Может ли мазок на трихомонады быть ошибочным

ПЦР или посев на трихомонаду ?

(молекулярный или культуральный метод?)

ПЦР определяет трихомонаду плохо , так как для трихомонады необходима слизь, а не соскоб, поэтому требуется отдельный образец, что неудобно для врача, забирающего анализ. Даже первая порция свежевыпущенной мочи с центрифугированием более информативно у мужчин. Лучше, сок простаты или эякулят.

Кроме того, самих клеток трихомонады бывает немного в образцах, но клетки крупные, потому под микроскопом они хорошо видны, а ПЦР отказывается их брать как единичные копии геномной ДНК.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ МОЧЕПОЛОВОГО ТРИХОМОНИАЗА

(Выделение и идентификация Trichomonas vaginalis в культурах)

Принцип: выявление влагалищной трихомонады в клиническом материале с помощью увеличения количества возбудителя при выращивании в искусственных питательных средах и последующей идентификации живых культур.

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА СКДС (готовится ex tempore)

Среда СКДС - солевой раствор (хлорид натрия - 6,5 г, хлорид калия -0,14 г, хлорид кальция - 0>12 г, бикарбонат натрия - 0,2 г, 0,5% раствор метиленового синего - 0,5 мл, дистиллированная вода - 1 л) - 100 мл, гидролизат казеина для парентерального белкового питания - 10 мл, дрожжевой аутолизат - 1.0 мл, сыворотка крови лошадей или крупного рогатого скота без консерванта - 30 мл, 20% раствор мальтозы - 10 мл, пенициллин и стрептомицин - по 160000 ОТ/мл.

Изготовление среды: представленные в рецептах растворы в объёме, который приведен, сливают в стерильную колбу, смешивают, доводят рН до 6,3, добавляют антибиотики из расчёта 1000 ЕТ любого на 1 мл полученной смеси, снова перемешивают, разливают по 5 мл в стерильные пробирки, на поверхность среды в них наливают стерильное вазелиновое масло (высота пласта – 5 г). Сохраняют перед использованием при 4°С не больше 2 недель.

Изготовление препарата: при выращивании на редких питательных средах влагалищные трихомонады дают придонный рост в виде компактного белого осадка, из которого пастеровской пипеткой берут материал для исследования в нативном препарате. Осадок наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом. Микроскопическое исследование культур следует проводить на 3-5-е, при отрицательных результатах - на 7-9-е, 11-17-е сутки после посева, так как продолжительность цикла развития влагалищной трихомонады в культуре зависит от посевной дозы.

Микроскопия: Исследование проводят под микроскопом с естественным или искусственным освещением (объектив 40, окуляр 7 или 10). Влагалищные трихомонады в поле зрения могут быть отдельными или размещаться большими сосредоточениями, активно двигаться, при этом хорошо распознаётся движение жгутиков и ундулирующей мембраны.

ТЕСТ IN POUCH ™ TV ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ TRICHOMONAS VAGINALIS ( производство BIOMED DIAGNOSTICS, Inc. США).

Тест IN Pouch TV представляет собой диагностическую систему для обнаружения Trichomonas vaginalis как у мужчин, так и у женщин. Тест IN Pouch содержит высокоселективную питательную среду для Т. Vaginalis, способствующую раннему выявлению инфекции и выявляющую меньшее число организмов по сравнению с другими селективными питательными средами методами. Это означает, что пациент получает необходимое лечение намного быстрее, и можно легко обнаружить менее острые инфекции. Данная тест-система является уникальной для транспортировки. Приготовление нативного мазка и выращивание культуры сочетаются в одной процедуре. Компактный, небьющийся тест-система InPouch TV поддерживает жизнеспособность микроорганизмов в течение 96 часов транспортировки до помещения в термостат. Данный тест-прибор устраняет риск доступа лаборанта к патогенным микроорганизмам III класса.

• Может применяться в условиях амбулатории. Не требуется

подготовка стёкол и центрифугирование.

• Возможность выявления Trichomonas в образцах мочи.

• Тест является менее трудоёмким благодаря сочетанию двух

процедур в одном тесте.

• Тест способен обнаруживать единичные трихомонады. Тест

является намного более чувствительным по сравнению с методом микроскопии нативного мазка.

• Реактивы можно хранить при комнатной температуре. Срок

ПРОЦЕДУРА ВЫПОЛНЕНИЯ ТЕСТА

Тест In Pouch TV представляет собой автономную систему для обнаружения Т. v aginalis в женских вагинальных образцах и в мужских образцах мочи. Патентованная питательная среда является селективной для транспортировки и роста Т. vaginalis, одновременно ингибируя рост посторонних микроорганизмов, способных повлиять на правильный диагноз. Тест In Pouch TV включает в себя защитный барьер в виде пластикового тест-пакета, устойчивого к проникновению кислорода, состоящего из двух камер (полостей) V-образной формы, которые соединены между собой узким проходом. Двухкамерная система позволяет производить непосредственное наблюдение за только что отобранными образцами в верхней камере до попадания инокулята в нижнюю камеру, где происходит инкубация культуры (т.е трихомонаду можно определить сразу во взятом материале при наличии достаточного количества подвижных жгутиковых форм). Образец можно концентрировать, позволяя клеточным материалам выпадать в осадок перед визуальным исследованием. Наблюдение за камерой под микроскопом осуществляется при помощи специального пластикового зажима для микроскопии. Инокулят, содержащий от 1 до 10 организмов, является достаточным для получения положительного результата анализа. Тестирование во время транспортировки и вне лабораторных условий можно легко производить благодаря гибкой упаковке и цельной конструкции тест - прибора In Pouch TV

Питательная среда тест-системы In Pouch TV содержит следующие компоненты: триптиказа, претеозный пептон, дрожжевой экстракт, мальтозу и другие виды сахара, аминокислоты, соли, антигрибковые и антибактериальные агенты в забуференом физиологическом растворе.

• Данный тест предназначен исключительно для лабораторной

• Со всеми образцами следует обращаться в соответствии с

инструкциями по работе с потенциально инфекционной

сывороткой и другими жидкими средами организма. Поскольку

тест-прибор In Pouch TV содержит инфекционные материалы, его

уничтожение следует производить в автоклаве или другим

аналогичным способом обезвреживания.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ХРАНЕНИЮ ИЗДЕЛИЯ

• In Pouch TV следует хранить при комнатной

температуре - от +18°С. до + 25°С.

• Не рекомендуется подвергать изделие воздействию

температуры, превышающей +25°С, так как может произойти

• Срок годности данного изделия составляет 12 месяцев от даты

изготовления. Пластиковая плёнка тест-мешочка является

весьма устойчивой к потере влаги, тем не менее,

незначительная потеря влаги может происходить.

• Тест-пакеты следует хранить в вертикальном положении, в

специально предназначенных закрытых коробочках.

Питательную среду нельзя хранить в холодильнике или замораживать!

Нельзя использовать тест - прибор In Pouch TV, содержащий мутную питательную среду или осадок!

Если необходимо создать активную трихомонадную культуру, инокулируйте 1-2 капли (30 мкл) активно развивающейся культуры в новый мешочек и инкубируйте содержимое при +37°С от 24 до 48 часов с последующей выдержкой при +32°С. Субкультура является жизнеспособной от 2 до 4 дней, в зависимости от изолята.

Субкультирование следует проводить после того, как концентрация организма достигнет уровня 1 х104 в 1 мл.

МАТЕРИАЛЫ, ВХОДЯЩИЕ В ТЕСТ-НАБОР

• Комплект из 10 тест-систем In Pouch TV.

• Микроскопический зажим для тест-системы In Pouch TV.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ПРИБОРЫ И МАТЕРИАЛЫ

• Бинокулярный микроскоп с объективами 10х, 20х или 40х.

• Одноразовые перчатки для работы с образцами и

• Одноразовые стеклянные пипетки для инокуляции осадка

• Тампон для взятия образца у пациента.

ОТБОР, ТРАНСПОРТИРОВКА И ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ

Тест-прибор In Pouch TV может служить средством для транспортировки образцов. Пластиковый защитный тест-пакет устойчив к повреждениям, а питательная среда поддерживает жизнеспособность микроорганизмов во время транспортировки. После проведения инокуляции в тест-прибор образец следует хранить при температуре от +18°С до + 37°С в ожидании появления культуры. Желательно, чтобы каждый образец был прокультивирован в день отбора, хотя образцы могли поддерживать жизнеспособность трихомонад в течение 24 часов при температуре +18аС.

Хранение в холодильнике не рекомендуется, так как в течение 3-£ часов жизнеспособность трихомонад нарушается.

Указывайте имя пациента и номер медицинской карты на этикетке на специально отведенном участке тест-набора In Pouch TV в тех случаях, когда забор и инокуляция производятся у постели больного. Не закрывайте (этикеткой) 1-1/2 дюйма нижней части тест-мешочка.

Женские вагинальные образцы: Взятие образцов проводится из заднего свода (posterior fornix) при помощи специального тампона Culturette swab. Можно также использовать ватные или дакроновые тампоны с деревянными или пластиковыми стержнями.

Мужские образцы мочи: Мочу (минимальное количество-15 мл) собирают в чистый контейнер для отбора образцов с завинчивающейся крышкой; после этого образец затем центрифугируется в течение 5 минут для выделения осадка при скорости вращения 500 об/мин.

Мужские уретральные образцы: Образцы отбирают с помощью тампонов или желобоватых зондов.

ПРОЦЕДУРА ВЫПОЛНЕНИЯ ТЕСТА

1. Инокуляция. Извлеките из коробочки мешочек с тестом In Pouch

TV. Расправьте мешочек во избежание образования загибов.

Убедитесь в том, что жидкость, содержащаяся в верхней камере,

находится ниже уровня ленты покрытия во избежание случайного

пролива жидкости во время вскрытия тест-пакета. Разорвите тест-

пакет вдоль линии метки, расположенной над покрытием. Раскройте

тест-пакет так, чтобы можно было ввести тампон, раздвинув в

стороны петли, расположенные в средней части ленты покрытия.

Вставьте тампон с образцом в жидкость верхней камеры тест-

пакета. Аккуратно выделите образец из тампона, сжимая его между

стенками верхней камеры, после чего поместите тампон в контейнер

для биологически опасных материалов. При проведении инокуляции

осадка мочи (прибл. 1-2 капли), осадок можно инокулировать в тест-

пакет с помощью одноразовой стеклянной стерильной пипетки.

Появление пузырьков в процессе инокуляции должно быть сведено

к минимуму. Если нет необходимости в срочном исследовании под

микроскопом взятого материала, переходите к пункту №4.

2. Срочная интерпретация результатов микроскопического исследования (нативный препарат).

Сожмите закрытый тест-пакет, отогните верхний край вниз и трижды скатайте. Затяните проволочные концы петель, расположенных на ленте, за пакет стем, чтобы зажать скатанный участок. Поместите верхнюю камеру тест-пакета на возвышенную платформу открытого пластмассового зажима микроскопа, расположив пакет таким образом, чтобы нижняя часть верхней камеры оказалась на несколько мм выше нижней границы зажима. Закройте и зафиксируйте зажим над мешочком. Мешочек следует осматривать с верхней стороны (со стороны открытого смотрового окошка) зажима микроскопа. Проводите наблюдение под микроскопом под малым увеличением (1ООх или 200х). Используйте большое увеличение (400х) без иммерсии в случаях, когда требуется подтверждение. Если трихомонады не просматриваются в верхней камере тест-пакета, это означает, что инокуляция содержит менее 100 организмов. После завершения просмотра снимите зажим с микроскопа.

3. Срочная концентрация образцов. Клеточный материал можно

концентрировать, если подержать мешочек в вертикальном

положении не менее 15 минут перед микроскопией. Обычно

трихомонады концентрируются в нижней части камеры. В таком

случае зажим для микроскопа устанавливают, как описано в пункте

№2. Проведите микроскопическое исследование с целью

обнаружения подвижных организмов.

4. Культивирование и интерпретация результатов

микроскопического исследования. Быстро переместите

содержимое из верхней камеры мешочка в нижнюю камеру.

Скатывайте тест-пакет сверху вниз до тех пор, пока лента не займёт

положение сверху этикетки. Загните проволочные концы петелек на

ленте с тем, чтобы зажать скатанный участок. Выполнение данного

действия способствует поддержанию анаэробных условий

культивирования. Инкубируйте тест-пакеты в вертикальном

положении при температуре +37°С в течение 18-24 часов. Перед

интерпретацией результатов надавите пакет о край стола снизу

вверх (« 5 раз), чтобы перемешать содержимое. Поместите нижнюю

часть нижней камеры на возвышенную платформу открытого

зажима микроскопа, затем закройте и зафиксируйте зажим над тест-

пакетом. Посмотрите под микроскопом под малым увеличением

(1ООх). Наилучшее положение в тест-мешочке, способствующее

обнаружению трихомонад - немного выше нижнего края пакета.

Проводите ежедневную оценку результатов исследования с целью

обнаружения подвижных трихомонад на протяжении 5-7 дней. Не принимайте ошибочное движение коричневой массы мельчайших частиц побочных веществ (продуктов распада клеток) за проявление активности трихомонад.

Специфичность: Исключительно для культивирования T . vaginalis. Другие виды Trichomonas теряют жизнеспособность и не воспроизводятся под воздействием рН и состава питательной среды, содержащейся в тест-приборе In Pouch TV. Культивирование: Т. vaginalis воспроизводится в течение нескольких часов после инокуляции в тест-системе In Pouch TV. Инокулят, содержащей от 1 до 10 организмов, является достаточным для получения положительного результата при тестировании.

Дополнительные виды образцов: амниотическую жидкость, секрет предстательной железы и сперму также можно исследовать и культивировать на предмет присутствия T . vaginalis. Полезный совет: В связи с тем, что сканированию подвергается большой объём жидкости, требуется гораздо больший объём питательной среды при тестировании с помощью тест-прибора In Pouch TV по сравнению с подготовкой влажного препарирования (wet mount). Обратите главное внимание на жидкость, а не на текстурированный пластиковый материал тест-пакета. Дрожжевые грибки: В тест-приборе In Pouch TV питательная среда подавляет, но полностью не устраняет рост дрожжевых грибков. Ключевые клетки и дрожжи можно наблюдать при микроскопическом исследовании.

Ограниченные возможности теста: В случае загрязнения образцов пациента противозачаточными губками или гелями происходит замедленное выделение (микроорганизмов).

Kультуральные исследования для диагностики мочеполового трихомониаза (выделение и идентификация Trichomonas vaginalis в культурах): питательная среда СКДС и Тест In Pouch TV (производство Biomed Diagnostics, I nc. США). Рассмотрена техника взятия материала, проведения исследований и интерпретация результатов. Описан межлабораторный и внутрилабораторный контроль качества результатов, а также показания к применению тестов. Приводятся ограничения и возможные источники ошибок при проведении исследований.

Тест In Pouch ™ TV является окончательным диагностическим средством.

• ФГУН "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера" Роспотребнадзора, Санкт-Петербург.

Резюме. Лабораторная диагностика трихомониаза - обязательная составляющая при постановке диагноза урогенитальный трихомоноз. Обзор освещает диагностические методы, направленные на выявление простейшего, антигенов T.vaginalis, специфических антител и ДНК возбудителя. Отражены существующие проблемы в интерпретации результатов и сведения об эффективности применения того или иного метода в алгоритме обследования пациентов.

Ключевые слова: лабораторная диагностика, урогенитальный трихомониаз.

The laboratory diagnostic of genitourinary trichomoniasis (literature review)

Abstract. The laboratory diagnostics of trichomoniasis is strongly recommended for the diagnosis confirmation. Current review summarizes diagnostic methods directed to identification by morphology of protozoa, by antigenic properties of T.vaginalis, by specific antibodies and by the pathogen DNA detection. Overview reflects the existing problems in the interpretation of results and information about the efficacy of each method in the patient's examination algorithm.

Key words: laboratory diagnostics, urogenital trichomoniasis.

Трихомониаз в структуре ИППП

Одно из центральных мест в структуре заболеваемости инфекциями, передающимися половым путем, занимает трихомоноз. Он широко распространен в странах Африки, Южной и Юго-Восточной Азии, а также в странах с большим притоком эмигрантов. В последние годы продолжается положительная тенденция к снижению уровня заболеваемости трихомонозом, однако отмечается рост скрытых и малосимптомных форм инфекции, затрудняющих своевременную диагностику трихомониаза и лечение [7,11].

Особенно распространен трихомоноз среди женщин [33], однако вопрос о значении T.vaginalis в патологии беременности остается открытым из-за противоречивости информации по этому вопросу [23,26]. Клиническая картина урогенитального трихомоноза характеризуется отсутствием специфических признаков и примерно у 50 % инфицированных трихомонозом имеет место бессимптомный характер течения заболевания, т.е. возможно трихомонадоносительство [49]. Недовыявление трихомонад - причина неконтролируемого их распространения среди сексуально активного населения. В результате это приводит к развитию хронических орхоэпидидимитов и простатитов у мужчин, а также хронических аднекситов у женщин, что в итоге может служить причиной бесплодия, невынашивания беременности, патологии новорожденных [25,29].

Трихомоноз имеет важное медицинское, социальное и экономическое значение не только из-за высокой распространенности инфекции, но и из-за доказанной роли T.vaginalis как кофактора ВИЧ-инфекции и рака шейки матки [33].

Диагностика урогенитального трихомониаза основывается на обнаружении в исследуемом материале T.vaginalis. Диагноз не может быть поставлен исключительно на основании клинической картины, поскольку патогномоничные симптомы встречаются только у 2 % пациенток. Ещё в 1980 году были представлены результаты, свидетельствующие о том, что если диагноз трихомоноза устанавливать только на основании клинической картины, то 88 % инфицированных T.vaginalis женщин будет дан ложноотрицательный результат, а у 29 % неинфицированных диагноз был бы поставлен ошибочно [27]. В связи с тем, что клинические симптомы зачастую не отражают реальной картины заболевания, в обязательном порядке необходимо применение лабораторных методов диагностики трихомониаза, причем актуальна задача своевременного проведения исследования.

До настоящего времени в соответствии с протоколом ведения больных урогенитальным трихомониазом [14] основными методами обнаружения трихомонад являются микроскопический и культуральный, т.е. прямая идентификация возбудителя в мазке либо при культивировании на питательной среде. Но сложилась парадоксальная ситуация: при высоком уровне заболеваемости трихомонозом в России отсутствует производственный выпуск стандартных, разрешенных к применению препаратов и питательных сред для диагностики трихомониаза. В практике используют зарубежные среды, что влияет на стоимость исследования, или приготовленные по прописям в лабораториях, что влияет на воспроизводимость и достоверность получаемых результатов.

Диагностика трихомониаза существенно осложнилась в последние годы в связи с распространенностью нетипичных округлых форм T.vaginalis, обнаруживаемых при световой микроскопии витальных препаратов [3].

Исторически микроскопия - это первый метод в лабораторной диагностике трихомоноза. Его использование экономически целесообразно в силу простоты и возможности одновременного просмотра мазка и на другие возбудители. Микроскопия может производиться в нативном препарате или в препарате, окрашенном по различным методикам. Нативный препарат необходимо исследовать в течение 10 минут после забора материала, поскольку утрачивается подвижность возбудителя, клетка округляется и получение однозначного результата затрудняется [30]. В положительных случаях микроскопии нативного препарата трихомонады обнаруживаются в виде грушевидной, овальной или округлой формы по величине несколько превосходящей лейкоциты [5]. Для подвижных форм характерны толчкообразные движения за счет жгутиков и ундулирующей мембраны, которые особенно хорошо видны при исследовании в микроскопе с темнопольным конденсором. Необходимо отличать подвижность T.vaginalis от подвижных жгутиковых представителей семейства Bodonidae. Подвижные бактерии, прикрепленные к лейкоцитам и создающие ложное впечатление движения, также вероятно ошибочно идентифицировать как крупную трихомонаду.

Микроскопия окрашенных препаратов несколько повышает процент выявления трихомонад по сравнению с нативными препаратами в силу того, что учитываются не только типичные жгутиковые, но и амастиготные формы. Кроме того окрашенные препараты можно использовать для косвенной оценки воспалительного процесса - скопление лейкоцитов на клетках плоского эпителия или вокруг них. Еще один косвенный признак урогенитального трихомоноза - наличие большого количества слизи в исследуемом материале [6]. Правда, с увеличением количества лейкоцитов в отделяемом из уретры у мужчин больных урогенитальным трихомонозом, вероятность получения ложноположительных результатов культуральным и микроскопическим методами увеличивается [12].

В препаратах, окрашенных метиленовым синим, трихомонады наблюдаются в виде округлой или овальной формы, расположенные в слизи между клеточными элементами. Четко просматривается оболочка паразитов, эксцентрично расположенное ядро, интенсивно окрашенное в синий цвет, протоплазма - светло-синяя, вакуоли - бесцветные. При таком способе окраски трихомонады имеют характерный вид и хорошо распознаются [8]. Для более детального просмотра клетки и выявления хорошо идентифицируемых жгутиков следует использовать дифференциальные методы окраски по Романовскому-Гимзе, Лейшману.

В целом микроскопия нативного препарата считается высокоспецифичным тестом (99,8 %), но имеет низкую чувствительность - от 38 % до 82 %. [1,10 ,17,48]. Во многом это связано с высокой долей субъективизма при визуальной оценке результатов.

В связи с низкой чувствительностью микроскопического метода и в соответствии с протоколом ведения больных урогенитльным трихомониазом [14] идентификацию T.vaginalis следует проводить культуральным методом, считающимся, по мнению большинства исследователей, "золотым стандартом".

Первое in vitro культивирование T.vaginalis было проведено в 1915 г [36]. С тех пор разработаны разные варианты жидких и полужидких питательных сред для диагностики трихомониаза: среда Джонсона-Трасселя (СPLM), Даймонд среда, модифицированная Даймонд среда с добавлением тиогликолята натрия, среда Купферберг STS, среда Купферберг Difco, среда InPouch TV, среда TYM.

Известна попытка создания бессывороточной питательной среды для культивирования трихомонад [35]. Была предложена синтетическая питательная среда, в которой лошадиная сыворотка была заменена на бычий сывороточный альбумин и холестерин, совместно либо с глицериновыми жирными кислотами, либо со смесью жирных кислот. Однако на такой модифицированной среде скорость роста и урожай T.vaginalis были низкими.

В 70-80-х годах прошлого века в отделе микробиологии ЦНИИКВИ была разработана модифицированная среда Джонсона-Трасселя - среда СКДС [5]. В состав этой среды входят: смесь гидролизата казеина и гидролизина или аминопептида, отходы фармацевтической промышленности при изготовлении лизоцима, ферментативный гидролизат биомассы микроорганизмов, а также экстракт кормовых дрожжей. Коммерчески среда СКДС не выпускается.

В настоящее время отечественные производители выпускают следующие готовые питательные среды: питательная среда для выявления влагалищных трихомонад (ООО "Диагност-Мед", г. Омск), основа питательной среды для культивирования трихомонад (НПО "Микроген", г. Махачкала) и питательная среда СВТ для визуальной диагностики трихомониаза (НИИЭМ имени Пастера, г. Санкт-Петербург).

Исследования, посвященные сравнению питательных сред, немногочисленны. Так, в США в 1989 г. были проведены сравнительные испытания питательных сред, используемых для культивирования T.vaginalis. В качестве посевного материала они использовали клинические образцы вагинальных секретов от больных трихомонозом [43]. Частота обнаружения на разных питательных средах была следующей: Даймонд среда (93,9 %), модифицированная Даймонд среда с добавлением тиогликолята натрия (92,3 %), среда Купферберг STS (38,5 %) и среда Купферберг Difco (49,2 %). Были отмечены высокие ростовые свойства питательной среды Даймонд и положительный эффект добавления. Авторы, однако, указывают на низкую селективность исследованных питательных сред в отношении дрожжеподобных грибов (в 32 % случаев наблюдался рост дрожжеподобных грибов).

В Англии в 1997 г было проведено сравнительное исследование чувствительности питательных сред InPouch TV, Diamond и Джонсона-Трасселя [21]. В 4 мл каждой из трех сред добавляли по 30 мкл инокулюма. Результат оценивали на первые, вторые и четвертые сутки. Было показано, что наибольшей чувствительностью обладает питательная среда InPouch TV (87 %) по сравнению с Diamond (60 %) и Джонсона-Трасселя (57 %).

Культуральная диагностика трихомониаза напрямую зависит от выпускаемых питательных сред. В оптимальном алгоритме лабораторной диагностики обязательной ступенью должно быть культуральное исследование, причем с использованием качественных стандартизированных питательных сред [9]. Этот вывод подтверждается исследованиями, проведенными в 1990 г в ЦНИКВИ [2], которые показали, что подавляющее число больных трихомонозом (72,8 %), как среди женщин, так и среди мужчин, были выявлены при использовании культурального метода.

Использование иммунохимических методов обнаружения антигенов возбудителя, таких как иммуноферментный анализ (ИФА) и реакция иммунофлуоресценции (РИФ), особенно актуально в случаях невозможности проведения культурального исследования или при расхождении результатов культурального и микроскопического методов.

Было показано, что чувствительность РИФ ниже, чем культурального исследования, но выше микроскопии нативного препарата [44]. Однако эта во многом субъективная методика к тому же требует отдельной обработки каждого мазка и люминесцентного микроскопа. Одновременная обработка всех проб в планшете и автоматическая детекция цветовых продуктов ферментативной реакции исправили некоторые основные недостатки РИФ.

В работах 80-х годов ИФА давал соизмеримый с культуральным методом процент положительных результатов. Однако авторы указывали, что из-за очевидной гетерогенности изолятов T.vaginalis при описываемых ими условиях ни один из них не имеет моноклональных антител, способных связываться с антигенами в клинических образцах [31,47]. Использование в качестве антигена отдельных иммуногенных белков для получения моноклональных антител несколько изменило сложившееся представление, и была продемонстрирована возможность обнаружения почти 90 % из протестированных клинических изолятов с положительным ответом.

Кроме того, явное преимущество этого метода перед методом "золотого стандарта" - это отсутствие строгих температурных требований. Авторы отмечают, что, возможно, важным звеном в получении достоверного результата служит процедура получения клинического материала, и важно использовать для образца буферный раствор, вследствие того, что помещение организма в фосфатно-солевой буферный раствор позволяет ему освобождать антигенную детерминанту, необходимую для связывания с антителом. Из этого следует, что ранее приписываемая гетерогенность T.vaginalis может быть обусловлена недоступностью антигенных детерминант для антитела, а не отсутствием антигена на поверхности трихомонады [34].

Стоит подчеркнуть, что в России отсутствуют коммерческие разрешенные к применению ИФА и РИФ тест-системы для диагностики трихомониаза.

Изучением иммунологии трихомоноза занимаются уже долгое время [3]. В литературе мало информации о природе иммунного ответа при трихомонозе, неизвестно влияние макро и микроорганизмов на наличие или отсутствие симптомов. Однако понятно, что природа этого механизма неоднозначна и многообразна [20].

Большая часть противотрихомонадных антител принадлежит к IgG-классу [37]. Тем не менее, в сыворотках больных женщин выявляют повышенное содержание специфических IgM, и IgA антител, а при остром трихомонозе в вагинальных смывах отмечается увеличение IgA [28]. Для определения противотрихомонадных антител у пациентов в разные годы пытались использовать реакцию связывания комплимента (РСК) [18], внутрикожную пробу [8], реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) [32, 37, 38], реакцию непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) [13].

В 1981 году для серодиагностики трихомоноза впервые был использован метод иммуноферментного анализа (ИФА). При использовании в качестве "подложки" цельноклеточного антигена чувствительность составила всего 80,4 % [45]. Позднее были предприняты попытки использовать в качестве антигена цистеиновые протеиназы T.vaginalis, поскольку предполагается, что они вовлечены в патогенез. Специфичность в этом случае составила 100 %, однако чувствительность не превысила 90 % [20, 46].

В России подобных работ не проводилось, и, по мнению наших исследователей, чувствительность метода составляет чуть более 30 %, и его использование может быть рекомендовано только в качестве вспомогательного теста [16]. Низкая эффективность серологических методов в диагностике трихомониаза связана также с тем, что антитрихомонадные антитела могут циркулировать в сыворотке крови в течение длительного времени после лечения, а значит, практически невозможно дифференцировать текущую и пролеченную формы заболевания [19].

Методы, основанные на выявлении нуклеиновых кислот. Методы генодиагностики на основе определения специфических нуклеотидных последовательностей (мишеней) ДНК возбудителя появились сравнительно недавно. Уже в 1992 Riley D. E. впервые сообщил об использовании ПЦР в диагностике трихомоноза [41]. В работе было показано, что этот метод при использовании электрофоретического способа регистрации результатов помогает выявлять от 10 до 100 трихомонад в исследуемом материале.

Чувствительность и специфичность ПЦР во многом обусловлена правильным выбором мишеней для амплификации [42]. В наибольшей степени исследованные локусы в геномах простейших - это гены рибосомальных РНК, отличающиеся мультикопийностью (254 копии 18S рРНК/на клетку T.vaginalis) [22]. Наряду с геном 18S pРНК исследован ген бета-тубулина T.vaginalis. Использование праймеров из этого гена обеспечивало чувствительность равную 98 % в сравнении с культуральным методом системы InPouch [39]. Вместе с тем, оценивая эффективность праймеров, следует учитывать генетически обусловленную внутривидовую вариабельность Т.vaginalis. Сравнение пяти наборов диагностических праймеров показало, что чувствительность ПЦР, в первую очередь, зависит от выбора праймеров и, в меньшей степени, от способа регистрации результата: иммуноферментный метод детекции продуктов ПЦР показал лучший результат, чем электрофорез в геле [24].

Согласно современным представлениям, применение метода ПЦР оправдано при диагностике латентного течения трихомоноза, для выявления Т.vaginalis при микст-инфекции урогенитального тракта, при скрининговых исследованиях (в комплексе с микроскопическим методом), а также для контроля качества микроскопического исследования. В целом, эффективность диагностики существенно повышается при использовании ПЦР в сочетании с культуральным и/или микроскопическими методами исследования.

Из-за отсутствия четкой клинической картины при хронических и стертых формах трихомоноза только лабораторные методы выявляют этиологический агент и устанавливают диагноз заболевания. В лабораторной диагностике острого трихомоноза при наличии в исследуемом материале типичных форм паразитов микробиологические методы дают однозначно интерпретируемые результаты, тогда как хронический трихомоноз, обусловленный неподвижными округлыми трихомонадами, представляет определенные трудности и требует использования комплекса лабораторных методов. Отметим, что, при очевидных преимуществах ПЦР, основным референс методом остается культуральное исследование.