. Значительную роль играет местный иммунитет слизистой оболочки кишечника, опосредуемый IgAs. Однако иммунитет носит типоспецифический характер, прочного перекрестного иммунитета не возникает.

Источником инфекции является только человек. Никакие животные в природе дизентерией не болеют. В экспериментальных условиях дизентерию удается воспроизвести только у обезьян. Способ заражения — фекально-оральный. Пути передачи — водный (преобладающий для шигелл Флекснера), пищевой, особенно важная роль принадлежит молоку и молочным продуктам (преобладающий путь заражения для шигелл Зонне), и контактно-бытовой, особенно для вида S. dysenteriae.

Особенностью эпидемиологии дизентерии является смена видового состава возбудителей, а также биотипов Зонне и серотипов Флекснера в определенных регионах. Например, до конца 30-х гг. XX в. на долю S. dysenteriae 1 приходилось до 30- 40 % всех случаев заболеваний дизентерией, а затем этот серотип стал встречаться все реже и реже и почти исчез. Однако в 1960-1980-е гг. S. dysenteriae вновь появилась на исторической арене и вызвала серию эпидемий, которые привели к формированию трех гиперэндемических очагов ее — в Центральной Америке, Центральной Африке и Южной Азии (Индия, Пакистан, Бангладеш и другие страны). Причины смены видового состава возбудителей дизентерии, вероятно, связаны с изменением коллективного иммунитета и с изменением свойств дизентерийных бактерий. В частности, возвращение S. dysenteriae 1 и широкое распространение ее, послужившее причиной формирования гиперэндемических очагов дизентерии, связывают с приобретением ею плазмид, обусловивших множественную лекарственную устойчивость и повышенную вирулентность.

Инкубационный период дизентерии 2-5 дней, иногда меньше суток. Формирование инфекционного очага в слизистой оболочке нисходящего отдела толстого кишечника (сигмовидная и прямая кишка), куда проникает возбудитель дизентерии, носит циклический характер: адгезия, колонизация, внедрение шигелл в цитоплазму энтероцитов, их внутриклеточное размножение, разрушение и отторжение эпителиальных клеток, выход возбудителей в просвет кишечника; вслед за этим начинается очередной цикл — адгезия, колонизация и т. д. Интенсивность циклов зависит от концентрации возбудителей в пристеночном слое слизистой оболочки. В результате повторяющихся циклов воспалительный очаг разрастается, образующиеся язвы, соединяясь, увеличивают обнаженность кишечной стенки, вследствие чего в испражнениях появляются кровь, слизисто-гнойные комочки, полиморфно-ядерные лейкоциты. Цитотоксины (SLT-I и SLT-II) обусловливают разрушение клеток, энтеротоксин — диарею, эндотоксины — общую интоксикацию. Клиника дизентерии во многом определяется тем, какой тип экзотоксинов в большей степени продуцируется возбудителем, степенью его аллергизирующего воздействия и иммунным статусом организма. Однако многие вопросы патогенеза дизентерии остаются еще не выясненными, в частности: особенности течения дизентерии у детей первых двух лет жизни, причины перехода острой дизентерии в хроническую, значение сенсибилизации, механизм местного иммунитета слизистой кишечника и др. Наиболее типичными клиническими проявлениями дизентерии служат понос, частые позывы: в тяжелых случаях до 50 и более раз в сутки, тенезмы (болезненные спазмы прямой кишки) и общая интоксикация. Характер стула определяется степенью поражения толстого кишечника. Наиболее тяжело протекает дизентерия, вызванная S. dysenteriae 1, наиболее легко — дизентерия Зонне.

Основной метод — бактериологический. Материалом для исследования служат испражнения. Схема выделения возбудителя: посев на дифференциально-диагностические среды Эндо и Плоскирева (параллельно на среду обогащения с последующим посевом на среды Эндо, Плоскирева) для выделения изолированных колоний, получение чистой культуры, изучение ее биохимических свойств и, с учетом последних, идентификация при помощи поливалентных и моновалентных диагностических агглютинирующих сывороток. Выпускают следующие коммерческие сыворотки.

К шигеллам, не ферментирующим маннит:

к S. dysenteriae 1 и 2 (поливалентные и моновалентные),

к S. dysenteriae 3-7 (поливалентные и моновалентные),

к S. dysenteriae 8-12 (поливалентные и моновалентные).

К шигеллам, ферментирующим маннит: к типовым антигенам S. flexneri I, II, III, IV, V, VI, к групповым антигенам S.flexneri 3, 4, 6,7,8 — поливалентная, к антигенам S. boydii 1-18 (поливалентная и моновалентные), к антигенам S. sonnei I фазы, II фазы, к антигенам S. flexneri I-VI + S. sonnei — поливалентная.

Для быстрой идентификации шигелл рекомендуется следующий метод: подозрительную колонию (лактозонегативная на среде Эндо) пересевают на среду TSI (англ. triple sugar iron) — трехсахарный агар (глюкоза, лактоза, сахароза) с железом для определения продукции H2S; или на среду, содержащую глюкозу, лактозу, сахарозу, железо и мочевину.

Любой организм, который расщепляет мочевину через 4- 6 ч инкубирования, вероятнее всего, относится к роду Proteus и может быть исключен. Микроорганизм, образующий H,S или имеющий уреазу, или образующий кислоту на косячке (ферментирует лактозу или сахарозу), может быть исключен, хотя штаммы, образующие H2S, должны быть исследованы как возможные члены рода Salmonella. Во всех других случаях культура, выросшая на этих средах, должна быть исследована и, если ферментирует глюкозу (изменение цвета столбика), выделена в чистом виде. Одновременно она может быть исследована в реакции агглютинации на стекле с соответствующими антисыворотками к роду Shigella. При необходимости проводят другие биохимические тесты, проверяющие принадлежность к роду Shigella, а также изучают подвижность.

Для обнаружения антигенов в крови (в том числе в составе ЦИК), моче и испражнениях могут быть использованы следующие методы: РПГА, РСК, реакция коагглютинации (в моче и испражнениях), ИФМ, РАГА (в сыворотке крови). Эти методы высокоэффективны, специфичны и пригодны для ранней диагностики.

Для серологической диагностики могут быть использованы: РПГА с соответствующими эритроцитарными диагностикумами, иммунофлуоресцентный метод (в непрямой модификации), метод Кумбса (определение титра неполных антител). Диагностическое значение имеет также аллергическая проба с дизентерином (раствор белковых фракций шигелл Флекснера и Зонне). Реакцию учитывают через 24 ч. Она считается положительной при наличии гиперемии и инфильтрата диаметром 10-20 мм.

Основное внимание уделяется восстановлению нормального водно-солевого обмена, рациональному питанию, дезинтоксикации, рациональной антибиотикотерапии (с учетом чувствительности возбудителя к антибиотикам). Хороший эффект дает раннее применение поливалентного дизентерийного бактериофага, особенно таблетированного с пектиновым покрытием, которое предохраняет фаг от действия НС1 желудочного сока; в тонком кишечнике пектин растворяется, фаги освобождаются и проявляют свое действие. С профилактической целью фаг следует давать не реже одного раза в три дня (срок его выживания в кишечнике).

Для создания искусственного иммунитета против дизентерии были использованы различные вакцины: из убитых бактерий, химические, спиртовая, но все они оказались малоэффективными и сняты с производства. Созданы вакцины против дизентерии Флекснера из живых (мутантных, стрептомицинзависимых) шигелл Флекснера; рибосомальные вакцины, но они также не нашли широкого применения. Поэтому проблема специфической профилактики дизентерии остается нерешенной. Основной путь борьбы с дизентерией заключается в улучшении системы водоснабжения и канализации, обеспечении строгих санитарно-гигиенических режимов на предприятиях пищевой, в особенности молочной промышленности, в детских учреждениях, местах общественного пользования и в соблюдении личной гигиены.

АЮРВЕДА ИЗ ИНДИИ ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ И КРАСОТЫ ПО МИНИМАЛЬНЫМ ЦЕНАМ! БОЛЬШОЙ АССОРТИМЕНТ В НАЛИЧИИ И ПОД ЗАКАЗ

Читайте также:

Внутривидовое типирование дизентерийных бактерий зонне

Оглавление

Резистентность шигелл