Стафилококк в пищевых продуктах молоко

Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк) - это весьма распространенный микроорганизм имеющий несколько видов, большинство из которых образует золотистый пигмент.

Некоторые виды золотистого стафилококка могут служить причиной тяжелых пищевых отравлений, так как продуцируют опасное токсическое вещество – энтеротоксин, являющийся непосредственной причиной интоксикации. В настоящее время установлено шесть серологических типов стафилококковых энтеротоксинов: А, В, С, D, Е, F.

Staphylococcus aureus – очень распространен, и его можно найти повсюду. Особенно благоприятны в качестве условий для его размножения пищевые продукты – молоко, мясо. Очень устойчив к любым условиям и способен выживать в замороженных продуктах в течение полугода. Стафилококк не боится кислой среды, высокой температуры, щелочей. Для того чтобы нейтрализовать заражение, нужен долгий процесс кипячения или прожаривания при температуре не ниже 75-80 градусов. Излюбленной средой для размножения Staphylococcus aureus является молоко и все молочные продукты, именно молоко чаще всего становится источником токсикоинфекции. Микроорганизмы могут размножиться при температуре от 16-18 до 37-40 градусов, для осеменения молочного продукта порой достаточно 4-5 часов. Энтеротоксин вырабатывается, как правило, в продуктах, изготовленных из некипяченого или непастеризованного молока. Источником заражения является свежая брынза, сырковая масса, сметана, сыры, изготовленные с помощью сычужного фермента. Также опасны все сладкие кондитерские изделия с кремовой прослойкой, особенно с заварным кремом на молоке. Сахар, влажная молочная среда, крахмал – это благоприятные условия для жизнедеятельности стафилококка. Образование энтеротоксина возможно также в кипяченом и пастеризованном молоке. Известны случаи отравлений мороженым, изготовленным из молока, содержащего энтеротоксин.

Реже стафилококк осеменяет мясо и мясные продукты. Он поражает больных животных с ослабленной иммунной системой или размножается на мясной пище, хранящейся в ненадлежащих условиях. Органолептические свойства молочных, мясных или овощных блюд, осемененных стафилококком, не меняются, поэтому на вкус и запах пища абсолютно не отличается от здоровой, незараженной.

Источником заражения пищевых продуктов патогенными стафилококками является человек. Наиболее частый путь заражения продуктов - воздушно-капельный, поскольку больные стафилококковыми заболеваниями верхних дыхательных путей активно выделяют их в окружающую среду при дыхании, кашле, чиханье. Опасным источником обсеменения продуктов являются работники со стафилококковыми поражениями кожи которые контактным путем загрязняют стафилококками оборудование, инвентарь, посуду.

Источником стафилококковой инфекции являются также животные, больные маститом и другими воспалительными заболеваниями. Продукты животного происхождения могут заражаться стафилококками при жизни животных (молоко при мастите вымени) или при разделке туши.

К профилактическим мероприятиям, предупреждающим обсеменение патогенными стафилококками пищевых продуктов, относятся своевременное выявление лиц с гнойными воспалительными процессами кожи, верхних дыхательных путей и отстранение их от контакта с пищевыми продуктами. Особое место принадлежит соблюдению правил личной гигиены работниками, занятыми изготовлением готовых кулинарных и кремовых изделий.

Чрезвычайно важным является создание условий, препятствующих образованию энтеротоксина в пищевых продуктах. Для хранения оптимальной является температура 2-4 °С, при которой не происходят размножение и накопление энтеротоксина. Большое значение имеет также соблюдение установленных сроков реализации скоропортящихся продуктов.

Не менее важно в профилактике стафилококковых токсикозов обеспечение высокого санитарного уровня, благоустройства и механизации производственных процессов, а также систематическое повышение гигиенических знаний по вопросам профилактики пищевых отравлений.

Роль стафилококков в возникновении пищевых отравлений впервые определил П. Н. Лащенков (1901). Он выделил стафилококки из тортов с кремом, послуживших причи­ной заболевания людей.

Наиболее благоприятной средой для развития стафи­лококков являются молочные продукты, кондитерские изделия с кремом, мясопродукты, паштеты, салаты и т.д.

Источниками заражения пищевых продуктов патоген­ными стафилококками являются человек и животные. Наиболее частый путь заражения продуктов - воздуш­но-капельный, поскольку больные стафилококковыми за­болеваниями верхних дыхательных путей (ангины, риниты, фарингиты) активно выделяют их в окружающую среду при дыхании, кашле, чихании.

Одним из опасных источников обсеменения продук­тов - больные со стафилококковыми поражениями ко­жи (нагноившиеся порезы, ожоги, ссадины, абсцессы и др.). В этом случае обсеменение продуктов происходит при непосредственном соприкосновении их с пораженны­ми органами или через загрязненные стафилококками оборудование, инвентарь, посуду.

Большое эпидемиологическое значение в распростра­нении стафилококковых пищевых заболеваний имеют люди - бактерионосители. В носоглотке почти каждого второго здорового человека обнаруживается патогенный стафилококк.

Инкубационный период при стафилококковых интоксикациях обычно составляет 2-4 ч. Внезапно наступают тошнота, рвота, появляются понос, боли в животе, слабость. Температура тела повышается редко. Продолжи­тельность заболевания 1-2 дня.

Профилактика стафилококковых токсикозов сводится к проведению мероприятий, исключающих возможность попадания возбудителей в пищевые продукты, и созда­нию условий, задерживающих развитие стафилококков и накопление энтеротоксина в продуктах.

К мероприятиям, предупреждающим обсеменение па­тогенными стафилококками пищевых продуктов, относят­ся своевременное выявление лиц с гнойными воспали­тельными процессами кожи, верхних дыхательных путей и отстранение их от работы с готовой пищей. С этой целью на пищевых предприятиях проводятся осмотры рук, кожных покровов. Особое место в профилактике токсикозов принадле­жит мероприятиям по улучшению санитарного режима предприятий и соблюдению правил личной гигиены (осо­бенно лицами, занятыми изготовлением готовых кулинар­ных и кремовых изделий), а также систематическому по­вышению гигиенических знаний по вопросам профилак­тики пищевых отравлений.

Чрезвычайно важно создать условия, препятствую­щие образованию энтеротоксина в пищевых продуктах: хранить продукты и готовые изделия на холоде и соблю­дать сроки их реализации.

Отравления стафилококком можно избежать, придерживаясь определённых правил:

• если покупаете продукты, срок хранения которых от нескольких часов до нескольких суток (кремовые кондитерские изделия, салаты, субпродукты, кисломолочные продукты), постарайтесь быстро их употребить в пределах соблюдения установленных сроков их реализации и предусмотрите временное хранение данных продуктов в холодильнике при температуре не выше +6 °С;
• при покупке продуктов обязательно проверте их внешний вид, свежесть, отсутствие первичных признаков порчи и дефектов;
• не рекомендуется употреблять в пищу блюда, не прошедшие полную термическую обработку; следует нагревать их очень тщательно;
• нельзя повторно замораживать продукты, так как у размороженных продуктов идёт бурное обсеменение с воздуха микробами, в том числе стафилококком, поэтому мясо и птицу размораживают только перед приготовлением блюда.

Программа производственного контроля распространяется на структурные подразделения организации и обязательна к применению в области производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий. Должностные лица (начальники структурных подразделений организации) обязаны осуществлять общий контроль за выполнением санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий по обеспечению безопасных для человека условий труда и требований санитарных.

Адрес: 390046, Рязанская область, город Рязань, ул. Свободы, дом 89

Основными источниками обсеменения стафилококками пищевых продуктов являются люди и животные с гнойно-воспалительными процессами (абсцессы, фурункулы, гнойные раны и др.), а также носители этих микроорганизмов. Перенос стафилококков от людей на пищевые продукты может происходить воздушно-капельным путем, при непосредственном контакте людей с продуктами, оборудованием, в процессе убоя скота и разделки туш.

Чаще всего причиной стафилококковых токсикозов является употребление молока, мяса и мясных изделий, кондитерских изделий с заварным кремом и др., контаминированных патогенными стафилококками. Органолептические свойства продуктов, в которых размножаются стафилококки и накапливаются энтеротоксины, не изменяются [2].

Энтеротоксигенные стафилококки размножаются в пищевых продуктах даже при содержании в них около 40% влаги. Они могут развиваться в продуктах, содержащих от 7% до 12% хлорида натрия. Сахар угнетает развитие стафилококков при концентрациях 30–40%. Некоторые микроорганизмы (В. сеreus, дрожжи из рода Саndidа и др.) оказывают на стафилококки стимулирующий эффект (они усиливают образование энтеротоксина).

Энтеротоксин стафилококков обладает высокой термоустойчивостью. Инактивирование (разрушение) токсина происходит только через 2,5–3 часа кипячения. При автоклавировании (120°С) токсин разрушается через 20 мин. При благоприятных температурных условиях энтеропатогенные стафилококки быстро размножаются в продуктах и продуцируют токсин. Пищевые токсикозы, вызванные энтеропатогенными стафилококками, протекают в форме острого гастроэнтерита, сопровождающегося рвотой, реже диареей, головной болью. Инкубационный период очень короткий – от 30 мин до 6 ч. Длится заболевание один, реже – два, три дня [1].

Выявление и определение количества этих микроорганизмов в пищевых продуктах проводят в соответствии с ГОСТ 31746-2012. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus.

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты, кроме молока и молочных продуктов, и устанавливает методы выявления и определения количества коагулазоположительных стафилококков и Staphylococcus aureus посевом: в жидкую селективную среду (с предварительным обогащением) и на (в) агаризованные селективно-диагностические среды [4].

Метод определения наиболее вероятного числа (НВЧ) коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом в жидкую селективную среду предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта менее 150 или в 1 см
жидкого продукта менее 15 колониеобразующих единиц (КОЕ) коагулазоположительных стафилококков и S. aureus.

Метод определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом на агаризованные селективно-диагностические среды предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г твердого продукта более 1500 или в 1 см
жидкого продукта более 150 КОЕ коагулазоположительных стафилококков и S. aureus [4].

Метод выявления и метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом с предварительным обогащением основаны на высеве навески продукта и (или) разведений навески продукта в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus.

При пересеве на агаризованную среду с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном выросшие типичные колонии без подтверждения по биохимическим признакам относят к коагулазоположительным стафилококкам.

Определенное количество жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции вносят в жидкую селективную питательную среду [6].

Перед посевом анаэробные условия в среде создают кипячением при (100±1) °С в течение 15 мин, наслоением агара или парафина в каждую пробирку после посева, а также с помощью альтернативной процедуры - инкубирования пробирок в емкости или инкубаторе в анаэробных условиях.

Пробирки с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч. Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков на Жиолитти-Кантони бульоне определяется по редукции теллурита калия, а на глюкозном или солевом бульоне - по помутнению среды [3].

Поверхность одной из агаризованных селективно-диагностических сред (Байрд-Паркер агара, молочно-солевого, яично-желточно-азидного, яично-желточно-солевого агара, агара с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном), инокулируют из предположительно положительных пробирок после 24 ч и все оставшееся пробирки после 48 ч.

Чашки Петри с посевами инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 ч. Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по редукции теллурита калия и яично-желточной реакции (лецитиназной активности) [7].

На агаре с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном после инкубирования присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по типичным колониям, показавшим специфичную реакцию (бычий фибриноген/кроличья плазма).

Подтверждение принадлежности типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам проводят по изучению отношения выявленных микроорганизмов к окраске по Граму, определению присутствия у них каталазы и коагулазы.

Подтверждение принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S. aureus проводят по определению образования ацетоина, определению ферментации в аэробных условиях мальтозы и, при необходимости, определению термостабильной нуклеазы и гемолитической активности. Результаты выявления коагулазоположительных стафилококков и S. aureus выражают: "обнаружены" или "не обнаружены"[5].

Метод НВЧ - определение количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus. Навески продукта и (или) серию разведений навески продукта вносят в жидкую селективную питательную среду. Наиболее вероятное число коагулазоположительных стафилококков и S. aureus в 1 см или в 1 г продукта определяют для подтвержденных посевов, пользуясь НВЧ-таблицей по ГОСТ 26670.

Методы определения количества коагулазоположительных стафилококков и S. aureus посевом на (в) агаризованные селективно-диагностические среды основаны на высеве навески продукта и/или разведения навески продукта на (в) агаризованную селективно-диагностическую среду, инкубировании посевов, подсчете типичных и (или) атипичных колоний, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus [4].

Проводят посев определенного количества жидкого продукта или определенное количество исходной суспензии при использовании продукта другой консистенции на (в) агаризованную селективно-диагностическую питательную среду на две параллельные чашки Петри. Аналогично проводят посев десятикратных разведений испытуемого продукта. Посевы в чашках Петри инкубируют при температуре 37 °С в течение 24-48 ч.

Количество коагулазоположительных стафилококков в 1 см
или 1 г продукта определяют по числу типичных и/или атипичных колоний, выросших на чашках Петри, принадлежность которых к коагулазоположительным стафилококкам подтверждена путем определения отношения микроорганизмов из этих колоний к окраске по Граму, наличия у них каталазы и коагулазы [3,4].

При посеве в (на) агаризованную среду с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном определяют только типичные колонии и без подтверждения по биохимическим признакам их относят к коагулазоположительным стафилококкам.

Количество S. aureus в 1 см
или 1 г продукта определяют исходя из количества коагулазоположительных стафилококков, принадлежность которых к S. aureus подтверждена по образованию ацетоина, определению ферментации в аэробных условиях мальтозы и, при необходимости, определению термостабильной нуклеазы и гемолитической активности.

При выявлении коагулазоположительных стафилококков в определенной навеске исследуемого продукта или его эквивалентном разведении с предварительным обогащением эту навеску или разведение вносят в одну из питательных сред [6,7].

Перед использованием Жиолитти-Кантони бульон прогревают кипячением при (100±1) °С в течение 15 мин для удаления воздуха. Охлаждают до 44 °С - 47 °С и с соблюдением правил асептики прибавляют раствор теллурита калия.

В 10 см модифицированного Жиолитти-Кантони бульона нормальной концентрации или сред вносят 1 см
жидкого продукта или 1 см исходной суспензии (т.е. 0,1 г или 0,1 см продукта). После посева навески продукта и (или) его разведений на поверхность Жиолитти-Кантони бульона осторожно наслаивают слой стерильного голодного агара или слой стерильного парафина и охлажденных до температуры 44 °С - 47 °С, дают полученному слою агара или парафина застыть и герметично закрывают.

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной средой нормальной концентрации 1:10. При использовании среды двойной концентрации соотношение между количеством высеваемого продукта или его разведением и питательной средой 1:1 [3].

Если при последующем подтверждении принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S. aureus не определяют наличие термостабильной нуклеазы и гемолитической активности, то допускается проводить посев в Жиолитти-Кантони бульон без прогрева перед посевом и без наслаивания голодного агара или парафина после посева.

Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч. Если появилось почернение или черный осадок в Жиолитти-Кантони бульоне или помутнение в солевом или сахарном бульоне, то проводят подтверждение принадлежности выросших микроорганизмов к коагулазоположительным стафилококкам. Если почернения, черного осадка или помутнения нет, то посевы инкубируют еще (24±2) ч [2].

Для получения изолированных колоний стерильной петлей делают пересевы культур из каждого посева на поверхность чашки Петри с одной из агаризованных селективно-диагностических сред: Байрд-Паркер агара, Байрд-Паркер агара с кроличьей плазмой и бычьим фибриногеном, молочно-солевого агара, яично-желточно-азидного агара или яично-желточно-солевого агара. Пересевы проводят также из пробирок, в которых нет видимых признаков роста.

Чашки Петри с пересевами инкубируют в термостате при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч или (48±2) ч. После 24 ч инкубирования чашек Петри по отмечают на дне чашек присутствие типичных и атипичных для коагулазоположительных стафилококков колоний [1].

На Байрд-Паркер агаре после инкубирования в течение 24 ч коагулазоположительные стафилококки образуют типичные колонии черного или серого цвета, блестящие и выпуклые, окруженные прозрачной зоной, диаметр колоний около 1,0-1,5 мм и до 1,5-2,5 мм после инкубирования в течение 48 ч. После инкубирования в течение 24 ч непосредственно около колонии в прозрачной зоне может появиться опалесцирующее кольцо, окружающее колонию.

Принадлежность выявленных коагулазоположительных стафилококков к S. aureus проводят по определению их способности образовывать ацетоин и ферментировать мальтозу в аэробных условиях [5].

Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера). Культуру высевают в пробирки со средой Кларка. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 48 ч. После инкубирования посевов к 1 см
отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 см
раствора - нафтола и 0,2 см
раствора гидроокиси калия. Появление розового окрашивания через 15-60 мин указывает на положительную реакцию. S. aureus образует ацетоин.

Определение ферментации мальтозы в аэробных условиях. Способность ферментации мальтозы в аэробных условиях определяют с целью дифференциации S. aureus от других коагулазоположительных видов S. intermedius и S. hyicus. Для определения ферментации мальтозы в аэробных условиях культуры, подлежащие исследованию, высевают уколом петлей в среду Гисса с мальтозой. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 48 ч. При ферментации мальтозы в аэробных условиях с образованием кислоты цвет среды Гисса изменяется. S. aureus ферментирует мальтозу в аэробных условиях [4].

Оценка результатов подтверждения принадлежности коагулазоположительных стафилококков к S. aureus. Если коагулазоположительные стафилококки образуют ацетоин и сбраживают мальтозу в аэробных условиях, то считают, что выявленные коагулазоположительные стафилококки относятся к S. aureus. Для биохимической идентификации допускается использование тест-систем промышленного производства, зарегистрированных на территории государства, принявшего стандарт.

Оценка результатов посевов в жидкие среды. При определении НВЧ коагулазоположительных стафилококков или S. aureus или при их выявлении в определенной навеске продукта посевы считают положительными (то есть коагулазоположительные стафилококки или S. aureus выявлены в испытуемой навеске продукта), если при последующем пересеве на агаризованные селективно-диагностические среды и подтверждении типичных и (или) атипичных колоний, выросших на этих средах, хотя бы в одной колонии будут обнаружены коагулазоположительные стафилококки или S. aureus [6].

Результаты выявления коагулазоположительных стафилококков или S. aureus записывают: обнаружены (не обнаружены) в 1 г (см3) продукта; масса или объем продукта, в котором выявляли коагулазоположительные стафилококки или S. aureus.

МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
STAPHYLOCOCCUS AUREUS

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ
ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
Минск

ВНЕСЕН Госстандартом Российской Федерации

2 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации(протокол № 11 от 25 апреля 1997 г.)

За принятие проголосовали:

Наименование национального органа по стандартизации

Главная государственная инспекция Туркменистана

3 Постановлением Государственного комитета Российской Федерации по стандартизации, метрологии и сертификации от 25 сентября 1997 г. № 341 межгосударственный стандарт ГОСТ 30347-97 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 1 июля 1998 г. с правом досрочного введения

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Июль 2000 г.

МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ

Методы определения Staphylococcus aureus

Milk and milk products. Methods for determination of staphylococcus aureus

Дата введения 1998-07-01

Настоящий стандарт распространяется на молоко и молочные продукты, закваски, бактериальные концентраты и препараты и устанавливает два метода определения Staphylococcus aureus в определенном объеме или навеске продукта - определение количества с предварительным обогащением; определение количества без предварительного обогащения.

Метод определения Staphylococcus aureus с предварительным обогащением основан на высеве навески продукта и разведении его в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, учете положительных пробирок (колб), пересеве на плотные селективные среды с последующим подтверждением принадлежности выросших колоний к Staphylococcus aureus .

Метод определения количества Staphylococcus aureus без предварительного обогащения посевом на агаризованные селективные среды основан на высеве продукта или разведении его на поверхности плотной среды, инкубировании, подсчете типичных колоний Staphylococcus aureus с последующим подтверждением выросших колоний к Staphylococcus aureus по плазмокоагулирующей способности.

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа

ГОСТ 10444.11-89 Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов

ГОСТ 27583-88 Яйца куриные пищевые. Технические условия

сухая плазма кроличья, цитратная;

контрольный штамм Staphylococcus aureus ;

калия теллурит [2], раствор с массовой концентрацией 10 г/дм 3 ;

глицин [1], раствор с массовой концентрацией 200 г/дм 3 ;

натрия пируват [8], раствор с массовой концентрацией 200 г/дм 3 ;

литий хлористый, гексагидрат [4];

экстракт дрожжевой [3] или

экстракт дрожжевой, очищенный [7];

фуксин основной [5], спиртовой раствор с массовой концентрацией 50 г/дм 3 ;

3.2 Питательные среды

3.2.3 Желточную эмульсию готовят следующим образом.

3.2.4 Солевой бульон*:

Состав: натрий хлористый ( NaCl ) - 7,5 г;

питательный сухой бульон - 1,5 г;

или гидролизованное молоко - 100 см 3 .

Приготовление: в 100 см 3 дистиллированной воды вносят 1,5 г сухого питательного бульона, кипятят 1-2 мин, фильтруют через ватный тампон, добавляют 7,5 г NaCl , устанавливают рН (6,9 ± 0,1).

Разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (10 ± 1) мин.

Или к 100 см 3 гидролизованного молока добавляют 7,5 г NaCl , устанавливают рН (6,9 ± 0,1), разливают и стерилизуют, как указано выше.

3.2.5 Желточно-солевой агар**

Состав: питательный агар***

для культивирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) [10] - 35 г

питательный агар II ***

(на основе гидролизата кормовых дрожжей) [10] - 24 г;

натрий хлористый ( NaCl ) - 75 г;

эмульсия желточная - 50,0 см 3 ;

вода дистиллированная - 1 дм 3 .

Приготовление: в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г питательного агара сухого II , добавляют 75 г хлористого натрия ( NaCl ), кипятят до полного расплавления агара, фильтруют через ватный тампон, разливают во флаконы или колбы и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин. После стерилизации охлаждают до температуры (45 ± 1) °С и добавляют 50 см 3 предварительно подготовленной желточной эмульсии. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.

3.2.6 Молочно-солевой агар**

Состав: питательный агар*** для культивирования микроорганизмов (на основе гидролизата кильки) [10] - 35 г

или питательный агар II *** (на основе гидролизата кормовых дрожжей) [10] - 24,0 г; натрий хлористый ( NaCl ) - 75,0 г;

молоко обезжиренное - 100 см 3 ;

вода дистиллированная - 1 дм 3 .

Приготовление: среду готовят, указано в 3.2.5, но после охлаждения до температуры (45 ± 1) °С добавляют вместо желточной эмульсии 100 см 3 стерильного обезжиренного молока. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки со средой хранят в холодильнике не более 5 сут.

3.2.7 Агар Байрд-Паркера * 4

Состав. Основа среды:

дрожжевой экстракт [3] - 1,0 г;

* Допускается применение солевого бульона [9], который готовится согласно указанию на этикетке.

** Допускается использовать солевой агар [9], который готовится согласно указанию на этикетке и к которому после стерилизации добавляется желточная эмульсия или обезжиренное молоко.

*** При изменении заводом-изготовителем количества вносимой среды на 1 дм дистиллированной воды, количество среды вносится согласно указанию на этикетке.

* 4 Допускается использовать агар Байрд-Паркера [9]. Среда готовится согласно указанию на этикетке.

мясной экстракт - 5,0 г;

литий хлористый, гексагидрат [4] - 5,0 г;

вода дистиллированная - 1 дм 3 .

Раствор пирувата натрия:

пируват натрия [8] - 20,0 г;

вода дистиллированная - 100 см 3 .

вода дистиллированная - 100,0 см 3 .

3.2.7.1 Приготовление основы среды: в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара.

При отсутствии мясного экстракта, триптона и дрожжевого экстракта вместо дистиллированной воды применяют 1 дм 3 мясопептонного бульона или питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой или питательный агар сухой II [10].

Все компоненты, внесенные в 1 дм 3 дистиллированной воды (мясопептонный бульон), нагревают и перемешивают до полного растворения, охлаждают до температуры 50-60 °С. Устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают в колбы или бутылки по 90 см 3 и стерилизуют при температуре (121 ± 1) °С в течение (20 ± 1) мин.

При использовании сухой среды в 1 дм 3 дистиллированной воды вносят 36 г питательного агара для культивирования микроорганизмов или 24 г питательного агара сухого II , добавляют 5 г хлористого лития. Нагревают до полного растворения, охлаждают до температуры 50-60 °С, устанавливают рН (7,2 ± 0,1), разливают и стерилизуют, как указано выше.

Готовую основу среды хранят не более 30 сут при температуре (6 ± 2) °С.

3.2.7.2 Перед использованием к 90 см 3 расплавленной основы среды добавляют асептически стерилизованные фильтрованием через мембранный фильтр растворы: 6,3 см 3 раствора глицина, 5 см 3 раствора пирувата натрия; 1 см 3 раствора теллурита калия; 5 см 3 желточной эмульсии.

Допускается растворы глицина, пирувата натрия, теллурита калия и желточную эмульсию готовить в асептических условиях на стерильной дистиллированной воде.

После тщательного перемешивания приготовленную среду разливают в чашки Петри.

Чашки со средой можно хранить не более 48 ч.

4.1 Приготовление растворов и реактивов

4.1.1 Раствор плазмы кроличьей цитратной готовится согласно инструкции по применению плазмы, прилагаемой к упаковке.

4.1.3 Приготовление реактивов для окраски по Грому

4.1.3.1 Приготовление реактива 1

В 100 см 3 этилового спирта растворяют 0,5 г кристаллического фиолетового [6].

4.1.3.2 Приготовление реактива 2

К 96 см 3 спиртового раствора йодистого калия массовой концентрацией 5 г/дм 3 добавляют 2 см 3 спиртового раствора основного фуксина [5] массовой концентрацией 50 г/дм 3 и 2 см 3 спиртового раствора йода массовой концентрацией 50 г/дм 3 .

Йодистый калий растворяют в спирте на водяной бане при температуре (45 ± 5) °С при постоянном помешивании.

5.1 Метод определения количества Staphylococcus aureus с предварительны м обогащением

5.1.1 Подготовка и проведение контроля

5.1.1.1 Из навески продукта готовят ряд десятикратных разведений по ГОСТ 9225 так, чтобы можно было определить наличие или отсутствие Staphylococcus aureus в определенной массе (объеме), указанной в нормативном документе на конкретный продукт.

5.1.1.2 Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см 3 в пробирки или колбочки с солевым бульоном (3.2.4).

Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1 : 10.

Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.

5.1.1.3 Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне, к Staphylococcus aureus делают пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркера (3.2.7), желточно-солевой агар или молочно-солевой агар (3.2.5; 3.2.6).

Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24-48 ч.

5.1.1.4 После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.

На желточно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus имеют форму плоских дисков диаметром 2-4 мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения среды.

На молочно-солевом агаре колонии Staphylococcus aureus растут в виде непрозрачных круглых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета, диаметром 2-4 мм, слегка выпуклых.

На среде Байрд-Паркера колонии Staphylococcus aureus растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний диаметром 1-1,5 мм, окруженных зоной просветления среды шириной 1-3 мм.

5.1.1.5 С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных колоний и пересеивают на поверхность скошенного питательного агара, как указано в 3.2.5, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии.

Посевы выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч. У выросших колоний определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика.

5.1.1.6 Из пяти изолированных, характерных для Staphylococcus aureus колоний, делают препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Для приготовления препарата на чистое и охлажденное после фламбирования предметное стекло наносят петлей каплю дистиллированной воды, в которую вносят петлей небольшое количество агаровой культуры, не размешивая в воде. Затем вносят петлей каплю реактива 1, приготовленного по 4.1.3.1. Смесь распределяют на участке примерно 1 см 2 , просушивают при температуре (20 ± 2) °С и фиксируют, медленно пронося предметное стекло над пламенем горелки. На одном стекле можно готовить по шесть - восемь мазков, отделяя их один от другого линиями, проведенными с лицевой стороны стекла.

Препарат ополаскивают водой и тщательно просушивают фильтровальной бумагой.

После просушивания на препарат наносят с избытком реактив 2, приготовленный по 4.1.3.2 так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность стекла. Продолжительность окрашивания 0,5 -1 мин. После окрашивания препарат быстро ополаскивают проточной водой, направляя струю под углом на стекло, помещенное вертикально. Препарат просушивают фильтровальной бумагой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Микробы, красящиеся по Граму, будут темно-фиолетового цвета, не красящиеся по Граму - красного цвета.

Стафилококки окрашиваются по Граму положительно (темно-фиолетового цвета), имеют шарообразную форму и располагаются скоплениями, чаще всего напоминающими гроздья винограда.

5.1.1.7 Постановка реакции плазмокоагуляции

В пробирку с 0,5 см 3 разведенной кроличьей плазмы вносят петлю суточной агаровой культуры. Внесенную культуру тщательно размешивают. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной, а в другую засевают контрольный штамм Staphylococcus aureus (коагулазоположительный стафилококк). Пробирки помещают в термостат и выдерживают при температуре (37 ± 1) °С в течение 3-6 ч. Если через 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то оставляют эти пробирки до 24 ч. Если через 24 ч плазма не свернулась, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.

При определении коагулазной активности реакцию считают отрицательной в тех случаях, когда в плазме не образуются отдельные нити или сгустки, или в тех случаях, когда в плазме появились отдельные нити (реакцию плазмокоагуляции оценивают на один плюс).

Реакцию считают положительной, если:

+ + + - сгусток, имеющий небольшой отсек;

+ + - сгусток в виде взвешенного мешочка.

Все три варианта являются положительным результатом.

При получении положительной реакции считают, что в посевах обнаружен Staphylococcus aureus .

5.1.2 Обработка результатов контроля

Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

5.1.3 Оформление результатов контроля

Морфологические, культуральные свойства и положительная реакция плазмокоагуляции свидетельствуют о присутствии коагулазоположительных стафилококков в засеянной массе продукта.

5.2 Метод определения количества Staphylococcus aureus без предварительного обогащения

5.2.1 Проведение контроля

5.2.1.1 1 см 3 жидкого продукта или его разведения (5.1.1) наносят на поверхность питательных сред (3.2.5 или 3.2.6 или 3.2.7) в 3 чашки Петри, тщательно растирают шпателем по поверхности питательной среды. Посевы инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение 24-48 ч. Чашки Петри с посевами инкубируют дном вверх.

5.2.1.2 После термостатирования подсчитывают количество характерных колоний на каждой чашке Петри (5.1.4). С каждой чашки Петри отбирают не менее пяти характерных и/или подозрительных колоний Staphylococcus aureus , а в случае роста менее пяти - все колонии характерные для Staphylococcus aureus и пересевают на поверхность скошенного питательного агара, разлитого в пробирки, как указано в 3.2.5, но без добавления хлористого натрия и желточной эмульсии. Пробирки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч.

У выросших культур определяют отношение к окраске по Граму и коагулированию плазмы кролика в соответствии с требованиями 5.1.6 и 5.1.7.

5.2.2 Обработка результатов контроля

Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.

Если при изучении характерных колоний в 80 % случаев, то есть не менее чем в 4 из 5 колоний подтвержден рост Staphylococcus aureus , то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашках Петри (5.1.7), принадлежат к Staphylococcus aureus . В остальных случаях количество Staphylococcus aureus определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

5.2.3 Оформление результатов контроля

Количество колоний Staphylococcus aureus в 1 г или 1 см 3 Х после определения его в определенной навеске продукта вычисляют по формуле

п - число десятикратных разведений.

Подсчитываем количество колоний Staphylococcus aureus , выросших на трех засеянных чашках при посевах продукта или его разведений:

1 г или 1 см 3 продукта - 84 96 72

10 -1 разведение - 9 10 7

10 -1 разведение - 84 96 72

10 -2 разведение - 99 10 7

[1] ТУ 6-09-09-200-84 Глицин для медицинских целей

[2] ТУ 6-09-2060-77 Калий теллуристокислый водный

[3] ТУ 6-09-3462-73 Экстракт дрожжевой. Технические условия

[4] ТУ 6-09-3751-83 Литий хлорид 1-водный. Технические условия

[5] ТУ 6-09-3804-82 Фуксин основной для микробиологических целей. Технические условия

[6] ТУ 6-09-4119-75 Кристаллический фиолетовый. Технические условия

[7] ТУ 6-09-4510-77 Экстракт дрожжевой очищенный. Технические условия

[8] ТУ 6-09-08-990-75 Натрий пировинограднокислый. Технические условия

[9] ТУ 10-02-02-789-176-94 Среды питательные сухие для определения Staphylococcus aureus . Технические условия

Ключевые слова : питательные среды, коагулазоположительные стафилококки, характерные колонии, окраска по Граму, коагулирование плазмы

ГОСТ 27583-88. На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52121-2003. Яйца куриные пищевые. Технические условия

Хотите оперативно узнавать о новых публикациях нормативных документов на портале? Подпишитесь на рассылку новостей!

Читайте также:

• Холера как биологическое оружие
• Посев из зева на стафилококк хеликс
• Через сколько дней после температуры можно делать прививку от полиомиелита
• Лягу ли я в больницу если у меня дизентерия
• Трихомонады в скрытой форме

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.