Какими красителями окрашивается гонококк для микроскопирования
Лабораторная диагностика гонореи проводится при помощи бактериоскопического и бактериологического анализа, реже используется серологический и иммуноферментный метод.
Гонорея – инфекционное заболевание, возбудителем которого является гонококк. Впервые гонококки были описаны немецким дерматовенерологом Альбертом Нейссером. Отсюда возбудители гонореи получили название Neisseria gonorrhoeae.
Морфология
Гонококки являются диплококками бобовидной формы и внешне напоминают кофейные зерна. Гонококки - грамотрицательные бактерии, при окрашивании по методу Грама они приобретают красный цвет. Под воздействием внешней среды (химических препаратов, лекарств) гонококки могут менять размеры и форму, становиться грамположительными. Способность гонококков менять свойства часто осложняет диагностику гонореи.
Гонококки хорошо размножаются в жидких питательных средах и на плотных средах с рH от 7,2 до7,4 единиц, содержащих нативный человеческий белок (асцитную жидкость, кровь, сыворотку крови). Культивирование гонококков происходит при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере, содержащей 3 – 5 % углекислого газа. При дальнейшем культивировании потребность в углекислом газе отпадает.
Во внешней среде гонококки малоустойчивы. На них пагубно влияет повышение и понижение температуры, высыхание, прямые солнечные лучи. Бактерии погибают при самых малых концентрациях дезинфицирующих средств. Но во влажной среде, например, в гное, на грязном белье они могут сохранять свою жизнеспособность до 24 часов.
Диагностика гонореи
Своевременная диагностика венерического заболевания позволяет остановить распространение инфекции по организму и безотлагательно начать лечение. В России порядок проведения диагностики гонореи регламентирован приказом Министерства здравоохранения РФ от 20.08.2003 № 415 и заключается в обязательном осуществлении бактериоскопического исследования с последующим бактериологическим подтверждением, которые помогают быстро определить наличие инфекции.
Отдел новых технологий ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера для проведения бактериоскопического исследования выпускает наборы реагентов для окраски по Граму в трёх разных вариантах.
- В состав комплекта № 1 входит фуксин Циля, окрашивающий гонококки в розовый цвет.
- В комплекте № 2 фуксин Циля заменен на водный раствор нейтрального красного, в результате чего грамотрицательные бактерии приобретают ярко-оранжевый цвет и хорошо видны на контрасте с фиолетовой окраской грамположительных бактерий.
- Наибольшую контрастность получают при применении комплекта № 3, в котором используются в качестве красителей бриллиантовый зеленый и сафранин. Грамположительные микроорганизмы приобретают зеленый цвет, а грамотрицательные – красный.
Бактериоскопический метод имеет следующие недостатки:
- необходима высокая концентрация бактерий в исследуемом материале, не менее 10 9 КОЕ/мл, в противном случае гонококки могут быть не выявлены;
- при ошибках в технике окрашивания бактерии могут повести себя нетипичным образом и окраситься в другие цвета;
- гонококки полиморфны – они могут менять размеры и окраску под воздействием различных препаратов.
Для эффективной диагностики гонореи бактериоскопический анализ дополняют бактериологическим анализом, при котором исследуемый материал высевают на питательные среды для получения чистых культур возбудителя.
Селективный компонент в виде комплекса антибиотиков подавляет рост посторонней микрофлоры. Благодаря селективному компоненту на питательной среде, выпускаемой Отделом новых технологий, образуются только колонии гонококков, которые очень легко визуально обнаружить.
Бактериологическое исследование завершают проведением бактериоскопии мазков, приготовленных из выросших колоний. Также для контроля морфологии возбудителя проводят тесты для обнаружения цитохромоксидазы (оксидазный тест) и бета-лактомазы – ферментов, продуцируемых гоноккоками.
Также мы предлагаем наборы реагентов для экспресс-определения бета-лактамазы, продуцируемой гонококками. Обнаружение в исследуемом материале бета-лактамазы свидетельствует о резистентности выделенных гонококков к пенициллинам, к цефалоспоринам.
Преимущества препаратов для диагностики гонореи, выпускаемых Отделом новых технологий ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера:
- мы на протяжении многих лет проводим исследования в области диагностики заболевания;
- мы выпускаем полный спектр препаратов для выявления гонококковой инфекции;
- мы внесли качественные изменения в состав препаратов, чтобы уменьшить риск ошибки при диагностировании;
- наши селективные питательные среды для диагностики гонореи не имеют аналогов в России и стоят дешевле зарубежных препаратов.
Диагноз гонореи основывается на данных бактериологического и бактериоскопического исследования и идентификации возбудителя. Применяются также иммунологические методы для выявления антител (реакция Борде - Жангу) и антигенов (иммунофлюоресцентный и иммунохимический методы), а также постановка кожно-аллергических проб с гонококковым аллергеном. Материалом для исследования на гонорею обычно служит отделяемое из уретры, парауретральных протоков, большой железы преддверия, канала шейки матки, влагалища, секрет предстательной железы, семенных пузырьков, желез и лакун уретры, промывные воды прямой кишки, соскобы из уретры и прямой кишки, а также отделяемое глаз при гонобленорее и синовиальная жидкость при поражении суставов. Забор материала производит врач.
Отделяемое уретры у мужчин (предварительно отверстие очищают ватным тампоном, смоченным физиологическим раствором) захватывают краем предметного стекла, желобоватым зондом, ложечкой Фолькмана или берут петлей из глубины. У женщин материал для исследования из уретры, бартолиновых желез и парауретральных ходов после обтирания их ватным тампоном берут тупой ложечкой. Чтобы взять материал из шейки матки, во влагалище вводят зеркало Куска, протирают ватным тампоном и отделяемое берут влагалищным пинцетом или браншей корцанга. Из прямой кишки материал берут тупой ложечкой или с помощью промывных вод, в которых вылавливают подозрительные комочки, нити и готовят из них мазки.
Из материала, взятого из каждого пораженного органа и урогенитального тракта, готовят мазки на двух стеклах. Мазки должны быть равномерно размазанными, нетолстыми. Гонококки в тонких слоях окрашиваются грамотрицательно или переобесцвечиваются, в толстых - грамположительно. Высушенные на воздухе мазки фиксируют на пламени горелки и окрашивают (один мазок - 1%-ным раствором метиленового синего, второй - по Граму). При окраске по Граму лучше пользоваться водным раствором кристаллического фиолетового и 1%-ным водным раствором нейтрального красного. Мазок, окрашенный метиленовым синим, используется только для предварительного ориентировочного просмотра. Окончательное заключение по результатам микроскопии делается только на основании окраски препарата по Граму. Если не учесть это замечание, то можно допустить ошибку, так как другая флора, помимо гонококка, может располагаться внутриклеточно и иметь внешнее сходство с гонококком.
Окраска метиленовым синим. На мазки, высушенные на воздухе и фиксированные над пламенем спиртовки или метиловым спиртом, на 15-20 с наносится 1%-ный водный раствор метиленового синего, который затем осторожно смывается водой. После высушивания мазки микроскопируются. Цитоплазма форменных элементов окрашивается в бледно-голубой цвет, ядра - в синий, гонококки - в интенсивно-синий. Аналогично окрашиваются и другие кокки. Если они находятся внутри клеток, то напоминают гонококки.
Окраска по Граму. Используют 1%-ный водный раствор кристаллического фиолетового (краску растворяют в горячей дистиллированной воде, раствор охлаждают и фильтруют через двойной бумажный фильтр); раствор Люголя (1 г кристаллического йода, 2 г калия йодида, 300 мл дистиллированной воды); 96%-ный этиловый спирт; 1%-ный водный раствор нейтрального красного.
На высушенный и фиксированный над пламенем спиртовки мазок кладут фильтровальную бумагу по размеру предметного стекла или несколько меньше, наливают на 1-2 мин раствор кристаллического фиолетового или же на мазок кладут фильтровальную бумагу, пропитанную 1 %-ным водным раствором кристаллического фиолетового. Затем мазок смывают водой и заливают раствором Люголя на 30-60 с. Потом раствор Люголя сливают, и мазок погружают в ванночку с 96%-ным спиртом для обесцвечивания, которое производят под визуальным контролем, погружая и вынимая мазок из спирта до тех пор, пока с него перестанут стекать струйки краски. Препарат быстро промывают водой, наливают на 2 мин раствор нейтрального красного, после чего мазок промывают водой и высушивают на воздухе.
Препарат микроскопируют под иммерсионной системой при плоском зеркале и открытой диафрагме. Гонококки окрашиваются в ярко-розовый цвет, протоплазма лейкоцитов - в слабо-розовый цвет. Ядра лейкоцитов и эпителиальных клеток, поскольку они удерживают частично кристаллвиолет, окрашиваются в слабо-синий цвет. В переобесцвеченном мазке ядра лейкоцитов и эпителиальных клеток почти не имеют фиолетовой окраски. В недообесцвеченном мазке гонококки окрашиваются в фиолетовый цвет и их можно принять за грамположительные кокки. В случае неправильной окраски мазка по Граму берут препарат, окрашенный метиленовым синим, предварительно снимая с него иммерсионное масло спиртом или ксилолом, и окрашивают по Граму.
Посылая в лабораторию материал для исследования, необходимо приложить к нему направление, в котором следует указать, откуда взят материал, фамилию, инициалы больного, номер истории болезни и предполагаемый диагноз. В ответах из лаборатории нужно отмечать количество форменных элементов, эпителиальных клеток в мазке, присутствие или отсутствие других микроорганизмов ( и их отношение к окраске по Граму), вагинальных трихомонад, дрожжевых клеток.
Если при бактериоскопии не выявлены гонококки, прибегают к методу посева патологического материала из очагов поражения на искусственные питательные среды. Им пользуются в подозрительных на гонорею случаях, при торпидной, хронической гонорее, у заведомых источников заболевания гонореей, в случае воспалительных заболеваний урогенитального тракта у женщин, для подтверждения диагноза при установлении излеченности у детей, при исследовании материала из полости рта, при подозрении на гонорею глаз. Наилучшей средой для получения культуры гонококка является мясо- пептонный агар с добавлением асцитной или гидроцельной жидкости. В.Н. Беднова и М.Я. Яцуха предложили безасцитные среды.
При посеве загрязненного посторонней микробной флорой (из прямой кишки) материала в среду добавляют полимиксин М (12,4 ЕД/мл) и ристомицина сульфат (6,2 ЕЛ/мл). Оба антибиотика подавляют рост грамположительных и грамотрицательных микробов, не влияя на рост гонококков. Наилучший результат дает непосредственный посев материала на питательные среды. Если невозможно произвести бактериологические исследования на месте, пользуются транспортными средами. Гонококк на искусственных питательных средах дает рост обычно через 24 ч в виде мелких росовидных колоний. Если на следующий день рост гонококков не обнаружен, за посевами наблюдают 6-7 сут. Распознавать гонококковые колонии помогает оксидная реакция. На выросшие подозрительные колонии наносятся одна-две капли 1%-ного раствора парафенилендиамина или 0,5%-ного раствора тетраметилпарафенилендиамина гидрохлорида.. Гонококковые колонии при этом окрашиваются в пурпурно-коричневый (до черного) цвет.
При микроскопии мазков, приготовленных из суточной культуры, гонококки имеют вид кокков или диплококков одинаковой величины; приготовленные из трехсуточной культуры гонококки полиморфные, отдельные экземпляры окрашиваются очень бледно, количество гонококков с сохранившейся морфологией невелико. Дальнейшую идентификацию подозрительных на гонококк колоний производят на желточной среде ферменции. Использование ее позволяет, как правило, выделить гонококки в монокультуре.
Для отличия гонококков от сходных с ними микробов можно ограничиться исследованием ферментации глюкозы, мальтозы, левулезы. Гонококки ферментируют только глюкозу.
Для выявления гонококков в отделяемом применяют прямой метод иммунофлюоресценции. Для этого приготовленные мазки выдерживают в меченной изотиоционатом антигонококковой сыворотке в течение 1 ч при 35 градусов С во влажной камере, промывают фосфатным буфером и исследуют в люминесцентном микроскопе. Метод пригоден для дифференцирования гонококков в культурах и менее информативен при исследовании мазков, приготовленных из отделяемого очагов поражения.
В последние годы в диагностике гонореи используют иммуноферментный анализ, разработанный фирмой "АВВОТТ" в США. Тест обладает большой информативностью и сокращает сроки диагностики.
В качестве отборочного теста при обследовании на гонорею применяют постановку внутрикожной пробы с аллергеном гонококка, содержащим иммунологически активный белок, позволяющий выявить состояние сенсибилизации к возбудителю. Для выявления специфической сенсибилизации к гонококку аллерген в количестве 0,1 мл вводят в область средней трети внутренней поверхности предплечья строго внутрикожно. Оценку реакции производят через 24 ч после введения препарата (реакция гиперчувствительности замедленного типа). В зависимости от размера местной реакции ее оценивают на + (диаметр 6-10 мм), ++ (11-20 мм), +++ (свыше 20 мм). Результат считается положительным при наличии гиперемии с инфильтрацией диаметром свыше 5 мм. Лица с положительными результатами внутрикожной пробы подлежат углубленному клинико-лабораторному обследованию на гонорею. Противопоказания к постановке пробы: декомпенсированные заболевания печени, почек, сердечно-сосудистой системы, крови, туберкулез, ревматизм в стадии обострения, беременность, новообразования, аллергические заболевания и предшествующая гормонотерапия, острые интеркуррентные заболевания.
2. Какие формы выживания гонококка формируются при неправильной антибиотикотерапии?
3. В-лактомазные штаммы
4. Полимембранные фагосомы
3. Какими свойствами обладает гонококковый эндотоксин?
1. Вызывает порозность и ломкость сосудов
2. Способствует пролиферации клеток
3. Способствует склерозированию тканей
4. Обладает антикоагулянтным действием
5. Губительно действует на сопутствующую флору
Какие микроорганизмы длительное время могут персистировать в трихомонадах?
1. Бледная трепонема
5. Грибы Candida
Какими красителями окрашивается гонококк для микроскопирования?
2. Метиленовым синим
3. Толуидиновым синим
4. Нейтральным красным
Какими путями осуществляется инфицирование гонококками?
2. Половые перверзии
3. Через предметы туалета, белье
4. При прохождении через родовые пути
5. Занос руками в глаза, нос, рот
7. В слизистой оболочке каких органов имеются иммунокомпететнтные клетки, отвечающие за иммунитет?
3. Предстательная железа
4. Мочевой пузырь
8. Какой метод исследования применяют для топической диагностики уретрита?
1. Двухстаканная проба
2. Проба Ульцмана
4. Реакция Борде-Жангу
5. Комбинированная провокация
9. Перечислите пути распространения гонококковой инфекции в организме?
1. По протяжению слизистой оболочки
2. По нервным волокнам
4. Из глубины тканей
Какие клинические симптомы характерны для острого переднего уретрита?
1. Боли и рези при мочеиспускании
2. Зуд и жжение в уретре
3. Гиперемия и отек губок уретры
4. Белый, крошковатый налет на головке полового члена
5. Обильные гнойные выделения из уретры
Какие клинические симптомы характерны для острого тотального уретрита?
1. Императивные позывы на мочеиспускание
2. Терминальная боль
3. Терминальная гематурия
4. Выделение мочи малыми порциями
5. Обильные гнойные выделения из уретры
Какие клинические симптомы характерны для хронического гонорейного уретрита?
1. Склеивание губок уретры после ночного сна
2. Наличие симптомов поражения желез
3. Усиление выделений при физической нагрузке
4. Ослабление эрекции
5. Снижение либидо
13. Перечислите осложнения переднего гонорейного уретрита:
14. Перечислите осложнения заднего уретрита:
15. Перечислите виды провокации, входящие в состав комбинированной провокации?
16. Через какие промежутки времени после комбинированной провокации берут мазки на гонококк?
1. Через 24 часа
2. Через 12 часов
3. Через 48 часов
4. Через 96 часов
5. Через 72 часа
17. В чем состоят особенности гонорейной инфекции у девочек?
1. Многоочаговость процесса
2. Часто поражается прямая кишка
3. Поражаются преддверие влагалища и влагалище
4. Восходящая гонорея встречается редко
5. Преобладает острый процесс
18. Какой препарат используется для профилактики бленнореи у новорожденных?
К каким осложнениям часто приводит диссеминированная гонорейная инфекция?
4. Перигепатит (синдром Фитца-Хью-Куртиса)
Какие антибиотики применяются для лечения гонореи?
21. Какой группе больных гонореей противопоказано назначение фторхинолонов?
3. Кормящие матери
4. Онкологические больные
5. Подростки до 14 лет
Какие препараты относятся к фторхинолонам?
Какой антибиотик следует выбрать при лечении смешанной гонорейно-трихомонадной инфекции?
24. Какому контингенту пациентов для подтверждения диагноза гонореи необходимо проводить культуральную диагностику?
1. Женщины старше 60 лет
4. Декретированный контингент
Дата добавления: 2018-04-15 ; просмотров: 836 ;
В гистологии, цитологии и эмбриологии существует много методов исследования.
Здесь рассматриваются лишь те, которые связаны со световой и электронной микроскопией мёртвых (фиксированных) клеток и тканей .
1.1. Световая микроскопия
1.1.1. Устройство микроскопа
| В микроскоп входят 3 системы -
1. Оптическая система включает объектив и окуляр. а ) Объектив (1) - это система линз, вставляемая в тубус (2) снизу и непосредственно направляемая на объект (отсюда - и название). Схема - строение светового микроскопа. Полный размер | ||||||||||||||||||||
| При использовании последнего объектива его следует погрузить в каплю кедрового (иммерсионного) масла, нанесённую на покровное стекло препарата.
в) Результирующее увеличение микроскопа - произведение увеличений объектива и окуляра, например: г) Таким образом, функция оптической системы - | ||||||||||||||||||||
| 2. Осветительная система - источник света, зеркало, конденсор и диафрагма.
а) Источник света (4) может быть встроен в микроскоп, а может находиться и вне микроскопа (пример - обычная настольная лампа). в) Конденсор (6) состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате. Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку лучей. г) Диафрагма (7) вмонтирована в конденсор; это система непрозрачных пластинок с отверстием посередине. | ||||||||||||||||||||
| 3. Механическая система - тубус (2) , штатив (8) , колонка (9) и предметный столик (10) .
а) С колонкой связаны макро- и микрометрический винты . б) Предметный столик может перемещаться в горизонтальной плоскости, что позволяет менять участки препарата, попадающие в поле зрения. | ||||||||||||||||||||
| В итоге, световые лучи проходят следующий путь:
1.1.2. Приготовление гистологического препарата
1.1.4. Гистохимические методы исследования а) Гистохимические методы основаны на специфической реакции между химическим реактивом и определённым компонентом препарата. 1а) РНК | Реакция Браше.
1. Реактив (как отмечалось, - смесь двух красителей: 2. а ) А. Пиронин специфически окрашивает РНК в красный цвет . б) Другие структуры ядра (помимо ядрышек) - зелёные . 3. Обычно делают и контрольный препарат, который перед окрашиванием обрабатывают рибонуклеазой. | |||||||||||||||||||
| Реакция Фёльгена.
1. Основной реактив - фуксинсернистая кислота (реактив Шиффа). 2. ДНК-содержащие структуры окрашиваются в пурпурно-красный цвет . | ||||||||||||||||||||
| Используются различные реакции; в том числе:
а) с бромфеноловым синим (у белков - тёмно-фиолетовая окраска ); | ||||||||||||||||||||
| ШИК-реакция.
1. Реактив - Ш ифф-пер и одная к ислота (выделенные буквы и составляют аббревиатуру ШИК ). 2. Периодат способствует образованию в субстрате альдегидной группы, которая взаимодействует с реактивом Шиффа. 3. На препарате ШИК-положительные компоненты (например, гранулы гликогена) имеют тёмно-красный цвет . | ||||||||||||||||||||
| Реакция с толуидиновым синим.
1. При взаимодействии толуидинового синего с веществами, содержащими много кислотных групп, наблюдается метахромазия
2. Подобным свойством обладают, в частности, компоненты аморфного вещества соединительной ткани - гликозамингликаны
4. Нейтральный | Реакция с суданом III (о которой уже упоминалось).
Капли жира в жировой клетке окрашиваются в яркий оранжево-красный цвет благодаря растворению в них красителя. | |||||||||||||||||||
1.1.5. Просмотр препаратов
1.1.5.1. Срез; окраска гематоксилин-эозином
| 1. Препарат - тонкая кишка собаки. Окраска гематоксилин-эозином. 1. На снимке мы видим внутреннюю поверхность тонкой кишки с находящимися на ней кишечными ворсинками ( 1). 2. а) Ядра клеток (2) - базофильны и окрашены гематоксилином в фиолетовый цвет. б) Цитоплазма (3) оксифильна и окрашена эозином в розовый цвет. |  1.1.5.2. Тотальный препарат: окраска судан III - гематоксилином
1.1.5.3. Срез после декальцинации; окраска по Шморлю
| |||||||||||||||||||||||
