Методические рекомендации по видовой идентификации стафилококков

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Шепелин А.П., Полосенко О.В., Марчихина И.И., Шолохова Л.П., Дятлов И.А.

Culture media for detection of staphylococci in clinical and sanitary microbiology

The article summarizes the new microbiological culture media produced in FSIS SRCAMB to improve the efficiency of diagnosis of infectious diseases, describes the advantages of these environments compared to foreign analogs, technological achievements in the field of drug development.

5 Питательные среды для выявления стафилококков

в клинической и санитарной микробиологии

О А.П. Шепелин, О.В. Полосенко, И.И. Марчихина, Л.П. Шолохова, И.А.Дятлов (D

Ï Роспотребнадзора, Московская область, п. Оболенск, Россия «в

§ Culture media for detection of staphylococci in clinical

| and sanitary microbiology

A.P. Shepelin, O.V. Polosenko, I.I. Marchikhina, L.P. Sholokhova, I.A. Dyatlov

(FSIS SRCAM&B), Obolensk, Russia

Ключевые слова: патогенные микроорганизмы; питательные среды; дифференциально-диагностические препараты; стафилококки.

Библиографическое описание: Шепелин АП, Полосенко ОВ, Марчихина ИИ, Шолохова ЛП, Дятлов ИА. Питательные среды для выявления стафилококков в клинической и санитарной микробиологии. Биопрепараты 2015; (4): 39-43.

Bibliographic description: Shepelin AP, Polosenko OV, Marchikhina II, Sholokhova LP, Dyatlov IA. Culture media for detection of staphylococci in clinical and sanitary microbiology. Biopreparation (Biopharmaceuticals) 2015; (4): 39-43.

Стафилококки играют значительную роль в возникновении различных заболеваний человека, как в госпитальных условиях, так и вне стационара. Их роль в этиологии инфекций, вызванных грамположительными микроорганизмами, неуклонно растет. Особенно велико значение стафилококков в отделениях реанимации и интенсивной терапии, где на их долю приходится до 50% всех случаев инфекции 1.

Род стафилококков включает более 20 видов, представители которых продуцируют 50 разновидностей антигенов, способные поражать любую ткань или орган и вызывать более 100 различных заболеваний - маститы, дерматиты, пневмонии, артриты, гнойные и раневые инфекции, пищевые отравления, сепсис, а их энтеротоксины как суперантигены стимулируют избыточный синтез Т-лимфоцитов, которые через образуемый интерлейкин-2 реализуют отравляющее действие 4.

Основными видами стафилококков являются золотистый, эпидермальный и сапрофитный. Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) является наиболее критичным в масштабах воздействия на организм человека. Поражение этим видом стафилококка может затронуть самые различные органы, более того, именно этот стафилококк может спровоцировать значительное количество различных по специфике заболеваний, начиная от простейших в своем течении и заканчивая теми из них, исход которых является для больного летальным. Золотистый стафилококк располагает рядом адаптив-

ных факторов, которые обеспечивают возможность противостояния защитным механизмам организма человека

С эпидермальным стафилококком (в. epidermidis) организм человека в здоровом его состоянии справляется без труда, в то время как для людей, находящихся, например, в условиях реанимационных отделений с соответствующим состоянием организма, он, оказываясь внутри тела, провоцирует тяжелейшие заболевания. В частности, к ним относятся сепсис, эндокардит, другие, как правило, нозокомиальные, осложнения.

в. saprophyticus вызывает циститы и дизурические расстройства; реже - пиелонефрит и эндокардит.

Актуальность совершенствования методических подходов к идентификации стафилококков связана с расширением видового состава данного рода и увеличивающимся значением в патогенезе рзличных заболеваний, что относится не только коагулазоположительным, но и коагула-зоотрицательным стафилококкам. При определении таксономического положения выделенных патогенных и условно патогенных бактерий основным является бактериологический метод. Этот метод включает в себя использование накопительных и элективных питательных сред и создание условий культивирования для преимущественного накопления в культуре нужных форм микробов, способы получения чистых культур из отдельных колоний или клеток микроорганизмов [6].

Целью настоящего исследования является разработка составов отечественных питательных сред: питательной среды для выявления патогенных маннитоположительных стафилококков (агар Фогеля-Джонсона) и агара для выделения и учета коагулазоположительных стафилококков (агар Байрд-Паркера).

Материалы и методы

При разработке компонентного состава агара Фогеля-Джонсона была выполнена работа по выбору белковой основы. В качестве питательной основы использовали панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ), панкреатический ги-дролизат казеина (ПГК), триптоны отечественного производства и импортные, пептон мясной, а также, разработанный ГНЦ ПМБ гидролизат казеина низкой степени расщепления (ГКНСР). Белковой основой агара Фогеля-Джонсона является панкреатический гидролизат казеина низкой степени расщепления (ГКНСР), который обеспечивает ростовые потребности стафилококков, обладающих протеолитической активностью, но в значительной мере уменьшает скорость роста сопутствующих микроорганизмов. Белковой основой агара Байрд-Паркера является панкреатический гидролизат казеина со степенью расщепления 30-35%.

Обе среды содержат хлорид лития и теллурит калия для подавления роста сопутствующей микрофлоры. Наличие теллури-та калия вызывает почернение колоний стафилококков. Составы обеих сред оптимизированы по содержанию глицина. Было доказано, что при определенных условиях, глицин может не только стимулировать, но и ингибировать рост стафилококков.

Методика посева изучаемых микроорганизмов включала подготовку стандартных взвесей культур каждого тест-штамма, соответствующих 10 единицам по стандартному образцу мутности, с использованием стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Полученные взвеси культур методом десятикратных разведений (4,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводили до необходимых концентраций и осуществляли посев на питательные среды.

Эмульсию яичного желтка готовили по общепринятой методике, включающей приготовление 10-20% желточной взвеси, полученной из желтка, асептически выделенного из яйца и внесенного в 200 мл изотонического раствора хлорида натрия [8].

При приготовлении питательных сред использовали 2% раствор теллурита калия, производство которого организовано в ФБУН ГНЦ ПМБ.

Результаты и обсуждение

Питательная среда для выявления патогенных маннитпо-ложительных стафилококков (агар Фогеля-Джонсона)

На первом этапе исследований изучали возможность использования в качестве белковой основы широкого спектра белковых гидролизатов. Было установлено, что при использовании большинства изученных гидролизатов в составе агара Фогеля-Джонсона наблюдался эффект сплошного роения протея и слабый рост некоторых штаммов стафилококка.

Для дальнейших исследований по оптимизации состава среды в качестве белковой основы агара Фогеля-Джонсона использовали ГКНСР. Дополнительно в состав среды был введен хлористый натрий для поддержания уровня осмотического давления, необходимого для поддержания жизнедеятельности микроорганизмов, так как ГКНСР не содержит хлоридов. При использовании ГКНСР были получены хорошие ростовые свойства тест-штаммов стафилококков. Отмечено отсутствие роения протея, что является важным показателем для этой среды.

Уменьшение количества ингибиторов в составе среды изучали методом полного факторного эксперимента в несколько этапов с одновременным изучением различных вариантов питательной основы. При этом концентрации всех остальных компонентов оставались на одном уровне с контрольными средами, так как считаются оптимальными.

Дальнейшая оптимизация состава среды заключалась в определении оптимальной концентрации хлористого лития. В ходе экспериментальной работы для среды Фогеля-Джонсона в качестве оптимальной была определена концентрация хлористого лития, составляющая 3,0 г/л. Необходимость в увеличении концентрации этого ингибитора отсутствует, так как использование ГКНСР в качестве белкового компонента и подобранная концентрация теллурита калия позволила сконструировать среду с заданными параметрами. Ввиду различной потребности штаммов стафилококков в аминокислотах и пептидах возникла необходимость определить оптимальную концентрацию глицина в составе среды, так как глицин в концентрации 10,0 г/л ингибирует рост стафилококков, и только концентрация 5,0 г/л, как нами было установлено, является полноценным стимулятором роста стафилококков.

В таблице 1 представлены сравнительные биологические показатели разработанной питательной среды и импортных аналогов с уменьшенной концентрацией теллурита калия и с рекомендуемой фирмами-производителями.

Таблица 1. Сравнительная характеристика биологических показателей агаров Фогеля-Джонсона

Количество колоний, диаметр, морфология,48 ч инкубации

S. aureus Wood-46 Разведение 10-6 46, 45 1,6-1,8 Черные колонии, желтые зоны 45, 50 1,6-1,8 Черные колонии, желтые зоны Нет роста Нет роста 45, 48 3,0 Бесцветные, круглые

S. aureus 6538-P Разведение 10-6 48, 40 1,4-1,6 Черные колонии, желтые зоны 35, 42 1,7 Черные колонии, желтые зоны 5 0,8-1,0 Черные колонии, желтые зоны 28, 23 0,6-1,0 Черные колонии, желтые зоны 35, 41 3,0 Бесцветные, круглые

S. saprophyticus CCM 883 Разведение 10-6 13 0,8-1,0 Черные колонии, желтые зоны 12 0,8-1,1 Черные колонии, желтые зоны Нет роста Нет роста 17 3,0 Бесцветные, круглые

S. epidermidis ATCC 14990 Разведение 10-6 12 0,6-0,7 Черные колонии 17 0,6-0,7 Черные колонии Нет роста Нет роста 22 3,0 Бесцветные, круглые

как S. aureus Wood-46, так и S. saprophyticus CCM 883 с S. epidermidis ATCC 14990. Кроме того, диаметр колоний остальных коагулазоположительных стафилококков меньше, чем на агаре Фогеля-Джонсона ГНЦ ПМБ.

Таким образом, новая питательная среда - агар Фогеля-Джонсона ГНЦ ПМБ обеспечивает рост патогенных стафилококков и стафилококков-сапрофитов с ингибирующим эффектом в отношении сопутствующей микрофлоры. Стафилококки, ферментирующие маннит, образуют на агаре Фогеля-Джонсона черные колонии, окруженные желтой зоной, не ферментирующие маннит - черные колонии без пожелтения среды вокруг (рис. 1).

Питательный агар для выделения и учета коагулазоположительных стафилококков (агар Байрд-Паркера)

На первом этапе оптимизации агара Байрд-Паркера была проведена работа по выбору белковой основы. В качестве питательной основы использовали ПГРМ, ПГК, триптоны от-

ечественного и зарубежного производства, пептон мясной, ГКНСР.

При оптимизации агара Байрд-Паркера для выделения стафилококков наиболее приемлемой с нашей точки зрения считается концентрация 5 мл 2% раствора теллурита калия на 1 л среды и 5,0 г/л хлористого лития. Такая комбинация дает отличный рост стафилококков и ингибирует рост сопутствующей микрофлоры.

Концентрации пирувата натрия, мясного экстракта в дальнейших экспериментах оставались на одном уровне с контрольными средами, так как считаются оптимальными. Изменение соотношения этих компонентов или внедрение различных стимулирующих добавок приводило к увеличению роения протея. Различная потребность стафилококков не только в аминокислотах и пептидах, но и ростовых факторах вылилась в необходимость увеличения концентрации дрожжевого экстракта до 3 г/л и оптимизации концентрации глицина, который в количестве 10,0 г/л ингибирует рост тест-штаммов стафилококков. С этой же целью в составе среды мясной экстракт был заменен на пептон и оптимизирована его концентрация.

Новая питательная среда подавляет рост сопутствующей микрофлоры. Так, рост тест-штаммов Ps. aeruginosa 27/99, E. coliATCC 25922, Sal. typhimurium 79, Ent. faecalis ATCC 19433 (NCTC 775), E. coli 3912/41 (055:K59), B. subtilis ATCC 6633 из разведений 10-4 на агарах Байрд-Паркера отсутствует.

Расщепление лецитовителлина наблюдается в проявлении четкой непрозрачной зоны лецитиназной активности вокруг

Таблица 2. Сравнительная характеристика биологических показателей агаров Байрд-Паркера

Количество колоний, диаметр, морфология, 48 ч инкубации

S. aureus Wood-46 Разведение 10-6 48, 50 1,0-1,2 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 49, 48 1,0-1,2 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 47, 46 0,6-0,8 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 45, 48 3,0 Бесцветные, круглые

S. aureus 6538-P Разведение 10-6 55, 44 1,2-1,4 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 47, 50 1,0-1,2 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 45, 48 0,6-0,8 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 35, 41 3,0 Бесцветные, круглые

S. saprophyticus CCM 883 Разведение 10-5 Рост в виде точечных колоний черного цвета Рост в виде точечных колоний черного цвета Нет роста 17 3,0 Бесцветные, круглые

S. epidermidis ATCC 14990 Разведение 10-5 Рост в виде точечных колоний черного цвета Рост в виде точечных колоний черного цвета 10, 15 точечные 57 3,0 Бесцветные, круглые

P. mirabilis 3177 Разведение 10-4 Зоны без роения Зоны без роения Зоны без роения Сплошной рост, роение

P. vulgaris HX 19 222 Разведение 10-4 Зоны без роения Зоны без роения Зоны без роения Сплошной рост, роение

колоний, а наличие протеолиза - в формировании прозрачной зоны шириной 2-5 мм (рис. 2).

Таким образом, следует отметить, что в результате проведенных исследований разработаны две питательные среды - агар Фогеля-Джонсона и агар Байрда-Паркера, предназначенные для выделения и определения количества ко-агулазоположительных стафилококков из клинического материала, пищевых продуктов и других объектов. Установле-

но, что по совокупности биологических показателей питательные среды ФБУН ГНГЦ ПМБ не только не уступают, но по ряду показателей превосходят импортные аналоги. Государственная регистрация новых питательных сред и внедрение их в практику санитарных и клинических исследований позволит отказаться от закупки дорогостоящих импортных препаратов.

1. Установлено, что оптимальной белковой основой агара Фогеля-Джонсона является панкреатический гидроли-зат казеина низкой степени расщепления (ГКНСР), который обеспечивает ростовые потребности стафилококков, обладающих протеолитической активностью, но в значительной мере уменьшает скорость роста сопутствующих микроорганизмов; белковой основой агара Байрд-Паркера - панкреатический гидролизат казеина со степенью расщепления 30-35%.

2. Определено количественное соотношение основных компонентов питательных сред: Фогеля-Джонсона и Байрд-Паркера, обеспечивающих рост патогенных стафилококков и стафилококков-сапрофитов с ингибирующим эффектом в отношении сопутствующей микрофлоры.

3. Показано, что стафилококки, ферментирующие ман-нит, образуют на агаре Фогеля-Джонсона черные колонии, окруженные желтой зоной, не ферментирующие маннит -черные колонии без пожелтения среды вокруг; на агаре Байрд-Паркера колонии стафилококков проявляют две характерные особенности: вокруг колоний наблюдаются зоны и кольца, образующиеся в результате липолиза и протеолиза.

1. Акатов АК, Зуева ВС. Стафилококки. М.: Медицина; 1983.

2. Тотолян АА, Малеев ВВ. Современные проблемы кокковых инфекций. Микробиология 2001; (2): 117-20.

3. Сидоренко СВ. Механизмы резистентности микроорганизмов. В кн.: Страчунский ЛС, Белоусов ЮБ, Козлов СН, ред. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. М.: Боргес; 2002.

4. Беляков ВД. Стафилококки и стафилококковая инфекция. Саратов; 1980.

5. Поздеев ОК. Медицинская микробиология. М.: ГЭОТАР-Мед; 2001.

6. Омарова СМ, Баснакьян ИА, Артемова ТА. Сухие питательные среды для культивирования кокковых культур. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 2005; (6): 30-3.

7. Методы контроля бактериологических питательных сред. Методические указания 4.2.2316-08. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2008.

8. Лабинская АС, Блинкова ЛП, Ещина АС, ред. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина; 2004.

1. AkatovAK, Zueva VS. Staphylococci. M.: Meditsina; 1983 (in Russian).

2. Totolyan AA, Maleev VV. Modern problems of cocci infections. Mikrobiologiya 2001; (2): 117-20 (in Russian).

3. Sidorenko SV. Mechanisms of microbial resistance. In: Strachunskiy LS, Belousov YuB, Kozlov SN, eds. Practical Guide to anti-infective chemotherapy. Moscow: Borges; 2002 (in Russian).

4. Belyakov VD. Staphylococci and staphylococcal infection. Saratov; 1980 (in Russian).

5. Pozdeev OK. Medical Microbiology. Moscow: GEOTAR-Med; 2001 (in Russian).

6. Omarova SM, Basnakyan IA, Artemova TA. Dry culture media for the cultivation of cocci cultures. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii 2005; (6): 30-3 (in Russian).

7. Control methods of bacteriological culture media. Guidelines 4.2.231608. Moscow: Federal Center of Hygiene and Epidemiology; 2008 (in Russian).

8. Labinskaya AS, Blinkova LP, Eschina AS, eds. General and sanitary microbiology techniques with microbiological studies. Moscow: Meditsina; 2004 (in Russian).

Shepelin AP. Deputy Director for scientific and production work. Doctor of Biological Sciences.

Polosenko OV. Senior researcher of Laboratory of microbiological and physico-chemical methods of analysis of scientific and production department of culture media. Candidate of Biological Sciences.

Marchihina II. Head of Laboratory of microbiological and physico-chemical methods of analysis of scientific and production department of culture media.

Sholohova LP. Head of Section of microbiological studies of Laboratory of microbiological and physico-chemical methods of analysis of scientific and production department of culture media.

Dyatlov IA. Director. Doctor of Medical Sciences, professor, corresponding member of Russian Academy of Sciences.

Шепелин Анатолий Прокопьевич. Заместитель директора по научно-производственной работе, д-р биол. наук.

Полосенко Ольга Вадимовна. Старший научный сотрудник лаборатории микробиологических и физико-химических методов анализа научно-производственного отдела питательных сред, канд. биол. наук.

Марчихина Ирина Ивановна. Заведующий лабораторией микробиологических и физико-химических методов анализа научно-производственного отдела питательных сред.

Шолохова Любовь Петровна. Заведующий сектором микробиологических исследований лаборатории микробиологических и физико-химических методов анализа научно-производственного отдела питательных сред.

Дятлов Иван Алексеевич. Директор, д-р мед. наук, профессор, член-корр. РАН.

Адрес для переписки: Шепелин Анатолий Прокопьевич; ¡nfo@ obolensk.org

Поступила 26.10.2015 г Принята 06.1 1.2015 г

Купить Методические рекомендации — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку "Купить" и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
Курьерская доставка (7 дней)
Самовывоз из московского офиса
Почта РФ

Разработаны в помощь специалистам органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, и лечебно-профилактических учреждений, осуществляющих организацию и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий по борьбе с внутрибольничными инфекциями

Дата введения	23.07.2006
Добавлен в базу	01.09.2013
Актуализация	01.02.2020

23.07.2006	Утвержден	Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Издан	Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора	2006 г.
Разработан	Государственное учреждение Научно-исследовательский институт микробиологии и эпидемиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН
Разработан	Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека

Метициллинрезистентные
Staphylococcus aureus – возбудители
внутрибольничных инфекций:
идентификация и генотипирование

Метициллинрезистентные Staphylococcus aureus - возбудители внутрибольничных инфекций: идентификация и генотипирование: Методические рекомендации - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2006. - 43 с.

1. Область применения. 2

2. Нормативные ссылки. 2

3. Общие сведения. 2

4. Характеристика MRSA как возбудителей внутрибольничных инфекций. 3

4.1. Таксономия и биологические особенности. 3

4.2. Клиническое значение. 4

4.3. Факторы патогенности и вирулентность. 5

4.4. Генетический контроль устойчивости к метициллину и особенности фенотипической экспрессии. 6

4.5. Особенности эпидемиологии MRSA.. 7

5. Лабораторные методы идентификации и типирования MRSA.. 10

5.1. Фенотипические методы.. 10

5.2. Молекулярно-генетический анализ генома MRSA с использованием полимеразной цепной реакции. 12

5.2.1. Обоснование. 12

5.2.2. Оборудование и реактивы.. 13

5.2.3. Вспомогательные методики. 15

5.2.4. Идентификация гена тес А.. 16

5.2.5. Генотипирование. 17

6. Организация эпидемиологического надзора за внутрибольничными инфекциями, вызванными MRSA.. 20

Библиографические данные. 21

Руководителя Федеральной службы

по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека

Метициллинрезистентные Staphylococcus aureus

- возбудители внутрибольничных инфекций:

идентификация и генотипирование

1. Область применения

1.1. В настоящих методических указаниях представлена информация о роли метициллинрезистентных штаммов золотистого стафилококка в возникновении внутрибольничных инфекций, их микробиологических и эпидемиологических особенностях, изложены традиционные и молекулярно-генетические методы идентификации и типирования.

1.2. Методические рекомендации разработаны в помощь специалистам органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, и лечебно-профилактических учреждений, осуществляющих организацию и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий по борьбе с внутрибольничными инфекциями.

2. Нормативные ссылки

2.2. Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации, утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации № 554 от 24 июля 2000 г.

2.6. Методические указания по эпидемиологическому надзору за внутрибольничными инфекциями от 02.09.87. № 28-6/34.

3. Общие сведения

В последнее десятилетие проблема внутрибольничных инфекций (ВБИ) приобрела исключительно большое значение для всех стран мира. Это обусловлено, прежде всего, значительным ростом числа госпитальных штаммов микроорганизмов, обладающих устойчивостью к широкому кругу антимикробных препаратов. Несмотря на значительный недоучет, в Российской Федерации ежегодно регистрируется около 30 тыс. случаев внутрибольничных инфекций, при этом минимальный экономический ущерб составляет более 5 млрд. рублей ежегодно. Среди возбудителей ВБИ одно из первых мест, по-прежнему, принадлежит микроорганизмам рода Staphylococcus, наиболее патогенным представителем которого является S.aureus. Эпидемиологическая ситуация осложняется в связи с широким распространением в стационарах, а также появлением и во внебольничной среде, клинических изолятов S.aureus, устойчивых к оксациллину (ORSA или MRSA). MRSA способны вызывать разнообразные клинические формы внутрибольничных инфекций, включая наиболее тяжелые, такие как: бактериемия, пневмония, синдром септического шока, септический артрит, остеомиелит и другие, которые требуют длительного и дорогостоящего лечения. Появление осложнений, вызванных MRSA, приводит к увеличению сроков госпитализации, показателей летальности, значительным экономическим потерям. Показано, что рост частоты ВБИ, наблюдаемый в стационарах различных стран мира, обусловлен распространением эпидемических штаммов MRSA, многие из которых способны вырабатывать пирогенные токсины - суперантигены, подавляющие иммунный ответ на S.aureus.

С конца 90-х годов прошлого века в стационарах России отмечается рост частоты выделения MRSA, которая в ряде больниц достигла 30 - 70 %. Это делает неэффективным использование многих антимикробных препаратов и существенно ухудшает качество оказания медицинской помощи населению. В этих условиях совершенствование методов эпидемиологического и микробиологического мониторингов, направленных на выявление эпидемически значимых штаммов, приобретает все более актуальное значение.

4. Характеристика MRSA как возбудителей внутрибольничных инфекций

В настоящее время MRSA являются ведущими возбудителями внутрибольничных инфекций в стационарах многих странах мира. Частота их выделения в стационарах США, Японии, многих стран Западной Европы достигает 40 - 70 %. Исключение составляют, по-видимому, только ряд скандинавских стран, где исторически были приняты жесткие противоэпидемические меры по контролю за распространением таких штаммов. В стационарах Российской Федерации частота выделения MRSA колеблется от 0 до 89 %. Наибольшая частота выделения отмечается в реанимационных, ожоговых, травматологических и хирургических отделениях стационаров, расположенных в крупных городах. Одной из основных причин этой закономерности является концентрация в таких стационарах пациентов с нарушениями целостности кожных покровов и поврежденными иммунологическими барьерами. Наиболее частым местом локализации инфекции являются послеоперационные и ожоговые раны и дыхательные пути. Первичные и вторичные бактериемии наблюдаются примерно у 20 % инфицированных больных. В случае инфицирования ожоговых больных частота бактериемии нередко возрастает до 50 %. Факторами, способствующими развитию бактериемии, является присутствие центрального венозного катетера, анемия, гипотермия и назальное носительство. Развитие бактериемии значительно увеличивает вероятность летального исхода. Особенно высокая смертность, обусловленная бактериемией, наблюдается среди пациентов, находящихся в ожоговых и отделениях интенсивной терапии, где она может достигать 50 % по сравнению с 15 % в контрольной группе. Риск развития летального исхода возрастает почти в три раза среди пациентов, у которых бактериемия обусловлена MRSA по сравнению с пациентами, инфицированными метициллинчувствительными штаммами S.aureus. Развитие госпитальной бактериемии приводит к значительному увеличению стоимости госпитализации. В современных условиях лечение таких пациентов требует, как правило, внутривенного введения ванкомицина, тейкопланина или линезолида, однако клиническая эффективность этих препаратов нередко оказывается значительно ниже, чем у антибиотиков, используемых для лечения пациентов с осложнениями, вызванными метициллинчувствительными S.aureus. По данным Центра по контролю за заболеваниями (США) средняя продолжительность пребывания пациента в больнице в случае хирургического вмешательства составляет 6,1 дня, тогда как при возникновении осложнений, вызванных MRSA она увеличивается до 29,1 дней, при этом средние расходы возрастают с 29455$ до 92363$ в пересчете на каждый случай. Заболевания, вызванные MRSA, могут начинаться на фоне терапии антибиотиками, в том числе аминогликозидами и цефалоспоринами. В этой связи необходимо отметить, что неадекватное назначение антибиотиков в случае тяжелых ВБИ драматически ухудшает прогноз заболевания. Летальность при осложнениях, вызванных MRSA, значительно колеблется и зависит как от возраста пациента, сопутствующего заболевания (артериальная гипертензия, диабет и др.), так и от присоединения дополнительной микрофлоры. Наиболее распространенными вторичными проявлениями инфекции, обусловленной MRSA, являются эндокардиты, гематогенный остеомиелит, септический артрит. Одним из наиболее грозных осложнений, вызываемых MRSA, является синдром токсического шока (СТШ). Клинические проявления СТШ включают следующий симптомокомплекс: гипертермия, сыпь, рвота, диарея, гипотензия, генерализованный отек, острый респираторный дистресс синдром, полиорганная недостаточность, диссеминированная интраваскулярная коагуляция. СТШ может развиться как осложнение после родов, хирургических вмешательств, при суперинфицировании S.aureus трахеальных повреждений, вызванных вирусом гриппа. Недавно описанные стафилококковая скарлатина и синдром упорной десквамации эпителия рассматривают как варианты СТШ.

Вопрос о вирулентности MRSA остается дискутабельным. Они практически не вызывают заболевания у здоровых лиц из числа медицинского персонала. Вместе с тем, в многочисленных исследованиях показано, что прогноз при тяжелых формах внутрибольничных инфекций, таких как пневмония и бактериемия, значительно хуже среди пациентов, инфицированных MRSA, по сравнению с пациентами, инфицированными метициллинчувствительными S.aureus.

Мишенью действия b-лактамных антибиотиков (как пенициллинов, так и цефалоспоринов) являются транс- и карбоксипептидазы - ферменты, участвующие в биосинтезе основного компонента клеточной стенки микроорганизмов - пептидогликана. Благодаря своей способности связываться с пенициллином и другими b-лактамами данные ферменты получили название пенициллинсвязывающих белков (ПСБ). У Staphylococcus aureus имеются 4 ПСБ, отличающиеся как по молекулярной массе, так и по функциональной активности. Устойчивость метициллинрезистентных штаммов золотистого стафилококка (MRSA) к b-лактамным антибиотикам обусловлена продукцией дополнительного пенициллинсвязывающего протеина - ПСБ-2¢, отсутствующего у чувствительных микроорганизмов. При подавлении В -лактамным антибиотиком активности основных пенициллинсвязывающих белков ПСБ-2¢, в силу своего более низкого сродства к препаратам данной группы, продолжает функционировать и сохраняет микробной клетке жизнеспособность. Синтез ПСБ-2¢ кодируется геном mecA, расположенным на хромосоме S.aureus, в специфической области, обнаруживаемой только у метициллинрезистетных штаммов стафилококка - тес ДНК. Меc ДНК представляет новый класс мобильных генетических элементов, который получил название стафилококковая хромосомная кассета тес (Staphylococcal chromosomal cassette тес = SCCmec). Выявлено существование 4 типов SCCmec, различающихся как размерами (от 21 до 66 т.п.н.), так и набором генов, составляющих данные кассеты. Разделение на типы основано на различиях в генах, образующих собственно комлекс тес, и в наборе генов, кодирующих рекомбиназы ссrА и ссrВ, входящих в различных сочетаниях в стафилококковую хромосомную кассету (рис. 1). Комлекс тес может включать: тесА - структурный ген, детерминирующий синтез ПСБ-2¢; mecI - регуляторный ген, влияющий на транскрипцию тесА; mecR1 - ген, передающий внутрь клетки сигнал о наличии в среде b-лактамного антибиотика; а также инсерционные последовательности IS431 и IS1272. В настоящее время известны 4 варианта комплекса тес (рис. 2).

Кроме того, различия между типами кассет тес обусловлены присутствием ряда дополнительных генов, расположенных в генетических областях J1а, J1b.

Генетическая структура комплексов тес различных классов

• Класс В, IS431 - mecA-DmecR1-IS1272

• Класс С, IS431 - mecA-DmecR1-IS431

• Класс D, IS431 - mecA-DmecR1

Рис. 2. тесА - структурный ген, детерминирующий синтез ПСБ-2¢;

mecI - регуляторный ген, влияющий на транскрипцию тесА;

mecR1 - ген, передающий внутрь клетки сигнал о наличии в среде b-лактамного антибиотика; IS431 и IS1272 - инсерционные последовательности

Уникальность метициллинрезистентности заключается также и в существовании феномена гетерорезистентности, суть которого состоит в том, что в условиях инкубации при 37 °С не все клетки популяции проявляют устойчивость к оксациллину. Генетический контроль феномена гетерорезистентности до настоящего времени полностью не выяснен. Известно только, что на экспрессию устойчивости могут влиять регуляторные гены b-лактамазы, а также ряд дополнительных генов, так называемые fem (factors essential for methicillin resistance) или aux, локализованные в различных частях хромосомы S.aureus, вне SCCmec. Сложность регуляции проявляется в фенотипических различиях. Выделяют 4 стабильных фенотипа (класса) резистентности. Первые три класса являются гетерогенными. Это означает, что в популяциях стафилококков, относящихся к этим классам, присутствуют субпопуляции микробных клеток с разным уровнем резистентности. При этом клоны стафилококков, получаемые из изолированных колоний (образовавшихся при рассеве первичной культуры) по популяционному составу полностью совпадают с исходной культурой.

Класс 1. Рост 99,99 % клеток подавляется оксациллином в концентрации 1,5 - 2 мкг/мл, рост 0,01 % микробов подавляется только при 25,0 мкг/мл.

Класс 2. Рост 99,9 % клеток подавляется при концентрации оксациллина 6,0 - 12,0 мкг/мл, тогда как рост 0,1 % микробов подавляется при концентрации > 25,0 мкг/мл.

Класс 3. Рост 99,0 - 99,9 % клеток подавляется при концентрации 50,0 - 200,0 мкг/мл и только рост 0,1 - 1 % микробной популяции подавляется при концентрации оксациллина 400,0 мкг/мл.

Класс 4. Представители этого класса характеризуются гомогенным уровнем устойчивости, который превышает 400,0 мкг/мл для всей популяции.

В связи с наличием гетерогенности по устойчивости к оксациллину могут возникать трудности при идентификации MRSA традиционными микробиологическими методами.

Будучи однажды занесенными в стационар, MRSА могут выживать там в течение длительного времени. Это определяет стратегию противоэпидемических мероприятий: очень важно не допустить занос и распространение в стационаре эпидемических штаммов.

Следует отметить, что периодически происходит смена эпидемического штамма, доминирующего на отдельных территориях. Так, по данным стафилококковой референс-лаборатории в Colindale (London), в 1996 г. штаммы EMRSA-15 и EMRSA-16 были ответственны за более чем 1500 инцидентов, охвативших трех и более пациентов, в 309 больницах Англии, тогда как остальные эпидемические штаммы были ответственны только за 361 инцидент в 93 больницах. Распространение этих эпидемических штаммов привело к росту смертности от MRSA в 15, а частоты бактериемии в 24 раза за период с 1993 по 2002 г.г. согласно данным национального департамента статистики Великобритании.

Продолжает нарастать спектр антибиоткорезистентности эпидемических штаммов MRSA. Они гораздо быстрее, чем метициллинчувствительные, приобретают устойчивость к препаратам из группы фторхинолонов. Характерной чертой многих эпидемических штаммов MRSA является устойчивость практически ко всем известным классам антимикробных препаратов, за исключением гликопептидов и оксазолидинонов. В последние годы участились случаи выделения изолятов MRSA, обладающих умеренной чувствительностью к ванкомицину и даже ванкомицинрезистентных. Распространение таких штаммов в стационарах России может иметь драматические последствия.

С проблемой госпитальных штаммов MRSA тесно переплетается и проблема MRSA вне госпитального происхождения. Эти штаммы пока не обладают множественной резистентностью к антибиотикам, генетически отличаются от госпитальных штаммов, их происхождение остается неизвестным. Предполагается, что они сформировались из спорадических госпитальных штаммов. Внегоспитальные штаммы MRSA способны вызывать некротизирующую форму пневмонии, характеризующуюся крайне тяжелым течением и требующей госпитализации пациента, в связи с чем возникает угроза заноса и распространения таких штаммов в стационарах.

Основные эпидемические штаммы и клоны MRSA

Эпидемические штаммы, идентифицированные в CPHL * (г. Лондон)

Международные клоны, идентифицированные в LMMRU ** (г. Нью-Йорк)

Читайте также: