Стафилококки коагулазоположительные в кале у ребенка
Микробиологическое исследование, позволяющее выявить инфицированность золотистым стафилококком и определить количество возбудителя. При выявлении патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов будет определена их чувствительность к антимикробным препаратам (антибиотикам и бактериофагам). В ином случае чувствительность к антибиотикам и бактериофагам не определяется, т.к. не имеет диагностического значения.
Staphylococcus aureus culture, MRSA culture (Methicillin-resistant S. aureus culture), quantitative.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Грудное молоко, кал, мазок из зева, мазок с конъюнктивы, мазок из носа, мазок урогенитальный (с секретом предстательной железы), мокроту, отделяемое раны, отделяемое уха, ректальный мазок, среднюю порцию утренней мочи.
Как правильно подготовиться к исследованию?
- Рекомендуется употребить большой объем жидкости (воды) за 8-12 часов до сбора мокроты.
- Исследование рекомендуется проводить до начала приема антибиотиков и других антибактериальных химиотерапевтических препаратов.
- Исключить прием мочегонных препаратов в течение 48 часов до сбора мочи (по согласованию с врачом).
- Исключить прием слабительных препаратов, введение ректальных свечей, масел, ограничить прием медикаментов, влияющих на перистальтику кишечника (белладонна, пилокарпин и др.) и на окраску кала (железо, висмут, сернокислый барий), в течение 72 часов до сбора кала.
- Женщинам исследование (процедуру взятия урогенитального мазка или сбор мочи) рекомендуется производить до менструации или через 2-3 дня после ее окончания.
Общая информация об исследовании
Золотистые стафилококки (Staphylococcus aureus) – грамположительные условно-патогенные бактерии рода Staphylococcus, являющиеся наиболее частой причиной стафилококковых, в частности внутрибольничных, инфекций. Золотистые стафилококки в норме могут располагаться на коже, слизистой оболочке носа и реже в гортани, влагалище, кишечнике. Они встречаются у 30 % здоровых людей.
Если у человека слабая иммунная система или нарушен нормальный состав микрофлоры, то при повреждении кожи (слизистых оболочек) золотистый стафилококк может приводить к разнообразным местным и системным инфекционно-воспалительным поражениям:
- кожи (карбункулам, импетиго, фолликулиту),
- молочных желез (маститу),
- дыхательных путей и ЛОР-органов (тонзиллиту, гаймориту, отиту, фарингиту, ларинготрахеиту, пневмонии),
- мочевыводящих путей (уретриту, циститу, пиелонефриту),
- пищеварительной системы (энтероколиту, аппендициту, перитониту, парапроктиту, холециститу),
- костно-суставной системы (остеомиелиту, артриту).
В отдельных случаях возможна генерализация инфекции с развитием септикопиемии. Производимый золотистым стафилококком энтеротоксин вызывает пищевые отравления и синдром токсического шока. Основные источники инфекции: здоровые (носители) и больные люди, домашние и сельскохозяйственные животные, а также пища, содержащая возбудителя инфекции (чаще всего это сахаросодержащие молочные продукты). Инфицирование может происходить контактным и воздушно-пылевым путем. Возможно аутоинфицирование.
Для идентификации золотистого стафилококка проводится посев клинического материала на питательные среды, где при наличии S. aureus через 18-24 часа наблюдается рост колоний золотистого цвета.
Определение количества бактерий может потребоваться, например, чтобы понять, нужно ли проводить лечение: в некоторых случаях, если количество небольшое, лечение не проводится. Решение о его необходимости зависит от клинических проявлений, а также от количества стафилококка. При небольшом содержании микробов и отсутствии симптоматики лечение может вообще не понадобиться, т. к. и в норме на слизистой могут находиться эти микробы. Стафилококк в кишечнике обнаруживается постоянно, это не повод для лечения, но если его количество превышено, тогда нужны меры (бактерия может вызывать колики и расстройства). Стафилококк в мазке без симптомов вагинита также является нормой, в то время как большие количества стафилококка в мазке, наряду с повышением лейкоцитов, требуют лечения.
Наличие стафилококка не обязательно означает инфекцию, это может быть бессимптомное носительство, например при посеве мазков из носа и зева носительством считается количество бактерий до 10 3 . Однако более высокие показатели говорят нам о золотистом стафилококке как о причине заболевания, и это уже далеко не бессимптомное носительство.
Многое зависит от возраста пациента. Например, золотистый стафилококк в количестве 10 4 является вполне нормальным показателем для детей старше 1 года, но у грудных детей в таком количестве уже потребует лечения.
В любом случае наличие стафилококка при отсутствии симптомов болезни – еще не повод к назначению лекарств.
Количество стафилококка может определяться до и после лечения. Если выясняется, что рост возбудителя обильный, значит, инфекция набирает обороты, предыдущая терапия была неудачной и срочно требуется новый курс лечения; умеренный и скудный рост микроорганизмов по результатам последних анализов говорит об успешности терапии. Кроме того, в дальнейшем необходимо контролировать количество стафилококков в течение 1 или 2 месяцев после пройденного лечения.
Отмечено также, что после пребывания больных в хирургической клинике стафилококк обнаруживался у них вдвое чаще, чем при поступлении. У больных, поступающих в стационары, наблюдается замена антибиотикочувствительных стафилококков на антибиотикоустойчивые.
Лечение больных стафилококковой болезнью препаратами пенициллина или другими давно применяемыми антибиотиками часто остается безрезультатным, поскольку такие препараты нередко только усугубляют тяжесть течения инфекции. Поэтому так важно установить, какие антибиотики будут эффективны при лечении стафилококка.
Для чего используется исследование?
- Для определения целесообразности лечения.
- Для дифференциации бактерионосительства и опасного инфицирования.
- Для контроля за состоянием пациента после проведенного лечения.
- Для того чтобы подтвердить, что стафилококк является причиной возникшего заболевания (об этом свидетельствуют высокие показатели посева).
Что означают результаты?
Референсные значения: нет роста.
Золотистый стафилококк в мазке в небольших количествах является частью нормальной микрофлоры человека. Значительное повышение стафилококка в мазке может быть симптомом воспалительного процесса, кожных инфекций (угри и пр.) и очень опасных заболеваний (пневмония, остеомиелит, эндокардит и др.). Результат посева интерпретирует врач исходя из того, в каком количестве выделены микроорганизмы.
Кто назначает исследование?
Терапевт, врач общей практики, педиатр, ЛОР, инфекционист.
Стафилококки (лат. Staphylococcus) — род повсеместно распространённых грамположительных бактерий-кокков.
Стафилококки встречаются в норме на всем протяжении желудочно-кишечного тракта человека, включая желудок (О.В. Добровольский, С.Ю. Сереброва), а также на коже, слизистой оболочке респираторных органов и в урогенитальном тракте.
Стафилококки представляют собой неподвижные шарообразные клетки диаметром от 0,5 до 1,5 мкм, располагающиеся одиночно, парами или гроздьями. Не образуют спор.
Стафилококки лучше других бактерий переносят воздействие высокой температуры, света, высушивания и химических агентов. Они выдерживают нагревание до 60°С в течение часа, а отдельные штаммы — до 80°С в течение получаса и 10 минут при нагревании до 150°С, солнечный свет в течение 10-12 часов, сухой жар — до 2-х часов. Стафилококки устойчивы к повышенному содержанию хлористого натрия (поэтому они хорошо сохраняются в консервированных продуктах), чистому этанолу и фенолу. Оптимальная температура для развития стафилококков 30–37 °С.
Частота выделения некоторых видов стафилококков от человека и ряда сельскохозяйственных и домашних животных (Широкова И.Ю.).
| Вид стафилококков | Вид хозяев (%) | ||||
| человек | ослы | овцы | козы | кошки | |
| S. aureus | 4,6 | 2,9 | 37,5 | 19,7 | 13,0 |
| S. epidermidis | 23,6 | 2,3 | 6,7 | 9,2 | 6,0 |
| S. hominis | 26,9 | 6,9 | — | — | — |
| S. capitis | 4,7 | 2,3 | — | — | 1,0 |
| S. haemolyticus | 11,8 | — | — | 18,5 | 2,0 |
| S. warneri | 4,6 | — | 2,5 | 13,0 | — |
| S. saprophyticus | 8,4 | 4,6 | 5,0 | 3,8 | — |
| S. cochnii | 4,2 | 2,3 | — | 1,7 | — |
| S. xylosus | 9,9 | 10,3 | 11,7 | 6,6 | 2,0 |
| S. simulans | 1,3 | — | 7,5 | — | 4,0 |
| S. intermedius | — | — | — | — | 10,0 |
| S. felis | — | — | — | — | 45,0 |
| S. sciuri | — | 25,1 | 17,5 | 5,8 | 6,0 |
Род стафилококки входит в семейство Staphylococcaceae, порядок Bacillales, класс Bacilli, тип Firmicutes, Terrabacteria group, царство Бактерии.
В род стафолококки входят следующие виды: S. agnetis, S. argensis, S. argenteus, S. arlettae, S. aureus (стафилококк золотистый), S. auricularis, S. capitis, S. caprae, S. carnosus, S. chromogenes, S. cohnii, S. condimenti, S. delphini, S. devriesei, S. epidermidis (стафилококк эпидермальный), S. equorum, S. faecalis, S. felis, S. fleurettii, S. gallinarum, S. haemolyticus, S. hominis, S. hyicus, S. intermedius, S. kloosii, S.leei, S. lentis, S. lugdunensis, S. lutrae, S. lyticans, S. massiliensis, S. microti, S. muscae, S. pasteuri, S. petrasii, S. pettenkoferi, S. piscifermentans, S. pseudintermedius, S. pseudolugdunensis, S. rostri, S. saccharolyticus, S. saprophyticus (стафилококк сапрофитный), S. schleiferi, S. schweitzeri, S. sciuri, S. simiae, S. simulans, S. stepanovicii, S. succinus, S. vitulus, S. warneri, S. xylosus.
У некоторых видов стафилококков выделены подвиды:
Ряд видов рода стафилококков, исходя из общности физиологических признаков и генетического родства, объединены в 4 группы:
- группа Staphylococcus epidermidis: S. epidermidis, S. capitis, S. warneri, S. haemolyticus, S. hominis и S. saccharolyticus
- группа Staphylococcus saprophiticus: S. saprophyticus, S. cohnii и S. xylosis
- группа Staphylococcus simulans: S. simulans и S. carnosus
- группа Staphylococcus sciuri: S. sciuri и S. lentus
В зависимости от способности продуцировать коагулазу, экстрацеллюлярный фермент, вызывающий свертывание плазмы крови, стафилококки подразделяются на коагулаза-положительные (коагулазопозитивные) и коагулаза-отрицательные (коагулазонегативные).
Коагулаза-положительными являются 5 видов стафилококков: Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), Staphylococcus delphini, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius, staphylococcus lutrae, staphylococcus schleiferi subsp. coagulans, среди которых патогенный для человека только золотистый стафилококк. Кроме стафилококков коагулаза-положительной является бактерия Yersinia pestis — возбудитель чумы.
К коагулаза-отрицательным относятся эпидермальный и сапрофитный стафилококки, а также Staphylococcus caprae, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus pettenkoferi, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus warneri, Staphylococcus xylosus и другие виды. Коагулаза-отрицательные стафилококки менее патогенны, чем коагулазо-положительные.
Коагулаза-отрицательные стафилококки входят в состав нормальной микрофлоры кожи человека и обычно не вызывают серьёзных заболеваний. Staphylococcus lugdunensis более вирулентны, чем другие коагулаза-отрицательные стафилококки и, в случае имплантируемых медицинских изделий или катетеров, Staphylococcus lugdunensis могут быть причиной тяжело текущих инфекций костей и суставов, возникающих у пациентов, находящихся на лечении в стационаре.
При исследовании биологического материала человека при положительном тесте на коагулазу делается вывод о наличии золотистого стафилококка.
При микробиологическом анализе кала на дисбактериоз отдельно подсчитывают коагулаза-положительные (фактически золотистый стафилококк) и коагулаза-отрицательные (в основном это эпидермальный и сапрофитный) стафилококки. При этом в норме золотистый стафилококк должен отсутствовать, а количество коагулаза-отрицательных стафилококков не должно превышать 10 4 колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г кала.
Коагулаза-отрицательные стафилококки обнаруживаются в кале у 15,0±3,0 % здоровых людей, причем среднее содержание в 1 г кала от 800 до 3200 КОЕ (М.Д.Ардатская, О.Н.Минушкин).
При избыточном росте стафилококка, как следствии дисбактериоза кишечника, кроме бактериофагов, при медикаментозной терапии применяются различные пробиотки (Бифидумбактерин, Бифиформ, Лактобактерин, Ацилакт, Линекс и др.) и/или адекватные конкретному штамму стафилококка и причине дисбактериоза антибиотики (у взрослых).
Золотистым стафилококком называют один из видов грамположительных бактерий шаровидной формы. Для детского организма он очень опасен, поскольку вызывает значительное количество заболеваний. В их перечне присутствуют и легкие кожные инфекции, и смертельно опасные недуги.
Бактерия может привести к развитию гнойно-воспалительных процессов уже в первый день жизни малыша. Дети наиболее подвергаются заражению, ведь иммунитет у них еще слабенький.
Трудности лечения состоят в том, что симптоматику инфицирования золотистым стафилококком легко перепутать с другими патологиями. Можно сразу не распознать, что виновником болезненного состояния малыша выступает именно эта бактерия.
Золотистый стафилококк: норма
Стафилококк локализуется в разных местах тела. Его золотистый вид любит поселяться в кишечнике, слизистой носа и горла.
Чтобы выявить присутствие в организме малыша золотистого стафилококка, необходимо исследовать кал на дисбактериоз. Такой тест проводится уже в родильном доме, когда появляется малейшее подозрение о проникновении бактерии в кишечник крохи.
Исследовать кал нужно минимум два раза с однодневным или двухдневным перерывом. Материал для теста (кал) желательно оперативно доставить в лабораторию (не позже, чем через три часа после испражнения). Это позволит получить корректные результаты.
Установленная норма золотистого стафилококка составляет 104. Это максимальное содержание бактерий в кале ребенка, которому исполнился год. Для грудных детей такой показатель считается высоким.
Важно наблюдать уровень золотистого стафилококка в динамике. Если происходит ускоренный рост бактерий, то это означает развитие инфекции, пришла пора начинать лечение.
Умеренное колебание количества золотистого стафилококка указывает, что состояние ребенка в норме.
Симптомы заражения золотистым стафилококком
Заражение золотистым стафилококком проявляется у каждого малыша по-разному.
При ранней форме инфицирования уже через несколько часов у ребенка происходит:
- повышение температуры;
- тошнота и рвотные позывы;
- нарушение стула;
- метеоризм.
Когда расстраивается работа ЖКТ, малыш начинает кряхтеть, натуживаться, иногда плакать. Стул у ребенка разжиженный, зеленоватого цвета, содержит белые комочки.
Запор, приходящий на смену поносу, сопровождается выраженным вздутием животика.
Если не облегчить неприятные симптомы, то ребенок может быстро ослабнуть.
Признаки поздней стадии заражения проявляются через три или пять дней после того, как золотистый стафилококк активизировался и удобно устроился в организме малыша. Бактерия выдает себя через:
- поражение внутренних органов и эпидермиса;
- заражение крови.
Бывает, хотя и редко, что золотистый стафилококк ничем не проявляется, и инфицирование протекает почти бессимптомно. Разве что возникают незначительные кожные патологии. Но анализ кала обязательно выявит бактерию, если она поселилась в организме малыша и размножилась выше допустимых пределов.
Причины инфицирования золотистым стафилококком
Причины заражения следующие:
- Ослабление иммунитета. Это – основной виновник инфицирования ребенка. Если защитные силы организма работают не в полную силу, то они не могут эффективно противостоять патогенным микроорганизмам. А болезнетворные бактерии встречаются на каждом шагу.
- Недостаточное соблюдение гигиены. Малыши кладут в рот все подряд, иногда не моют руки перед тем, как сесть за стол (вина родителей). Порой за ними просто не уследишь, особенно во время прогулки или игры в песочнице. Микроорганизмы обожают грязь, поэтому риск заражения золотистым стафилококком возрастает, если уделять мало времени гигиене малыша и не приучать его к соблюдению личной чистоты.
- Прямое инфицирование ребенка от человека – носителя бактерий. Им может быть:
- сотрудник лечебного учреждения;
- работник пищеблока в детском саду или в школе.
Бактерии проникают сквозь поврежденные места на коже, слизистые оболочки и через пищу.
Золотистый стафилококк может принести и насекомое. Поэтому его укусы всегда следует обрабатывать антисептиком.
Золотистый стафилококк в кале – как помочь малышу в домашних условиях
У малышей уже со второй недели жизни и до полугода функциональные нарушение ЖКТ – явление частое. Кишечник заселяет множество бактерий различных видов. Он никогда не бывает стерильным.
Лечение медикаментами целесообразно проводить только тогда, когда количество золотистого стафилококка в кале малыша в несколько раз превышает допустимое содержание.
В первую очередь, нужно нормализовать работу детского кишечника, не прибегая к фармакологии. Ведь часто лечим одно, но при этом наносим вред другой части организма.
Когда малыш начинает страдать от запоров, можно помочь ему так:
Такие процедуры следует использовать редко, чтобы ЖКТ не отвык работать самостоятельно.
Если малыш на грудном вскармливании, то маме необходимо временно отказаться от потребления риса, бобовых, капусты, винограда и черники. Эти продукты скрепляют содержимое кишечника, способствуют метеоризму.
После нескольких месяцев стул у ребенка налаживается.
Лечение золотистого стафилококка
Лечить ребенка, инфицированного этим видом бактерии, непросто, поскольку она способна выделять фермент пенициллиназу. Тот наделяет золотистый стафилококк невосприимчивостью к антибиотикам.
Основные направления терапии:
- Укрепление иммунитета.
- Нормализация метаболизма.
Младенцы находятся на стационарном лечении в стерильных боксах. Важно не прерывать кормление грудным молоком, которое лучше любого лекарства способствует росту иммунитета. Поэтому мама постоянно должна быть возле малыша.
Когда появляются признаки воспаления тонкой кишки, повышается температура, кал превращается в слизистую зеленую массу, начинается лечение антибиотиками.
Вспомогательным способом терапии является применение отваров календулы, ромашки, настоя череды.
Наличие золотистого стафилококка в кале малыша – еще не повод, чтобы начинать пичкать его лекарствами. Необходимо четко отличать два понятия:
- стафилококк;
- стафилококковая инфекция.
Когда у ребенка присутствуют признаки заражения, то это и есть инфицирование золотистым стафилококком.
Когда же симптомы отсутствуют, но бактерия в кале обнаружена, родителям необходимо работать над укреплением иммунитета ребенка. Ослабление организма малыша – провоцирующий фактор инфицирования золотистым стафилококком.
Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Любасовская Л.А., Корниенко М.А., Припутневич Т.В., Ильина Е.Н., Щеголев А.И.
В отделениях реанимации новорождённых всего мира проблема госпитальных инфекций , вызываемых коагулазонегативными стафилококками (CoNS), стоит на первом месте в течении последних 20 лет. Новорождённые с очень низкой и экстремально низкой массой тела при рождении являются особой группой риска по CoNS-инфекциям. Однако в России CoNS до сих пор часто воспринимают как контаминанты, а не как главные этиологические агенты пневмонии и сепсиса у глубоконедоношенных новорождённых. В данной работе показано, что в ОРИТ постоянно циркулируют госпитальные штаммы CoNS, способные вызывать фатальные инфекции у глубоконедоношенных новорождённых.
Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Любасовская Л.А., Корниенко М.А., Припутневич Т.В., Ильина Е.Н., Щеголев А.И.
Microbiological and Molecular Genetic Characteristics of Coagulase-Negative Staphylococcal Isolates from Neonates in Intensive Care Unit
The problem of hospital-acquired infections due to coagulase-negative staphylococci (CoNS) in neonatal intensive care units is crucial over the last 20 years in the world. Neonates with very low or extremely low body weight belong to a special group of risks by the CoNS infection. However, in Russia CoNS up to now are frequently considered as contaminants and not as the main etiologic factors of pneumonia and sepsis in extremely premature infants. It was shown that hospital strains of CoNS causing fatal infections in extremely premature infants are always present in intensive care units.
Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика коагулазонегативных стафилококков, выделенных у новорождённых отделения реанимации и интенсивной терапии
Л. А. ЛЮБАСОВСКАЯ', М. А. КОРНИЕНКО2, Т. В. ПРИПУТНЕВИЧ', Е. Н. ИЛЬИНА2, А. И. ЩЕГОЛЕВ'
1 ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В. И. Кулакова Минздрава РФ, Москва
2 ФГБУНИИ физико-химической медицины ФМБА, Москва
Microbiological and Molecular Genetic Characteristics of Coagulase-Negative Staphylococcal Isolates from Neonates in Intensive Care Unit
L. A. LUBASOVSKAYA, M. A. KORNIENKO, T. V. PRIPUTNEVICH, E. N. ILYINA, A. I. SHCHEGOLEV
V. I. Kulakov Scientific Centre of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Moscow Research Institute of Physico-Chemical Medicine, Moscow
В отделениях реанимации новорождённых всего мира проблема госпитальных инфекций, вызываемых коагулазонегатив-ными стафилококками (CoNS), стоит на первом месте в течении последних 20 лет. Новорождённые с очень низкой и экстремально низкой массой тела при рождении являются особой группой риска по CoNS-инфекциям. Однако в России CoNS до сих пор часто воспринимают как контаминанты, а не как главные этиологические агенты пневмонии и сепсиса у глубоконедоношенных новорождённых. В данной работе показано, что в ОРИТ постоянно циркулируют госпитальные штаммы CoNS, способные вызывать фатальные инфекции у глубоконедоношенных новорождённых.
Ключевые слова: ОРИТ новорождённых, инфекции, коагулазонегативные стафилококки, факторы патогенности, кло-нальность.
The problem of hospital-acquired infections due to coagulase-negative staphylococci (CoNS) in neonatal intensive care units is crucial over the last 20 years in the world. Neonates with very low or extremely low body weight belong to a special group of risks by the CoNS infection. However, in Russia CoNS up to now are frequently considered as contaminants and not as the main etio-logic factors of pneumonia and sepsis in extremely premature infants. It was shown that hospital strains of CoNS causing fatal infections in extremely premature infants are always present in intensive care units.
Key words: neonatal intensive care units, infections, coagulase-nagative staphylococci, pathogenicity factors, clonality.
С середины 80-х годов, коагулазонегативные стафилококки (Со№) стали рассматриваться как группа этиологических агентов госпитальных инфекций в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) новорождённых. Однако их видовой состав, антибиотикорезистентность, генетические и фенотипические характеристики до сих пор недостаточно изучены.
Поскольку глубоконедоношенные дети чаще подвергаются воздействию инвазивных процедур (интубация трахеи, катетеризация центральных вен, инфузия липидных растворов), вероятность заразиться внутрибольничной инфекцией у них
Адрес для корреспонденции: 117513 Москва, ул. Академика Опарина, 4. МЦ АГ и П им. В. И. Кулакова
больше, чем у доношенных детей [1, 2]. Основными нозологическими формами СоЖ9-инфекций, как правило, являются пневмония и катетер-ас-социированный сепсис [1, 2], а по данным некоторых исследователей, менингит, причем иногда без клеточных или химических изменений в спинно-мозговой жидкости [3]. В единичных публикациях описаны случаи некротизирующего энтероколита [4], остеомиелита [29] и септического артрита, вызванного СоЫБ у новорождённых с очень низкой и экстремально низкой массой тела (ОНМТ и ЭНМТ) при отсутствии центрального венозного катетера (ЦВК) [5].
Абсолютное большинство госпитальных СоЫБ представлены метициллинорезистентными штаммами (ЫКСоЫБ), обладающими дополнительным пенициллинсвязывающим белком, ко-
даруемым геном mecA, поэтому при лечении инфекций, вызванных MRCoNS, препаратом выбора чаще всего служит ванкомицин. Этот препарат являлся основным в терапии CoNS-инфекций в ОРИТ новорождённых, хотя в публикациях последних лет имеется много сообщений о том, что использование ванкомицина у пациентов с инфекциями, вызванными штаммами стафилококков с МПК между 1 и 2 мг/мл следует проводить с осторожностью, поскольку отсутствует его клиническая эффективность [6].
Патогенность как коагулазоположительных, так и коагулазоотрицательных стафилококков во многом обусловлена наличием широкого спектра различных факторов вирулентности, в том числе и продукция различных токсинов [7]. Основными токсинами стафилококков являются различные гемолизины, лейкоцидины, большой спектр энтеротоксинов, относящихся к нескольким серологическим типам A-E, G, H, I, J, K-R, токсин синдрома токсического шока, эксфолиативные токсины A и B и др. [8]. CoNS по сравнению с S.aureus обладают значительно меньшим разнообразием токсинов [9] и из наиболее часто встречаемых у них являются некоторые энтеротокси-ны и токсин токсического шока [10, 11].
Способность к образованию биоплёнок является фактором, способствующим колонизации CoNS на поверхности синтетических имплантов — центральных венозных катетеров, интубационных трубок и т. д. Их формирование связано с поверхностными белками и межклеточными полисаха-ридными адгезинами (PIA). Помимо PIA, к факторам адгезии стафилококка относят клампинг фактор, кодируемый генами clfA и clfB, коллаген-связывающий белок (ген cna), а также фибронек-тинсвязывающий белок (гены fnbA; fnbB) [12—16].
Синтез PIA регулируется ica опероном, в который входят следующие гены icaA, icaB, icaC, icaD. Функция белка, кодируемого геном icaB, заключается в деацетилировании поли-М-ацетилг-люкозамина. Деацетилирование PIA требуется для его прикрепления к поверхности клетки и формирования биоплёнок [17]. Присутствие этих генов является прогностическим признаком образования биоплёнок у CoNS, что и может объяснить причину катетер-ассоциированных CoNS-сепсисов.
Способность к образованию биоплёнок и ме-тициллинорезистентность, дают CoNS преимущество в борьбе за право населять особую экологическую нишу — госпитальную среду, вызывая инфекции у иммунокомпрометированного контингента больных, в частности у глубоконедоношенных новорождённых или новорождённых с тяжёлой неинфекционной патологией.
Таким образом, подробное изучение микробиологических и молекулярно-генетических
свойств коагулазонегативных стафилококков является важной и своевременной задачей. Определение частоты выделения отдельных видов CoNS у новорождённых, находящихся на выхаживании в ОРИТ, наличие или отсутствие у них основных факторов патогенности — маркёров антибиотикорезистентности (метициллинорези-стентность и чувствительность в ванкомицину), а также выявление их принадлежности к определённым клональным группам явилось целью данного исследования.
Материал и методы
Фенотипическая характеристика. Чувствительность к антибиотикам, (ампициллину, оксациллину, ванкомицину, линезо-лиду, гентамицину, линкомицину (клиндамицину), эритромицину, ципрофлоксацину, хлорамфениколу, тетрациклину) выделенных изолятов CoNS, определяли диско-диффузионным методом на агаре Мюллера-Хинтон (HiMedia) с использования стандартизованных дисков (BioRad Inc.) или путём определением минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотика на автоматическом анализаторе Vitek2Compact (BioMerieux, США). При интерпретации результатов тестирования руководствовались критериями CLSI [18].
Генетическая характеристика. Расширенная генетическая характеристика 70 клинических изолятов CoNS, выделенных от 28 новорождённых, включала:
— определение наличия гена mecA для подтверждения устойчивости к метициллину (оксациллину);
— тестирование геномной ДНК на наличие известных генов вирулентности и патогенности;
— типирование 41 штамма S.haemolyticus и 28 штаммов S.epidermidis на основании существующих схем мультилокус-ного секвенирования (MLST).
Проведение ПЦР. С помощью олигонуклеотидных прай-меров, перечисленных в табл. 1, были амплифицированы фрагменты гена mecA, генов токсинов hlgA, hlgA, hlgB, hlgC, sea, seb, sed, see, seg, seh, sei, sej, tsst, факторов адгезии и колонизации clfA, clfB, cna, fnbA, fnbB, icaA, icaB, icaC, icaD. Реакция амплификации проводилась по стандартному протоколу: в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 66 мМ Tris-HCl (рН 9,0), 16,6 мM (NH4)2SO4, 2,5 мМ MgCl2, 250 мкМ каждого dNTP, 1 ед. Taq DNA полимеразы (ООО НПФ Литех, Россия) и по 10 пмоль праймеров для амплификации тестируемого гена. Реакцию ставили на TETRAD DNA ENGINE (MJ Research, Inc.) при температуре 94°C 2 минут, далее 35 циклов 94°C 30 секунд, THO^ 30 секунд и 72°C 30 секунд. Продукты
Таблица 1. ПЦР праймеры, используемые в данном исследовании для генетической характеристики CoNS
Ген Название 5'-3' последовательность Температура реакции, °C Размер ампликона, bp
mecA MecA-P4 tccagattacaacttcaccagg 56 160
hlA hlA1 atagagatacttggaacccg 58 294
sea SEA-1 ggttatcaatgtgcgggtgg 60 195
seb SEB-1 aaacttgtatgtatggtggtg 58 178
sed SED-1 ggtgaaatagataggactgc 58 193
see SEE-1 gaaatcaatgtgctggaggc 60 313
sej SEJ-1 tactgattttctccctgacg 60 397
sei SEI-1 agattgaaaaggcgtcacag 62 513
seg SEG-1 atctttatatgtctccacctg 58 411
seh SEH-1 gctaatgtttgggtagatgg 58 195
tsst TSST-1 taagacctttgttgcttgcg 62 247
hlgA hlgA1 tcaatcggagtcagtggctc 62 206
hlgB hlgB1 gctatacatttggtggtgac 58 262
hlgC hlgc1 cttacttgcccctcttgcc 60 437
icaA icaA1 gaggtaaagccaacgcactc 62 485
icaB icab1 gattaactttgatgatatgg 52 516
icaC icac1 tattaggtcaatggtatggc 60 246
icaD icad1 cagaggcaatatccaacgg 56 217
cfA clfa1 aagtgtgcctagaatgagagc 60 995
clfB clfb1 accactacaacagagccagc 62 300
fnbA fnba1 atcgttgttgggatgggac 56 334
fnbB fnbb1 aagaagatacaaacccagg 54 410
cna cna1 gaacaggtgggtcaagcag 58 245
амплификации анализировали в 2% агарозном геле с визуализацией бромистым этидием.
Секвенирование ДНК. Перед постановкой реакции секвенирования ампликоны, полученные в ходе стандартной ПЦР, обрабатывали щелочной фосфатазой арктических креветок и экзонуклеазой I E.coli (ExoI, производства Fermentas, Литва) для инактивации неизрасходованных нуклеотидов и деградации олигонуклеотидных праймеров. Для этого к полученным ампликонам добавляли по 5 мкл смеси, содержащей 66 мМ Tris-HCl pH 9,0; 16,6 мМ (NH4)2SO4; 2,5 мМ MgCl2; 5 ед. ExoI и 0,5 ед. щелочной фосфатазы арктических креветок. Инкубировали в течение 20 минут при температуре 37°С с последующей инак-
тивацией ферментов и прогреванием в течение 10 минут при 85°С.
Определение нуклеотидных последовательностей амп-лифицированных фрагментов ДНК проводили модифицированным методом Сенгера с использованием ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit и прибора ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) в соответствии с прилагаемыми инструкциями.
Анализ данных секвенирования. Анализ последовательностей и выравнивание выполняли с помощью программного обеспечения VECTOR NTI v. 9.0. Для филогенетического анализа использовали программу MEGA v. 4.0 (http://www.mega-software.net).
Результаты и обсуждение
В период с 2010 по 2012 годы из клинического материала от новорождённых детей, выделено
Рис. 2. Частота выделения различных видов CoNS.
Рис. 1. Частота выделения различных групп микроорганизмов из клинического материала у новорождённых ОРИТ.
2867 изолятов микроорганизмов (рис. 1), из которых 1259 (43,9%) быши отнесены к СаЫБ, и 672 из них идентифицированы до вида.
Видовой состав коагулазонегативных стафилококков был представлен в основном тремя видами: 8.гр1йетт1й15 (69,5%), 8.Наето1у^сш (22%) и 8.НотМ8 (8%). Значительно реже, выделялись другие виды — Б.шгпеп, 8.ра51гип, 8жргоркуйсш, в общей сложности составившие 0,5% от всех идентифицированных СоN8. При сравнении видового состава изолятов ^N8, выделяемых при колонизации слизистых ЖКТ (кал и зев) и из очагов инфекций, было обнаружено, что в обоих случаях преобладает 8.ер1йетт1й15, причём при инфекциях высеваемость 8.ер1йетт1й1$ была выше (74%), чем при колонизации (65%). Вторым по частоте выделения был 8.Наето1у^еш — 29% изолятов из кала и зева и 15% из очагов инфекций, 8.ЪотЫ8 — 5,6 и 9,5 % соответственно (рис. 2).
Поскольку в ОРИТ новорождённых в качестве стартовой терапии чаще всего применяют комбинацию защищённого пенициллина (амокси-циллина/клавуланата) с аминогликозидом (нетилмицин), а для этиотропной терапии инфекций, вызванных метициллинорезистентными стафилококками используют ванкомицин или линезолид, все выделенные в данном исследовании изоляты ^N8 (п=1259) были протестированы на чувствительность к оксациллину, пенициллину, гентамицину, ванкомицину и линезолиду. Для группы изолятов, отобранных для углубленного генетического типирования (п=70), были получены расширенные антибиотикограммы, включающие линкомицин (клиндамицин), эритромицин, фузидин, ципрофлоксацин, хлорамфе-никол, тетрациклин.
Абсолютное большинство выделенных изолятов ^N8 были устойчивыми к метициллину 93% (1171/1259), метициллинорезистентность которых подтвердилась наличием гена тесА у 96% геноти-пированных изолятов. Вырабатывали пеницилли-
назу 98% (1234/1259) и были устойчивы к гентами-цину 91% (1145/1259) изолятов, а устойчивых к ванкомицину и линезолиду обнаружено не было.
Среди изолятов, для которых была сделана расширенная антибиотикограмма (n=70), устойчивы к тетрациклину были 18% (13/70), к хлорам-фениколу — 41% (29/70), к линкомицину — 40% (28/70), к эритромицину — 77% (54/70), к фузи-диевой кислоте — 34% (24/70), к ципрофлоксаци-ну — 66% (46/70).
При анализе чувствительности 114 изолятов MRCoNS к ванкомицину с определением минимальной подавляющей концентрации у 6% МПК составила 0,5 мкг/мл; у 93% МПК 1—2 мкг/мл; МПК более 2 мкг/мл (4 мкг/мл) у 1% изолятов. Исходя из современных представлений о чувствительности стафилококков к ванкомицину, можно говорить лишь о 6% изолятов CoNS, в отношении которых этот антибактериальный препарат будет клинически эффективен.
Отдельно стоит сказать, что в ходе настоящего исследования проведён анализ клинического материала от 16 погибших глубоконедоношенных новорождённых, для которых был подтвержден инфекционный диагноз. В 9 из 16 случаев (56%) в аутопсийном материале были обнаружены госпитальные микроорганизмы: в 7 случаях MRCoNS (77%), в 1 случае полирезистентный штамм Enterobacter cloacae, в 1 случае — Candida famata. Сроки пребывания этих новорождённых в ОРИТ превышали 72 часа. Вызывает особый интерес, что из 7 новорождённых, в аутопсийном материале которых обнаружены MRCoNS, 3 ребенка получали ванкомицин, но элиминации возбудителя при этом не произошло.
В рамках генетической характеристики ограниченной группы клинических изолятов CoNS (n=70) было проверено наличие следующих токсинов: гемолизинов а и у, энтеротоксинов А, В, D, Е, G, H, I, J и токсина токсического шока. Гены, ответственные за синтез токсинов, указанны
Таблица 2. Наличие генов токсинов у 70 клинических изолятов CoNS
Гемоли- Энтеро- Энтеро- Энтеро- Энтеро- Энтеро- Энтеро- Энтеро- Энтеро- Токсиче- Гемолизин а токсин А токсин В токсин D токсин E токсин G токсин H токсин I токсин J ского зин а hla sea seb sed see seg seh sei sej шока tst hlgA, hlgB,
s.haemolyticus (п=38) 3 (8%) 0 0 0 2 (5,3%) 0 0 0 0 2 (5,3%) 0
s.epidermidis (п=25) 16 (64%) 0 7 (28%) 10 (40%) 1 (4%) 0 4 (16%) 0 0 4 (16%) 0
s.hominis (п=4) 000000000 1 (25%) 0
s.wameri (п=3) 0 0 0 0 0 0 1 (33,3%) 0 0 0 0
Таблица 3. Наличие генов основных факторов адгезии и колонизации у 70 клинических изолятов ^^
Межклеточный полисахаридный адгезин
Клампинг Коллаген- Фибронектин-фактор связывающий связывающий белок белок
Читайте также:
