Эритроцитарный диагностикум сыпного тифа

РНГА с сыпнотифным диагностикумом (anti-Ricketsia prowazeki)

Исследование предназначено для определения наличия в крови пациента специфических антител к Ricketsia prowazeki - возбудителю сыпного тифа. Анализ является серологическим маркером болезни Брилла-Цинссера (спорадического сыпного тифа).

Серологический анализ проводится методом РНГА (реакцией непрямой гемагглютинации). В лунках лабораторной планшетки серолог разводит исследуемую сыворотку с поэтапным удвоением. Затем добавляет в образцы стандартные эритроциты, сенсибилизированные риккетсиями. При наличии в пробах иммунных антител к антигену возбудителя инфекции, эритроциты слипаются и равномерно покрывают все дно лунки – реакция считается положительной, при отрицательной реакции эритроциты располагаются на дне в виде маленькой пуговки.

Подготовка к исследованию:

Анализ проводится утром, натощак.
С последнего приема пищи должно пройти не менее 8 часов.
Исключить прием алкоголя не менее чем за 24 часа до взятия биоматериала.
Не рекомендуется сдавать кровь на серологию после флюорографии, рентгена, физиотерапевтических процедур.

Тип биоматериала: венозная кровь

Синонимы (rus): Серодиагностика с эритроцитарным сыпнотифозным (риккетсиозным Провачека) диагностикумом

Синонимы (eng): Detection of anti-typhus Рrowazeki antibodies in patient serum

Методы: Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Сроки выполнения: 7-8 дней

Сыпным или вшивым тифом называют острую инфекцию, вызываемую внутриклеточными паразитами - риккетсиями провачека (Ricketsia prowazeki). Это название мелкая грамотрицательная бактерия, унесшая миллионы жизней, получила по фамилиям двух ученых, разгадавших тайну смертельного заболевания - американского биолога Говарда Тейлора Риккетса и чешского естествоиспытателя Станислава Провачека.

Источник инфекционного процесса - больной человек, от которого заражение передается здоровому человеку платяными и головными вшами. Расчесывая укусы этих специфических паразитов, человек втирает их экскременты, содержащие риккетсии, в клетки кожных покровов. Сыпной тиф распространяется из-за плохих социальных условий, скученности, тесноты. Именно поэтому наиболее страшные эпидемии инфекции возникали в военное время и при стихийных катастрофах.

После выздоровления у человека вырабатывается иммунный барьер к возбудителю, однако он способен сохраняться в организме длительный период и спустя много лет рецидивировать. Повторный сыпной тиф имеет те же клинические проявления, но в более легкой форме. При заражении риккетсиями в организме продуцируются специфические антитела, концентрация которых нарастает с каждой неделей заболевания и остается повышенной длительный период. Для эндогенной рецидивирующей инфекции (болезни Брилла) также характерно выраженное повышение уровня иммунных антител.

Опытные инфекционисты проводят серологическое исследование при наличии у пациента:

сильной головной боли;
высокой температуры (до 40°С);
бессонницы, раздражительности;
потери аппетита;
характерных высыпаний на коже - на боках туловища и сгибах конечностей;
симптомов поражения сердечной, нервной и сосудистой систем - учащенное сердцебиение, снижение кровяного давления, нарушение сознания.

Негативная РНГА считается отрицательным результатом - заражения риккетсиями нет. Положительным результатом считается диагностический титр 1:640 - текущий или перенесенный в прошлом риккетсиоз (сыпной или спорадический тиф).

Рекомендовано проводить РНГА - исследование в парных образцах биоматериала: первое - на седьмой день инфекционного процесса, второе - спустя две недели.

В настоящее время в лабораториях используются следующие диагностикумы.

1 .Бактериальный диагностикум сальмонелл брюшного тифа (или сальмонелл паратифа А и В, шигелл Флекснера, Зонне и др. бактерий семейства Enterobacteriaceae) является взвесью убитых бактерий соответствующего вида и применяется в реакции агглютинации для обнаружения антител в сыворотке больных, т.е для серодиагностики.

2. Сальмонеллезные 0-диагностикумы содержат О-антигены различных групп сальмонелл. Получают из взвеси убитых нагреванием сальмонелл. Применяются для выявления О-антител при сальмонеллезных инфекциях в реакции агглютинации с сывороткой больных (серодиагностика).

3. Сальмонеллезные Н-диагностикумы представляют собой жгутиковые антигены формалинизированных бульонных культур сальмонелл соответствующих видов и используются в реакции агглютинации для серодиагностики заболевания, т.е. для определения Н- антител в сываротке.

4. Vi — брюшнотифозный диагностикум — препарат, полученный из S. typhi, содержащей Vi-антиген, воздействием формалина Применяется в реакции агглютинации для обнаружения Vi-антител в сыворотке для серодиагностики брюшнотифозного бактерионосительства.

5. Диагностикум бруцеллезный единый – взвесь убитых бруцелл, подкрашенная метиленовым синим. Единый бруцеллезный диагностикум применяется для определения антител в сыворотках крови больных бруцеллезом людей и животных в реакциях агглютинации Хеддльсона и Райта (серодиагностика бруцеллеза).

6. Диагностикум риккетсиозный Провачека - взвесь убитых риккетсий Провачека. Применяется для определения антител в сыворотке больных эпидемическим сыпным тифом в реакции агглютинации риккетсий (РАР) – серодиагностика эпидемического сыпного тифа.

7. Кардиолипиновый антиген готовят из мышечной ткани сердца быка в виде спиртового экстракта с добавлением холестерина. Применяют в качестве неспецифического антигена для постановки реакции Вассермана с целью серодиагностики сифилиса.

8. Антиген Вассермана – специфический антиген из тканевых трепонем, обработанных ультразвуком. Применяется для постановки реакции Вассермана с целью серодиагностики сифилиса.

9. Эритроцитарный сальмонеллезный 0-диагностикум – взвесь эритроцитов с адсорбированными на них О-антигенами различных групп сальмонелл. Используется для постановки РПГА с сывороткой больного для серодиагностики сальмонеллезной инфекции.

10. Эритроцитарный брюшнотифозный Vi-диагностикум - эритроциты, сенсибилизированные очищенным Vi-антигеном S. typhi. Применяется в РПГА для определения Vi-антител в сыворотке для серодиагностики брюшнотифозного бактерионосительства.

11. Эритроцитарный дифтерийный диагностикум – эритроциты, сенсибилизированные дифтерийным анатоксином. Применяется в РПГА для определения антитоксических противодифтерийных антител в исследуемой сыворотке с целью оценки напряженности антитоксического иммунитета для выявления контингента лиц, подлежащих ревакцинации против дифтерии.

12. Эритроцитарный микоплазменный диагностикум - эритроциты, сенсибилизированные микоплазменным антигеном. Применяется для определения нарастания титра антимикоплазменных антител в парных сыворотках больного в РПГА с целью серодиагностики микоплазменных инфекций.

13. Эритроцитарный сыпнотифозный (риккетсиозный Провачека) диагностикум – эритроциты, сенсибилизированные риккетсиозным Провачека антигеном. Применяется в РПГА для определения антириккетсиозных Провачека антител в сыворотке больного (серодиагностика эпидемического сыпного тифа).

14. Эритроцитарный риккетсиозный Музера диагностикум - эритроциты, сенсибилизированные риккетсиозным Музера антигеном. Применяется в РПГА для определения антириккетсиозных Музера антител в сыворотке больного (серодиагностика эндемического сыпного тифа).

15. Эритроцитарный риккетсиозный Бернета диагностикум - эритроциты, сенсибилизированные риккетсиозным Бернета антигеном. Применяется в РПГА для определения антириккетсиозных Бернета антител в сыворотке больного (серодиагностика Ку-лихорадки).

16. Эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум – эритроциты с адсорбированными на них антитоксическими антибутулиническими антителами. Используется для постановки РПГА с целью быстрого выявления экзотоксина в сыворотке больного (экспресс-метод диагностики ботулизма).

17.Эритроцитарный антительный противостолбнячный диагностикум – эритроциты с адсорбированными на них антитоксическими антистолбнячными антителами. Используется для постановки РПГА с целью быстрого выявления экзотоксина в сыворотке больного (экспресс- метод диагностики столбняка).

18. Эритроцитарный антительный противогангренозный диагностикум – эритроциты с адсорбированными на них антитоксическими противогангренозными антителами. Используется для постановки РПГА с целью быстрого выявления противогангренозного экзотоксина в сыворотке больного (экспресс-метод диагностики газовой гангрены).

19. Эритроцитарный антительный менингококковый диагностикум – эритроциты с адсорбированными на них антименингококковыми антителами. Применяется в РПГА для выявления менингококкового антигена в ликворе больного.

20. Гриппозный диагностикум представляет собой аллантоисную жидкость инфицированных вирусом гриппа (типов А, В) куриных эмбрионов и инактивированную. Диагностикум применяется при постановке РТГА или РСК с парными сыворотками больных для определения нарастания титра антител (серодиагностика гриппа)

21. Диагностикум вируса клещевого энцефалита получают из суспензии мозга белых мышей, зараженных вирусом клещевого энцефалита с последующей инактивацией вируса.

Диагностикум используется в РТГА или РСК для определения нарастания титра антител в парных сыворотках больного (серодиагностика клещевого энцефалита).

В настоящее время в лабораториях используются следующие диагностикумы.

Использование: повышение специфичности целевого продукта. Задача: единый диагностикум риккетсий Провачека. Сущность изобретения: корпускулярный сухой обрабатывают тритоном Х-100, выделяют мембранные белки путем центрифугирования и сенсибилизируют ими формалинизированные танизированные эритроциты. Новым в способе является то, что сенсибилизацию эритроцитов проводят при Т 49-51 o C, а в качестве сенситина используют мембранные белки риккетсий Провачека, выделенные из единого антигена риккетсий Провачека при Т от 0 до 4 o C.

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционной иммунологии и может быть использовано при производстве диагностических препаратов с использованием нерастворимых носителей.

В медицинской промышленности для изготовления эритроцитарных риккетсиозных антигенных диагностикумов в качестве нерастворимых носителей используют эритроциты человека и различные сенситины, полученные из очищенных эфиром риккетсий Провачека, культивируемых в желточных оболочках куриных эмбрионов или в кишечнике вшей. (Пшеничнов Р.А, Колотов В.М, Касатова О.А. Жидкий эритроцитарный сыпнотифозный диагностикум для непрямой гемагглютинации. Ж. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 1967, N 9, с. 62-64).

Известные способы приготовления эритроцитарных антигенных диагностикумов не позволяют получать стабильные при хранении препараты, обладающие высокой специфичностью и позволяющие проводить внутригрупповую дифференциацию риккетсиозов группы сыпного тифа.

Известен способ приготовления сухого эритроцитарного сыпнотифозного антигенного диагностикума (СЭСД) на основе формалинизированных и танизированных эритроцитов барана, нагруженных (сенсибилизированных) антигеном риккетсий Провачека, выделенным из корпускулярного антигена риккетсий Провачека с помощью обработки 2%-ным раствором детергента тритона Х-100 (экспериментально-производственный регламент N 400-92 "Диагностикум эритроцитарный сыпнотифозный сухой для РНГА").

Однако существующий способ позволяет получать диагностикум с активностью, не превышающей активность коммерческих жидких препаратов. Кроме того, с его помощью невозможно проводить внутригрупповую дифференциацию риккетсиозов группы сыпного тифа, что важно для эпидемиологов, т.к. комплекс противоэпидемических мероприятий, проводимых при эпидемическом сыпном тифе, отличается от комплекса противоэпидемических мероприятий, проводимых при эндемическом сыпном тифе.

Преимуществом этого диагностикума перед жидким является то, что в качестве нерастворимого носителя используют эритроциты барана, с его помощью выявляются сыпнотифозные антитела у лиц, вакцинированных сыпнотифозной вакциной, он стабилен при хранении и выпускается в ампулах в сухом виде. Однако решить вопрос о повышении специфичности и внутригрупповой дифференциации путем увеличения нагруженности эритроцитов сенситином невозможно, т. к. для приготовления сенситина используют риккетсии Провачека, подвергнутые эфирной обработке, в процессе которой наряду с неспецифическими примесями удаляются и специфические антигены, отвечающие за внутригрупповую дифференциацию.

Изобретение направлено на решение задачи: повышение специфичности целевого продукта.

Для этого единый диагностикум риккетсий Провачека корпускулярный сухой обрабатывают тритоном Х-100, выделяют мембранные белки путем центрифугирования и сенсибилизируют ими формалинизированные танизированные эритроциты.

Существенные признаки заявляемого способа: ограничительные - сенсибилизация формалинизированных и танизированных эритроцитов барана тритоновым антигеном риккетсий Провачека и центрифугирование; отличительные - сенсибилизацию эритроцитов проводят при температуре 49 51 o C, в качестве сенситина используют мембранные белки риккетсий Провачека, выделенные из единого антигена риккетсий Провачека при температуре 0 4 o C.

Способ осуществляют следующим образом. 50 мл единого диагностикума (диагностикума риккетсиозного Провачека корпускулярного сухого для реакции связывания комплемента РСК, реакции нейтрализации антигена РНАг, метода флуоресцирующих антител МФА) регидратируют в 50 мл дистиллированной воды, осаждают риккетсии путем центрифугирования при 10000 мин -1 в течение 30 минут, а осадок ресуспендируют в 50 мл 10 mM трисHCl буферного раствора, содержащего 2% тритона Х-100. Инкубация суспензии в течение 1 часа при Т от 0 до 4 o C. Затем смесь центрифугируют при 10000 мин -1 в течение 30 минут, осадок, представляющий собой мембранные белки риккетсий Провачека, ресуспендируют в 50 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Полученные мембранные белки риккетсий Провачека (сенситин) используют для сенсибилизации формалинизированных танизированных эритроцитов барана. Для определения рабочей дозы проводят пробную сенсибилизацию. С этой целью в 5-ти пробирках готовят последовательные двукратные разведения сенситина (с 1:4 1:64) в объеме 1 мл на фосфатном буферном растворе pH 6,4. В каждую пробирку добавляют по 1 мл 6% -ной взвеси формалинизированных танизированных эритроцитов барана. Пробирки помещают в термостат и выдерживают в течение 1 часа при Т 49 51 o C. Затем эритроциты в пробирках осаждают центрифугированием при 1500 мин -1 в течение 5 минут, осадок 2 раза отмывают в 0,9%-ном растворе хлорида натрия с добавлением инактивированной и истощенной нормальной лошадиной сыворотки до концентрации 1% Затем осадок ресуспендируют в 4 мл такого же раствора, т.е. получают 2 мл 3% сенсибилизированных эритроцитов (СЭ).

В лунках полистиролового 96-луночного планшета готовят последовательные двукратные разведения (с 1:125 до 1:64000) стандартной сыворотки к риккетсиям Провачека. Затем в лунки первого ряда вносят по 0,025 мл СЭ из пробирки с разведением 1: 4, в лунки второго ряда из пробирки 1:8 и т.д. Проводят постановку контроля каждой пробы на спонтанную агглютинацию. Реакцию проводят при Т 20 22 o C в течение 1 часа. Учет результатов проводят по четырехкрестовой шкале. За рабочее разведение принимают максимальное разведение сенситина, обеспечивающее четкую агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов стандартной сывороткой до диагностического титра.

Специфическую чувствительность сенсибилизированных эритроцитов оценивают в РНГА с гетерологичной сывороткой. Выбранное рабочее разведение используют для приготовления 100 мл эритроцитарного антигенного диагностикума. Отконтролированный диагностикум стабилизируют в наполнителе, содержащем полиглюкин до конечной концентрации 50% затем разливают в ампулы по 1 мл и подвергают лиофильному высушиванию.

Пример 1. Получение диагностикума по способу прототипу. Содержимое 50 ампул с диагностикумом риккетсиозным Провачека для реакции агглютинации регидратируют в 0,9%-ном растворе хлорида натрия, осаждают риккетсии путем центрифугирования при 10000 мин -1 в течение 30 минут. Осадок гомогенизируют в 50 мл 2%-ного раствора тритона Х-100. Инкубацию смеси проводят при Т 20 22 o C в течение 30 минут, затем центрифугируют при 10000 мин -1 в течение 30 минут и отбирают надосадочную жидкость, представляющую собой поверхностный антиген риккетсий Провачека. Получено 48 мл поверхностного антигена риккетсий Провачека, который используют для сенсибилизации формалинизированных танизированных эритроцитов барана. Для определения дозы сенситина проводят пробную сенсибилизацию при Т 42 - 44 o C по регламенту N 400-92. Рабочее разведение сенситина равно 1:4. Выбранное рабочее разведение сенситина используют для приготовления 100 мл эритроцитарного риккетсиозного антигенного диагностикума. Целевой продукт, полученный по способу-прототипу имеет активность в РНГА с сывороткой к риккетсиям Провачека 1:1600, с сывороткой к риккетсиям тифи 1:1600, т.е. не наблюдается разницы в титрах.

Пример 2. Получение диагностикума по предлагаемому способу. Содержимое 50 ампул сухого единого диагностикума регидратируют в 50 мл дистиллированной воды, буксируют и отделяют риккетсии путем центрифугирования при 10000 мин -1 в течение 30 минут. К осадку добавляют 50 мл охлажденного до 2 o C, 10mM триHCl буферного раствора pH 7,4, содержащего тритон Х-100 в конечной концентрации 2% Взвесь риккетсий инкубируют при 0 4 o C в течение 1 часа. Заданный режим температуры обусловлен тем, что при температуре выше 4 o C снижается специфическая активность диагностикума, а при температуре ниже 0 o C происходит замерзание смеси. Затем взвесь центрифугируют при 10000 мин -1 в течение 30 минут, надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 50 мл 0,9% -ного раствора хлорида натрия и гомогенизируют. Полученную смесь, состоящую из мембранных белков, используют в качестве сенситина для приготовления специфического эритроцитарного диагностикума. Предварительно проводят пробную сенсибилизацию по методике, описанной выше. Рабочее разведение сенситина равно 1:16. Для приготовления 100 мл эритроцитарного диагностикума используют 3,2 мл сенситина в исходном разведении. К 50 мл сенситина в разведении 01: 16 на фосфатном буферном растворе pH 6,4 приливают 50 мл 6% танизированных формалинизированных эритроцитов и смесь выдерживают на водяной бане при температуре 49 - 51 o C в течение 1 часа, периодически, каждые 15 минут, встряхивая. При температуре менее 49 o C происходит снижение нагруженности эритроцитов сенситином, а при температуре выше 51 o C наступает инактивация препарата. Затем нагруженные сенситином (сенсибилизированные) ФТЭ осаждают центрифугированием при 1500 мин -1 в течение 5 минут. К осадку добавляют 200 мл 1%-ного раствора нормальной лошадиной сыворотки и вновь осаждают эритроциты центрифугированием. Осадок сенсибилизированных и отмытых ФТЭ ресуспендируют в 97 мл 1%-ного раствора нормальной лошадиной сыворотки. Целевой продукт, полученный по способу, указанному в заявке, имеет активность в РНГА с сывороткой к риккетсиям Провачека 1:50000, с сывороткой к риккетсиям тифи 1: 1600. С гетерологичной сывороткой к риккетсиям сибирика диагностикум не взаимодействует.

Таким образом, полученный по предлагаемому способу диагностикум в 30 раз активнее препарата, приготовленного по способу-протитопу. Кроме того, он позволяет проводить в РНГА внутригрупповую дифференциацию риккетсиозов группы сыпного тифа по разнице в титрах сывороток (в 31 раз) к риккетсиям Провачека и риккетсиям тифи.

Способ получения диагностикума эритроцитарного сыпнотифозного антигенного сухого путем сенсибилизации формализированных танизированных эритроцитов барана тритоновым антигеном риккетсий Провачека и центрифугирования, отличающийся тем, что сенсибилизацию эритроцитов проводят при 49-51 o С, а в качестве антигена используют мембранные белки риккетсий Провачека, выделенные из единого антигена риккетсий Провачека при 0-4 o С.

PD4A - Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:Федеральное государственное унитарное предприятие “Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам “Микроген”

Извещение опубликовано: 10.10.2004 БИ: 28/2004

Стоянова Наталия Александровна – ведущий научный сотрудник, к.м.н.

Фрейлихман Ольга Александровна – ведущий научный сотрудник, к.б.н.

Панферова Юлия Александровна - научный сотрудник

Сюзюмова Елена Александровна – младший научный сотрудник

Кондрашова Вероника Дмитриевна – младший научный сотрудник

Лаборатория зооантропонозных инфекций начала свою деятельность в 1933 г. в качестве структурной единицы на базе отдела паразитарных тифов (основатель отдела Н.Н. Романенко).
В течение 25 лет руководство лабораторией осуществлял К.Н. Токаревич (в последующие годы заведующими были Ф.И. Красник, Е.М. Попова, Б.В. Вершинский, А.Б. Дайтер). С 1993 г. лабораторией руководит Н.К. Токаревич.

На протяжении многих лет одной из основных тем исследований, проводимых в лаборатории, были риккетсиозы: сначала сыпной тиф, включая его редуцированную форму (болезнь Брилля), затем – крысиный риккетсиоз, коксиеллез и клещевой риккетсиоз Азии. В настоящее время – моноцитарный эрлихиоз человека и гранулоцитарный анаплазмоз человека.

В результате многолетних исследований по проблеме сыпного тифа выявлены патогенетические, эпидемические, клинические и иммунологические особенности повторного сыпного тифа и впервые в нашей стране сформулирована концепция о рецидивном происхождении повторных заболеваний сыпным тифом.

Наряду с риккетсиозами и лептоспирозом в разные годы получили развитие и другие направления, посвященные изучению эпидемиологии, лабораторной диагностике и профилактике орнитоза, туляремии, иерсиниоза, геморрагической лихорадки с почечным синдромом, клещевого энцефалита и других арбовирусных инфекций (К.Н. Токаревич, А.Б. Дайтер, Б.В. Вершинский, Л.А. Вишнякова, Г.Я. Ценева, Ф.С. Носков, Е.Д. Соколова, И.И. Камалов и др.). Таким образом, общая линия в эволюции профиля научных исследований и прикладных разработок характеризовалась расширением перечня нозологических форм с акцентом на инфекции, общие для животных и человека (зооантропонозы).

Одним из основных направлений научной деятельности лаборатории на протяжении многих лет является региональная эпидемиология зооантропонозных инфекций на северо-западе России. За разработку концепции ландшафтной нозогеографии и системного картографирования сотруднику лаборатории Б.В. Вершинскому была присуждена Государственная премия СССР.

К настоящему времени выявлены множественные природные очаги этих инфекций в Северо-Западном федеральном округе (СЗФО), показана их трансформация под влиянием урбанизации. Сформулированы положения об эволюции лептоспирозов, установлены причины значительного роста заболеваемости и высокой летальности при этой инфекции в Санкт-Петербурге в 80-90-е гг. XX и в начале XXI вв. Показано, что этиологическая структура лептоспироза, социально-профессиональный состав больных и клиническое течение инфекции существенно меняется в пространстве и времени (Н.А. Стоянова, Г.Ф. Трифонова, С.О. Майорова, Н.К. Токаревич).

Второе направление исследований, проводимых лабораторией, – усовершенствование и разработка средств индикации возбудителей зооантропонозных инфекций и выявления антител к ним. Так были разработаны эритроцитарный иммуноглобулиновый диагностический препарат для обнаружения коксиелл Бернета в реакции непрямой гемагглютинацин (РНГА); иммуноферментная тест-система для выявления коксиелл, корпускулярный антиген коксиелл 1-й фазы для реакции связывания комплемента; эритроцитарный диагностикум для выявления антител к коксиеллам 1-й фазы в РНГА; эритроцитарный диагностикум для выявления антител к коксиеллам 1-й фазы в реакции непрямого гемолиза, иммуноферментная тест-система для определения антител к коксиеллам 1-й и 2-й фаз. На производство ряда перечисленных препаратов разработаны и утверждены технические документации. Они рекомендованы для применения в практике здравоохранения (Н.К. Токаревич, А.Б. Дайтер и др.).
Разработана технология производства иммуноферментных тест-систем для обнаружения лептоспир и антител к ним (Н.А. Стоянова и др.).

В лаборатории проводятся исследования по усовершенствованию молекулярно-генетических методов для выявления C. burnetii и лептоспир, а также для изучения генетической гетерогенности этих возбудителей. Так, было показано, что сконструированный набор праймеров, позволяющий амплифицировать фрагмент гена groEL С.burnetii, эффективен для выявления методом ПЦР возбудителей Ку-лихорадки в биологическом материале. Проведены исследования генетической гетерогенности штаммов С.burnetii, выделенных на территории России и сопредельных государств с использованием различных генотипических маркеров.
При исследовании музейных штаммов из коллекции НИИ им. Пастера методами мультиспейсер-типирования (анализ нуклеотидной последовательности межгенных спейсеров) и MLVA (мультилокусного анализа тандемных повторов переменной копийности, или VNTR) было установлено, что популяции С.burnetii, циркулирующей на территории России, свойственна относительная генетическая однородность. Однако ряд штаммов С.burnetii, штаммы Ленинград-2 и Ленинград-4, обладают, согласно анализу сиквенс-типов межгенных спейсеров, уникальным для российской популяции генотипом (О.А. Фрейлихман).
При анализе локусов VNTR также были выявлены значительные генетические отличия штамма Ленинград-2 от других штаммов, выделенных на территории России. По результатам мультиспейсертипирования и VNTR-анализа штаммы С.burnetii, выделенные в различных регионах России, филогенетически наиболее близки к группе штаммов европейского происхождения. Результаты мультиспейсер-типирования коррелируют с результатами анализа методом MLVA (Ю. А. Панферова), позволяя дифференцировать штаммы С.burnetii различного географического происхождения.
Высокая дискриминативная способность данных методов позволяет использовать их в качестве методов генотипирования и молекулярно-эпидемиологического мониторинга.
С целью разработки и усовершенствования методики типирования патогенных лептоспир для определения серогрупповой и видовой принадлежности штамма, а также для характеристики их генетических особенностей, было проведено исследование штаммов лептоспир коллекции лаборатории методом VNTR, в ходе которого были разработаны (совместно с Парижским Институтом Пастера) праймеры к кодирующим последовательностям, фланкирующие VNTR, длина которых у лептоспир разных видов варьирует.

Для типирования штаммов в зависимости от их серогрупповой и видовой принадлежности был применен метод анализа длин рестрикционных фрагментов. В ходе исследования были выявлены различные рестрикционные профили гена ompL1 лептоспир, относящихся к разным видам и разным серогруппам. Показано, что детерминирующие сайты рестрикции могут рассматриваться в качестве генетического маркера для дифференциации патогенных лептоспир.
В развитие этих исследований была оценена гетерогенность рестрикционных профилей генов факторов патогенности lsa 21, lenA и lipL32 среди лептоспир различной систематической принадлежности (согласно генетической и серологической классификации). Установлено, что ген lipL32 может быть использован для создания системы для дифференциации геномовидов патогенных лептоспир на основании полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, полученных с использованием рестриктаз Bsa29I и BamHI (А.Н. Ваганова).

Проводимые в лаборатории молекулярно-генетические исследования имеют большое значение для повышения эффективности лабораторной диагностики и эпидемиологического надзора за зооантропонозными инфекциями.

Изучение патогенеза лептоспироза позволило выявить различные варианты инфекционного процесса и установить ведущие патогенные свойства лептоспир: адгезия к гепатоцитам и способность к колонизации их поверхности, токсическое действие, выражающееся в нарушении микроциркуляции проницаемости сосудов, адгезия к нефротелию и колонизация его поверхности (Ю.Е. Полоцкий, В.Н. Семенович, Н.А. Стоянова).

Совместно с И.С. Фрейдлин установлено, что мишенями стимулирующего действия коксиелл Бернета являются клетки системы мононуклеарных фагоцитов и эндотелиальные клетки. Выявлена взаимосвязь между иммуномодулирующими и протективными свойствами коксиеллезных препаратов, установлено, что показатели раннего индуцированного ответа могут служить критериями эффективности последующей вакцинации коксиеллезной вакциной (Н.К. Токаревич).

Четвертым направлением исследований лаборатории является разработка препаратов для специфической профилактики и лечения зооантропонозных инфекций. Данное направление формировалось еще в блокадные годы, когда сотрудники лаборатории (К.Н. Токаревич, Е.М. Попова, А.Ф. Фомина) в короткие сроки освоили выпуск сыпнотифозной вакцины из легочной ткани инфицированных белых мышей; препарат был с успехом использован для иммунизации наиболее угрожаемых контингентов. Тогда же сотрудниками антирабического отдела (В.Г. Ушаков, С.А. Барановская) был разработан оригинальный метод пассирования вакцинного штамма вируса бешенства и производства антирабической вакцины, которую использовали для иммунизации военнослужащих и гражданского населения.
В послевоенные годы на базе лаборатории были продолжены исследования по технологии производства антирабической вакцины (T.И. Соловьев, И.А. Пискарева). Кроме того, в осажденном городе было проведено экспериментальное и клиническое изучение эффективности лептоспирозных сывороток реконвалесцентов и налажено их производство (К.Н. Токаревич, Е.М. Попова).
В 80-90-е годы совместно с сотрудниками НИИЭМ им. Гамалеи и Института военной медицины были проведены многоплановые исследования, направленные на разработку и испытания инактивированной комбинированной вакцины против лихорадки Ку.

В лаборатории были изучены биологические свойства различных штаммов коксиелл Бернета и отобраны из них наиболее перспективные для создания вакцин; разработаны количественные методы стандартизации коксиеллезных препаратов; определена роль отдельных субстанций коксиелл в индукции различных звеньев иммунной системы, а также проведен отбор адекватных критериев и методов для оценки эффективности вакцинных препаратов (Н.К. Токаревич).
Итогом этой работы (выполненной совместно с А.Б. Дайтером, И.В. Тарасевичем, А.Ж. Василенко и др.) явилось создание инактивированной комбинированной вакцины против лихорадки Ку, обладающей выраженными иммуногенными и протективными свойствами. Результаты морфологических исследований свидетельствовали о ее низкой реактогенности. При испытании на лабораторных животных и волонтерах показана высокая иммунногенная активность вакцины, однократное введение которой защищает животных от внутрибрюшного и аэрозольного заражения вирулентными штаммами коксиелл в течение всего периода наблюдения.
Государственные испытания этого препарата, проведенные в 2007 году, подтвердили ее низкую реактогенность и безопасность. По данным иммуноферментного анализа у 84% и 81% вакцинированных были обнаружены в сыворотке крови IgG антитела к коксиеллам Бернета 2-й фазы через один месяц и один год после однократного подкожного введения препарата, соответственно. Вакцина рекомендована для применения в практике. Новизна этого инновационного препарата подтверждена 9 авторскими свидетельствами и патентами на изобретения.

В настоящее время, в результате исследований, проводимых О.А. Фрейлихман, Ю.А. Панферовой, Н.А. Стояновой и Н.К. Токаревичем, получены новые данные, расширяющие представления о биологических свойствах и генетическом разнообразии популяции патогенных лептоспир и коксиелл, циркулирующих на территории России:

– установлено, что мультилокусный анализ тандемных повторов переменной копийности является высокодискриминативным методом генотипирования патогенных лептоспир;

– разработаны праймеры для генотипирования лептоспир методом MLVA к локусам VNTR_L1, VNTR_L2 и VNTR-Lb5;

– выявлено 22 генотипа лептоспир, различающихся по набору аллелей изученных локусов;

– по результатам анализа нуклеотидной последовательности 16S pPHK лептоспир выявлен ряд редко встречающихся генотипов, некоторые из которых являются уникальными;

– показана высокая дискриминационная способность VNTR-анализа C.burnetii и возможность применения этого метода для молекулярно-эпидемиологического анализа;

– секвенирование гена icmD C. burentii, позволило кластеризовать штаммы, выделенные от разных источников;

– сконструированы наборы праймеров и зондов для эффективного типирования штаммов C. burnetii в рамках полиморфизма A/G гена EnhA.1 и T/G гена TolQ.

Усовершенствована лабораторная диагностика лептоспироза, лихорадки Ку, иксодовых клещевых боррелиозов:

– с помощью методов генной инженерии сконструирована иммуноферментной тест-системы для диагностики лептоспироза (совместно с В.Н. Куликовым и А.А Козаренко)

– аргументирована возможность применения метода матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрии для идентификации штаммов лептоспир (совместно с Е.В. Зуевой);

– разработаны праймеры для создания диагностической тест-системы для определения количественного содержания лептоспир в биологическом материале методом ПЦР-РВ;

– разработана диагностическая тест-система для выявления C. burnetii в биологическом материале основанная на амплификации методом ПЦР-РВ по технологии TaqMan фрагмента гена groEL;

– оптимизирована ПЦР для выявления возбудителей иксодовых клещевых боррелиозов;

– определена роль различных цитокинов в иммунопатогенезе лептоспирозной инфекции (совместно с О.А. Петровой и А.А. Тотоляном);

– установлено влияние климата на рост заболеваемости клещевого энцефалита на территории европейского севера России (Н.К. Токаревич совместно с А.А. Трониным, Б.А. Ревичем, Р.В. Бузиновым, В.П. Болтенковым).

Читайте также: