Контроль питательных сред на холеру

Бесплатная горячая линия юридической помощи

Главная
"ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУК 4.2.2218-07" (утв. Роспотребнадзором 31.05.2007)

7. Питательные среды, реактивы, консерванты. Порядок контроля качества питательных сред

1%-я пептонная вода, рН 8,5 +/- 0,1 без ингибиторов роста сопутствующей флоры и с теллуритом калия (см. среды обогащения);

2%-й раствор поваренной соли: 20 г хлорида натрия и 0,1 г едкого натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды; жидкость пропускают через бумажный фильтр, разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют в автоклаве 20 мин. при 0,7 атм.

а) Основной раствор пептона готовят по следующей прописи:

Пептон сухой - 100,0

Натрия хлорид - 50,0

Калия нитрат - 10,0

Натрия карбонат - 25,0

Дистиллированная вода - 1 л

В холодную дистиллированную воду погружают пептон, хлорид и карбонат натрия. Смесь кипятят при постоянном помешивании до полного растворения пептона, не допуская его пригорания, затем добавляют нитрат калия. Проверяют реакцию среды, если нужно, рН доводят до 8,5 +/- 0,1. Раствор фильтруют через миткалевый или бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют в автоклаве 20 мин. при 1 атм.

Основной раствор пептона сохраняется до 2 лет.

б) 1%-я пептонная вода.

Для получения 1%-й пептонной воды концентрированный раствор разводят в 10 раз дистиллированной водой. После установления рН 8,5 +/- 0,1 разливают в пробирки или во флаконы и стерилизуют 20 мин. при давлении 0,7 атм.

Можно готовить 1%-ю пептонную воду и непосредственно из отдельных компонентов, взяв навески в 10 раз меньше указанных в рецепте основного пептона. Технология приготовления такая же, как и основного пептона.

в) Пептонная вода с теллуритом калия.

В 1%-ю пептонную воду (рН 8,5 +/- 0,1) после автоклавирования добавляют теллурит калия в конечном разведении 1:100000 или 1:200000. Предварительно готовят рабочий 0,1%-й раствор теллурита калия (1:1000). Срок хранения рабочих растворов 7 дней.

Плотные среды для выделения холерных вибрионов

Щелочной мясопептонный агар:

Мясная вода - 1 л

Натрия хлорид - 5,0

В мясную воду вносят пептон и хлорид натрия. Смесь перемешивают и подщелачивают 20%-м раствором едкого натра до рН 8,3 +/- 0,1. Затем добавляют агар-агар и содержимое помещают в автоклав для варки среды в начале текучим паром в течение 30 - 40 мин., а затем при 1 атм. 20 мин. Если мясопептонный агар варят на плите, среду кипятят до полного расплавления агар-агара при постоянном помешивании.

Для получения прозрачной агаровой среды ее после варки с целью отстоя на 2 - 3 ч оставляют в автоклаве или помещают в термостатную комнату при температуре (43 +/- 2) °С, лучше время отстоя продлить до 18 - 20 ч. Отстоявшийся агар осторожно, не взбалтывая, сливают с осадка на плотный ватно-марлевый фильтр. В фильтрате уточняют реакцию среды, если требуется, подкисляют ее, но подщелачивать агар на данном этапе не рекомендуется во избежание выпадения осадка при стерилизации готовой среды. Профильтрованный агар разливают в посуду и стерилизуют при 1,0 атм. 20 мин.

Рекомендуется использовать питательную среду для выделения холерных вибрионов элективно-дифференциальную сухую (СЭДХ).

Среда обладает выраженными элективными свойствами, обеспечивая ингибицию сопутствующей микрофлоры (энтеробактерий, протея, кокков и др.) и практически не влияет на рост вибрионов. Холерные вибрионы О1 и не О1 групп через 12 - 18 ч формируют на этих средах плоские прозрачные колонии желтого цвета за счет ферментации сахарозы диаметром 1,0 - 2,0 мм; V. parahaemolyticus - мелкие, голубоватые (цвета среды) с уплотненным центром; V. alqinolyticus - крупные, желтые; колонии Pseudomonas, Aeromonas - голубые, Enterobacteriaceae - очень мелкие, плотные или полупрозрачные, иногда окрашены в желтый цвет; колонии протея, как правило, не роятся.

Среды для идентификации вибрионов

а) Среды с углеводами для отбора колоний:

Натрия хлорид - 5,0

Индикатор Андреде - 40 мл

Вода дистиллированная - 1 л

Среду варят, фильтруют, разливают по 5 - 7 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. Готовую среду после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк. Среда светлая.

Среду можно готовить на 1,0 - 1,3%-м питательном агаре, добавляя к нему в соответствующих концентрациях углеводы и индикатор Андреде.

Готовится как и среда Ресселя, но вместо глюкозы берут сахарозу в том же количестве.

1,5 - 1,7%-й мясопептонный агар или другой

слабощелочной питательный агар - 1 л

2%-й раствор серно-кислого закисного железа - 10,0 мл

0,8%-й раствор тиосульфата натрия - 10,0 мл

0,4%-й раствор сульфата натрия - 10,0 мл

1%-й раствор фенолового красного - 24,0 мл

Вначале в расплавленном питательном агаре (рН 7,7 +/- 0,1) растворяют углеводы, затем к нему добавляют свежеприготовленные растворы железа и солей натрия согласно прописи среды (индикатор на сероводород). Кроме того, для регистрации кислотообразования добавляют индикатор феноловый красный. Среду варят, фильтруют, разливают по 5 - 7 мл в стерильные пробирки, стерилизуют 20 мин. при давлении 0,5 атм. и скашивают по типу среды Ресселя; рН готовой среды 7,3 +/- 0,1; цвет красный.

1,5%-й питательный агар - 1 л

Серно-кислое железо (FeSO4) - 0,2

Гипосульфит натрия (Na2SO3 х 5Н2О) - 0,08

Сульфит натрия (Na2SO3) - 0,4

0,2%-й феноловый красный - 10,0.

После расплавления рН среды довести до 8,0, разлить в пробирки по 5 - 7 мл и стерилизовать при 0,7 атм. 15 мин. Готовую среду после стерилизации скашивают так, чтобы получить столбик и косяк.

6) Среды для идентификации.

К 100 мл 1%-й пептонной воды (рН 7,3 +/- 0,1) без селитры добавляют 0,5 - 1,0% необходимого углевода или спирта (L-арабиноза, D-манноза, D-сахароза, D-маннит, L-инозит, D-глюкоза, растворимый крахмал и др.) и 1% индикатора Андреде или 0,1 мл 1,6%-го раствора бромтимолового синего. Среды разливают в стерильные пробирки с поплавками и стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин.; среду с L-арабинозой следует стерилизовать в течение 20 мин. при 0,1 - 0,2 атм. Для приготовления сред Гисса можно применять только перечисленные изомеры углеводов. Готовые среды Гисса с индикатором Андреде светлые, при кислотообразовании краснеют. Среды с бромтимоловым синим зеленого цвета с травянистым оттенком, при кислой реакции - желтого цвета, при щелочной - синего.

Натрия хлорид - 5,0

Двузамещенный фосфат калия - 0,3

Бромтимоловый синий - 0,03

Дистиллированная вода - 1 л

К воде добавляют пептон, натрия хлорид и агар-агар. Смесь подогревают до расплавления агара, затем вносят фосфат калия и глюкозу, продолжают кипятить 2 - 3 мин. Смесь подщелачивают 20%-м раствором едкого натрия до рН 7,4 +/- 0,1, доводят объем среды до первоначального и добавляют 3 мл 1%-го водного раствора бромтимолового синего. Затем среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 4 - 5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. Цвет среды до стерилизации синий, а после автоклавирования травянисто-зеленый, рН 7,1 +/- 0,1. При кислой реакции среда желтеет.

Двузамещенный фосфат калия - 5,0

Дистиллированная вода - 1 л.

Смесь ингредиентов нагревают до полного их растворения, затем фильтруют через бумажный фильтр и разливают по 5 мл в стерильные пробирки. Бульон стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин.

Среда Кодама. В 1%-ю пептонную воду добавляют 0,5% растворимого крахмала. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют 20 мин. под давлением 0,5 атм. Для оценки результатов расщепления крахмала используют реактив Люголя.

Среда с желатиной. К мясопептонному бульону или бульону Хоттингера прибавляют мелко нарезанную желатину из расчета 10,0 - 15,0 г на 100 мл (летом концентрацию желатины увеличивают до 20%). Желатине дают набухать в течение 30 мин. и затем растворяют при медленном нагревании в водяной бане при температуре (45,0 +/- 5,0) °С. Устанавливают рН 7,1 +/- 0,1, прибавляя к расплавленной желатине 10%-й раствор двууглекислого натрия. При более щелочной реакции желатина застывает плохо, а иногда и совсем не застывает. В 1 л растворенной желатины вносят для просветления два взбитых с небольшим количеством дистиллированной воды яичных белка. Смесь перемешивают и прогревают текучим паром в течение 20 мин. до полного свертывания белка и просветления среды. Затем среду фильтруют в горячем состоянии через бумажный или ватно-марлевый фильтр с большой поверхностью. Среду, разлитую по 5 - 8 мл в пробирки, стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 мин. После стерилизации среду охлаждают путем погружения пробирок в холодную воду в строго вертикальном положении, чтобы верхняя часть столбика при застывании оставалась совершенно ровной.

Среда для определения декарбоксилаз и дигидролаз аминокислот

Дрожжевой экстракт - 25,0 (сухой 3,0)

Натрия хлорид - 5,0

Натрия карбонат - 0,1

(0,1%-й раствор в 20%-м спирте) - 45,0 (0,045 г сухого)

Аминокислота - 10,0 - 20,0

Дистиллированная вода - 1 л

Все ингредиенты по прописи вышеуказанной среды растворяют при нагревании, устанавливают рН 6,4 +/- 0,1, затем добавляют соответствующий индикатор и делят среду на 4 равные части. В одну часть аминокислоты не добавляют, эта порция служит контролем. В остальные порции вносят соответственно: в первую - 1% лизина, во вторую - 1% орнитина, в третью - 1% аргинина. Аминокислоты должны быть в L-форме, если имеются D-аминокислоты, то добавляют 2%, т.к. микроорганизмы активны только в отношении L-форм. После добавления аминокислот перед стерилизацией в случае необходимости реакцию среды исправляют 0,1%-м раствором соляной кислоты. Среду разливают по 1 - 2 мл в химически чистые стерильные пробирки и стерилизуют при давлении 0,1 - 0,2 атм. 20 мин. Небольшое количество флокулята в средах не имеет значения. Пептонно-дрожжевая среда имеет травянисто-зеленый цвет, при кислой реакции среда желтеет, при щелочной - синеет.

Мясопептонный бульон: мясная вода с 1% сухого пептона и 0,85% поваренной соли. Смесь кипятят до полного растворения пептона и соли, устанавливают нужную реакцию среды, стерилизуют при 0,7 атм. 20 мин.

а) Для определения образования индола

Парадиметиламинобензальдегид - 1,0 г

Этиловый спирт - 95,0 мл

Концентрированная соляная кислота - 20,0 мл.

Альдегид растворяют в спирте, затем добавляют кислоту, смешивают, хранят в темном месте.

Полоски фильтрованной бумаги пропитывают насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушивают в термостате.

б) Для выявления образования сероводорода

Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором уксусно-кислого свинца. Подсушивают на воздухе.

Полоски индикаторных бумажек на индол и сероводород помещают под пробку пробирки с засеянной культурой. В случае образования индола полоска краснеет, а при образовании сероводорода полоска чернеет.

в) Для определения нитратредуктазы

Готовят отдельно два раствора. Первый - путем растворения при нагревании в фарфоровой ступке в 20 мл дистиллированной воды 0,2 мг альфа-нафтиламина (C10H7NH2). Жидкость осторожно вливают в 150 мл 12%-го раствора уксусной кислоты. Второй - 0,5 г сульфаниловой кислоты (C6H4NH2SO3H) растворяют в 150 мл 12%-й уксусной кислоты.

Затем оба раствора сливают в темную склянку с хорошо притертой пробкой. Реактив Грисса должен быть бесцветным, если он розовеет, то им не пользуются.

Сложность приготовления реактива Грисса, дефицитность и токсичность входящих в него компонентов (в частности, альфа-нафтиламина) ограничивают возможности его применения. Этих недостатков лишен метод с использованием риванолового реактива, представляющего собой смесь равных объемов 0,1%-го раствора риванола в дистиллированной воде и 12%-го раствора соляной кислоты. В случае положительной реакции культура испытуемого штамма, выращенная в бульоне или 1%-й пептонной воде с 0,1%-м KNO3, окрашивается в красный цвет.

г) Для определения бета-галактозидазной активности приготавливают М/75 раствор орто-нитрафенил - бета-Д-галактопиранозида (ОНФГ):

Дистиллированная вода - 75 мл

Фосфатный буфер - 5 мл.

Растворяют в дистиллированной воде при 37 °С ОНФГ, затем добавляют раствор однозамещенного фосфорно-кислого натрия (NaH2PO4 х H2O). Доводят рН до 7,0. Раствор должен быть бесцветным - хранят при температуре -4 °С. Перед использованием раствор выдерживают в течение нескольких минут до растворения фосфата, который на холоде кристаллизируется.

а) Консервант с борной кислотой

Борная кислота - 40,0 г

0,9%-й раствор натрия хлорида - до 1 л.

Стерилизуют на водяной бане или текучим паром при 100 °С по 20 мин. в течение 3-х дней.

Соединяют 100 мл дефибринированной крови барана с 15 мл консерванта с борной кислотой.

б) Консервант Алсевера

Сахароза (или глюкоза) - 20,5

Хлористый натрий - 8,0

Цитрат натрия - 4,2

Дистиллированная вода - до 1,0 л.

рН - 6,1 доводится 10%-м раствором лимонной кислоты.

Стерилизуют на водяной бане или текучим паром при температуре 100 °С по 20 мин. в течение 3-х дней.

Консервант Алсевера и дефибринированную кровь соединяют поровну. Консервированную кровь хранят при температуре (4 +/- 1) °С.

Питательные среды, консерванты, ингибиторы посторонней микрофлоры, используемые в диагностике холеры, подлежат обязательной проверке в соответствии с действующими инструктивно-методическими документами.

Бактериологический контроль качества плотных и жидких питательных сред могут проводить лаборатории противочумных и других учреждений, имеющие разрешение на работу с возбудителем холеры, применяя для контроля тест-штаммы Vibrio cholerae Р-1 (145) и Vibrio cholerae eltor М-878, а также лаборатории особо опасных инфекций учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, с использованием тест-штамма авирулентного холерного вибриона не О1 серогруппы Р-9741 в порядке, определяемом действующими методическими указаниями по контролю питательных сред.

Бактериологическому контролю подлежит каждая серия сухой среды производственного выпуска, имеющая номер государственной регистрации, лицензии на ее производство и соответствующий срок годности, а также среды лабораторного изготовления.

На контроль направляют часть общего объема среды, предназначенного для проведения исследований, в количестве 200 мл агара и 100 мл основного раствора пептона производственного выпуска и в двойном объеме для серий лабораторного изготовления. В направлении следует указать название среды, предприятие-изготовитель, номер серии и срок годности сухой среды, дату контролируемой варки. Транспортируемые образцы должны быть надежно упакованы, флаконы с жидкой средой закрыты резиновыми пробками.

Оптимальный срок проверки питательной среды 10 - 14 дней после приготовления.

При положительном результате контроля пробы соответствующая серия сухой среды считается пригодной к использованию. Последующий контроль этой серии среды осуществляется ежегодно, а также при изменении условий приготовления сухой среды, независимо от времени предыдущей проверки.

Если при первом контроле среда оказалась непригодной, необходим повторный бактериологический контроль этой же серии сухой среды, при этом на контроль необходимо направлять образец новой варки и навеску сухой среды этой же серии.

При получении отрицательного результата повторного контроля среды, приготовленной на месте, и положительного бактериологического контроля образца этой же серии сухой среды, сваренного в лаборатории контролирующего учреждения, следует считать пригодной данную серию сухой питательной среды и принять меры к выяснению и устранению ошибки в технологии местного изготовления.

При получении отрицательного результата на образец сухой среды данной серии направляют рекламацию в адрес учреждения-изготовителя и ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Сроки хранения щелочного агара и основного раствора пептона производственного выпуска (сухая среда и приготовленные из нее образцы) указаны в инструкции предприятия-изготовителя по применению среды.

Для сред лабораторного изготовления определены следующие сроки хранения:

- для щелочного агара - 6 месяцев с момента изготовления и первичного контроля, по истечении этого срока допускается переконтроль и продление срока годности еще на 3 месяца;

- для основного раствора пептона - 2 года с контролем качества среды после приготовления, затем спустя 1,0 - 1,5 года хранения.

Срок хранения 1%-й пептонной воды при герметичной упаковке (резиновые пробки и металлические колпачки) - 2 месяца, а после переконтроля возможно продление срока хранения на 1 месяц.

Питательные среды, готовые к употреблению, хранят в темном прохладном месте (6 - 20 °С), не допуская перепада температур больше чем на 5 °С. Подъем и снижение температур губительно действуют на биологические свойства сред.

Щелочной агар и основной пептон, контролируемые авирулентным тест-штаммом холерного вибриона, подлежат периодической перепроверке по согласованию с территориальными лабораториями и противочумными учреждениями на базе последних вирулентными тест-штаммами. Ежегодному контролю в территориальном противочумном учреждении подлежит также теллурит калия.

Руководитель – Директор ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, к.м.н. Носков А.К., телефон (863)240-27-03

Референс – центр по мониторингу холеры (далее – центр) руководствуется в своей деятельности законодательством Российской Федерации, нормативно-правовыми актами Президента Российской Федерации, Правительства Российской Федерации, Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Центр осуществляет свою работу во взаимодействии с региональными центрами по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II-IY групп патогенности; с региональными центрами по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I-II групп патогенности с прикрепленными субъектами Российской Федерации и Центрами индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней, созданных на базе противочумных учреждений; национальными центрами верификации диагностической деятельности и Национальными центрами, осуществляющими функции государственных коллекций, Роспотребнадзора, научно-исследовательскими институтами, органами и учреждениями Роспотребнадзора и другими учреждениями.

Приказом директора № 95

Положение

Общие положения

1.2. Создание и ликвидация Центра осуществляется в соответствии с приказом руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

1.3. Назначение руководителя Центра согласовывается с Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

1.4. Центр руководствуется в своей деятельности законодательством Российской Федерации, нормативными актами Президента Российской Федерации, Правительства Российской Федерации, Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и настоящим Положением.

1.5. Центр осуществляет свою работу во взаимодействии с научно-исследовательскими институтами, органами и организациями Роспотребнадзора, медицинским организациям субъектов Российской Федерации.

1.6. Международное взаимодействие Центра осуществляется под контролем и при согласовании Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в установленном порядке.

1.7. Центр ежегодно представляет отчет о своей деятельности в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в срок до 15 марта следующего за отчетным годом.

2. Задачи и функции

2.1. Анализ эпидемиологических рисков, ассоциированных с распространением возбудителя холеры, возникновением атипичных и новых штаммов.

2.2. Анализ состояния лабораторной диагностики и мониторинга холеры.

2.3. Оказание консультативно-методической помощи органам и организациям Роспотребнадзора, медицинским организациям по лабораторной диагностике и мониторингу холеры.

2.4. Оказание консультативно-методической и практической помощи органам и организациям Роспотребнадзора и медицинским организациям при проведении профилактических и противоэпидемических мероприятий в рамках плановой работы и в очагах холеры.

2.5. Информирование Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, территориальных органов и организаций Роспотребнадзора, Центров индикации возбудителей инфекционных болезней I-II групп патогенности, научно-методических центров по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности о выявлении новых штаммов возбудителя холеры.

2.6. Подготовка предложений и организация разработки нормативно-методических документов по эпидемиологическому надзору, диагностике и профилактике инфекционной холеры.

2.7. Углубленное изучение выделенных культур микроорганизмов с использованием современных методов анализа и характеристики возбудителя холеры.

2.8. Проведение мониторинга инфекционной заболеваемости, составление прогнозов развития эпидемиологической ситуации по холере, разработка моделей для прогнозирования последствий эпидемического проявления этого заболевания.

2.9. Разработка и внедрение в практику новых диагностических препаратов, алгоритмов и методов лабораторной диагностики холеры, изучение эффективности профилактических и лечебных препаратов.

2.10. Организация взаимодействия профильных научных организаций Роспотребнадзора Министерства здравоохранения Российской Федерации, Российской академии наук по научному и практическому сотрудничеству по совершенствованию эпидемиологического надзора, диагностики и профилактики холеры, в т.ч. в рамках целевых программ.

2.11. Подготовка предложений по организации межведомственного взаимодействия по борьбе с холерой, а также в рамках международного сотрудничества.

2.12. Направление в Центр верификации диагностической деятельности культур холерных вибрионов в установленном порядке.

2.13. Подготовка предложений по проведению внешнего контроля качества лабораторных исследований и проведение в установленном порядке внешнего контроля качества лабораторных исследований по холере.

2.14. Повышение профессиональной подготовки специалистов в рамках образовательной деятельности, проведение семинаров и стажировок на рабочем месте для специалистов органов и организаций Роспотребнадзора, медицинских организаций (по согласованию).

2.15. Разработка и реализация научно-исследовательских работ и программ с вовлечением специалистов органов и организаций Роспотребнадзора, медицинских организаций закрепленных субъектов Российской Федерации.

3.2. Внесение предложений по совершенствованию системы эпидемиологического надзора и организации работы лабораторной службы, методов и средств диагностики, профилактики и лечения холеры.

3.3. Участие в организации работ по внешнему контролю качества лабораторной диагностики, а также в международных программах контроля качества лабораторных исследований и мониторинга за холерой по согласованию с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3.4. Организация, проведение и участие в работе съездов, конференций, семинаров, симпозиумов и совещаний по изучаемой проблематике при согласовании с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3.5. Запрос выделенных штаммов и образцов клинического материала по профильной нозологии Центра из органов и организаций Роспотребнадзора.

3.6. Разработка, внедрение и ведение автоматизированных информационных систем по мониторингу за возбудителем холеры.

Структура Центра

Руководитель – Директор, к.м.н. Носков А.К.

Помощники руководителя по вопросам:

— эпидемиологии холеры – гл.н.с., д.м.н., профессор Москвитина Э.А.

— микробиологии холеры –гл.н.с., д.м.н. Кругликов В.Д.

Специалисты:

Аннотация научной статьи по нанотехнологиям, автор научной работы — Мазрухо Алексей Борисович, Каминский Денис Игоревич, Ломов Юрий Михайлович, Телесманич Наталья Робертовна, Рожков Константин Константинович

Сконструирована новая питательная среда для культивирования и выделения холерного вибриона ХДС-агар на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей. Результаты лабораторных испытаний разработанной среды с использованием 28 штаммов холерного вибриона , апробации в ходе мониторинга водных объектов на наличие V. cholerae и тактико-специального учения специализированной противоэпидемической бригады (СПЭБ) свидетельствуют о её преимуществах перед контрольным щелочным агаром и создают предпосылки возможности включения данной среды в мобилизационный резерв СПЭБ.

Похожие темы научных работ по нанотехнологиям , автор научной работы — Мазрухо Алексей Борисович, Каминский Денис Игоревич, Ломов Юрий Михайлович, Телесманич Наталья Робертовна, Рожков Константин Константинович

A new nutrient medium for cultivation and isolation of Vibrio cholerae HDS-agar was constructed on basis of the bakery yeast pancreatic digest. The results of laboratory testing of the elaborated medium with the use of 28 Vibrio cholerae strains and approbation on examining the samples of water indicated its advantages as compared to the control alkaline agar and created prerequisites for possible inclusion of this medium into the mobilization reserve of Specialized Anti-Epidemic Team (SAET).

УДК 616.932: 57.083.13: 614.4

НОВАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРЫ ХДС-АГАР КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ЭЛЕМЕНТ МОБИЛИЗАЦИОННОГО РЕЗЕРВА СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКИХ БРИГАД

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт, Rostov Research Institute for Plague Control, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, Gorky St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002,

Сконструирована новая питательная среда для культивирования и выделения холерного вибриона ХДС-агар на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей. Результаты лабораторных испытаний разработанной среды с использованием 28 штаммов холерного вибриона, апробации в ходе мониторинга водных объектов на наличие V. cholerae и тактико-специального учения специализированной противоэпидемической бригады (СПЭБ) свидетельствуют о её преимуществах перед контрольным щелочным агаром и создают предпосылки возможности включения данной среды в мобилизационный резерв СПЭБ.

Ключевые слова: питательные среды, холера, холерный вибрион, специализированная противоэпидемическая бригада.

Keywords: nutrient media, cholera, Vibrio cholerae, Specialized Anti-Epidemic Team.

Опыт последних десятилетий по локализации и низация СПЭБ пяти научно-исследовательских про-

ликвидации очагов холеры на территории России, тивочумных институтов Роспотребнадзора (в Сарато-

бывшего СССР и стран СНГ свидетельствует, что ве, Ростове-на-Дону, Ставрополе, Волгограде и Ир-

наиболее действенной и эффективной структурой для кутске) и их оснащение современными автономными

решения этой задачи является специализированная мобильными лабораториями на базе пневмокаркас-

противоэпидемическая бригада (СПЭБ) - формирова- ных систем и автомобильного шасси 3. Этот факт

ние быстрого реагирования на чрезвычайные ситуа- в совокупности с высоким уровнем профессиональ-

ции (ЧС) природного и техногенного характера, ной подготовки и большим практическим опытом

имеющие медико-санитарные последствия или угрозу специалистов бригад позволяет осуществлять необхо-

их возникновения. В ходе реализации распоряжения димый объём профилактических и противоэпидеми-

Правительства Российской Федерации от 21.05.2007 г. ческих мероприятий, в том числе связанных с обсле-

№ 642-р в период 2007-2009 гг. осуществлена модер- дованием многочисленных контингентов населения и

интенсивным масштабным мониторингом объектов окружающей среды при возникновении вспышек холеры. Одним из наиболее значимых направлений повышения эффективности мероприятий, проводимых СПЭБ в очагах холеры, является совершенствование существующих и разработка новых питательных сред для микробиологической диагностики этой инфекции, которые в перспективе могут быть включены в мобилизационный резерв специализированных противоэпидемических бригад.

Среди 16 наименований питательных сред, необходимых для проведения лабораторной диагностики холеры, наиболее высока количественная потребность в щелочном агаре [4]. Для обеспечения работы СПЭБ по локализации и ликвидации эпидемического очага холеры в течение двух месяцев (при исследовании в среднем 500 проб в сутки), согласно регламентированной схеме по выделению и идентификации Vibrio cholerae [5], требуется 4320 л готового щелочного агара. Используемые в микробиологической практике щелочные агары содержат в качестве питательных основ трудно поддающиеся стандартизации и дорогостоящие гидролизаты белков животного происхождения (мяса, субпродуктов, казеина). Это существенно увеличивает себестоимость анализа по исследованию материала, подозрительного на наличие холерного вибриона, и требует дополнительной оптимизации (по содержанию соответствующего белкового гидролиза-та в готовой среде) каждой серии щелочного агара в процессе её изготовления.

В связи с вышеизложенным большой интерес представляет сконструированная в Ростовском-на-Дону научно-исследовательском противочумном институте агаризованная питательная среда для культивирования и выделения холерного вибриона ХДС-агар (холерная дрожжевая среда агаризованная). Питательной основой данной среды является разработанный сотрудниками института панкреатический перевар пекарских дрожжей, запатентованный по способу его получения [6] и являющийся универсальным базовым компонентом целого комплекса питательных сред для культивирования, выделения и изучения свойств холерного вибриона, чумного и сибиреязвенного микробов. Преимуществами сред на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей является их низкая себестоимость, простая технология изготовления, высокая чувствительность, сочетание в их составе азотистых компонентов (пептидов, аминокислот) и стимуляторов роста (витаминов группы В), обусловливающих выраженные вегетирующие свойства в отношении указанных микроорганизмов. Ранее нами была показана высокая эффективность использования жидкой накопительной питательной среды для холерного вибриона, сконструированной на основе данного белкового гидролизата [7].

Целью настоящего исследования явилась оценка разработанной питательной среды ХДС-агара как потенциальной составляющей мобилизационного резерва СПЭБ. Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи: охарактеризовать сконструированную среду в сравнении с используемым в практике щелочным агаром по основным биологическим показателям в отношении коллекционных

штаммов V. cholerae; провести апробацию разработанной среды в процессе многолетнего мониторинга водных объектов г. Ростова-на-Дону на наличие холерного вибриона и оценить её эффективность в ходе опытно-исследовательского тактико-специального учения (ТСУ) СПЭБ.

Материалы и методы

В работе были использованы 28 штаммов холерного вибриона из коллекции музея живых культур Рос-товского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора: 4 штамма V.cholerae cholerae O1 (Р-1 - тест-штамм, 41, 569В, Р-2/60); 11 штаммов V.cholerae eltor O1 (М-878 - тест-штамм, 1310, Р-5879, Р-10058/1, Р-14863, Р-14864, Р-15301, Р-15302, Р-18367, Р-18368, Р-18369); 8 штаммов V.cholerae O139 (Р-16063, Р-16064, Р-16065, РО-2, РО-7, МО 45, Р-16131, 88) и 5 штаммов V.cholerae non O1/ non O139 (Р-9741 - тест-штамм, КМ-15, КМ-6, Р-12691, Р-11972).

Опытная среда ХДС-агар имела следующий состав (из расчёта на 1,0 л среды):

- панкреатический перевар пекарских дрожжей -0,05 % (по аминному азоту);

- натрий хлористый - 4,0 г;

- натрий фосфорнокислый двузамещённый 12-водный - 6,0 г;

- агар-агар микробиологический - 12,0 г;

- вода дистиллированная - до 1,0 л;

рН готовой среды - 7,8 ± 0,2.

Подготовку коллекционных штаммов V.cholerae и их посев на опытную и контрольную среды осуществляли в соответствии с требованиями МУ 3.3.2.2124-06 [8]. Культивирование штаммов проводили при 37 °С. Учёт результатов - через 12 ч. Согласно предписаниям вышеприведённых методических указаний, оценивали следующие биологические показатели сред: чувствительность, показатель прорастания, диаметр и морфологию колоний.

Исследование проб воды поверхностных водоёмов и сточных вод на наличие холерного вибриона осуществляли в период 2000-2008 гг. силами специалистов СПЭБ Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора согласно схеме, регламентированной действовавшими в указанный период выполнения работы нормативно-

методическими документами [5, 9]. Пробы отбирали из сети пунктов отбора проб воды на территории г. Ростова-на-Дону. Данная работа проводилась с целью оказания помощи учреждениям практического здравоохранения и как один из этапов подготовки личного состава СПЭБ к работе в зонах ЧС, обусловленных или осложнённых вспышками холеры. За девять указанных лет было исследовано 1120 проб воды (980 проб из поверхностных водоёмов и 140 - из стоков). Посев материала осуществляли параллельно на опытную и контрольную среды. Сравнение данных сред осуществляли по числу выделенных штаммов, идентифицированных как V. сШегае О1 и не О1 серогрупп.

каждого модуля, заполненных через быстроразъём-ные соединения.

Личным составом СПЭБ, согласно требованиям СП 3.1.1.2521-09 [10], проведено обследование эпидемического очага, разработан оперативный план противоэпидемических мероприятий. Специалистами бригады было организовано выявление и контроль исполнения медицинского наблюдения за 30 лицами, контактировавшими с больными и вибрионосителями, отбор точечных проб из сети пунктов отбора проб воды рек Дон и Темерник.

Исследование 20 поступивших учебных проб, в том числе 10 проб из реальных объектов окружающей среды (вода поверхностных водоёмов и стоков) и 10 проб (семь из которых были искусственно контами-нированы токсигенным штаммом V. сИо1егае еког 5879 до конечной концентрации возбудителя в пробе от 103 до 107 микробных клеток/мл), имитирующих, согласно легенде, клинический материал от больных, вибрионосителей и лиц, контактировавших с ними, осуществляли в соответствии с требованиям МУК 4.2.2218-07 [5] с использованием всех современных методов, рекомендованных практическим руководством по лабораторной диагностике опасных инфекционных болезней [11]. Посев материала с целью биологического обогащения и последующего выделения культур V.cho1erae проводили параллельно на опытные (ХДС-Н и ХДС-агар) и контрольные (основной пептон, 1%-я пептонная вода и щелочной агар) питательные среды.

Результаты и обсуждение

Результаты сравнительного изучения опытной и контрольной сред по их основным биологическим показателям

Группа Чувствительность, м.к. (M±m) Показатель прорастания, % (M±m) Диаметр колоний, мм (M±m) Морфология колоний

штаммов Опытная Контрольная Опытная Контрольная Опытная Контрольная Опытная Контрольная

среда среда среда среда среда среда среда среда

cholerae O1 10,0±0,0 32,5±22,5 36,5±1,6 20,6±1,8 2,2±0,2 1,6±0,1 Типичная* Типичная

*- колонии гладкие, блестящие, прозрачные или полупрозрачные, голубоватые, с ровными краями.

Результаты использования группы из 11 штаммов V.cholerae eltor для оценки биологических показателей изучаемых сред свидетельствуют, что на опытной среде среднее значение диаметра колоний данных культур было в 1,55 раз выше, чем на контрольной среде при практически идентичных остальных показателях.

Полученные значения изученных биологических показателей сконструированной питательной среды ХДС-агара в отношении тест-штаммов холерного вибриона (V.cholerae cholerae O1 P-1, V.cholerae eltor O1 M-878 и V.cholerae non O1/non O139 P-9741), используемых для контроля качества питательных сред, продемонстрировали её полное соответствие требованиям МУ 3.3.2.2124-06 [8].

Разработанная на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей агаризованная питательная среда для культивирования и выделения холерного вибриона ХДС-агар не только соответствует критериям качества, регламентированным действующими методическими указаниями, но и превосходит используемый в практике аналог - коммерческий щелочной агар по ряду биологических показателей в отношении трёх из четырёх исследованных групп штаммов V.cholerae.

Результаты сравнительного изучения эффективности использования опытной и контрольной сред для исследования проб воды поверхностных водоёмов и сточных вод на наличие холерного вибриона в ходе ежегодно проводимого специалистами СПЭБ мониторинга водных объектов на территории г. Ростова-на-Дону за период 2000-2008 гг. подтвердили преимущества опытной среды, выявленные при её лабораторных испытаниях с использованием коллекционных штаммов V.cholerae. За девять лет апробации сконструированной питательной среды ХДС-агара при мониторинге водных объектов с её помощью были выделены 18 штаммов V. cholerae O1 и 302 штамма V. cholerae non O1, в то время как на контрольном щелочном агаре были изолированы только один штамм V. cholerae O1 и 164 штамма холерного вибриона не О1 серо групп. Благодаря использованию разработанной питательной среды ХДС-агара в августе 2001 г. из сточных вод на территории г. Ростова-на-Дону был выделен токсиген-ный эпидемически значимый штамм V. cholerae O1, сходный по генотипу (по данным VNTR-анализа) со штаммами, вызвавшими вспышку холеры в г. Казани месяцем раньше. Это позволило своевременно провести необходимый комплекс санитарно-противоэпидеми-ческих (профилактических) мероприятий и предотвратить распространение инфекции.

На опытной среде холерный вибрион был выделен из всех 7 искусственно контаминированных штаммом V. cholerae eltor 5879 проб (с конечной концентрацией данного микроорганизма 103, 105 и 107 микробных клеток/мл), в то время как с помощью контрольного щелочного агара возбудитель холеры был изолирован только из проб, содержавших указанный штамм V.cholerae в концентрациях 105 и 107 микробных клеток/мл. Этот факт свидетельствует о более высокой чувствительности опытной среды ХДС-агара по сравнению с использованной контрольной средой аналогичного назначения.

Выделение в ходе ТСУ атоксигенного штамма V. cholerae eltor из реальной пробы воды открытого водоёма только с помощью разработанной среды ХДС-агара подтверждает полученные в результате многолетнего мониторинга водных объектов данные о преимуществе данной среды перед используемым в микробиологической практике щелочным агаром.

Таким образом, в ходе выполнения настоящего исследования было установлено, что сконструированная питательная среда ХДС-агар существенно превосходит традиционный щелочной агар. Это создаёт хорошие предпосылки возможности включения разработанной среды в мобилизационный резерв СПЭБ, необходимый для обеспечения работы специализированных бригад по проведению противоэпидемических мероприятий в зонах ЧС, обусловленных или осложнённых возникновением очага холеры.

1. Сконструирована новая агаризованная питательная среда на основе панкреатического перевара пекарских дрожжей для культивирования и выделения холерного вибриона - ХДС-агар.

2. Разработанная среда превосходит используемый в практике коммерческий щелочной агар по ряду биологических показателей в отношении различных штаммов холерного вибриона, характеризуясь при этом значительно более низкой себестоимостью.

3. Продемонстрирована высокая эффективность использования разработанной среды в процессе многолетнего мониторинга водных объектов на наличие хо-

лерного вибриона, а также практического применения тематического опытно-исследовательского тактико-специального учения как этапов подготовки специалистов СПЭБ.

4. Сконструированная агаризованная питательная среда для диагностики холеры ХДС-агар уже на этапе её лабораторных испытаний способствовала реальному обеспечению санитарно-эпидемиологического благополучия на территории Ростовской области.

5. Разработанная среда может быть рекомендована для включения в мобилизационный резерв питательных сред СПЭБ, что в перспективе должно способствовать повышению готовности бригад и более эффективной их работе в зонах ЧС, обусловленных или осложнённых возникновением очага холеры.

1. Распоряжение Правительства Российской Федерации «О

2. Организация лабораторного мобильного комплекса спе-

циализированной противоэпидемической бригады про-

Поступила в редакцию_

тивочумного института / Е.С. Казакова [и др.] // Журн. микробиол. 2010. № 2. С. 24-27.

3. Сборник нормативно-методических документов по орга-

низации работы специализированных противоэпидемических бригад Роспотребнадзора / под ред. Г.Г. Онищен-ко и В.В. Кутырева. Саратов, 2008. С. 10, 12-14, 79-82.

4. Алгоритм и тактика обеспечения питательными средами

специализированной противоэпидемической бригады при работе в очаге холеры / А.Б. Мазрухо [и др.] // Здоровье населения и среда обитания. 2009. № 11. С. 8-16.

5. Лабораторная диагностика холеры: метод. указания

МУК 4.2.2218-07. М., 2007. 87 с.

6. Пат. 2375441 Российская Федерация, МПК 8 С 12 N 1/16.

Способ получения белкового гидролизата.

7. Оценка жидкой накопительной питательной среды

ХДС-Н для культивирования и выделения холерного вибриона / Д.И. Каминский [и др.] // Биотехнология. 2003. № 4. С. 70-74.

8. Контроль диагностических питательных сред по биоло-

гическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллёза, легионеллёза: МУ 3.3.2.2124-06. М., 2006. 26 с.

9. Инструкция по организации и проведению противохо-

лерных мероприятий. М., 1995. 173 с.

10. Профилактика холеры. Общие требования к эпидемио-

логическому надзору за холерой на территории Российской Федерации: СП 3.1.1.2521-09. М., 2010.

11. Лабораторная диагностика опасных инфекционных бо-

лезней: практ. руководство / под ред. Г.Г. Онищенко и В.В. Кутырева. М., 2009. С. 27-61.

Читайте также: