Типовые стафилококковые бактериофаги способ получения

Стерильный очищенный фильтрат фаголизатов бактерий рода Staphylococcus (с активностью по Аппельману - не менее 10 -5 ) - до 1 мл.

Представляет собой прозрачную жидкость желтого цвета различной интенсивности, возможен зеленоватый оттенок.

Препарат вызывает специфический лизис бактерий Staphylococcus.

Лечение и профилактика гнойно-воспалительных и энтеральных заболеваний, вызванных бактериями рода Staphylococcus у взрослых и детей:

заболевания уха, горла, носа, дыхательных путей и легких (воспаления пазух

носа, среднего уха, ангина, фарингит, ларингит, трахеит, бронхит, пневмония, плеврит);

хирургические инфекции (нагноения ран, ожоги, абсцесс, флегмона, фурункулы, карбункулы, гидроаденит, панариции, парапроктит, мастит, бурсит, остеомиелит);

урогенитальные инфекции (уретрит, цистит, пиелонефрит, кольпит, эндометрит, сальпингоофорит);

энтеральные инфекции (гастроэнтероколит, холецистит), дисбактериоз кишечника;

генерализованные септические заболевания;

гнойно-воспалительные заболевания новорожденных (омфалит, пиодермия, конъюнктивит, гастроэнтероколит, сепсис и др.);

другие заболевания, вызванные стафилококками.

При тяжелых проявлениях стафилококковой инфекции препарат назначается в составе комплексной терапии.

С профилактической целью препарат используют для обработки послеоперационных и свежеинфицированных ран, а также для профилактики внутрибольничных инфекций по эпидемическим показаниям.

Важным условием эффективной фаготерапии является предварительное определение чувствительности возбудителя к бактериофагу и раннее применение препарата.

Индивидуальная непереносимость или чувствительность к любому из компонентов препарата.

Целесообразно применение препарата при наличии инфекций, вызванных фагочувствительными штаммами стафилококков (по рекомендации врача).

Препарат используют для приема внутрь (через рот), ректального введения, аппликаций, орошений, введения в полости ран, вагины, матки, носа, пазух носа и дренированные полости. Перед употреблением флакон с бактериофагом необходимо взболтать и просмотреть. Препарат должен быть прозрачным и не содержать осадка.

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Нифонтова В.В., Чугунова Е.О.

Дано описание процесса выделения бактериофагов из патологического материала, получения фаголизата и применение его для лечения гнойного отита у собаки. Известно, что в настоящее время появляются антибиотикорезистентные штаммы микроорганизмов и бактериофаги могут служить альтернативным источником антибактериальных средств терапии. В рамках данного исследования объектом служила собака породы кокер спаниель, страдающая гнойным отитом. Стандартное лечение, направленное на подавление патогенной микрофлоры, результатов не дало, микрофлора гнойного экссудата in vitro оказалась нечувствительной к антибиотикам. Асептически собрав гнойный экссудат, мы провели индикацию и идентификацию микрофлоры, а затем выделили из данного патологического материала стафилококковый и протейный бактериофаги . На следующем этапе исследований определили чувствительность и специфичность фаголизата к соответствующей микрофлоре, а также установили титр бактериофагов по методу Аппельмана и Грациа. После лабораторных испытаний полученного фаголизата перешли к фаготерапии гнойного отита, которая оказала терапевтический эффект в течение трех дней.

OBTAINING BACTERIOPHAGES AND APPLICATION IN VETERINARY

The article shows the process of extracting bacteriophages from pathological material, obtaining bacteriophages drug and using phagotherapy for therapy of purulent otitis in dogs. It is known that there are antibiotic-resistant strains of microorganisms and bacteriophages can be an alternative source of antibacterial means of therapy. A cocker spaniel having purulent otitis served as the object of our research. Standard treatment directed at suppression of pathogenic microflora didn't show any results, the microflora of purulent effluent in vitro was not sensitive to antibiotics. Purulent effluent was collected aseptically, and after indication and identification of its microflora, then we allocated Staphylococcus and Proteus bacteriophages from this pathological material. At the next stage of research we determined sensitivity and specificity of bacteriophages to the corresponding microflora, and also bacteriophages titer using Appelman and Gratsia method. After laboratory testing of phagolysate, phagotherapy was applied to purulent otitis and showed therapeutic effect within three days.

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА 2/2015

В.В. Нифонтова, Пермская государственная сельскохозяйственная академия им. акад. Д.Н. Прянишникова

Е.О. Чугунова, Пермская государственная сельскохозяйственная академия им. акад. Д.Н. Прянишникова

Дано описание процесса выделения бактериофагов из патологического материала, получения фаголизата и применение его для лечения гнойного отита у собаки. Известно, что в настоящее время появляются антибиотикорезистент-ные штаммы микроорганизмов и бактериофаги могут служить альтернативным источником антибактериальных средств терапии. В рамках данного исследования объектом служила собака породы кокер спаниель, страдающая гнойным отитом. Стандартное лечение, направленное на подавление патогенной микрофлоры, результатов не дало, микрофлора гнойного экссудата in vitro оказалась нечувствительной к антибиотикам. Асептически собрав гнойный экссудат, мы провели индикацию и идентификацию микрофлоры, а затем выделили из данного патологического материала стафилококковый и протейный бактериофаги. На следующем этапе исследований определили чувствительность и специфичность фаголизата к соответствующей микрофлоре, а также установили титр бактериофагов по методу Аппельмана и Грациа. После лабораторных испытаний полученного фаголизата перешли к фаготерапии гнойного отита, которая оказала терапевтический эффект в течение трех дней.

Ключевые слова: гноеродные микроорганизмы, бактериофаги, титр по методу Аппельмана и Грациа.

Бактериофаг - ультрамикроскопический, внутриклеточный облигатный паразит-вирус, лизирующий бактерии и акти-номицеты. Впервые явление бактериофагии наблюдал в 1898 г. Н.Ф. Гамалея, позднее - Туорт в 1915 г. и д'Эррелль в 1917 г. [4]. Бактериофагу присущи наследственность, изменчивость, приспособляемость и другие свойства вирусов. Они несут всю информацию, необходимую для процесса их репродукции в соответствующих клетках, но не имеют собственного механизма для генерации энергии и рибосом для синтеза белков. Корпускулы бактериофагов имеют форму

сперматозоидов, состоят из сферической, цилиндрической или многогранной головки и короткого или длинного, прямого или изогнутого отростка. Каждая фаговая частица (вирион) содержит геном, представленный молекулой ДНК или РНК, заключенный в белковую или липопротеи-новую оболочку (капсид), которые вместе формируют нуклеокапсид. В отростке фаговой корпускулы имеется футляр и центрально расположенный стерженек белковой природы, так хвостовой отросток напоминает иглу для шприца. На конце отросток имеет утолщение в виде пластинки, от которого отходят белковые ни-

ти диаметром не более 2 миллимикронов [2, 4]. Размер различных фагов колеблется от 0,1 мкм в диаметре до 20 мкм [1], хвост фага в 1,5 раза длиннее головы и в 4 раза тоньше [4].

Бактериофаги широко распространены в природе. Почти везде, где условия обитания благоприятны для размножения бактерий и актиномицетов, удается обнаружить паразитирующие в их клетках бактериофаги. Они поражают более 140 различных родов бактерий [2, 6]. Их можно обнаружить в организмах животных, а также в желудочно-кишечном тракте, на коже и слизистых человека, таким образом, фаги - нормальные симбионты тела человека [4]. С.В. Цыганова (2009) для выделения бактериофагов методом обогащения в качестве источников фагов использовала внутренние органы гусей и сточные воды птицехозяйства. Таким образом, выделить бактериофаг можно из различных материалов, где могли раньше или в данный момент присутствовать бактерии, на которых выделенный фаг размножается. При отсутствии подходящих хозяев многие фаги могут сохранять способность к инфицированию десятилетиями, если не будут повреждены внешними агентами [2].

В литературе имеются сообщения, свидетельствующие о положительном лечебно-профилактическом действии препаратов бактериофагов при использовании их во время эпидемии холеры, при дизентерии и других желудочно-кишечных болезнях. Фаги применяют в хирургической и акушерско-гинекологической практике.

Отдельные попытки использования различных бактериофагов при инфекционных болезнях животных были предприняты в 20-30-х годах. Д'Эрелль (1928, 1935) пытался использовать фаги при пуллорозе-тифе у кур.

И.Ф. Квеситадзе (1957) применил бактериофаг для лечения 6 000 больных сальмонеллёзом телят. Эффективность фаготерапии сальмонеллёзных телят в отдельных хозяйствах достигала 90-100 %.

К.Н. Шерстобаев (1949) использовал

бактериофаг для лечения и профилактики колибактериоза поросят. При лечении 4 964 поросят было отмечено выздоровление у 95,6 % животных.

И.Л. Бирюков и Р.К. Петренко (1958) сообщили, что дача цыплятам пуллорум-фага предохраняла их от пуллороза на 90 % в лабораторных и до 80 % в производственных условиях [3].

С открытием и развитием антибиотиков бактериофаги были незаслуженно забыты. Однако в настоящее время на фоне появления антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов бактериофаги могут служить альтернативным источником антибактериальных средств терапии.

Цель исследования - получить бактериофаги для лечения гнойного отита у собак.

1) произвести отбор патологического материала (экссудат из среднего и наружного уха) от больного животного;

2) определить состав микрофлоры в полученном экссудате;

3) выделить бактериофаги из патологического материала и установить их ли-тическую активность в отношении соответствующих микроорганизмов;

4) провести фаготерапию полученным фаголизатом.

Материалы и методы исследования

Объект исследования - собака породы американский кокер спаниель, страдающая отитом наружного и среднего уха.

Материалом для исследования служили: экссудат из ушей, собранный асептически стерильным инструментом в стерильную одноразовую емкость; выделенные из экссудата микроорганизмы и полученные к ним бактериофаги. Метод исследования - бактериологический.

Для выделения фага исследуемый материал высевали на мясопептонный агар (МПА) в чашки Петри и на селективные питательные среды, инкубировали при 37 °С и через 24 часа получали колонии

новым наполнителем и диаметром пор 0,22 мкм (рис. 1). Фаголизат собирали в стерильные одноразовые пробирки в условиях ламинарного бокса.

В результате инкубации посеянного на мясопептонный агар экссудата получили гладкие, выпуклые, с желтоватым пигментом колонии стафилококков; единичные мелкие серые колонии стрептококков и протей, который занимал 70-75 % площади чашки Петри. При этом отмечен характерный гнилостный запах и феномен роения протея.

Для селективного обогащения стафилококков использовали солевой бульон (МПБ с 6,5 % №С1). Через 24 часа после инкубирования при 37 °С произвели пересев на желточно-солевой агар, электив-ность которого обеспечивается высоким содержанием хлористого натрия, а добавленный яичный желток позволяет выявлять лецитовителлазную активность, которая является одним из показателей пато-генности стафилококков. После 18 часов инкубации получили рост колоний, морфологически похожих на золотистый стафилококк (рис. 2), поэтому продолжили исследование и пересеяли типичные колонии на скошенный мясопептонный агар для последующей проверки выросших культур в реакции плазмокоагуляции. На

Рис. 2. Колонии золотистого стафилококка на желточно-солевом агаре

следующий день поставили реакцию с плазмой крови кролика, которая дала положительный результат и подтвердила наличие S. aureus в исследуемом экссудате.

Учитывая результаты идентификации возбудителей, решили выделить бактериофаги к золотистому стафилококку и протею. После стандартной процедуры очистки фаголизата от бактерий и их частиц определяли чувствительность, специфичность и титр полученных бактериофагов.

+++ наличие стерильного пятна и зон лизиса.

Таким образом, видно, что полученные нами фаголизаты проявляют специфичность и чувствительность в отношении соответствующих бактерий. Наиболее выраженное и крупное стерильное пятно получено для Proteus vulgaris (рис. 3).

Далее необходимо было определить ак-

тивность полученных бактериофагов и установить их титр по Аппельману и Грациа.

Для определения титра по методу Ап-пельмана использовали 12 пробирок с 4,5 мл мясопептонного бульона в каждой. В первую пробирку внесли 0,5 мл исследуемого фага, содержимое пробирки тщательно перемешали. Из этой пробирки 0,5 мл перенесли в следующую и т.д., приготовив ряд 10-кратных разведений фага (10-1-10-10). В каждую пробирку приготовленного ряда внесли по одной капле соответствующей бульонной культуры. Пробирки №№ 11, 12 служили контролем, в одну из них внесли 0,5 мл исследуемого фага (контроль на отсутствие бактерий в исследуемом фаге), в другую пробирку - одну каплю микробной культуры (контроль культуры). Все пробирки поместили в термостат на 18 ч. Титр фага определяли по наибольшему разведению препарата, в котором была обнаружена литическая активность. В итоге получили титр 10-7 для стафилококкового бактериофага и 10-8 для протейного.

Далее определяли титр данных фаголи-затов методом агаровых слоев по Грациа, используя разведения бактериофагов, показавших титр по Аппельману от 10-6 до 10-10. В чашки Петри заливали 0,5 %-ный МПА с генцианвиолетом (0,1 мл 0,4 %-но-го генцианвиолета на 1 дм3 среды) и подсушивали в термостате до полного удаления конденсата. Затем 0,7 %-ный МПА в пробирках по 2,5 мл в каждой расплавляли на водяной бане и охлаждали до 48-50 °С, вносили 0,1 мл 1-миллиардной взвеси соответствующей суточной агаровой культуры и добавляли 1 мл соответствующего разведения исследуемого бактериофага, тщательно перемешивали вращательными движениями и содержимое пробирки вы-

Результаты определения чувствительности и специфичности фаголизатов

Вид микроорганизмов Фаголизат к St. aureus Фаголизат к протею Контроль

Рис. 3. Стерильное пятно протейного фага

ливали в чашку Петри с МПА (вторым слоем). Смесь равномерно распределяли по поверхности агара и оставляли чашку в горизонтальном положении на 40-50 мин, то есть до полного охлаждения агара. Затем чашки слегка подсушили и инкубировали в термостате при 37 °С в течение 18-20 ч. На следующий день на фоне равномерного роста микробов отмечали негативные колонии, обусловленные лизисом микробной культуры в результате действия бактериофага (рис. 4).

Таким образом, допуская, что каждый участок лизиса образовался в результате действия одной корпускулы фага, мы рассчитали количество активных корпускул фага в 1 мл препарата и получили титр протейного бактериофага по Грациа 15*108 или 1,5*109. Данный титр стафилококкового фагового препарата оказался на порядок ниже и составил 8*106.

Полученные фаголизаты объединили в стерильную одноразовую пробирку и обрабатали уши собаки созданным бакте-риофаговым препаратом. Терапевтиче-

ский эффект был отмечен уже в первые сутки после обработки, количество экссудата резко снизилось, исчез неприятный запах из ушей. Через три дня гнойные истечения из ушных раковин прекратились, т.е. был достигнут лечебный результат.

Полученные нами фаголизаты проявили специфичность и чувствительность в отношении St. aureus, Proteus vulgaris и Proteus mirabilis. Наиболее выраженное и крупное стерильное пятно получено для Proteus vulgaris. Двумя способами установлены титры бактериофагов: по Ап-пельману получили титр 10-7 для стафилококкового бактериофага и 10-8 для протейного; по Грациа - 8*106 и 1,5*109 соответственно. Фаготерапия показала высокий терапевтический эффект, который был достигнут за три дня.

Рис. 4. Результаты титрования протейного фага по методу агаровых слоев

1. Адамс М. Бактериофаги / пер. с англ. Т. С. Ильиной и др. - М.: Иностр. лит., 1961. - 527 с.

2. Бактериофаги: биологическое и практическое применение / под ред. Э. Каттер, А. Сулаквелидзе / пер. с англ.; науч. ред. А.В. Летаров. - М.: Научный мир, 2012. - 640 с.

3. Фаги листерий и их практическое применение: учебное пособие / И.А. Бакулов, Т.И. Кольпикова, Д.А. Васильев [и др.]. - Ульяновская ГСХА, 1998. - 33 с.

4. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии. - М.: Медгиз, 1958. - 347 с.

5. Цыганова С.В. Выделение бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц и изучение их биологических свойств: автореф. дис. . канд. вет. наук. - СПб. - 2009. - 23 с.

6. Ackerman H. W. Freguency of morphological phage descriptions // Arch. Virol. - 2001. - № 146. - P. 843-857.

OBTAINING BACTERIOPHAGES AND APPLICATION IN VETERINARY

B.B. Nifontova, E.O. Chugunova

Perm Agricultural Academy

Keywords: pyogenic microorganisms, bacteriophages, the titer of bacteriophages by Appelman's and Gratsia's method.

Презентация была опубликована 3 года назад пользователемИнна Токарева

Презентация на тему: " Лекция Промышленное производство бактериофагов. Бактериофаги или фаги (от латинского bakteriophage – разрушающий бактерии) – вирусы, обладающие способностью." — Транскрипт:

1 Лекция Промышленное производство бактериофагов

2 Бактериофаги или фаги (от латинского bakteriophage – разрушающий бактерии) – вирусы, обладающие способностью проникать в бактериальные клетки, репродуцироваться в них и вызывать их лизис. Однако выделен такой литический агент был лишь в 1917 г. д'Эреллем. Это был бактериофаг, специфичный для палочки дизентерии Григорьева-Шига. В х годах бактериофаги заняли заслуженное место среди других лечебно- профилактических препаратов. Феномен бактериофагии впервые наблюдал в 1898 г. Н.Ф.Гамалея. Он установил, что густая взвесь сибиреязвенных микроорганизмов в дистиллированной воде в известных условиях может просветляться. Просветленная вода приобретала способность растворять свежую культуру сибиреязвенных микроорганизмов.

3 Фаги различаются по химической структуре, типу нуклеиновых кислоты, морфологии и характеру взаимодействия с микробной клеткой. Бактериофаги специфичны для различных видов бактерий. По степени специфичности фаги могут быть разделены на три группы: полифаги – активные в отношении нескольких родственных видов, монофаги – лизирующие микроорганизмов одного типа, типовые фаги, способные лизировать только определенные типы данного вида.

4 Классификация бактериофагов В настоящее время еще не разработано единой классификации вирусов вообще и бактериофагов в частности. Практическая необходимость привела к появлению классификаций, в основу которых положены общая морфология частицы (морфотип) и свойства генетического материала. Международный комитет по таксономии вирусов предлагает при классификации использовать свойства вириона и его нуклеиновой кислоты: морфологию и размеры вириона; молекулярную масса частицы, седиментационные свойства, ее плавучую плотность;

5 тип, молекулярную массу, относительную долю, конформацию и состав нуклеиновой кислоты; данные о гибридизации нуклеиновой кислоты; физиологические тесты и тесты на спектр литической активности.

6 Структура и морфология фагов Бактериофаги принадлежат к числу наиболее хорошо известных вирусов. Современные представления о морфологии фагов связаны с изучением их методом электронной микроскопии. Морфология бактериофагов исследовалась преимущественно на Т-фагах Escherichia coli. По форме они сходны со сперматозоидом.

8 В нем можно различить не менее трех частей: полый стержень, окружающий его сократительный чехол и находящуюся на дистальном конце стержня шестиугольной формы базальную пластинку с шестью шипами и шестью нитями (фибриллы). Отросток фага Т-2 имеет особенно сложное строение.

9 От шипов и нитей зависит специфическая адсорбция на клетке-хозяине. Длина хвостового отростка до 250 нм, ширина 20 – 25 нм. Хвостовой отросток предназначен для прикрепления фага к бактериальной клетке. На электронных микрофотографиях препаратов фагов можно видеть фаговые частицы в двух состояниях: у одних частиц головка очень редко выделяется на общем фоне и чехол отростка растянут, у других головка мало отличается от фона по своей электронной плотности и чехол сжат (сократился). Первое состояние характерно для активного фага, в головке которого заключено ДНК, второе для фага, который инъецировал свою ДНК в бактериальную клетку.

10 Химический состав Фаги состоят из белка, на долю которого приходится 50 – 60 %, нуклеиновой кислоты – 40 – 50% и небольшого количества липидов в виде нейтральных жиров (1,7 – 2,6%). Большинство фагов содержит двухцепочечную ДНК, однако обнаружено много фагов с одноцепочечной ДНК или РНК. ДНК фага имеет спиралеобразное строение, характеризуется высокой полярностью и отличается от ДНК бактерий своим нуклеотидным составом. Молекулы ДНК бактериофага Т4

11 Взаимодействие фага с бактериальной клеткой Фаг действует на живые клетки бактерий в процессе их активного роста и не действует на мертвых микроорганизмов. Крайним выражением процесса бактериофагии является лизис бактерий. Наряду с этим при взаимодействии фага и бактерии можно наблюдать самые различные изменения бактерий – от едва заметных морфологических до полного растворения и их гибели. Следовательно, под бактериофагией в широком смысле слова надо понимать не только лизис бактерий, но и всевозможные изменения, вызванные фагом.

12 Процесс взаимодействия фага с микробной клеткой проходит несколько стадий: адсорбция, проникновение в клетку, репродукция и выделение фагов.

13 Резистентность Фаги более устойчивы в воздействию внешних факторов, чем бактерии. Выдерживают нагревание до 75 С, переносят замораживание при -185 С, длительное время сохраняются при высушивании, переносят прямой солнечный свет до 2 – 3 дней, ультрафиолетовые лучи до 10 минут, сохраняют свою активность при рН от 2,5 до 8,5. Несмотря на относительную повышенную резистентность, фаги быстро погибают при кипячении, действии кислот, дезинфицирующих средств.

14 Распространенность фагов в природе Бактериофаги широко распространены в природе повсеместно там, где встречаются бактерии. Бактериофаги могут быть выделены из воды, почвы, молока, их можно обнаружить в организме людей и животных. Свойства фагов лизировать клетки патогенных бактерий было использовано для борьбы с различными заболеваниями. Из бактериофагов стали создавать соответствующие лекарственные средства.

15 Производство бактериофагов. Использование в медицине Для лечения и профилактики ряда инфекций наряду с вакцинами, антибиотиками и другими препаратами применяют вирусы бактерий – бактериофаги, обладающие высокой специфичностью к патогенным и условно- патогенным бактериям. Избирательность их действия значительно выше, чем антибиотиков и других химиотерапевтических средств. Бактериофаги не оказывают влияния на нормальную микрофлору организма человека.

16 Большую группу среди них составляют бактериофаги против кишечных инфекций: дизентерийный, брюшнотифозный, сальмонеллезный, колипротейный. Бактериофаг дизентерийный (Bacteriophagum disentericum) препарат, активный в отношении дизентерийных бактерий Флекснера, Зонне и Ньюкасл, Штуцера Шмитца и Григорьева Шига. Применяют для лечения и профилактики дизентерии. Бактериофаг брюшнотифозный (Bacteriophagum salmonellae typhi) смесь бактериофагов, активных в отношении возбудителей брюшного тифа различных фаготипов. Препарат применяют для предупреждения заболеваний брюшным тифом людей, контактировавших с больным.

17 Бактериофаг стафилококковый (Bacteriophagum staphilococcicum) фильтрат фаголизата стафилококков. Его применяют местно для лечения гнойных заболеваний фурункулеза, гнойно- осложненных ран, абсцессов и др. При кишечных заболеваниях, связанных со стафилококком, бактериофаг вводится через рот или в клизмах подобно кишечным фагам. Развитие резистентных форм бактерий и осложнения, связанные с применением антибиотиков и сульфаниламидных препаратов, привели к широкому спросу на, так называемые, раневые бактериофаги – стафилококковый, стрептококковый, синегнойной палочки, протейный.

18 Бактериофаг стрептококковый (Bacteriophagum streptococcicum) – препарат, активный в отношении штаммов стрептококка различного происхождения. Применяют для лечения и профилактики кожных, хирургических стрептококковых инфекций, при ангине и др. Бактериофаг пиоцианеус (синегнойной палочки) (Bacteriophagum pyocyaneum) – препарат, активный в отношении штаммов синегнойной палочки. Применяют для лечения инфекций различных органов и кожных гнойных инфекций, вызванных синегнойной палочкой.

19 Технологический процесс производства жидких бактериофагов состоит из следующих этапов: подбора штаммов для производства данного вида фага получения маточных бактериофагов приготовления серий жидкого бактериофага контроля готового препарата на стерильность, безвредность и литическую активность, этикетировки и упаковки препарата

20 Рис. Графическая схема технологического процесса производства жидкого бактериофага 1 - пробирка для засева культуры; 2 - бутыль емкостью 3 л для засева культуры; 3 - емкость Боброва для составления нативной взвеси; 4 - много рамный фильтр (фильтрующий); 5 - реактор; 6 - бутыль емкостью 1 л со смесью маточных фагов; 7 -фильтр (стерилизующий); 8 - розлив препарата во флаконы;

21 Отобранные для производства штаммы должны обладать типичными морфологическими, биохимическими и серологическими свойствами. Для лучшего сохранения целесообразно после проверки свойств культур высушивать их под вакуумом из замороженного состояния (лиофилизировать) и хранить в темном месте при температуре °С. Производственная коллекция непрерывно пополняется свежевыделенными штаммами. Для получения маточных бактериофагов к пробам речных и сточных вод подсевают соответствующую культуру бактерии и после инкубации при 37°С фильтруют через стерилизующие фильтры. Литическая активность фильтратов проверяется титрованием в жидкой питательной среде (по Аппельману) с набором штаммов данного вида. Наиболее активные используют для приготовления маточных фагов.

22 Серийный бактериофаг готовят в реакторах емкостью от 250 до 500 л. Реакторы имеют паровую рубашку с разрешающим давлением 3 · 10 5 Па (3 атм), пропеллерную мешалку, спусковой вентиль и систему труб для аэрации среды. Реактор и все его части изготавливают из нержавеющей стали. В состав питательный сред для получения кишечных и раневых бактериофагов входят белковые основы в виде кислотных или ферментативных гидролизатов казеина, мяса (гидролизат Хоттингера, пептон Мартена). В качестве источника ростовых факторов используют мясные экстракты, чаще с добавлением глюкозы, значение рН среды устанавливают в пределах 7,27,6 в зависимости от вида бактерий, для которых специфичен бактериофаг.

23 В реактор с питательной средой (37°С) засевают нативную взвесь бактерий из расчета млн. клеток на 1 мл среды. Маточный фаг добавляют в количестве 0,01 0,1% объема питательной среды. Содержимое тщательно перемешивают воздухом. Воздух, подаваемый в биореактор под давлением, поступает через стерильный (ватно-угольный) фильтр с активированным углем. Лизис проходит при температуре 37°С в течение 4-10 ч (в зависимости от вида бактериофага). Полноту лизиса определяют визуально (по полноте прозрачности). По завершении процесса добавляют консервант хинозол (0,01%). Через 1,52 ч после добавления консерванта фаголизат фильтруют через стерилизующие пластины и разливают в стерильных условиях во флаконы по 100, 50 и 25 мл.

24 Технологический процесс производства сухих бактериофагов включает: Работу с производственными штаммами бактерий Получения маточных бактериофагов Приготовления серии жидкого бактериофага Получения серии сухого бактериофага Контроля готового препарата Этикетировки и упаковки препарата.

25 Для получения сухого бактериофага первые три стадии аналогичны. Затем проводится концентрация фага, его высушивание, таблетирование, нанесение кислотоустойчивого покрытия. Контроль сухого препарата проводится на специфическую стерильность, на наличие постоянных микроорганизмов, безвредность, литическую активность, остаточную влажность, растворимость в искусственном желудочном соке. Бактериофаг фасуется подобно другим таблетированным препаратам, этикетируется и упаковывается. Кроме таблетированной формы (по аналогии с другими фармакопейными формами) бактериофаг может готовиться на в виде мазей, гелей или в виде ректальных суппозиториев.

26 Концентрация жидкого бактериофага может проводиться путем высаливания сульфатом аммония, который добавляют в количестве 69% от объема фага. Высаливание продолжается 18 ч без последующего диализа при температуре (+2)(+4°С), рН 6,97,0. К образовавшейся пастообразной массе добавляют в качестве стабилизатора глюконат кальция (9%). Если защитным покрытием служит пектин, его добавляют одновременно с глюконатом кальция (3% к массе). Массу наносят на кассеты (толщина слоя 1 см) и высушивают из замороженного состояния под вакуумом в аппаратах для лиофилизации до достижения остаточной влажности 24%.

27 Концентрацию жидкого бактериофага также можно проводить методом ионообменной хроматографии с использованием волокнистой ДЭАЭ-целлюлозы. При этом профильтрованный бактериофаг разводят пополам стерильной очищенной водой и пропускают через хроматографичекие колонки с ДЭАЭ-целлюлозой. Затем проводят элюацию бактериофага 0,7-1,0 М раствором NaCl на 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,0-7,4) с добавлением 1 % сернокислого аммония. Концентрат стерильно собирают в емкости, добавляя в качестве стабилизатора 50 % обрата молока и 2 % глюкозы, затем подвергают лиофилизации.

28 Контроль препаратов бактериофагов Бактериофаги контролируют на специфическую стерильность, безвредность, литическую активность. У жидких бактериофагов определяют также общую стерильность, а у сухих, кроме перечисленных тестов, - обсемененность посторонней микрофлорой, устойчивость к действию желудочного сока, растворимость в кишечном соке и остаточную влажность. Высушенную массу измельчают в грануляторе, контролируют на специфическую стерильность, обсемененность посторонними микроорганизмами и литическую активность. В настоящее время бактериофаги выпускаются в широком ассортименте.

29 Стерильность фагов общую устанавливают путем посева препарата (10 флаконов от серии) на тиогликолевую среду (методика ГФ Украины). Для контроля специфической стерильности образцы из расчета 15 табл. из каждых табл. высевают на 10 % желчный бульон с последующим пересевом через 48 ч. на среды Плоскирева или Эндо. Степень загрязненности посторонней микрофлорой определяют на чашках с 2 % агаром. Среднее число колоний, выросших на всех чашках, не должно превышать 10. Стерильность жидких и сухих фагов определяют как общую, так и специфическую.

30 Безвредность проверяют путем подкожного введения 3 мышам массой г 1 мл препарата (таблетку предварительно растворяют в 20 мл воды очищенной). Бактериофаг не должен вызывать гибели мышей. Срок наблюдения 3 суток. Литическую активность определяют методом Аппельмана. Титрование проводят не менее, чем с 2 штаммами каждого вида и серотипа микроорганизмов, в отношении которых препарат должен быть активным. Для каждого вида бактериофага соответствующими ТУ предусмотрены допустимые минимальные титры.

31 Бактериофаг с оболочкой из ацетофталата целлюлозы испытывают на устойчивость в желудочном соке или 0,1 н растворе НСl при 37 0 С и растворимость в кишечном соке или 0,1 н растворе NaOH. Таблетки должны быть устойчивы к воздействию желудочного сока в течение 3 ч, время растворения в кишечном соке не должно превышать 30 мин. Остаточную влажность определяют высушиванием до постоянной массы навески размельченных таблеток. В готовом препарате остаточная влажность не должна превышать 7 %.

Читайте также:

Типовые стафилококковые бактериофаги способ получения

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Нифонтова В.В., Чугунова Е.О.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Нифонтова В.В., Чугунова Е.О.

OBTAINING BACTERIOPHAGES AND APPLICATION IN VETERINARY