Когда начинает действовать анатоксин стафилококковый

АНАТОКСИН СТАФИЛОКОККОВЫЙ ОЧИЩЕННЫЙ АДСОРБИРОВАННЫЙ

Регистрационный номер Р N000649/01 от 28.07.2008.

Лекарственная форма. Суспензия для подкожного введения.

Анатоксин стафилококковый очищенный адсорбированный представ­ляет собой токсин стафилококковый обезвреженный формалином и теплом, очищенный от балластных белков, адсорбированный на геле алюминия гидроксида.

Препарат представляет собой равномерную суспензию белого цвета с желтоватым оттенком, разделяющуюся при стоянии на прозрачную надосадочную жидкость и нежный рыхлый осадок, полностью разбивающийся при встряхивании.

В 1,0 мл препарата содержится 10 ЕС (2 дозы) стафилококкового ана­токсина, алюминий (сорбент) - от 0,9 до 1,3 мг, мертиолят (консервант) - от 80 до 120 мкг.

Фармакотерапевтическая группа: МИБП.

Иммунологические свойства. При введении препарат вызывает образование специфических антител к экзотоксину стафилококковому.

Показания к применению.

Профилактика стафилококковых инфекций у лиц с повышенным рис­ком заболевания - промышленные и сельскохозяйственные рабочие, подвер­гающиеся по роду своей деятельности частому травматизму, а также у боль­ных, которым предстоят плановые операции.

Иммунизация доноров с целью получения антистафилококковой плазмы и антистафилококового иммуноглобулина.

Противопоказаниями для применения анатоксина стафилококкового очищенного адсорбированного являются: острые инфек­ционные и неинфекционные заболевания, обострение хронических заболе­ваний (применение препарата возможно не ранее, чем через месяц после выздоровления или ремиссии); хронические заболевания в стадии декомпен­сации; сильные аллергические реакции на пищевые, лекарственные и дру­гие вещества; тимомегалия; болезни крови; злокачественные новообразо­вания. С целью выявления противопоказаний при профилактическом приме­нении препарата врач (фельдшер) должен провести опрос и в день прививки -осмотр прививаемого с обязательной термометрией.

Способ применения и дозы.

Препарат вводят глубоко подкожно в об­ласть нижнего угла лопатки. Ампулу перед вскрытием тщательно встряхи­вают до получения гомогенной суспензии.

Непригоден к применению препарат, содержащийся в ампулах с нару­шенной целостностью, маркировкой, при изменении физических свойств (наличие неразвивающихся хлопьев), с истекшим сроком годности, с нару­шением условий хранения.

Вскрытие ампул и процедуру иммунизации осуществляют при строгом соблюдении правил асептики и антисептики.

Разовая доза препарата составляет 0,5 мл.

Препарат во вскрытой ампуле хранению не подлежит.

Курс иммунизации промышленных и сельскохозяйственных рабочих состоит из двух инъекций (по 1 дозе каждая) с интервалом от 30 до 45 сут. Первая ревакцинация проводится спустя три месяца после окончания курса иммунизации. Последующие ревакцинации проводят с интервалом 12 мес.

Курс иммунизации плановых хирургических больных (детей старше 1 года и взрослых) состоит из двух инъекций (по 1 дозе каждая) пре­парата с интервалом от 20 до 30 сут; вторую инъекцию проводят не позднее, чем за 4-5 сут до операции.

Курс иммунизации доноров состоит из трех инъекций препарата с ин­тервалом 7 дней. При первой инъекции донорам вводят - 1,0 мл (2 дозы) пре­парата, при второй - 1,0 мл (2 дозы), при третьей - 2,0 мл (4 дозы).

Суммарное количество препарата, вводимое донору за полный курс иммунизации, составляет 4,0 мл (8 доз).

Побочное действие. Введение препарата у отдельных привитых может сопровождаться общей и местной реакцией. Общие реакции характеризуются легким недомоганием и субфебрильной температурой (до 37,5 °С) продолжи­тельностью от 24 до 48 часов. Для местных реакций характерно развитие гиперемии и образование в месте инъекции инфильтрата диаметром до 5 мм. Гиперемия исчезает в течение 3-4 сут, инфильтрат сохраняется до 10 сут, а у части привитых - до 30 и более сут, в виде безболезненного уплотнения. При наличии инфильтрата очередную прививку производят на противоположной стороне.

Взаимодействие с другими лекарственными средствами.

Анатоксин стафилококковый очищенный адсорбированный следует вводить не ранее, чем через 3 недели после предшествующей инъекции иммуноглобулина человека или антистафилококковой плазмы.

Форма выпуска. В ампулах по 1,0 мл (2 дозы). Упаковка содержит 10 ампул, инструкцию по применению и ампульный нож.

Транспортирование. В соответствии с СП 3.3.2.1248-03 при температуре от 2 до 8 °С. Замораживание не допускается

Условия хранения. В соответствии с СП 3.3.2. 1248-03 при температуре от 2 до 8 °С в сухом, защищенном от света месте. Замораживание не допускается.

Условия отпуска. Для лечебно-профилактических учреждений.
Срок годности. Срок годности - 2 года. Препарат с истекшим сроком годности применению не подлежит.

СТАЙЛАБ предлагает тест-системы для рецепторного анализа анатоксина-а в пробах воды, а также стандартные растворы и сухие стандарты анатоксина-а и гомоанатоксина-а.

Рецепторный метод анализа, стрипованный планшет
Иммуноферментный метод анализа, стрипованный планшет
Иммуноферментный метод анализа, тест-полоски PN520042, PN520043 Anatoxin-a Strip Test
Стандарты PN 300620 Anatoxin-a(+), стандартный раствор анатоксина-а, 10 мкг/мл, 1 мл

Анатоксин-а является нейротоксином. Он действует подобно никотину и некоторым другим ядам: связывается с Н-холинорецепторами (никотиновыми рецепторами к ацетилхолину) и активирует нервную систему. Но сродство анатоксина-а к этим рецепторам приблизительно в 20 раз выше, чем у никотина, что приводит к более тяжелым отравлениям.

Не следует путать анатоксин-а с анатоксином-а(С) (anatoxin-a(S). Эти вещества различаются как химически, так и по механизму действия: анатоксин-а(С) является природным органофосфатом и необратимо блокирует ацетилхолинэстеразу.

Отравление анатоксином-а хорошо исследовано на примерах диких и домашних животных. В 1977 году в США этот яд вызвал гибель 30 голов скота и 9 собак, в 1985 году в Канаде – около 1000 летучих мышей и 24 крякв и американских сивязей. Менее масштабные случаи, как правило, связанные с нейротоксикозами или гибелью собак или коров, зафиксированы по всему миру.

Анатоксин-а начинает действовать уже через несколько минут после попадания в организм. Для начала отравления характерны неуверенные движения и мышечные подергивания, которые сменяются затрудненным дыханием и судорогами. Животные умирают в период от нескольких минут до нескольких часов из-за остановки дыхания. Подобным же образом действует гомоанатоксин-а.

Согласно исследованиям, анатоксин-а не проявляет хронической токсичности. Это означает, что даже длительное употребление этого яда в дозах ниже минимальной токсической не приведет к негативным последствиям. Однако острая токсичность анатоксина-а весьма высока: ЛД50 для мышей составляет, по разным источникам, 250 – 375 мкг/кг массы тела, что ненамного ниже токсичности стрихнина. Кроме того, анатоксин-а проявил репродуктивную токсичность в исследовании на хомячках: практически всегда он вызывал остановку роста плода и в некоторых случаях – такие патологии, как гидроцефалия. Впрочем, в аналогичном исследовании на мышах он не проявил таких эффектов. О репродуктивной токсичности этого яда для людей данных нет.

В первых исследованиях анатоксина-а для определения его ЛД50 и ЛД100, а также экотоксичности использовались биологические методы. Исследования проводили на мышах, а также на ракообразных и их личинках. Для обнаружения анатоксина-а эти методы непригодны, поскольку не являются селективными, обладают недостаточной чувствительностью при высоких концентрациях токсина и требуют больших затрат биоматериала. К современным методам анализа анатоксина-а относится хроматография – ВЭЖХ с УФ- или флуоресцентным детектором, ВЭЖХ-МС или ГХ-МС. Основной недостаток этих методов применительно к обнаружению анатоксина-а заключается в быстром распаде этого вещества: поскольку анализ невозможно провести на месте сбора проб, не всегда удается получить корректные данные о содержании в них токсина. Тонкослойная хроматография позволяет определять содержание анатоксина-а в клетках цианобактерий и обладает высокой чувствительностью.

Альтернативные методы анализа анатоксина-а основаны на сродстве этого вещества и гомоанатоксина-а к никотиновым рецепторам. Они называются рецепторными методами анализа и позволяют быстро и с высокой точностью определять концентрацию анатоксина-а в пробах. Тест-система Anatoxin-a RBA Kit создана на основе этого эффекта и позволяет определять содержание анатоксина-а в пределах от 10 мкг/л до 500 мкг/л. Кроме того, с помощью тест-системы Anatoxin-a ELISA Kit возможно определять содержание анатоксина-а методом иммуноферментного анализа (ИФА), что значительно сокращает временные затраты.

Редкое присутствие фактора объясняется следующим образом. Лейкоцидин относится к двухкомпонентным токсинам. Он состоит из двух неассоциированных белков, S и F (от англ. slow и fast — медленно и быстро элюируемые компоненты при ионообменной хроматографии), каждый из которых обладает собственной мишенью. Цитолитический эффект наблюдается только при их совместном действии. В штаммах, обладающих двумя токсинами (гамма-гемолизин и лейкоцидин), имеются три разных S-компонента (HlyA, HlyC и LukS-PV) и два F-компонента (HlуB и LukF-PV). От их сочетания зависит цитотоксическая активность цельного токсина. В частности, LukS-PV—LukF-PV — комбинация, которая не действует на эритроциты. Остальные сочетания дают три гамма-токсина — HlyA (HlуA—LukF-PV), HlyB (HlуA—HlуB) и HlyC (HlуC—HlyB). Они продуцируются практически всеми штаммами S. aureus, имеют высокую гемолитическую активность и слабее действуют на нейтрофилы.

Белок А. Пожалуй, это самый знаменитый фактор золотистого стафилококка, по крайней мере для специалистов, непосредственно не связанных с микробиологией. Он входит в состав клеточной стенки и обладает способностью вступать во взаимодействие с Fc-фрагментом IgG человека. Этот феномен, нашедший широкое применение в иммунологии, неспецифичен, так как реакция не затрагивает участков IgG, ответственных за распознавание антигенов. Если учесть, что Fc-фрагмент обеспечивает связывание IgG-опсонинов с фагоцитами и комплементом, то его блокада белком А может иметь негативные последствия для опсонофагоцитарной защиты.

Стафилокиназа. Растворение сгустков крови обеспечивает проникновение бактерий во внутреннюю среду. Так действует стафилокиназа. Переводя плазминоген в плазмин, она способствует разрушению фибрина, в том числе образуемого стафилококковой коагулазой. Это высвобождает инфицированные микротромбы, которые с током крови распространяются по организму. Этому содействует и повреждение экстрацеллюлярного матрикса соединительной ткани. В нем участвуют протеазы и гиалуронидаза стафилококка. Определенное значение имеет стафилококковая ДНК-аза. Ее подключение к инвазивности связано с расщеплением ДНК, накапливающейся в гнойном содержимом.

Лекарственная резистентность. Золотистый стафилококк печально знаменит своей быстрой адаптацией к антибиотикам и другим антибактериальным средствам. И хотя блестящий опыт первых испытаний пенициллина связан с излечением от стафилококкового сепсиса, сегодня это удается далеко не всегда. Количество резистентных стафилококков и спектр их устойчивости быстро росли на протяжении последних лет, и в настоящее время многие штаммы не чувствительны не только к классическому пенициллину, но и к антибиотикам последних поколений. Это эволюционно неизбежный процесс, отражающий экологическую пластичность бактерий. У стафилококков он связан с селекцией штаммов, разрушающих антибиотики. Главная роль принадлежит ферментам — плазмидзависимым бета-лактамазам. Они легко подстраиваются к новым пенициллинам и цефалоспоринам, а благодаря подвижности генов резистентности, входящих в состав R-транспозонов, быстро распространяются в микробных популяциях.

Лекарственная устойчивость — важнейший патогенетический фактор стафилококковых инвазий: затрудняя элиминацию возбудителя, он стабилизирует очаговые процессы, повышая вероятность осложнений. Кроме бета-лактамазоустойчивых пенициллинов (их история начинается с метициллина), цефалоспоринов и новых классов бета-лактамных антибиотиков (карбапенемы, монобактамы) для преодоления резистентности в состав препаратов предложено включать ингибиторы бета-лактамаз, например, сульбактам. Это повышает эффективность антибактериальной терапии, расширяя спектр чувствительных штаммов. Впрочем, и такой подход спасает не всегда. Большим злом являются метициллинрезистентные стафилококки, MRSA (от англ. methicillin-resistent S. aureus). Они устойчивы к бета-лактамным антибиотикам благодаря хромосомной добавке, кодирующей дополнительный пенициллинсвязывающий белок (РВР2а) — мутантную пептидогликановую транспептидазу. Несмотря на свое название (и в отличие от четырех главных транспептидаз), РВР2а слабо связывает бета-лактамные антибиотики, которые из-за этого лишаются антибактериальной активности. Такие штаммы резистентны к пенициллинам и цефалоспоринам (по крайней мере в реальных клинических дозировках), создавая серьезные трудности для этиотропной терапии. Приходится использовать другие антибиотики, в частности гликопептидного ряда. Препаратом выбора является ванкомицин, активный против MRSA. Однако недавно появились штаммы S. aureus, устойчивые к ванкомицину. Они создают тревожную перспективу, заставляя искать новые подходы к лечению инфекций, вызываемых множественно устойчивыми к лекарствам штаммами стафилококков.

Условия возникают не только извне (высокая инфицирующая дозировка, повреждение тканей, внедрение инородных тел), их формирует и сам инфицируемый организм. Речь идет о нарушениях гомеостаза, которые снижают резистентность к местным инвазиям и повышают вероятность системных осложнений. Сопротивление пиогенной инфекции во многом зависит от качества опсонофагоцитарных реакций. Их ослабление повышает чувствительность к стафилококку, способствуя стабилизации пиогенного процесса. Эндогенными факторами риска по развитию стафилококковых пиодермий являются диабет, гиперфункция сальных желез и изменение качества их секрета (в периоде полового созревания), возрастная эволюция апокринных потовых желез.

Стабилизация очагов пиогенной инфекции может быть связана с тем, что бактерии вызывают слабый иммунный ответ, который не обеспечивает образования необходимого количества опсонически активных антител. Установлено, например, что в отличие от стафилококковых поражений внутренних органов пиодермии не стимулируют синтеза антипептидогликановых антител — важного компонента опсонофагоцитарной защиты. У больных с хроническими стафилококковыми инвазиями (например, при остеомиелите) находили антитела, блокирующие опсоническую активность противостафилококковых антител здоровых людей. Кроме того, золотистый стафилококк способен скрываться от антител в сгустках фибрина и внутри самих фагоцитов. По той же причине иммунитет не срабатывает и при бактериемии. В любом случае, никто еще не сумел доказать, что содержание антител к каким-либо антигенам надежно коррелирует с устойчивостью против стафилококковых инвазий.

Много сил отдано иммунопрофилактике и иммунотерапии стафилококковых инфекций. На роль протективных антигенов претендовали разные продукты золотистого стафилококка. Наиболее широкие испытания прошел стафилококковый анатоксин. Его применение было нацелено на повышение устойчивости к S. aureus на основе антител против альфа-токсина. Опыты начались в 1930-х гг. под впечатлением блестящих результатов борьбы с дифтерией при помощи обезвреженного формалином токсина дифтерийной палочки. В нашей стране дело зашло так далеко, что препаратом стали широко иммунизировать беременных женщин для профилактики перинатальной гнойной патологии. Но накопилось столько противоречий, что плановая иммунопрофилактика была оставлена. Собственно этого следовало ожидать, исходя из патогенетической поливалентности золотистого стафилококка и скромной роли каждого из его факторов в развитии инфекционного процесса. Анатоксин (так же, как еще более загадочный препарат — антифагин) был рекомендован и для лечения хронических стафилококковых пиодермий. Механизм его действия в этом случае не ясен, но он, безусловно, не исчерпывается стимуляцией специфического иммунитета.

Иллюзорная идея о профилактической и терапевтической ценности анатоксина породила еще один препарат — противостафилококковый иммуноглобулин, широко разрекламированный как эффективное средство против септических стафилококковых инвазий. Его готовят из крови доноров, вакцинированных стафилококковым анатоксином, стандартизуют по антителам против альфа-токсина и именно их считают действующим началом. Но подобная логика не убеждает: вакцинация, не гарантирующая активного иммунитета, вряд ли способна обеспечить образование антител, эффективных в создании пассивного иммунитета. Введение иммуноглобулина (особенно больших дозировок при внутривенных инфузиях) может давать санирующий эффект не за счет нейтрализации бактериальных токсинов, а в результате подавления вторичной токсемии, связанной, в частности, с цитокинами. Синдром интоксикации (сложный сам по себе) — лишь часть патогенеза стафилококковой инвазии, и только с таких позиций следует обсуждать проблемы иммунотерапии стафилококковых инфекций.

Наряду с пиогенными инфекциями, золотистый стафилококк способен вызывать специфические интоксикации, патогенез и клиническая картина которых целиком связаны с определенными бактериальными токсинами. Инвазия необязательна, хотя она может предшествовать или сопутствовать интоксикации. К специфическим токсинам золотистого стафилококка относятся эксфолиативный токсин, токсин синдрома токсического шока, энтеротоксин. В отличие от других патогенетически значимых факторов названные токсины кодируются плазмидами, умеренными бактериофагами или хромосомными генами, называемыми островами патогенности. Поэтому они продуцируются ограниченным числом стафилококковых штаммов, определяя уникальность их вирулентности.

Содержимое (Table of Contents)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Анатоксин стафилококковый ФС.3.3.1.0006.15

очищенный,

раствор для подкожного Взамен ГФ Х, ст. 62,

введения ФС 42 – 3238 — 95

Настоящая фармакопейная статья распространяется на анатоксин стафилококковый очищенный, раствор для подкожного введения, который представляет собой токсин стафилококковый, обезвреженный формалином при нагревании и очищенный от балластных белков способом, гарантирующим полную детоксикацию и отсутствие возможности реверсии токсичности, при сохранении антигенной и иммуногенной активности.

Препарат не содержит консервантов и антибиотиков.

При подкожном введении анатоксин стафилококковый очищенный вызывает образование специфических антител (антитоксинов) против экзотоксина стафилококкового.

Область применения – специфическая иммунотерапия острой и хронической (в стадии обострения) стафилококковой инфекции у взрослых.

ПРОИЗВОДСТВО

При производстве анатоксина стафилококкового очищенного используют штамм Staphylococcus aureus О15 (или другой штамм стафилококка, обладающий аналогичными свойствами), который депонирован в официальной коллекции, происхождение и история которого документированы.

При культивировании на жидких питательных средах штамм должен образовывать токсин стафилококковый (синонимы: экзотоксин, альфатоксин, альфастафилолизин). Метод культивирования должен обеспечивать высокую продукцию токсина, сохранять гемолитические свойства штамма и исключать контаминацию штамма посторонней микрофлорой. Токсинсодержащая культуральная жидкость, освобожденная от микробных клеток и продуктов их распада, должна содержать токсин стафилококковый с гемолитической активностью не менее 500 DHM (минимальная гемолитическая доза) и иметь Lh (лимит гемолитического действия) токсина не более 0,4 мл. Способ детоксикации токсина стафилококкового должен гарантировать отсутствие токсичности и возможность ее реверсии при сохранении антигенной (не менее 2 ЕС/мл) и иммуногенной (способность вызывать образование специфических антител) активности анатоксина стафилококкового.

Для характеристики анатоксина стафилококкового очищенного, раствора для подкожного введения, определяют: рН, прозрачность, цветность, стерильность, аномальную токсичность, специфическую безвредность, специфическую активность, антигенную активность, содержание формальдегида.

ИСПЫТАНИЯ

Прозрачная жидкость бесцветная или светло-желтого цвета. Определяют визуально.

Должен быть прозрачным. Определение проводят визуально.

Препарат должен быть нетоксичным.

Белым мышам (5 животным) массой 18–20 г препарат вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл, 2 морским свинкам массой 250–300 г подкожно по 2 мл.

Препарат считают выдержавшим испытание, если:

  • — в течение 7 сут наблюдения все животные остались живы и ни у одного из животных не были выявлены видимые признаки заболевания;
  • — ни у одного из животных не отмечена потеря массы тела;
  • — ни у одной морской свинки в месте введения препарата не развился абсцесс или некроз.

Если в течение периода наблюдения регистрируют гибель хотя бы 1 животного, заболевание, уменьшение массы тела или повреждение в месте инъекции, испытание повторяют на удвоенном количестве животных при тех же условиях учета опыта. Повторное испытание считают удовлетворительным, если препарат отвечает вышеперечисленным требованиям.

Препарат должен быть безвредным.

Кроликам (2 животным) массой 2 – 2,5 кг препарат в дозе 3 мл вводят подкожно в боковую поверхность тела и в той же дозе – внутривенно в краевую вену уха.

Препарат считают выдержавшим испытание, если в течение 5 сут наблюдения кролики остаются здоровыми и в местах введения препарата отсутствуют явления некроза тканей.

Должен вызывать образование специфических антител при подкожном введении (содержание антиальфастафилолизина (специфических антител) в сыворотке крови иммунизированных кроликов должно быть не менее 3 МЕ в 1 мл (среднеарифметическое значение).

(антитоксинсвязывающая способность). 1 мл препарата должен содержать от 10 до 14 ЕС (единиц связывания) стафилококкового анатоксина. 1 ЕС представляет собой минимальное количество анатоксина, которое связывает 1 МЕ (Международную единицу) антиальфастафилолизина.

Метод определения антигенной активности основан на способности стафилококкового анатоксина связывать специфические антитела (антиальфастафилолизин) и на способности антител нейтрализовать гемолитические свойства токсина стафилококкового.

Для постановки реакции используют следующие ингредиенты:

  • испытуемый анатоксин стафилококковый;
  • стандартный образец (СО) антиальфастафилолизина с установленным содержанием стафилококковых антител (МЕ/мл);
  • токсин стафилококковый, гемолитические свойства которого характеризуются величиной Lh (лимит гемолитического действия — минимальное количество токсина стафилококкового, которое, будучи связано с 1 МЕ антиальфастафилолизина, вызывает почти полный (+++) гемолиз эритроцитов кролика);
  • 15 % взвесь эритроцитов кролика;
  • 0,9 % раствор натрия хлорида.

Определение антитоксинсвязывающей способности анатоксина стафилококкового сопровождается 4 контролями.

1 контроль — служит для коррекции учета результатов опытного ряда, т.к. в нем определяется количество МЕ (Международных единиц) анти­альфастафилолизина, которое нейтрализует Lh токсина стафилококкового в условиях опыта. СО антиальфастафилолизина разводят 0,9 % раствором натрия хлорида до содержания 1 МЕ в 1 мл, разливают в ряд пробирок в объеме 0,8; 0,9; 1; 1,1; 1,2 мл и доводят общий объем в каждой пробирке 0,9 % раствором натрия хлорида до 2 мл. Таким образом, первый контроль состоит из ряда пробирок, содержащих от 0,8 до 1,2 МЕ антиальфастафилолизина.

3 контроль — контроль отсутствия спонтанного лизиса эритроцитов кролика. В пробирку вносят 2 мл 0,9 % раствора натрия хлорида.

4 контроль — контроль гемолитического действия токсина стафилококкового на эритроциты кролика в условиях опыта. В пробирку вносят 2 мл 0,9 % раствора натрия хлорида.

Опытный ряд — испытуемый препарат разводят 0,9 % раствором натрия хлорида в 8, 10, 12, 14 и 16 раз. Переносят в пробирки по 1 мл приготовленных разведений и добавляют в них по 1 мл раствора СО антиальфастафилолизина, содержащего 2 МЕ/мл. Пробирки осторожно встряхивают и выдерживают 20 мин при температуре (20 ± 2) °С.

Затем в пробирки опытного и контрольных рядов (кроме третьего) добавляют токсин стафилококковый в объеме Lh, установленном в день проведения испытания. Все пробирки встряхивают и выдерживают 20 мин при температуре (20 ± 2) °С. Далее в каждую пробирку добавляют по 0,1 мл свежеприготовленной 15 % взвеси эритроцитов, пробирки вновь встряхивают и выдерживают в течение 1 ч при температуре (37 ± 1) °С, а затем — 1 ч при температуре (20 ± 2) °С.

Результаты учитывают визуально по степени гемолиза эритроцитов:

Учет результатов опыта начинают с определения результатов контроля.

Во втором и третьем контроле гемолиз эритроцитов должен отсутствовать. Отсутствие гемолиза во втором контроле свидетельствует, о том, что антиальфастафилолизин в дозе 2 МЕ полностью нейтрализовал гемолитическое действие дозы токсина стафилококкового в опыте; в четвертом контроле должен произойти полный гемолиз эритроцитов.

Антигенная активность (антитоксическая способность) (АС) стафилококкового анатоксина, выраженная в единицах связывания (ЕС), рассчитывается по следующей формуле:

n — кратность разведения испытуемого анатоксина в опыте;

2 — количество МЕ антиальфастафилолизина в опыте;

а — количество МЕ антиальфастафилолизина, затраченное на нейтрали-зацию дозы токсина стафилококкового в первом контрольном ряду;

(2 — а) — количество МЕ антиальфастафилолизина, связанное испытуемым анатоксином в условиях опыта, являющееся эквивалентом количества единиц связывания (ЕС) анатоксина в опыте.

Раздел должен содержать следующую информацию: наименование штамма(ов); место их депонирования; морфологическую характеристику; при необходимости допустимое количество пассажей и методику их проведения с указанием субстрата и условий культивирования; дополнительные к паспортным данным требования к характеристикам штаммов.

Показатели, которые отражают качество конечного продукта, но не могут быть определены, должны быть определены на промежуточных стадиях производства, что также должно быть отражено в нормативной документации.

Содержимое (Table of Contents)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Анатоксин стафилококковый ФС.3.3.1.0005.15

очищенный адсорбированный,

суспензия для подкожного Взамен ГФ Х, ст.63,

введения ФС 42 – 3111 -95

Настоящая фармакопейная статья распространяется на анатоксин стафилококковый очищенный адсорбированный, суспензия для подкожного введения, который представляет собой токсин стафилококковый, обезвреженный формалином при нагревании, очищенный от балластных белков способом, гарантирующим полную детоксикацию и отсутствие возможности реверсии токсичности при сохранении антигенной и иммуногенной активности, адсорбированный на гидроксиде алюминия или другом разрешенном к применению минеральном адсорбенте.

При подкожном введении анатоксин стафилококковый очищенный адсорбированный вызывает образование специфических антител (антитоксинов) к экзотоксину стафилококковому.

  • — профилактика стафилококковых инфекций у лиц с повышенным риском заболевания (промышленные и сельскохозяйственные рабочие, подвергающиеся по роду своей деятельности частому травматизму), а также у больных, которым предстоят плановые операции;
  • — иммунизация доноров с целью получения антистафилококковой плазмы и изготовления антистафилококкового иммуноглобулина.

ПРОИЗВОДСТВО

При производстве анатоксина стафилококкового очищенного используют штамм Staphylococcus aureus О15 (или другой штамм стафилококка, обладающий аналогичными свойствами), который депонирован в официальной коллекции, происхождение и история которого документированы.

При культивировании на жидких питательных средах штамм должен образовывать экзотоксин (синонимы: токсин стафилококковый, альфатоксин, альфастафилолизин). Метод культивирования должен обеспечивать высокую продукцию токсина, сохранять гемолитические свойства штамма и исключать контаминацию штамма посторонней микрофлорой. Токсинсодержащая культуральная жидкость, освобожденная от микробных клеток и продуктов их распада, должна содержать токсин стафилококковый с гемолитической активностью не менее 500 DHM (минимальная гемолитическая доза) и иметь Lh (лимит гемолитического действия) токсина не более 0,4 мл. Способ детоксикации токсина стафилококкового должен гарантировать отсутствие токсичности и возможность ее реверсии при сохранении антигенной (не менее 2 ЕС/мл) и иммуногенной (способность вызывать образование специфических антител) активности анатоксина стафилококкового. Последующая концентрация должна обеспечить содержание в 1 мл концентрата не менее 30 ЕС (единиц связывания).

Для производства анатоксина стафилококкового адсорбированного проводят сорбцию полученного концентрированного анатоксина, добавляя необходимое (расчётное) количество гидроксида алюминия. Сорбция должна быть полной.

Для характеристики анатоксина стафилококкового очищенного адсорбированного, суспензии для подкожного введения, определяют: рН, время седиментационной устойчивости, размер частиц, дисперсность, стерильность, аномальную токсичность, специфическую безвредность, специфическую активность, полноту сорбции, содержание формальдегида, адсорбента и консерванта.

ИСПЫТАНИЯ

Суспензия белого цвета с желтоватым оттенком, разделяющаяся при стоянии на прозрачную надосадочную жидкость и рыхлый осадок, полностью диспергируемый при встряхивании. Определение проводят визуально.

После встряхивания не должно наблюдаться расслаивания в течение 2,5 мин.

Показатель дисперсности от 0,6 до 1,4. Определение проводят фотометрически при разведении препарата 1:1 0,9 % раствором натрия хлорида в соответствии с указаниями в нормативной документации.

Препарат должен быть нетоксичным.

Белым мышам (5 животным) массой тела 18–20 г препарат вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл, 2 морским свинкам массой 250–300 г – подкожно по 2 мл.

Препарат считают выдержавшим испытание, если:

  • — в течение 7 сут наблюдения все животные остались живы и ни у одного из животных не были выявлены видимые признаки заболевания;
  • — ни у одного из животных не отмечена потеря массы тела;
  • — ни у одной морской свинки в месте введения препарата не развился абсцесс или некроз.

Если в течение периода наблюдения регистрируют гибель хотя бы 1 животного, заболевание, уменьшение массы тела или повреждение в месте инъекции, испытание повторяют на удвоенном количестве животных при тех же условиях учета опыта. Повторное испытание считают удовлетворительным, если препарат отвечает вышеперечисленным требованиям.

Препарат должен быть безвредным.

Кролику массой 2 – 2,5 кг препарат вводят подкожно по 2,5 мл в оба бока. Препарат считают выдержавшим испытание, если в течение 5 сут наблюдения кролик остаётся здоровым, и в местах введения препарата отсутствуют явления некроза тканей.

Должен вызывать образование специфических антител при подкожном введении (содержание антиальфастафилолизина (специфических антител)) в сыворотках крови иммунизированных кроликов должно быть не менее 3 МЕ в 1 мл (среднеарифметическое значение).

Примечание.

Сорбция стафилококкового анатоксина должна быть полной. Надосадочная жидкость не должна содержать свободного стафилококкового анатоксина. Допускается наличие в 1 мл надосадочной жидкости не более 0,2 ЕС антиальфастафилолизина (1 ЕС представляет собой минимальное количество анатоксина, которое связывает 1 ME (Международная единица) антиальфастафилолизина).

Для постановки реакции используют следующие ингредиенты:

  • испытуемый анатоксин стафилококковый;
  • стандартный образец (СО) антиальфастафилолизина с установленным содержанием стафилококковых антител (МЕ/мл);
  • токсин стафилококковый, гемолитические свойства которого характеризуются величиной Lh (лимит гемолитического действия — минимальное количество токсина стафилококкового, которое, будучи связано с 1 МЕ антиальфастафилолизина, вызывает почти полный (+++) гемолиз эритроцитов кролика);
  • 15 % взвесь эритроцитов кролика;
  • 0,9 % раствор натрия хлорида.

Для определения полноты сорбции в 4 пробирки (опытный ряд) наливают надосадочную жидкость испытуемого препарата: в первую пробирку – 1 мл неразведенной надосадочной жидкости, в остальные пробирки вносят по 1 мл надосадочной жидкости, разведенной 0,9% раствором натрия хлорида соответственно в 2, 5, 10 раз. В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора СО антиальфастафилолизина, разведенного до содержания 0,2 МЕ/мл. Пробирки осторожно встряхивают и выдерживают 20 мин при температуре 18 – 20 °С.

Проведение испытания сопровождается 4 контролями:

В пробирки опытного ряда и контрольные пробирки № 1 и № 3 добавляют токсин стафилококковый в дозе Lh/10. В контрольные пробирки № 2 и № 4 токсин не добавляют.

Все пробирки встряхивают и выдерживают 20 мин при температуре

(20 ± 2) °С. Далее в каждую пробирку добавляют по 2 капли (0,1 мл) 15 % взвеси эритроцитов, приготовленной в день испытания; пробирки вновь встряхивают и выдерживают в течение 1 ч при температуре (37 ± 1) °С, а затем – 1 ч при температуре (20 ± 2) °С.

Результаты испытания учитывают визуально по степени гемолиза эритроцитов:

Учет результатов испытания начинают с определения результатов контроля.

В пробирках опытного ряда признаков гемолиза не должно быть.

Наличие признаков гемолиза в опытном ряду означает присутствие в надосадочной жидкости свободного стафилококкового анатоксина, который связывает антиальфастафилолизин, и оставшийся свободным токсин стафилококковый вызывает гемолиз эритроцитов кролика.

Пример расчета: в 1 пробирке опытного ряда (неразведенная надосадочная жидкость) зафиксирован почти полный гемолиз (+++). Это означает, что в 1 мл надосадочной жидкости содержится 0,1 ЕС стафилококкового анатоксина, т.к. 0,1 ЕС стафилококкового анатоксина связался с 0,1 ME антиальфастафилолизина, а оставшийся свободным токсин стафилококковый вызвал гемолиз эритроцитов кролика.

Раздел должен содержать следующую информацию: наименование штамма(ов); место депонирования; морфологическую характеристику; при необходимости – допустимое количество пассажей и методику их проведения с указанием субстрата и условий культивирования; дополнительные к паспортным данным требования к характеристикам штаммов.

Показатели, которые отражают качество конечного продукта, но не могут быть определены, должны быть определены на промежуточных стадиях производства, что также должно быть указано в нормативной документации.

При температуре от 2 до 8 °С. Замораживание не допускается.

Читайте также:

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.

Copyright © Иммунитет и инфекции