Элективная питательная среда для культивирования стафилококков

Молочно-солевой агар: в 100 см 3 питательного агара растворяют при кипячении 6,5 г хлорида натрия, стерилизуют при 0,1 МПа в течение 20 мин. К расплавленному и остуженному до 45°С агару добавляют 10 см 3 на 100 см 3 обезжиренного стерилизованного молока, тщательно размешивают и разливают тонким слоем в чашки Петри. Учитывают колонии с зоной просветления.

Желточно-солевой агар: к 150 см 3 расплавленного и охлажденного до 45°С 6%-ного солевого агара стерильно добавляют 50 см 3 желточного раствора (1 желток куриного яйца растворяют в 150-200 см 3 физиологического раствора). Быстро перемешивают и разливают в чашки Петри.

Среды для культивирования дрожжей и микроскопических грибов

Среда Сабуро. Основой этой среды является дрожжевая вода. Для приготовления дрожжевой воды 70…100 г свежих прессованных дрожжей (7…10 г сухих дрожжей) кипятят в течение 20…30 мин в 1 л дистиллированной воды и отстаивают в высоком цилиндре на холоде 12 час. Отстоявшуюся жидкость декантируют, добавляют еще 1 л воды, кипятят 30 мин, фильтруют, доводят рН до требуемого значения. Приготовленную среду стерилизуют дробно по 20 мин 2…3 сут. К 100 мл стерильной дрожжевой воды добавляют 1% пептона, 2% агара, после растворения агара вносят 4% глюкозы или мальтозы, фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют при 0,05 МПа в течение 20 мин.

Среду можно готовить и на обычной 1%-ной пептонной воде.

Синтетическая среда Ридер для дрожжей. В состав среды входят (в г/л):сульфат аммония 3,сульфат магния 0,7, нитрат кальция 0,04, хлорид натрия 0,5. дегидрофосфат калия 1,0, гидрофосфат калия. Начальное значение рН среды 6,6.Для изучения размножения дрожжей добавляют 2% сахара, для исследования брожения 5…10%. Полная синтетическая среда содержит также витамины (в мкг/мл): инозит 5, биотин 0,0001, пантотеновую кислоту 0,25, тиамин 1,0, пиридоксин 0,25, никотиновую кислоту 0,5. Стерилизуют среду в автоклаве при давлении 0,1 МПа.

Картофельно-глюкозный агар. Очищенный и нарезанный ломтиками картофель массой 200 г заливают 1 л дистиллированной воды и кипятят в течение 1 часа. Отвар фильтруют, к фильтрату добавляют воду до первоначального объема, 2% глюкозы и 2…3% агар-агара. Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 10 мин. При употреблении устанавливают рН 3,5 при помощи 10%-ного стерильного раствора безводной лимонной кислоты.

Синтетическая среда Чапека для грибов. Состав среды (в г/л): сахароза или глюкоза 30, дигидрофосфат калия 1,0, нитрат натрия 2,0, сульфат магния 0,5, хлорид калия 0,05, сульфат железа 0,1, агар 20. Навеску агара выщелачивают и добавляют к указанным ингредиентам, предварительно растворенным в 1 л дистиллированной воды, прогревают текучим паром, устанавливают рН 4,0…5,5 10% раствором лимонной кислоты или гидроксида натрия. Фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют дробно текучим паром 3 сут по 30 мин.

Полная среда с лизином для выявления несовершенных дрожжей. В 1 л водопроводной воды вносят (в г/л): глюкозу - 50, сульфат магния - 1, дигидрофосфат калия - 2, лактат калия - 12 мл 50% раствора, L(+) моногидрат лизина – 1, витаминный раствор (на 100 мл стерильной дистиллированной воды добавляют (в г) инозитола 2, пантотената кальция 0,4, никотинамида 0,5, хлоргидраттиамина 0,1), агара - 20. рН среды составляет 5,0…5,2. Среду разливают в пробирки и стерилизуют 15 мин при 0,1 МПа.

Среда с ацетатом для обнаружения несовершенных дрожжей. На 1 л водопроводной воды берут 10 г ацетата натрия, 10 г хлорида аммония, 5 г глюкозы, 3 мл дрожжевого автолизата, разливают в пробирки и стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 30 мин.

Среды для культивирования молочнокислых бактерий

Цельное молоко разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 10 мин. Среду используют для изучения физиологических свойств молочнокислых бактерий.

Обезжиренное молоко отделяют от сливок путем сепарирования, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при тех же режимах, что и цельное молоко. Среду используют для изучения физиологических свойств микробов и для группового количественного учета молочнокислых бактерий.

Гидролизованное молоко. В стерильном обезжиренном молоке устанавливают рН 7,6…7,8. Молоко нагревают до 45 0 С и к 1 л молока добавляют 0,5 - 1 г панкреатина, предварительно растворенный в теплой воде, и 5 мл хлороформа. Емкость с молоком плотно закрывают корковой пробкой, смесь тщательно перемешивают и ставят в термостат при температуре 40 0 С на 18…24 часа. Затем полученную прозрачную жидкость декантируют и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат разводят водой в 2 раза, устанавливают рН 7,0…7,2 и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 15 мин.

Агар с гидролизованным молоком. В гидролизованное молоко вносят 1,5…2,0% агар-агара. Смесь нагревают до кипения и выдерживают до полного растворения агара. Горячую среду фильтруют через ватный фильтр, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 10…15 мин.

Среда для количественного учета гнилостных бактерий

Молочный агар готовят путем внесения 20% горячего стерильного обезжиренного молока в стерильный расплавленный 2% водный раствор агар-агара. Используется эта среда для количественного учета протеолитических и пептонизирующих бактерий (микрококков, маммококков). Вокруг колоний гнилостных бактерий образуются зоны протеолиза и пептонизации.

Среда с говяжьим жиром. В состав среды входят: пептон – 1 г, дрожжевой автолизат – 0,3, двузамещенный фосфат натрия – 0,1 г, агар – 1,5 г, дистиллированная вода – до 100 мл, рН 7,0…7.4.

Отдельно готовят в пробирках стерильный говяжий жир. Среду стерилизуют при 121 0 С (0,1 МПа) в течение 15 мин.

Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) является главной патогенной бактерией в клинической области и в пищевой промышленности. Внутрибольничные инфекции, вызванные S. aureus, создают увеличивающееся число проблем. Поэтому становится более важной задлачей обнаружение S. aureus, и в частности метициллин-резистентного S. aureus (MRSA). Обычные среды для обнаружения S. aureus являются маннито-солевым агаром (названный Агаром Чапмана в Европе). У этой среды, основанный на повышенной солености и брожении маннита, есть чрезмерное количество ложно-положительных и ложно-отрицательных результатов. CHROMagar Staphylococcus aureus является отборной хромогенной средой c высокой спецификой и высокой чувствительностью. Другой обычной средой для обнаружения S. aureus является Кровяной агар, который требует утомительной и дорогостоящей экспертизы с иммунологическими тестами 5-10 колоний на подозреваемом образце. С другой стороны, CHROMagar Staphylococcus aureus более удобен и более эффективен, чем обычные методы благодаря устранению ложно-положительных результатов. Используя CHROMagar Staphylococcus aureus, будет достаточно проверить единственную колонию с типичным цветом для дальнейшей идентификации и обнаружения S. aureus с высокой вероятностью.

Артикул (Кат. №) TA670: банка, кол-во порошка для приготовления 1000 мл,
Артикул (Кат. №) TA672: банка, кол-во порошка для приготовления 5000 мл.
Возможны другие варианты фасовок, пожалуйста, уточняйте.

Хранение
Порошок хранить при температуре 15/30°C. Использовать до даты срока годности, указанной на этикетке.

Состав (г/л)
Агар 15,0; Пептон и дрожжевой экстракт 40,0; Соли 25,0; Хромогенная смесь 2,5; pH: 6,9 +/- 0,2
(Классический состав, скорректированный для соответствия с рабочими характеристиками).

Инокуляция
Если чашка агара была остужена, необходимо довести ее до комнатной температуры перед инокуляцией.
Нанести образец на чашку и инкубировать при температуре 37°C 24 часа.

Интерпретация
МИКРООРГАНИЗМЫ — Внешние признаки колоний
S. aureus – от розового до розовато-лилового
Другие бактерии – нет роста, бесцветные, голубые

ТОЛЬКО ДЛЯ ИН-ВИТРО ДИАГНОСТИКИ.
Для использования обученным персоналом.

Приготовление
Для приготовления определенного количества среды, добавить сухой порошок в очищенную воду в соответствующем количестве ИЛИ, развести среду в пропорции 82,5 грамм на литр очищенной воды. Размешать порошок вращательными движениями для разбухания агара. Нагреть и довести до кипения (100°C), при регулярном перемешивании круговыми движениями. Если используется автоклав, делать без давления. НЕ НАГРЕВАТЬ ВЫШЕ 100°С. Смесь также можно довести до кипения в микроволновой печи: после закипания вынуть из печи, аккуратно перемешать, затем поместить обратно в печь, дать быстро вскипеть несколько раз, до получения полностью однородной смеси (зерна агара должны исчезнуть). Кипения должно проходить без вспенивания, крупными пузырями. Примечание: в некоторых случаях использование автоклава может быть лишним, и кипения при 100°С может быть достаточно для стерилизации. Охладить на водяной бане до 45-50°C, аккуратно помешивая. Аккуратно перемешать до образования однородной массы. Разлить в стерильные чашки Петри или пробирки дать застыть (до консистенции геля) и высохнуть. Хранить в темном месте. Готовые чашки со средой можно хранить при комнатной температуре одни сутки. При температуре 2/8°C – до одного месяца, в темноте, не допуская высыхания.

Рабочие характеристики и ограничения
Чувствительность и специфичность S.aureus составляет 95,5 %, a специфичность 99,4% (Gaillot et al., 2000).
Для подтверждения требуется дополнительное тестирование.

Примечание: для прямого выявления MRSA можно использовать селективную среду CHROMagar™ MRSA.

Утилизация отходов
После интерпретации чашки автоклавировать при 121°C в течение минимум 20 минут.

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Шепелин А.П., Полосенко О.В., Марчихина И.И., Шолохова Л.П., Дятлов И.А.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Шепелин А.П., Полосенко О.В., Марчихина И.И., Шолохова Л.П., Дятлов И.А.

Culture media for detection of staphylococci in clinical and sanitary microbiology

The article summarizes the new microbiological culture media produced in FSIS SRCAMB to improve the efficiency of diagnosis of infectious diseases, describes the advantages of these environments compared to foreign analogs, technological achievements in the field of drug development.

5 Питательные среды для выявления стафилококков

в клинической и санитарной микробиологии

О А.П. Шепелин, О.В. Полосенко, И.И. Марчихина, Л.П. Шолохова, И.А.Дятлов (D

Ï Роспотребнадзора, Московская область, п. Оболенск, Россия «в

§ Culture media for detection of staphylococci in clinical

| and sanitary microbiology

A.P. Shepelin, O.V. Polosenko, I.I. Marchikhina, L.P. Sholokhova, I.A. Dyatlov

(FSIS SRCAM&B), Obolensk, Russia

Ключевые слова: патогенные микроорганизмы; питательные среды; дифференциально-диагностические препараты; стафилококки.

Библиографическое описание: Шепелин АП, Полосенко ОВ, Марчихина ИИ, Шолохова ЛП, Дятлов ИА. Питательные среды для выявления стафилококков в клинической и санитарной микробиологии. Биопрепараты 2015; (4): 39-43.

The article summarizes the new microbiological culture media produced in FSIS SRCAMB to improve the efficiency of diagnosis of infectious diseases, describes the advantages of these environments compared to foreign analogs, technological achievements in the field of drug development. Key words: pathogens; differential diagnostic media; staphylococci; inhibition.

Bibliographic description: Shepelin AP, Polosenko OV, Marchikhina II, Sholokhova LP, Dyatlov IA. Culture media for detection of staphylococci in clinical and sanitary microbiology. Biopreparation (Biopharmaceuticals) 2015; (4): 39-43.

Стафилококки играют значительную роль в возникновении различных заболеваний человека, как в госпитальных условиях, так и вне стационара. Их роль в этиологии инфекций, вызванных грамположительными микроорганизмами, неуклонно растет. Особенно велико значение стафилококков в отделениях реанимации и интенсивной терапии, где на их долю приходится до 50% всех случаев инфекции 3.

Род стафилококков включает более 20 видов, представители которых продуцируют 50 разновидностей антигенов, способные поражать любую ткань или орган и вызывать более 100 различных заболеваний - маститы, дерматиты, пневмонии, артриты, гнойные и раневые инфекции, пищевые отравления, сепсис, а их энтеротоксины как суперантигены стимулируют избыточный синтез Т-лимфоцитов, которые через образуемый интерлейкин-2 реализуют отравляющее действие 5.

Основными видами стафилококков являются золотистый, эпидермальный и сапрофитный. Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) является наиболее критичным в масштабах воздействия на организм человека. Поражение этим видом стафилококка может затронуть самые различные органы, более того, именно этот стафилококк может спровоцировать значительное количество различных по специфике заболеваний, начиная от простейших в своем течении и заканчивая теми из них, исход которых является для больного летальным. Золотистый стафилококк располагает рядом адаптив-

ных факторов, которые обеспечивают возможность противостояния защитным механизмам организма человека

С эпидермальным стафилококком (в. epidermidis) организм человека в здоровом его состоянии справляется без труда, в то время как для людей, находящихся, например, в условиях реанимационных отделений с соответствующим состоянием организма, он, оказываясь внутри тела, провоцирует тяжелейшие заболевания. В частности, к ним относятся сепсис, эндокардит, другие, как правило, нозокомиальные, осложнения.

в. saprophyticus вызывает циститы и дизурические расстройства; реже - пиелонефрит и эндокардит.

Актуальность совершенствования методических подходов к идентификации стафилококков связана с расширением видового состава данного рода и увеличивающимся значением в патогенезе рзличных заболеваний, что относится не только коагулазоположительным, но и коагула-зоотрицательным стафилококкам. При определении таксономического положения выделенных патогенных и условно патогенных бактерий основным является бактериологический метод. Этот метод включает в себя использование накопительных и элективных питательных сред и создание условий культивирования для преимущественного накопления в культуре нужных форм микробов, способы получения чистых культур из отдельных колоний или клеток микроорганизмов [6].

Целью настоящего исследования является разработка составов отечественных питательных сред: питательной среды для выявления патогенных маннитоположительных стафилококков (агар Фогеля-Джонсона) и агара для выделения и учета коагулазоположительных стафилококков (агар Байрд-Паркера).

Материалы и методы

При разработке компонентного состава агара Фогеля-Джонсона была выполнена работа по выбору белковой основы. В качестве питательной основы использовали панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ), панкреатический ги-дролизат казеина (ПГК), триптоны отечественного производства и импортные, пептон мясной, а также, разработанный ГНЦ ПМБ гидролизат казеина низкой степени расщепления (ГКНСР). Белковой основой агара Фогеля-Джонсона является панкреатический гидролизат казеина низкой степени расщепления (ГКНСР), который обеспечивает ростовые потребности стафилококков, обладающих протеолитической активностью, но в значительной мере уменьшает скорость роста сопутствующих микроорганизмов. Белковой основой агара Байрд-Паркера является панкреатический гидролизат казеина со степенью расщепления 30-35%.

Обе среды содержат хлорид лития и теллурит калия для подавления роста сопутствующей микрофлоры. Наличие теллури-та калия вызывает почернение колоний стафилококков. Составы обеих сред оптимизированы по содержанию глицина. Было доказано, что при определенных условиях, глицин может не только стимулировать, но и ингибировать рост стафилококков.

Методика посева изучаемых микроорганизмов включала подготовку стандартных взвесей культур каждого тест-штамма, соответствующих 10 единицам по стандартному образцу мутности, с использованием стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Полученные взвеси культур методом десятикратных разведений (4,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводили до необходимых концентраций и осуществляли посев на питательные среды.

Эмульсию яичного желтка готовили по общепринятой методике, включающей приготовление 10-20% желточной взвеси, полученной из желтка, асептически выделенного из яйца и внесенного в 200 мл изотонического раствора хлорида натрия [8].

При приготовлении питательных сред использовали 2% раствор теллурита калия, производство которого организовано в ФБУН ГНЦ ПМБ.

Результаты и обсуждение

Питательная среда для выявления патогенных маннитпо-ложительных стафилококков (агар Фогеля-Джонсона)

На первом этапе исследований изучали возможность использования в качестве белковой основы широкого спектра белковых гидролизатов. Было установлено, что при использовании большинства изученных гидролизатов в составе агара Фогеля-Джонсона наблюдался эффект сплошного роения протея и слабый рост некоторых штаммов стафилококка.

Для дальнейших исследований по оптимизации состава среды в качестве белковой основы агара Фогеля-Джонсона использовали ГКНСР. Дополнительно в состав среды был введен хлористый натрий для поддержания уровня осмотического давления, необходимого для поддержания жизнедеятельности микроорганизмов, так как ГКНСР не содержит хлоридов. При использовании ГКНСР были получены хорошие ростовые свойства тест-штаммов стафилококков. Отмечено отсутствие роения протея, что является важным показателем для этой среды.

Уменьшение количества ингибиторов в составе среды изучали методом полного факторного эксперимента в несколько этапов с одновременным изучением различных вариантов питательной основы. При этом концентрации всех остальных компонентов оставались на одном уровне с контрольными средами, так как считаются оптимальными.

Дальнейшая оптимизация состава среды заключалась в определении оптимальной концентрации хлористого лития. В ходе экспериментальной работы для среды Фогеля-Джонсона в качестве оптимальной была определена концентрация хлористого лития, составляющая 3,0 г/л. Необходимость в увеличении концентрации этого ингибитора отсутствует, так как использование ГКНСР в качестве белкового компонента и подобранная концентрация теллурита калия позволила сконструировать среду с заданными параметрами. Ввиду различной потребности штаммов стафилококков в аминокислотах и пептидах возникла необходимость определить оптимальную концентрацию глицина в составе среды, так как глицин в концентрации 10,0 г/л ингибирует рост стафилококков, и только концентрация 5,0 г/л, как нами было установлено, является полноценным стимулятором роста стафилококков.

В таблице 1 представлены сравнительные биологические показатели разработанной питательной среды и импортных аналогов с уменьшенной концентрацией теллурита калия и с рекомендуемой фирмами-производителями.

Таблица 1. Сравнительная характеристика биологических показателей агаров Фогеля-Джонсона

Количество колоний, диаметр, морфология,48 ч инкубации

S. aureus Wood-46 Разведение 10-6 46, 45 1,6-1,8 Черные колонии, желтые зоны 45, 50 1,6-1,8 Черные колонии, желтые зоны Нет роста Нет роста 45, 48 3,0 Бесцветные, круглые

S. aureus 6538-P Разведение 10-6 48, 40 1,4-1,6 Черные колонии, желтые зоны 35, 42 1,7 Черные колонии, желтые зоны 5 0,8-1,0 Черные колонии, желтые зоны 28, 23 0,6-1,0 Черные колонии, желтые зоны 35, 41 3,0 Бесцветные, круглые

S. saprophyticus CCM 883 Разведение 10-6 13 0,8-1,0 Черные колонии, желтые зоны 12 0,8-1,1 Черные колонии, желтые зоны Нет роста Нет роста 17 3,0 Бесцветные, круглые

S. epidermidis ATCC 14990 Разведение 10-6 12 0,6-0,7 Черные колонии 17 0,6-0,7 Черные колонии Нет роста Нет роста 22 3,0 Бесцветные, круглые

как S. aureus Wood-46, так и S. saprophyticus CCM 883 с S. epidermidis ATCC 14990. Кроме того, диаметр колоний остальных коагулазоположительных стафилококков меньше, чем на агаре Фогеля-Джонсона ГНЦ ПМБ.

Таким образом, новая питательная среда - агар Фогеля-Джонсона ГНЦ ПМБ обеспечивает рост патогенных стафилококков и стафилококков-сапрофитов с ингибирующим эффектом в отношении сопутствующей микрофлоры. Стафилококки, ферментирующие маннит, образуют на агаре Фогеля-Джонсона черные колонии, окруженные желтой зоной, не ферментирующие маннит - черные колонии без пожелтения среды вокруг (рис. 1).

Питательный агар для выделения и учета коагулазоположительных стафилококков (агар Байрд-Паркера)

На первом этапе оптимизации агара Байрд-Паркера была проведена работа по выбору белковой основы. В качестве питательной основы использовали ПГРМ, ПГК, триптоны от-

ечественного и зарубежного производства, пептон мясной, ГКНСР.

При оптимизации агара Байрд-Паркера для выделения стафилококков наиболее приемлемой с нашей точки зрения считается концентрация 5 мл 2% раствора теллурита калия на 1 л среды и 5,0 г/л хлористого лития. Такая комбинация дает отличный рост стафилококков и ингибирует рост сопутствующей микрофлоры.

Концентрации пирувата натрия, мясного экстракта в дальнейших экспериментах оставались на одном уровне с контрольными средами, так как считаются оптимальными. Изменение соотношения этих компонентов или внедрение различных стимулирующих добавок приводило к увеличению роения протея. Различная потребность стафилококков не только в аминокислотах и пептидах, но и ростовых факторах вылилась в необходимость увеличения концентрации дрожжевого экстракта до 3 г/л и оптимизации концентрации глицина, который в количестве 10,0 г/л ингибирует рост тест-штаммов стафилококков. С этой же целью в составе среды мясной экстракт был заменен на пептон и оптимизирована его концентрация.

Новая питательная среда подавляет рост сопутствующей микрофлоры. Так, рост тест-штаммов Ps. aeruginosa 27/99, E. coliATCC 25922, Sal. typhimurium 79, Ent. faecalis ATCC 19433 (NCTC 775), E. coli 3912/41 (055:K59), B. subtilis ATCC 6633 из разведений 10-4 на агарах Байрд-Паркера отсутствует.

Расщепление лецитовителлина наблюдается в проявлении четкой непрозрачной зоны лецитиназной активности вокруг

Таблица 2. Сравнительная характеристика биологических показателей агаров Байрд-Паркера

Количество колоний, диаметр, морфология, 48 ч инкубации

S. aureus Wood-46 Разведение 10-6 48, 50 1,0-1,2 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 49, 48 1,0-1,2 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 47, 46 0,6-0,8 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 45, 48 3,0 Бесцветные, круглые

S. aureus 6538-P Разведение 10-6 55, 44 1,2-1,4 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 47, 50 1,0-1,2 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 45, 48 0,6-0,8 Черные колонии, зоны липолиза и протеолиза 35, 41 3,0 Бесцветные, круглые

S. saprophyticus CCM 883 Разведение 10-5 Рост в виде точечных колоний черного цвета Рост в виде точечных колоний черного цвета Нет роста 17 3,0 Бесцветные, круглые

S. epidermidis ATCC 14990 Разведение 10-5 Рост в виде точечных колоний черного цвета Рост в виде точечных колоний черного цвета 10, 15 точечные 57 3,0 Бесцветные, круглые

P. mirabilis 3177 Разведение 10-4 Зоны без роения Зоны без роения Зоны без роения Сплошной рост, роение

P. vulgaris HX 19 222 Разведение 10-4 Зоны без роения Зоны без роения Зоны без роения Сплошной рост, роение

колоний, а наличие протеолиза - в формировании прозрачной зоны шириной 2-5 мм (рис. 2).

Таким образом, следует отметить, что в результате проведенных исследований разработаны две питательные среды - агар Фогеля-Джонсона и агар Байрда-Паркера, предназначенные для выделения и определения количества ко-агулазоположительных стафилококков из клинического материала, пищевых продуктов и других объектов. Установле-

но, что по совокупности биологических показателей питательные среды ФБУН ГНГЦ ПМБ не только не уступают, но по ряду показателей превосходят импортные аналоги. Государственная регистрация новых питательных сред и внедрение их в практику санитарных и клинических исследований позволит отказаться от закупки дорогостоящих импортных препаратов.

1. Установлено, что оптимальной белковой основой агара Фогеля-Джонсона является панкреатический гидроли-зат казеина низкой степени расщепления (ГКНСР), который обеспечивает ростовые потребности стафилококков, обладающих протеолитической активностью, но в значительной мере уменьшает скорость роста сопутствующих микроорганизмов; белковой основой агара Байрд-Паркера - панкреатический гидролизат казеина со степенью расщепления 30-35%.

2. Определено количественное соотношение основных компонентов питательных сред: Фогеля-Джонсона и Байрд-Паркера, обеспечивающих рост патогенных стафилококков и стафилококков-сапрофитов с ингибирующим эффектом в отношении сопутствующей микрофлоры.

3. Показано, что стафилококки, ферментирующие ман-нит, образуют на агаре Фогеля-Джонсона черные колонии, окруженные желтой зоной, не ферментирующие маннит -черные колонии без пожелтения среды вокруг; на агаре Байрд-Паркера колонии стафилококков проявляют две характерные особенности: вокруг колоний наблюдаются зоны и кольца, образующиеся в результате липолиза и протеолиза.

1. Акатов АК, Зуева ВС. Стафилококки. М.: Медицина; 1983.

2. Тотолян АА, Малеев ВВ. Современные проблемы кокковых инфекций. Микробиология 2001; (2): 117-20.

3. Сидоренко СВ. Механизмы резистентности микроорганизмов. В кн.: Страчунский ЛС, Белоусов ЮБ, Козлов СН, ред. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. М.: Боргес; 2002.

4. Беляков ВД. Стафилококки и стафилококковая инфекция. Саратов; 1980.

5. Поздеев ОК. Медицинская микробиология. М.: ГЭОТАР-Мед; 2001.

6. Омарова СМ, Баснакьян ИА, Артемова ТА. Сухие питательные среды для культивирования кокковых культур. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 2005; (6): 30-3.

7. Методы контроля бактериологических питательных сред. Методические указания 4.2.2316-08. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2008.

8. Лабинская АС, Блинкова ЛП, Ещина АС, ред. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина; 2004.

1. AkatovAK, Zueva VS. Staphylococci. M.: Meditsina; 1983 (in Russian).

2. Totolyan AA, Maleev VV. Modern problems of cocci infections. Mikrobiologiya 2001; (2): 117-20 (in Russian).

3. Sidorenko SV. Mechanisms of microbial resistance. In: Strachunskiy LS, Belousov YuB, Kozlov SN, eds. Practical Guide to anti-infective chemotherapy. Moscow: Borges; 2002 (in Russian).

4. Belyakov VD. Staphylococci and staphylococcal infection. Saratov; 1980 (in Russian).

5. Pozdeev OK. Medical Microbiology. Moscow: GEOTAR-Med; 2001 (in Russian).

6. Omarova SM, Basnakyan IA, Artemova TA. Dry culture media for the cultivation of cocci cultures. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii 2005; (6): 30-3 (in Russian).

7. Control methods of bacteriological culture media. Guidelines 4.2.231608. Moscow: Federal Center of Hygiene and Epidemiology; 2008 (in Russian).

8. Labinskaya AS, Blinkova LP, Eschina AS, eds. General and sanitary microbiology techniques with microbiological studies. Moscow: Meditsina; 2004 (in Russian).

Shepelin AP. Deputy Director for scientific and production work. Doctor of Biological Sciences.

Polosenko OV. Senior researcher of Laboratory of microbiological and physico-chemical methods of analysis of scientific and production department of culture media. Candidate of Biological Sciences.

Marchihina II. Head of Laboratory of microbiological and physico-chemical methods of analysis of scientific and production department of culture media.

Sholohova LP. Head of Section of microbiological studies of Laboratory of microbiological and physico-chemical methods of analysis of scientific and production department of culture media.

Dyatlov IA. Director. Doctor of Medical Sciences, professor, corresponding member of Russian Academy of Sciences.

Шепелин Анатолий Прокопьевич. Заместитель директора по научно-производственной работе, д-р биол. наук.

Полосенко Ольга Вадимовна. Старший научный сотрудник лаборатории микробиологических и физико-химических методов анализа научно-производственного отдела питательных сред, канд. биол. наук.

Марчихина Ирина Ивановна. Заведующий лабораторией микробиологических и физико-химических методов анализа научно-производственного отдела питательных сред.

Шолохова Любовь Петровна. Заведующий сектором микробиологических исследований лаборатории микробиологических и физико-химических методов анализа научно-производственного отдела питательных сред.

Дятлов Иван Алексеевич. Директор, д-р мед. наук, профессор, член-корр. РАН.

Адрес для переписки: Шепелин Анатолий Прокопьевич; ¡nfo@ obolensk.org

Поступила 26.10.2015 г Принята 06.1 1.2015 г

Использование медицинская микробиология . Сущность изобретения: питательная среда используется с целью повышения селективных свойств среды, упрощения и ускорения выделения патогенных стафилококков Среда дополнительно содержит желток, при этом нативный яичный белок и желток она содержит в виде яичной взвеси. 0,1 %-ный водный раствор кристалвиолета и дефибринированную кровь при следующем соотношении компонентов агар-агар 20,0 25,0 г, хлористый натрий 100,0-102,0 г, яичная взвесь 100,0-150,0 г; 0.1 %-ный водный раствор кристалвиолета 3,0-3,5 мл, дефибринированная 100,0-150,0 мл, бульон Хоттингера до 1 л. 2 табл. о w Ё

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4889842/13 (22) 10.10.90 (46) 30.07.92. Бюл. N 28 (71) Самарский филиал Научно-производственного объединения "Гигиена и профпатология" (72) А.В.Ставский и Н.И. Червонная (53) 576.8.093, 1(088.8) (56) Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. Биргера. М,: Медицина, 1973, с.

75-76, Авторское свидетельство СССР

N 687118, кл, С 12 N 5/00, 1977. (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ СТАФИЛОКОККОВ

Изобретение относится к медицинской микробиологии.

Известна питательная среда для выделения стафилококков, содержащая агарагар, приготовленный на мясном бульоне, и

10% дефибринированной крови, Недостатком данной среды являются . слабые селективные свойства.

Известна питательная среда для выделения стафилококков, содержащая физиологический раствор, мясо-пептонный агар (рН 7,2) 10% хлористого натрия и 10-20% желточной взвеси.

Недостатком данной среды являются также слабые селективные свойства.

Известна также питательная среда для выделения стафилококков, содержащая агар-агар, нативный яичный белок. хлористый натрий, бульон Хоттингера.

Недостатком данной питательной среды являются ее слабые селективные свойства, сложность и длительность выделения

5Ц 1751199 Al (s>)s С 12 N 1/20, С 12 Q 1/04 (57) Использование: медицинская микробиология. Сущность изобретения: питательная среда используется с целью повышения селективных свойств среды, упрощения и ускорения выделения патогенных стафилококков. Среда дополнительно содержит желток, при этом нативный яичный белок и желток она содержит в виде яичной взвеси, 0,1%-ный водный раствор кристалвиолета и дефибринированную кровь при следующем соотношении компонентов; агар-агар 20,025,0 г; хлористый натрий 100 0 102,0 г; яичная взвесь 100,0 — 150,0 г; 0,1%-ный водный раствор кристалвиолета 3,0-3,5 мл; дефибринированная кровь 100,0-150,0 мл; бульон

Хоттингера до 1 л, 2 табл. патогенных стафилококков, так как в связи с широким применением антибиотиков и химиотерапевтическйх препаратов, оказывающих влияние на изменчивость микробов кокковой группы, в этиологии многих гнойно-воспалительных процессов большая роль стала придаваться, наряду с золотистым стафилококком, и другим видам стафилококков, относящимся к группе потенциально-патогенных. В соответствии с этим недостатком известной питательной среды является определение только одного вида стафилококков, что снижает диагностическую ценность питательной среды.

Целью изобретения является повышение селективных свойств среды, упрощение и ускорение выделения патогенных стафилококков.

Эта цель достигается тем, что среда дополнительно содержит желток,при этом нативный белок и желток она содержит в виде яичной взвеси. 0.1%-ный водный раствор

3,0-3,5 мл кристалвиолета и дефибринированную кровь при следующем соотношении компонентов:

Агар-агар . 20,0-25;0 r

Натрий хлористый 100,0-102,0 г 5

Яичная взвесь 100,0 — 150,0 г

0,1 g -ный водный раствор кристалвиолета

Дефибринированная 10 кровь 100 0 — 150,0 мл

Бульон Хоттингера До 1 л

Питательную среду готовят, например, следующим образом.

1000 мл агаровой питательной основы, 15 приготовленной из сухого питательного агара по обычной прописи с добавлением 10,,ного хлористого натрия и 3,3 мл 0,10/-ного водного раствора кристалвиолета, стерилизуют, охлаждают до 60-70 С, добавляют в 20 асептических условиях стерильно приготов- ленную яичную взвесь (куриное яйцо — белок и желток, смешанное с 200 мл стерильного физиологического раствора) в количестве 100 мл и 110 мл дефибриниро- 25 ванной крови. Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. После застывания и подсушивания среду используют для проведения необходимых исследо-. ваний. Срок хранения среды после 30 приготовления 7 — 10 дней при температуре

Питательная среда используется следующим образом.

Для выделения культур стафилококков 35 исследуемый материал (мазки из зева, носа, гной, раневое содержимое, вода, смывы с объектов внешней среды) рассеивают по всей поверхности питательной среды тампоном или шпателем, а при дифференциа- 40 ции уже выделенных штаммов стафилококков — штрихами на сектора чашки Петри, Учет результатов проводят через

24 — 48 ч инкубации в термостате при 37"С.

При посеве исследуемого материала на 45 предлагаемую диагностическую среду на ней вырастают, наряду с золотистым стафилококком, и другие виды стафилококков с признаками патогенности (вирулентности).

П р vi м е р 1. При прямом посеве тампо- 50 ном мазка иэ зева ребенка с подозрением на дифтерию бь|ли использованы одновременно простой мясо-пептонный агар(МПА), кровяной и желточно-солевой агары, а так- 55 . же предлагаемая диагносгическая среда, Указанный набор питательных сред применялся как при прямом посеве патологического материала, так и при проведении идентификации выделяемых иэ зева микроорганизмов. Через 18 — 24 ч все культуры с простого агара, подозрительные как стафилококки (наличие золотистого, желтого или белого пигмента колоний), пересевались вновь на кровяной агар, желточно-солевую и предлагаемую среды, Все колонии с предлагаемой питательной диагностической среды также засевались на кровяной и желточно-солевой агары, После 18 ч инкубации производился учет результатов. Иэ зева ребенка было выделено 9 штаммов стафилококков (3 — с золотистым пигментом, 6 — с белым). Дальнейшая идентификация позволила установить, что все три штамма золотистого стафил око кка обладали гемолитической и лецитиназной активностью. Из культур белого стафилококка два штамма дали на кровяном ага ре четкую зону гемолиза и один штамм обладал лецитиназной активностью, При посеве этого же материала на предлагаемую диагностическую среду было выделено 11 штаммов стафилококков (колонии фиолетового или оранжевого цвета), из которых у 4 культур наблюдали одновременно зоны лизиса зритроцитов и помутнения с радужным венчиком: у трех колоний отмечалась только зона гемолиза и у одного штамма — только зона помутнения.

Следовательно, обычными методами выделено 6 штаммов стафилококков, обладавших факторами агрессии (гемолизин, лецитинаэа), а при использовании предлагаемой диагностической среды изолировано 8 штаммов патогенных стафилококков.

Несмотря на несущественное различие в количестве выделенных штаммов, следует подчеркнуть, что исследование с применением предлагаемой диагностической среды продолжалось в течение 18-24 ч, в то время как использование обычной методики потребовало не менее 48 ч работы, Пример 2; При параллельном контрольйом посеве на МПА, кровяной агар и . предлагаемую питательную среду шести смывов и двух проб воздуха в операционной после ее профилактической обработки было обнаружено, что в одном смыве с загубника наркозного аппарата и в одной пробе воздуха присутствовали белые стафилококки, обладавшие при последующем исследовании гемолитической активностью, но не имев- шие лецитиназы. Применение обычных сред позволило получить окончательный ответ через 48 ч, а при использовании предлагаемой диагностической среды ответ был получен через сутки, Пример 3, Готовят среду, как указано, при этом компоненты берут в следующих количествах в бульоне Хоттингера. г/n:

Натрий хлооистый 99.0

Яичная взвесь - 80.0 мл

0,1 — íûé водный раствор кристалвиолета 2,75 мл

Дефибринированная кровь 80,0 мл

Золотистый стафилококк дает хороший типичный рост колоний, Зоны гемолиза и помутнения слабо различимы. Колонии белого стафилококка светло-фиолетового цвета, Наблюдается единичный рост колоний кишечной палочки и вульгарного протея. что свидетельствует о недостаточном тормозящем действии хлористого натрия и кристалвиолета в количествах, добавляемых в среду.

Пример 4. Готовят среду, как указано, при этом компоненты берут в следующих количествах в бульоне Хоттингера, г/л;

Натрий хлористый 100

Яичная взвесь 100 мл

0,1 -ный водный раствор кристалвиолета 3 мл

Дефибринированная кровь 100 мл

При посеве золотистого стафилококка вырастают колонии оранжево-желтого цвета с явно выраженной зоной гемолиза и зоной помутнения с радужным, венчиком, размером на 1 мм более размера зоны гемолиза. Белые стафилококки дают колонии светло-фиолетового цвета с зоной гемолиза и без нее или с зоной помутнения; радужный венчик больше размеров зоны гемолиза на 1 мм, Среда позволяет дифференцировать стафилококки с признаками патогенности от непатагенных видов.

Кишечная палочка и протеи роста не дают.

Пример 5. Готовят среду, как указано, при этом компоненты берут в следующих количествах в бульоне Хоттингера, г/л:

Натрий хлористый 101,0

Яичная взвесь 130,0 мл

0,1 -ный водный раствор кристалвиолета 3,25 мл

Дефибринированная кровь 130,0 мл

Рост колоний патогенных стафилококков типичный, сопровождается четкой зоной гемолиза вокруг колоний с зоной помутнения и радужным венчиком, превосходящим по размеру зону гемолиза на 3 мм.

Колонии стафилококков типичные, оранжевого или фиолетового цвета. Некоторые колонии белого стафилококка дают слабый радужный венчик, что позволяет отйесТй их к группе стафилококков с признаками патогенности..Кишечные палочки и протеи не дают роста.

Пример 6. Готовят среду, как указано. при этом компоненты берут в следующих количествах в бульоне Хоттингера, г/n:

5 Натрий хлористый 102,0

Яичная взвесь 150,0 мл

0,1 -ный водный раствор кристалвиолета 3,5 мл

10 Дефибринированная кровь, 150,0 мл

Колонии золотистого и белого стафилококков типичные, оранжевого цвета с зоной гемолиза и зоной помутнения с радужным

15 венчиком по периферии, Зона помутнения превосходит размеры зоны гемолиэа на

3 мм; колонии белого стафилококка фиолетового цвета; некоторые колонии дают зону гемолиза и зону помутнения с радужным

20 венчиком, свидетельствующие о наличии факторов агрессии — гемолизина и лецитиназы. Кишечные палочки и протеи не растут.

Пример 7, Готовят среду, как указано, при этом компоненты берут в следующих

25 количествах в бульоне Хоттингера, г/л:

Натрий хлористый 103,0

Яичная взвесь 170,0 мл

0,1 -н ый водный раствор кристалвиолета . 3,75 мл

Дефибринированная кровь 170,0 мл

Колонии золотистого стафилококка вы35 растают ярко-оранжевого цвета с нетипич-, ной морфологией (колонии мелкие, слегка морщинистые) со значительным количественным уменьшением числа колоний по сравнению с контрольным высевом„что сви40 детельствует о тормозящем действии избытка хлористого натрия и кристалвиолета.

Зоны гемолиза и помутнения нечеткие, едва различимые из-за слияния по цвету.c интенсивно окрашенным фоном среды. Белые

45 стафилококки темно-фиолетового цвета с нетипичной морфологией колоний, Кишечные палочки и протеи роста не дают, Указанное свидетельствует, что предлагаемая модификация питательной диагно50 стической среды позволяет сократить обьемы и срок исследований за счет преимущественного выделения стафилококков, одновременной их идентификации и определения признаков иэ вирулентности, так

55 как наличие в среде раствора кристалвиолета позволяет расти только стафилококкам;

"присутствие желтка «яйчйой взвеси в питательной среде дает возможность в этой же чашке визуально наблюдать лецитовителазную реакцию, с помощью которой определя1751199

50 ется наличие у исследуемого штамма микроорганизмов фермента лецитиназы; присутствие в среде дефибринированной крови дает возможность визуально наблюдать гемолитическую активность штаммов. Все отмеченное расширяет диагностические воэможности среды.

Положительный эффект доститается только лишь при строго определенной взаимосвязи существенных признаков. Исключение любого иэ них не позволяет достичь положительный эффект, Проведенные исследования предлагаемой диагностической среды с использованием выделенных и идентифицированных ранее 124 штаммов стафилококков показало, что предлагаемая диагностическая среда четко дифференцирует патогенных микробов этой группы, кэк и с использовэнием набора других сред для выделения и идентификации штаммов стафилококков, с той лишь разницей, что выделение и частичная идентификация этих бактерий проводится в одной чашке.

В результате изучения выделяемости патогенных стэфилококков с использованием различных питательных сред получены следующие результаты: всего исследовано

124 штамма стафилококков; выделено 97 штаммов стафилококков с признаками вирулентности; в том числе на обычных дифференциальных средах кровяной агар — 81, желточно-солевой агар 74: на предлагаемой диагностической среде 92.

При испытательных исследованиях на предлагаемой диагностической среде вырастали колонии только патогенных стафилококков (колонии фиолетового или оранжевого цвета). Кроме того, при наличии у микробов факторов агрессии (гемолизин и лецитинэза) вокруг колонии наблюдалась зона гемолизэ эритроцитов и зона частичного помутнения с радужным венчиком различной интенсивности по периферии зоны темолизэ или несколько ее превосходящая по размерам (на 1-3 мм). В табл. 1 приведены данные, свидетельствующие о различных рбэкцирх микроорганизмов в зависимости от дозы добавляемых в предлагэемую диагностическую среду ингредиентов, Как свидетельствует табл. 1, минимальные количества дефибринированной крови и яичной взвеси, при которых получается довольно четкий результат, определяются на уровне 100 — 150 мл по показателям чегкости зон гемолиза и помутнения с радужным венчиком и величинам размеров зон гемолиза и помутнения.

Зависимость роста стафилококков на предлагаемой питательной среде от количества добавляемого в нее раствора кристалвиолета представлена в табл. 2.

Как видно из табл. 2, доза добавляемого в предлагаемую диагностическую среду кристалвиолета существенно не оказывает влияния на культуру стафилококка, в то время кэк культура кишечной палочки не растет на среде уже в дозе кристалвиолета от 3,5 мл и выше, Таким образом, как свидетельствуют приведенные примеры, предлагаемая диагностическая питательная среда, приготовленная при строго определенных соотношениях вносимых ингредиентов, позволяет четко дифференцировать патогенных представителей стафилококков от непатогенных с одновременным определением у них в одной чашке двух ферментов агрессии (гемолизин и лецитиназа). Это позволяет в значительной мере сократить объемы И сроки исследования за счет преимущественного выделения только стафилококков с одновременной их идентификацией и определением признаков вирулентности, Кроме того, использование предлагаемой диагностической среды позволяет экономить питательные среды, необходимые по обычной методике для аналогичной идентификации (кровяной агар, желточно-солевой агар), а также рабочего времени персонала, необходимого для посева на дополнительные среды (мясопептонный агар, кровяной агар, желточносолевая среда) по обычной схеме исследования, и времени, требуемого на их раздельное приготовление и подготовку посуды, Все указанное увеличивает производительность труда персонала бактериологических лабораторий.

Питательная среда для выделения патогенных стэфилококков, содержащая агарагар, нативный яичный белок, хлористый натрий, бульон Хоттингера, о т л и ч а ю щ ая с я тем, что, с целью повышения селективных свойств среды, упрощения и ускорения выделения патогенных стафилококков, она дополнительно содержит желток, при этом нативный яичный белок и желток — в виде яичной взвеси, 0,1 -ный водный раствор кристалвиолета и дефибринированную кровь при следующем соотношении компонентов:

Агар-агар 20,0 -25,0 г

Хлористый натрий 100.0 t02,0 r

Яичная взвесь 100.0 -150.0

0,1%-ный водный раствор кристалвиолета 3.0- 3.5 ïï

100,0 — 150,0 мл .

Зависимость размеров зон гемолиза и помутнения в предлагаемой диагностической питательной среде от дозы добавляемых ингредиентов