Основа агара для выделения стафилококков и бацилл

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Шепелин А.П., Полосенко О.В., Марчихина И.И., Шолохова Л.П., Дятлов И.А.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Шепелин А.П., Полосенко О.В., Марчихина И.И., Шолохова Л.П., Дятлов И.А.

Culture media for detection of staphylococci in clinical and sanitary microbiology

The article summarizes the new microbiological culture media produced in FSIS SRCAMB to improve the efficiency of diagnosis of infectious diseases, describes the advantages of these environments compared to foreign analogs, technological achievements in the field of drug development.

5 Питательные среды для выявления стафилококков

в клинической и санитарной микробиологии

О А.П. Шепелин, О.В. Полосенко, И.И. Марчихина, Л.П. Шолохова, И.А.Дятлов (D

Ï Роспотребнадзора, Московская область, п. Оболенск, Россия «в

§ Culture media for detection of staphylococci in clinical

| and sanitary microbiology

A.P. Shepelin, O.V. Polosenko, I.I. Marchikhina, L.P. Sholokhova, I.A. Dyatlov

(FSIS SRCAM&B), Obolensk, Russia

Ключевые слова: патогенные микроорганизмы; питательные среды; дифференциально-диагностические препараты; стафилококки.

Библиографическое описание: Шепелин АП, Полосенко ОВ, Марчихина ИИ, Шолохова ЛП, Дятлов ИА. Питательные среды для выявления стафилококков в клинической и санитарной микробиологии. Биопрепараты 2015; (4): 39-43.

The article summarizes the new microbiological culture media produced in FSIS SRCAMB to improve the efficiency of diagnosis of infectious diseases, describes the advantages of these environments compared to foreign analogs, technological achievements in the field of drug development. Key words: pathogens; differential diagnostic media; staphylococci; inhibition.

Bibliographic description: Shepelin AP, Polosenko OV, Marchikhina II, Sholokhova LP, Dyatlov IA. Culture media for detection of staphylococci in clinical and sanitary microbiology. Biopreparation (Biopharmaceuticals) 2015; (4): 39-43.

Стафилококки играют значительную роль в возникновении различных заболеваний человека, как в госпитальных условиях, так и вне стационара. Их роль в этиологии инфекций, вызванных грамположительными микроорганизмами, неуклонно растет. Особенно велико значение стафилококков в отделениях реанимации и интенсивной терапии, где на их долю приходится до 50% всех случаев инфекции 3.

Род стафилококков включает более 20 видов, представители которых продуцируют 50 разновидностей антигенов, способные поражать любую ткань или орган и вызывать более 100 различных заболеваний - маститы, дерматиты, пневмонии, артриты, гнойные и раневые инфекции, пищевые отравления, сепсис, а их энтеротоксины как суперантигены стимулируют избыточный синтез Т-лимфоцитов, которые через образуемый интерлейкин-2 реализуют отравляющее действие 4.

Основными видами стафилококков являются золотистый, эпидермальный и сапрофитный. Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) является наиболее критичным в масштабах воздействия на организм человека. Поражение этим видом стафилококка может затронуть самые различные органы, более того, именно этот стафилококк может спровоцировать значительное количество различных по специфике заболеваний, начиная от простейших в своем течении и заканчивая теми из них, исход которых является для больного летальным. Золотистый стафилококк располагает рядом адаптив-

ных факторов, которые обеспечивают возможность противостояния защитным механизмам организма человека

С эпидермальным стафилококком (в. epidermidis) организм человека в здоровом его состоянии справляется без труда, в то время как для людей, находящихся, например, в условиях реанимационных отделений с соответствующим состоянием организма, он, оказываясь внутри тела, провоцирует тяжелейшие заболевания. В частности, к ним относятся сепсис, эндокардит, другие, как правило, нозокомиальные, осложнения.

в. saprophyticus вызывает циститы и дизурические расстройства; реже - пиелонефрит и эндокардит.

Актуальность совершенствования методических подходов к идентификации стафилококков связана с расширением видового состава данного рода и увеличивающимся значением в патогенезе рзличных заболеваний, что относится не только коагулазоположительным, но и коагула-зоотрицательным стафилококкам. При определении таксономического положения выделенных патогенных и условно патогенных бактерий основным является бактериологический метод. Этот метод включает в себя использование накопительных и элективных питательных сред и создание условий культивирования для преимущественного накопления в культуре нужных форм микробов, способы получения чистых культур из отдельных колоний или клеток микроорганизмов [6].

Целью настоящего исследования является разработка составов отечественных питательных сред: питательной среды для выявления патогенных маннитоположительных стафилококков (агар Фогеля-Джонсона) и агара для выделения и учета коагулазоположительных стафилококков (агар Байрд-Паркера).

Материалы и методы

При разработке компонентного состава агара Фогеля-Джонсона была выполнена работа по выбору белковой основы. В качестве питательной основы использовали панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ), панкреатический ги-дролизат казеина (ПГК), триптоны отечественного производства и импортные, пептон мясной, а также, разработанный ГНЦ ПМБ гидролизат казеина низкой степени расщепления (ГКНСР). Белковой основой агара Фогеля-Джонсона является панкреатический гидролизат казеина низкой степени расщепления (ГКНСР), который обеспечивает ростовые потребности стафилококков, обладающих протеолитической активностью, но в значительной мере уменьшает скорость роста сопутствующих микроорганизмов. Белковой основой агара Байрд-Паркера является панкреатический гидролизат казеина со степенью расщепления 30-35%.

Обе среды содержат хлорид лития и теллурит калия для подавления роста сопутствующей микрофлоры. Наличие теллури-та калия вызывает почернение колоний стафилококков. Составы обеих сред оптимизированы по содержанию глицина. Было доказано, что при определенных условиях, глицин может не только стимулировать, но и ингибировать рост стафилококков.

Методика посева изучаемых микроорганизмов включала подготовку стандартных взвесей культур каждого тест-штамма, соответствующих 10 единицам по стандартному образцу мутности, с использованием стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Полученные взвеси культур методом десятикратных разведений (4,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводили до необходимых концентраций и осуществляли посев на питательные среды.

Эмульсию яичного желтка готовили по общепринятой методике, включающей приготовление 10-20% желточной взвеси, полученной из желтка, асептически выделенного из яйца и внесенного в 200 мл изотонического раствора хлорида натрия [8].

При приготовлении питательных сред использовали 2% раствор теллурита калия, производство которого организовано в ФБУН ГНЦ ПМБ.

Результаты и обсуждение

Питательная среда для выявления патогенных маннитпо-ложительных стафилококков (агар Фогеля-Джонсона)

На первом этапе исследований изучали возможность использования в качестве белковой основы широкого спектра белковых гидролизатов. Было установлено, что при использовании большинства изученных гидролизатов в составе агара Фогеля-Джонсона наблюдался эффект сплошного роения протея и слабый рост некоторых штаммов стафилококка.

Для дальнейших исследований по оптимизации состава среды в качестве белковой основы агара Фогеля-Джонсона использовали ГКНСР. Дополнительно в состав среды был введен хлористый натрий для поддержания уровня осмотического давления, необходимого для поддержания жизнедеятельности микроорганизмов, так как ГКНСР не содержит хлоридов. При использовании ГКНСР были получены хорошие ростовые свойства тест-штаммов стафилококков. Отмечено отсутствие роения протея, что является важным показателем для этой среды.

Уменьшение количества ингибиторов в составе среды изучали методом полного факторного эксперимента в несколько этапов с одновременным изучением различных вариантов питательной основы. При этом концентрации всех остальных компонентов оставались на одном уровне с контрольными средами, так как считаются оптимальными.

Дальнейшая оптимизация состава среды заключалась в определении оптимальной концентрации хлористого лития. В ходе экспериментальной работы для среды Фогеля-Джонсона в качестве оптимальной была определена концентрация хлористого лития, составляющая 3,0 г/л. Необходимость в увеличении концентрации этого ингибитора отсутствует, так как использование ГКНСР в качестве белкового компонента и подобранная концентрация теллурита калия позволила сконструировать среду с заданными параметрами. Ввиду различной потребности штаммов стафилококков в аминокислотах и пептидах возникла необходимость определить оптимальную концентрацию глицина в составе среды, так как глицин в концентрации 10,0 г/л ингибирует рост стафилококков, и только концентрация 5,0 г/л, как нами было установлено, является полноценным стимулятором роста стафилококков.

В таблице 1 представлены сравнительные биологические показатели разработанной питательной среды и импортных аналогов с уменьшенной концентрацией теллурита калия и с рекомендуемой фирмами-производителями.

Таблица 1. Сравнительная характеристика биологических показателей агаров Фогеля-Джонсона

Количество колоний, диаметр, морфология,48 ч инкубации

S. aureus Wood-46 Разведение 10-6 46, 45 1,6-1,8 Черные колонии, желтые зоны 45, 50 1,6-1,8 Черные колонии, желтые зоны Нет роста Нет роста 45, 48 3,0 Бесцветные, круглые

S. aureus 6538-P Разведение 10-6 48, 40 1,4-1,6 Черные колонии, желтые зоны 35, 42 1,7 Черные колонии, желтые зоны 5 0,8-1,0 Черные колонии, желтые зоны 28, 23 0,6-1,0 Черные колонии, желтые зоны 35, 41 3,0 Бесцветные, круглые

S. saprophyticus CCM 883 Разведение 10-6 13 0,8-1,0 Черные колонии, желтые зоны 12 0,8-1,1 Черные колонии, желтые зоны Нет роста Нет роста 17 3,0 Бесцветные, круглые

S. epidermidis ATCC 14990 Разведение 10-6 12 0,6-0,7 Черные колонии 17 0,6-0,7 Черные колонии Нет роста Нет роста 22 3,0 Бесцветные, круглые

как S. aureus Wood-46, так и S. saprophyticus CCM 883 с S. epidermidis ATCC 14990. Кроме того, диаметр колоний остальных коагулазоположительных стафилококков меньше, чем на агаре Фогеля-Джонсона ГНЦ ПМБ.

Таким образом, новая питательная среда - агар Фогеля-Джонсона ГНЦ ПМБ обеспечивает рост патогенных стафилококков и стафилококков-сапрофитов с ингибирующим эффектом в отношении сопутствующей микрофлоры. Стафилококки, ферментирующие маннит, образуют на агаре Фогеля-Джонсона черные колонии, окруженные желтой зоной, не ферментирующие маннит - черные колонии без пожелтения среды вокруг (рис. 1).

Питательный агар для выделения и учета коагулазоположительных стафилококков (агар Байрд-Паркера)

На первом этапе оптимизации агара Байрд-Паркера была проведена работа по выбору белковой основы. В качестве питательной основы использовали ПГРМ, ПГК, триптоны от-

ечественного и зарубежного производства, пептон мясной, ГКНСР.

При оптимизации агара Байрд-Паркера для выделения стафилококков наиболее приемлемой с нашей точки зрения считается концентрация 5 мл 2% раствора теллурита калия на 1 л среды и 5,0 г/л хлористого лития. Такая комбинация дает отличный рост стафилококков и ингибирует рост сопутствующей микрофлоры.

Концентрации пирувата натрия, мясного экстракта в дальнейших экспериментах оставались на одном уровне с контрольными средами, так как считаются оптимальными. Изменение соотношения этих компонентов или внедрение различных стимулирующих добавок приводило к увеличению роения протея. Различная потребность стафилококков не только в аминокислотах и пептидах, но и ростовых факторах вылилась в необходимость увеличения концентрации дрожжевого экстракта до 3 г/л и оптимизации концентрации глицина, который в количестве 10,0 г/л ингибирует рост тест-штаммов стафилококков. С этой же целью в составе среды мясной экстракт был заменен на пептон и оптимизирована его концентрация.

Новая питательная среда подавляет рост сопутствующей микрофлоры. Так, рост тест-штаммов Ps. aeruginosa 27/99, E. coliATCC 25922, Sal. typhimurium 79, Ent. faecalis ATCC 19433 (NCTC 775), E. coli 3912/41 (055:K59), B. subtilis ATCC 6633 из разведений 10-4 на агарах Байрд-Паркера отсутствует.

Расщепление лецитовителлина наблюдается в проявлении четкой непрозрачной зоны лецитиназной активности вокруг

Таблица 2. Сравнительная характеристика биологических показателей агаров Байрд-Паркера

Количество колоний, диаметр, морфология, 48 ч инкубации

S. aureus Wood-46 Разведение 10-6 48, 50 1,0-1,2 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 49, 48 1,0-1,2 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 47, 46 0,6-0,8 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 45, 48 3,0 Бесцветные, круглые

S. aureus 6538-P Разведение 10-6 55, 44 1,2-1,4 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 47, 50 1,0-1,2 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 45, 48 0,6-0,8 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 35, 41 3,0 Бесцветные, круглые

S. saprophyticus CCM 883 Разведение 10-5 Рост в виде точечных колоний черного цвета Рост в виде точечных колоний черного цвета Нет роста 17 3,0 Бесцветные, круглые

S. epidermidis ATCC 14990 Разведение 10-5 Рост в виде точечных колоний черного цвета Рост в виде точечных колоний черного цвета 10, 15 точечные 57 3,0 Бесцветные, круглые

P. mirabilis 3177 Разведение 10-4 Зоны без роения Зоны без роения Зоны без роения Сплошной рост, роение

P. vulgaris HX 19 222 Разведение 10-4 Зоны без роения Зоны без роения Зоны без роения Сплошной рост, роение

колоний, а наличие протеолиза - в формировании прозрачной зоны шириной 2-5 мм (рис. 2).

Таким образом, следует отметить, что в результате проведенных исследований разработаны две питательные среды - агар Фогеля-Джонсона и агар Байрда-Паркера, предназначенные для выделения и определения количества ко-агулазоположительных стафилококков из клинического материала, пищевых продуктов и других объектов. Установле-

но, что по совокупности биологических показателей питательные среды ФБУН ГНГЦ ПМБ не только не уступают, но по ряду показателей превосходят импортные аналоги. Государственная регистрация новых питательных сред и внедрение их в практику санитарных и клинических исследований позволит отказаться от закупки дорогостоящих импортных препаратов.

1. Установлено, что оптимальной белковой основой агара Фогеля-Джонсона является панкреатический гидроли-зат казеина низкой степени расщепления (ГКНСР), который обеспечивает ростовые потребности стафилококков, обладающих протеолитической активностью, но в значительной мере уменьшает скорость роста сопутствующих микроорганизмов; белковой основой агара Байрд-Паркера - панкреатический гидролизат казеина со степенью расщепления 30-35%.

2. Определено количественное соотношение основных компонентов питательных сред: Фогеля-Джонсона и Байрд-Паркера, обеспечивающих рост патогенных стафилококков и стафилококков-сапрофитов с ингибирующим эффектом в отношении сопутствующей микрофлоры.

3. Показано, что стафилококки, ферментирующие ман-нит, образуют на агаре Фогеля-Джонсона черные колонии, окруженные желтой зоной, не ферментирующие маннит -черные колонии без пожелтения среды вокруг; на агаре Байрд-Паркера колонии стафилококков проявляют две характерные особенности: вокруг колоний наблюдаются зоны и кольца, образующиеся в результате липолиза и протеолиза.

1. Акатов АК, Зуева ВС. Стафилококки. М.: Медицина; 1983.

2. Тотолян АА, Малеев ВВ. Современные проблемы кокковых инфекций. Микробиология 2001; (2): 117-20.

3. Сидоренко СВ. Механизмы резистентности микроорганизмов. В кн.: Страчунский ЛС, Белоусов ЮБ, Козлов СН, ред. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. М.: Боргес; 2002.

4. Беляков ВД. Стафилококки и стафилококковая инфекция. Саратов; 1980.

5. Поздеев ОК. Медицинская микробиология. М.: ГЭОТАР-Мед; 2001.

6. Омарова СМ, Баснакьян ИА, Артемова ТА. Сухие питательные среды для культивирования кокковых культур. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 2005; (6): 30-3.

7. Методы контроля бактериологических питательных сред. Методические указания 4.2.2316-08. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2008.

8. Лабинская АС, Блинкова ЛП, Ещина АС, ред. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина; 2004.

1. AkatovAK, Zueva VS. Staphylococci. M.: Meditsina; 1983 (in Russian).

2. Totolyan AA, Maleev VV. Modern problems of cocci infections. Mikrobiologiya 2001; (2): 117-20 (in Russian).

3. Sidorenko SV. Mechanisms of microbial resistance. In: Strachunskiy LS, Belousov YuB, Kozlov SN, eds. Practical Guide to anti-infective chemotherapy. Moscow: Borges; 2002 (in Russian).

4. Belyakov VD. Staphylococci and staphylococcal infection. Saratov; 1980 (in Russian).

5. Pozdeev OK. Medical Microbiology. Moscow: GEOTAR-Med; 2001 (in Russian).

6. Omarova SM, Basnakyan IA, Artemova TA. Dry culture media for the cultivation of cocci cultures. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii 2005; (6): 30-3 (in Russian).

7. Control methods of bacteriological culture media. Guidelines 4.2.231608. Moscow: Federal Center of Hygiene and Epidemiology; 2008 (in Russian).

8. Labinskaya AS, Blinkova LP, Eschina AS, eds. General and sanitary microbiology techniques with microbiological studies. Moscow: Meditsina; 2004 (in Russian).

Shepelin AP. Deputy Director for scientific and production work. Doctor of Biological Sciences.

Polosenko OV. Senior researcher of Laboratory of microbiological and physico-chemical methods of analysis of scientific and production department of culture media. Candidate of Biological Sciences.

Marchihina II. Head of Laboratory of microbiological and physico-chemical methods of analysis of scientific and production department of culture media.

Sholohova LP. Head of Section of microbiological studies of Laboratory of microbiological and physico-chemical methods of analysis of scientific and production department of culture media.

Dyatlov IA. Director. Doctor of Medical Sciences, professor, corresponding member of Russian Academy of Sciences.

Шепелин Анатолий Прокопьевич. Заместитель директора по научно-производственной работе, д-р биол. наук.

Полосенко Ольга Вадимовна. Старший научный сотрудник лаборатории микробиологических и физико-химических методов анализа научно-производственного отдела питательных сред, канд. биол. наук.

Марчихина Ирина Ивановна. Заведующий лабораторией микробиологических и физико-химических методов анализа научно-производственного отдела питательных сред.

Шолохова Любовь Петровна. Заведующий сектором микробиологических исследований лаборатории микробиологических и физико-химических методов анализа научно-производственного отдела питательных сред.

Дятлов Иван Алексеевич. Директор, д-р мед. наук, профессор, член-корр. РАН.

Адрес для переписки: Шепелин Анатолий Прокопьевич; ¡nfo@ obolensk.org

Поступила 26.10.2015 г Принята 06.1 1.2015 г

Терехов В.И., Крамарь П.В. ФГБОУ ВПО "Кубанский
государственный аграрный университет", г. Краснодар
Малышева Т.В. ФГБОУ ВПО "Кубанский
государственный медицинский университет", г. Краснодар
Скориков А.В. госветуправление Краснодарского края, г. Краснодар

В рамках реализации национального проекта "Развитие АПК" в сельскохозяйственные предприятия субъектов страны в т.ч. Краснодарского края были завезены из-за рубежа высокопродуктивные коровы, в большинстве своём голштинской породы. Однако в течение года до 30-50% завезенного поголовья выбывало по различным причинам. Исследованиями ряда специалистов установлено, что чаще всего коровы данной породы заболевают и выбраковываются в течение первого месяца после родов, при этом у них диагностируют заболевания конечностей, печени, нарушения обмена веществ, сердечно-сосудистой системы, причина которых связывается, в основном, с несбалансированностью рациона [1, 5, 6].

Однако, на практике весьма распространенным явлением оказывается тот факт, что при тщательном теоретическом подборе рациона для коров, фактически оказывается, что животные не в состоянии его освоить. При этом в лучшем случае продуктивность животных не изменяется, а в худшем - происходит снижение продуктивности, рост заболеваемости и выбытия коров.

Усвояемость кормовых нутриентов и общая переваримость ингредиентов кормосмеси у коров может зависеть не только от состава рациона, но и функциональной активности органов пищеварения самих животных. Принято считать, что "дополнительным органом" пищеварительной системы жвачных является микрофлора преджелудков. Между тем, в процессах завершающей деградации, элиминации, синтеза ряда биологически активных веществ и постоянной антигенной стимуляции играет микрофлора дистального отдела кишечника [1, 6-8]. Поэтому, как нам представляется, стартовым механизмом развития многих патологических процессов, в том числе и некробактериоза у высокопродуктивных коров, могут быть глубокие нарушения в микробиоценозе их пищеварительного тракта.

В связи с этим целью работы было изучение качественного и количественного состава микрофлоры дистального отдела кишечника здоровых и больных некробактериозом коров.

Материалы и методы. Исследованию подвергли 30 здоровых коров голштинской породы (10 сухостойных, 10 новотельных и 10 в 1-ой фазе лактации) и 10 больных некробактериозом.

Фекалии для бактериологических исследований отбирали непосредственно из прямой кишки в утреннее время в стерильные пластиковые контейнеры. Из фекалий делали 10 десятикратных разведений и производили посев на специальные среды. В качестве по-следних использовали агар Эндо (для выделения энтеробактерий), агар Виль-сон-Блер (для выделения клостридий), агар с теллуритом калия (для выделения энтерококков), 10% солевой агар (для выделения стафилококков), агар Сабуро (для выделения грибов), полужидкий бифидоагар (НПО "Питательные среды", г.Махачкала) с добавлением неомицина (для выделения бифидобактерий), полужидкий питательный агар с ка-намицином (для выделения бактероидов), агар Квасникова (для выделения молочно-кислых бактерий), мясо-пептонный агар (для выделения мезофильных аэробных бактерий). Посевы инкубировали при 370С (за исключением посевов на грибы, которые инкубировали при комнатной температуре) в течение 72 ч, при этом ежедневно учитывали рост и проводили микроскопию появившихся колоний. Культивирование посевов для выделения молочно-кислых бактерий осуществляли в газовой среде с использованием газогенерирующих пакетов "Анаэро-газ". Кроме того, в фекалиях определяли целлюлозолитическую, амилолитическую и протеолитическую (по трипсину) активность микрофлоры по методам описанным Т.И. Каблучеевой (2004) [2].

Результаты исследований. При бактериологическом и химическом исследовании фекалий сухостойных коров было установлено (табл.1 и 2), что в них присутствуют эшерихии, энтерококки, лактобакте-рии, слизеобразующие бациллы, плесневые и дрожжеподобные грибы, бифидобактерии, бактероиды и клостридии. Однако, количество данных микроорганизмов было разным. Больше всего в фекалиях содержалось бифидобактерий и бактероидов - 6,7 и 5,9 lg КОЕ/г соответственно. Лактобактерий, эшерихий и слизеобразующих бацилл было в пределах 4,7, 4,25 и 4,0 lg КОЕ/г, соответственно. Количество энтерококков и клостридий составляло, в среднем, 2,5 и 2,0 lg КОЕ/г, соответственно. Микроскопических грибов из рода Mucor и Candida составило, в среднем, 1,5 lg КОЕ/г. Стафилококки ни в одном случае выделены не были.

Таблица 1. Количественный состав микроорганизмов дистального отдела кишечника у здоровых и больных некробактериозом коров, lg КОЕ/г

1 фаза лактации

Больные некробактериозом коровы

Таблица 2. Ферментативная активность кишечной микрофлоры здоровых и больных некробактериозом коров

1 фаза лакта­ции

Больные некробактериозом коровы

Протеолитическая активность, мкг/мл трипсина

Целлюлозолитическая активность кишечной микрофлоры составила 18,3%, протеолитическая активность 67 мкг/мл трипсина, амилолити-ческая активность 70,4%.

У новотельных коров из фекалий высевались те же микроорганизмы, что и у сухостойных коров, однако несколько в ином в количественном отношении. Количество бифидобактерий составило, в среднем, 5,8 lg КОЕ/г, бактероидов - 6,0, эшерихий - 4,75, бацилл и молочнокислых бактерий - 4,25, клостридий и плесневых грибов - 2,25, энтерококков и грибов кандида - 2,75 и 2,0 lg КОЕ/г, соответственно.

Целлюлозолитическая активность кишечной микрофлоры составила 18,5%, протеолитическая - 56 мкг/мл трипсина, амилолитическая - 48,3%.

Результаты исследований фекалий коров 1-й фазы лактации показали, что у всех животных высевалась кишечная палочка, плесневые грибы из рода Aspergillus и Mucor, слизеобразующие бациллы, лактобак-терии и энтерококки количество которых составляло в среднем соответственно 4,75, 2,5, 5,5, 4,0 и 3,0 lg КОЕ/г. Бактерии из родов Bacteroides и Bifidum выделены нами только у 60% коров. Их концентрация была соответственно 6,3 и 5,7 lg КОЕ/г. У 40% животных выделили клостридии в концентрации 3,0 lg КОЕ/г. Стафилококки не были выделены ни в одном случае.

Целлюлозолитическая активность кишечной микрофлоры составила 18,8%, протеолитическая - 45,6 мкг/мл трипсина, амилолитическая - 44,7%.

Следовательно, результаты исследований свидетельствуют о бедности микробного пейзажа толстого отдела кишечника у обследованных коров, в видовом составе которого не выявлено какого-либо превалирующего положения тех или иных микроорганизмов. Между тем, то обстоятельство, что количество симбионтных бактерий находится на низком уровне (особенно у лакирующих коров), свидетельствует о наличии дисбиоза. Данное состояние препятствует качественному протеканию пищеварительного процесса и усвояемости кормовых составляющих рациона. Об этом косвенно могут свидетельствовать показатели це-люлозолитеческой, протеолитической и амилолитической активности фекальной микрофлоры. Результаты проведенных исследований также свидетельствуют о влиянии рациона кормления коров на качественный и количественный состав их кишечной микрофлоры и её ферментативную активность. Ввод в рацион значительного количества концентрированных кормов не только не способствует увеличению численности са-харолитических бактерий, но и снижает её энзиматическую активность. Особенно это показательно на примере амилолитической и протеолитической активности, значения которых у сухостойных коров, получающих минимум концентратов и сочных кормов, в 1,5-2 раза выше, чем у коров 1-й фазы лактации, в рационе которых наиболее высокий процент ввода концентратов, силоса и сенажа.

Результаты бактериологического исследования фекалий больных некробактериозом коров показали (табл. 1), что по качественному составу микрофлоры дистального отдела не отличается от состава у здоровых животных. А именно у больных также как и здоровых коров были выделены эшерихии, энтерококки, бациллы, лакто- и бифидобактерии, бактероиды, клостридии, плесневые и дрожжеподобные грибы. В тоже время, по количественному составу имелись существенные различия, которые проявлялись большим (на 1-2 порядка) содержанием кишечной палочки, энтерококков, бактероидов и клостридий при одновременно меньшим на 1-2 порядка содержанием лакто- и бифидобактерий. Количественное присутствие бацилл и микромицетов было у здоровых и больных коров примерно одинаковым.

Кроме того, было установлено, что у исследуемых животных разной была ферментативная активность кишечной микрофлоры (табл. 2). У больных некробактериозом коров целлюлозолитическая активность была на уровне 15,5%, протеолитическая активность - 39,6 мкг/мл трипсина, амилолитическая активность - 35,0%, что в 1,2-2 раза меньше, чем у здоровых животных из группы сухостойных, новотельных и коров 1-й фазы лактации.

Заключение. Таким образом, в хозяйствах, неблагополучных по некробактериозу, у здоровых коров до родов, и особенно в первый месяц после родов, состояние микробиоценоза кишечного тракта характеризуется дисбиотическими изменениями. Данные изменения могут напрямую влиять как на процессы пищеварения и усвояемость кормовых нутриентов, так и на напряженность неспецифической (колонизационной) защиты организма животных. У больных некробактериозом коров состояние кишечного микробиоценоза находится в состоянии выраженного дисбаланса, которое проявляется не только диспропорцией в соотношении симбиотных, сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов, но и значительным снижением ферментативной активности кишечной микрофлоры. В связи с чем, при проведении мероприятий, направленных на ликвидацию или профилактику некробактериоза необходимо осуществлять меры по нормализации микробного состава в кишечном тракте коров.

Список литературы

1. Гимранов, В.В. Этиология, характер распространенности и особенности патологий в области пальцев у коров голштино-фризской породы / В.В. Гимра-нов, Р.А. Утеев, А.Ф. Гилязов // Аграрный вестник Урала, 2010. -N°3. -С.77-79.
2. Каблучеева, Т.И. Использование пробиотиков в птицеводстве /Т.И. Каблучеева. -Краснодар: КГАУ, 2004. -107с.
3. Крапивина, Е.В . Мониторинговое исследование защитных функций и микробиоценоза толстого кишечника у лактирующих коров / Е.В. Крапивина, Д.В. Иванов, М.В. Игнатенко // Проблемы биологии продуктивных животных, 2010.-N°3. -С. 5-10.
4. Кряжевских, Л. Метод T-RFLP - основа профилактики некробактери-оза скота / Л. Кряжевских, Г. Лаптев // Животноводство России, 2009. -N°10.-С.38-40.
5. Мищенко, В.А. Анализ причин заболеваний высокопродуктивных коров /В.А. Мищенко // Вестник ОрелГАУ, 2008. -N°2. -С.21-24.
6. Шкуратова, И.А. Распространение и особенности проявления нарушений обмена веществ у высокопродуктивных коров Свердловской области/ И.А. Шкуратова, Н.А. Верещак, А.И. Белоусов и др. // Сб.науч. трудов ведущих ученых России и Зарубежья. -Екатеринбург: Уральское из-во, 2010. -Вып.3. -С.472-474).
7. Collinder Eje Intestinal functions in animals/ Stockholm, Sweden, 2001. -67p.
8. Leroy, R.V. Normal Intestinal Flora of Cattle Fed High-Roughage Rations / R.V. Leroy, R.Kay // Journal of Bacteriology. 1965. -Vol.89. -N°5. -P. 1244-1249.

Стартовым механизмом развития многих патологических процессов у высокопродуктивных коров, в том числе и некробактериоза, могут быть глубокие нарушения в микробиоценозе их пищеварительного тракта. Цель работы - изучение качественного и количественного состава микрофлоры дистального отдела кишечника здоровых и больных некробактериозом коров. Исследованию подверглись 10 сухостойных, 10 новотельных, 10 в первой фазе лактации и 10 больных некробак-териозом коров. Фекалии для бактериологических исследований отбирали непосредственно из прямой кишки в утреннее время в стерильные пластиковые контейнеры. Из фекалий делали 10 десятикратных разведений и производили посев на специальные среды. Культивирование посевов для выделения молочнокислых бактерий осуществляли в газовой среде с использованием газогенерирующих пакетов "Анаэрогаз". Целлюлозолитическую, амилолитическую и протеолитическую (по трипсину) активность кишечной микрофлоры осуществляли по методам, описанным Т.И. Каблучеевой (2004).

Установлено, что после отела в течение месяца у коров происходят существенные изменения в количественном составе и ферментативной активности кишечной микрофлоры, так количество лактобактерий и бифидобактерий снизилось с 4,7 и 6,7 lg КОЕ/г у сухостойных коров до 4,0 и 5,7 lg КОЕ/г у коров первой фазы лактации. У коров, больных некробактериозом, количество этих микроорганизмов было ещё более низким и находилось в диапазоне 3,7 и 4,25 lg КОЕ/г. В тоже время, количество микромицетов, клостридий, бактероидов, бацилл, энтерококков и эшерихий увеличилось на 1-2 порядка, что является свидетельством ярко выраженного дисбактериоза. Таким образом, у здоровых коров в первый месяц после родов состояние микробиоценоза кишечного тракта характеризуется как дисбиотическое, что может напрямую влиять как на процессы пищеварения и усвояемость кормовых нутриентов, так и на напряженность колонизационной резистентности организма животных, а, следовательно, на заболеваемость их некробактериозом. У больных некробактериозом коров состояние кишечного микробиоценоза находится в состоянии выраженного дисбаланса, которое проявляется не только диспропорцией в соотношении симбиотных, сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов, но и значительным снижением ферментативной активности кишечной микрофлоры.

Ключевые слова: Коровы, дистальный отдел кишечника, кишечный микробиоценоз, дисбактериоз, кишечная микрофлора, симбионты, некробактериоз. Сведения об авторах

Крамарь Павел Владимирович, соискатель кафедры микробиологии, эпизоотологии и вирусологии факультета ветеринарной медицины Кубанского государственного аграрного университета; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина,13; тел. 890946656609.

Малышева Татьяна Вячеславовна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры микробиологии ФГБОУ ВПО "Кубанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации; 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4, тел. 89182422225.

Скориков Александр Владимирович, кандидат биологических наук, заместитель руководителя государственного управления ветеринарии Краснодарского края; 350000, г. Краснодар, ул. Рашпилевская, 36; тел.: 8(918)3145411.

INTESTINAL MICROBIOTA STATE IN HEALTHY COWS AND AT NECROBACTERIOSIS

Terekhov V.I., Malysheva T.V., Kramar P.V., Skorikov A.V.

Necrobacillosis is factorial infectious disease, occurrence of which depends on the conditions and feeding of animals. The aim of research was to examine the qualitative and quantitative composition of the distal gut microflora of cows and its enzymatic activity in different physiological periods and at necrobacteriosis. At necrobacteriosis intestinal microbiota state is in marked imbalance, which is evident not only in the ratio imbalance of symbiontic, saprophytic and opportunistic pathogens, but also in a significant decrease of enzymatic activity of the intestinal microflora. At necrobacteriosis number of lactobacilli and bifidobacteria were even lower, ranging 3,7 and 4,25 lg CFU/g, when the number of micromycetes, Clostridium, Bacteroides, bacilli, enterococci and Escherichia increased by 1-2 times. So, for elimination or prevention of necrobacteriosis intestinal microbial structure must be normalized.

Key words: cow, distal intestine, intestinal microbiocenosis, dysbiosis, intestinal microflora, symbionts, necrobacteriosis.

References

1. Gimranov V.V., Uteev R.A., Gilyazov A.F. Etiologiya, kharakter rasprostranennosti i osobennosti patologii v oblasti paltsev u korov golshtinofrizskoy porody [Etiology, character of prevalence and disorder peculiarities of Holstein-Friesian cows' fingers]. - Agrarny vestnik Urala. - Yekaterinburg, 2010 (3). - pp.77-79.
2. Kablucheeva T.I. Ispol'zovanie probiotikov v ptitsevodstve [Probiotic use in poultry breeding]. - Krasnodar, 2004. -107 p.
3. Krapivina E.V., Ivanov D.V., Ignatenko M.V. Monitoringovoe issledovanie zashchitnykh funktsiy i mikrobiotsenoza tolstogo kishechnika u laktiruyushchikh korov [Monitoring study of protective functions and microbiocenosis of the large intestine in lactating cows]. - 2010: pp. 5-10.
4. Kryazhevskikh L., Laptev G . Metod T-RFLP - osnova profilaktiki nekrobakterioza skota [T-RFLP - basic method of prevention of cattle necrobacteriosis]. - Zhivotnovodstvo Rossii. - Moscow, 2009 (10). - pp.38-40.
5. Mishchenko V.A . Analiz prichin zabolevaniy vysokoproduktivnykh korov [Analysis of causes of diseases of high yielding cows]. - Vestnik OrelGAU. - Orel, 2008 (2). - pp.21-24.
6. Shkuratova I.A., Vereshchak N.A., Belousov A.I. Rasprostranenie i osobennosti proyavleniya narusheniy obmena veshchestv u vysokoproduktivnykh korov Sverdlovskoy oblasti [Distribution and features of display of metabolic disorders in high yielding cows of Sverdlovsk area]. - Yekaterinburg, 2010. - pp.472-474.
7. -8. Vide supra.

Kramar Pavel V., applicant of the department of microbiology, epizootiology and virology of the Kuban State Agrarian University; 13, Kalinina st., Krasnodar, 350044; phone: 8(909)46656609.