Тест пкт для определения сепсиса

Предлагаем Вам информацию, представляющую современный метод диагностики сепсиса, основанный на определении концентрации прокальцитонина - маркера септического состояния пациента. По всем интересующим Вас вопросам просим обращаться по вышеуказанному адресу. Мы будем рады ответить на Ваши вопросы и предоставить дополнительную информацию.

ДИАГНОСТИКА СЕПСИСА ПО ПРОКАЛЬЦИТОНИНУ (ПКТ)

Прокальцитонин (ПКТ) – биохимический маркер для ранней диагностики, мониторинга тяжести течения сепсиса и оценки синдрома системной воспалительной реакции (ССВР).

Прокальцитонин – предшественник кальцитонина. В норме их синтез осуществляется в C-клетках щитовидной железы. У здоровых людей концентрация ПКТ низкая. Увеличение уровня прокальцитонина в крови происходит при невирусных инфекциях. Значительное повышение прокальцитонина обнаруживают у пациентов с бактериальным сепсисом, особенно при тяжелом сепсисе и/или септическом шоке. При генерализации бактериальной инфекции происходит резкая экстратиреоидальная выработка ПКТ в нейроэндокринных клетках легких, в поджелудочной железе, печени, макрофагах, моноцитах, др. тканях. Уровень прокальцитонина в сыворотке крови возрастает в течение 6-12 часов после генерализации инфекции. Синтез ПКТ стимулируют бактериальные экзо- и эндотоксины при участии цитокинов. При этом не происходит повышения уровнякальцитонина.

Тест на прокальцитонин – хороший критерий контроля эффективности лечения сепсиса, а так же - прогностический маркер. Период полураспада ПКТ - 25-30 часов. Поэтому после успешного оперативного лечения или антибиотикотерапии уровень прокальцитонина в крови быстро снижается (на 30-50% за сутки). При сохраняющемся повышении уровня прокальцитонина более 4 дней нужна коррекция лечения. Если после лечения не наблюдается быстрого снижения уровня прокальцитонина, прогноз заболевания сомнительный. Постоянно повышающиеся показатели ПКТ свидетельствуют о плохом прогнозе заболевания.

У больных, находящихся в критическом состоянии с клиническими признаками системного воспаления, сепсис трудно отличить от других неинфекционных синдромов. Терапия и исходы болезни существенно отличаются у пациентов с сепсисом и без сепсиса. Компания BRAHMS AG (Германия) разработала экспресс-диагностику сепсиса по Прокальцитонину (ПКТ).

В настоящее время Прокальцитонин - наиболее показательный и доступный лабораторный параметр диагностики сепсиса.

Раннее и высокоспецифичное увеличение уровня ПКТ в ответ на системную воспалительную реакцию различного генеза и сепсис обеспечивает преимущество данного метода по сравнению с другими параметрами, такими например, как интерлейкины.

Экспресс тест ПКТ-Q обеспечивает дифференциальную диагностику сепсиса от локализованной бактериальной инфекции, хронических воспалительных и аутоиммунных заболеваний.

При сепсисе уровень концентрации ПКТ значительно выше 1-2 нг/мл и часто достигает значений от 10 до 100 нг/мл или даже превышает их в индивидуальных случаях.

Экспресс тест ПКТ-Q используется для определения течения и прогноза жизнеугрожающих септических инфекций и для контроля эффективности терапии.

Только Прокальцитонин является лабораторным параметром с доказанной корреляцией к клинической тяжести патологического процесса у смешанной популяции пациентов ОРИТ.

Экономическая эффективность применения Экспресс теста ПКТ-Q в диагностике и мониторинге сепсиса состоит в сокращении применения дорогостоящих антибиотиков, уменьшении времени пребывания в ОРИТ и значительном снижении стоимости лечения.

Клиническое применение Экспресс-теста ПКТ-Q:

ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИЗМЕРЕНИЯ PCT В ЛАБОРАТОРИИИ

Наиболее часто встречающиеся вопросы

Образцы исследования концентрации ПКТ

Только сыворотка или плазма может быть использована. Концентрация ПКТ в образцах артериальной крови составляет приблизительно на 4% выше чем в образцах венозной крови.

Стабильность in vitro

- При комнатной температуре

В течение 2 часов после забора крови распадается приблизительно 2%.

Стабилен в течение нескольких месяцев

Замораживание/размораживание (3 цикла)

Потеря PCT в образце составляет

Время полураспада in vivo

Как часто надо проводить измерение концентрации ПКТ для мониторинга

Минимум один раз в день

Интерпретация значений концентрации ПКТ в период терапевтического мониторинга (в т.ч. после хирургического удаления очага инфекции и/или после назначения антибактериальной терапии)

Приблизительно 50% снижение концентрации ПКТ в день в течение нескольких дней указывает на эффективность терапии (хирургической, антибиотикотерапии)

Устойчиво высокая или повышающаяся концентрация ПКТ указывает на неконтролируемое течения заболевания и необходимость изменения терапии.

Интерпретация значений концентрации ПКТ в течение мониторинга инфекционного заболевания пациентов группы высокого риска, в т.ч. после трансплантации органов или с множественной травмой

Отсутствие инфекционных осложнений обусловливает низкий уровень ПКТ или снижение повышенного уровня ПКТ (в т.ч. после операций) в течение нескольких дней приблизительно на 50% в день. Уровень нормы достигается в течение нескольких дней. Постоянно повышенный уровень ПКТ или его повторное увеличение свидетельствует об инфекционных осложнениях

Для мониторинга пациента всегда должен использоваться один и тот же источник образца (плазма или сыворотка).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Значения концентрации ПКT

Концентрация ПКТ (нг/мл)

Хронические воспалительные заболевания или аутоиммунные заболевания

Мягкое или умеренное течение локализованной бактериальной инфекции

Синдром системной воспалительной реакции (ССВР), множественная травма, новорожденные

Тяжелая бактериальная инфекция, сепсис, полиорганная недостаточность

Абсолютный уровень концентрации ПКТ различается при ССВР, сепсисе, тяжелом сепсисе и септическом шоке по определению АССР/SCCM объединительной конференции.

Для определения клинической тактики рекомендуется измерять концентрацию ПКТ как минимум 1 раз в день в течение курса противовоспалительной терапии. Увеличение концентрации ПКТ свидетельствует о повышении воспалительной активности, тогда как снижение концентрации ПКТ указывает на уменьшение воспалительной активности и тем самым на более благоприятный прогноз.

Влияние лекарственных препаратов на изменение концентрации ПКТ :

Не обнаружено влияния на изменение концентрации ПКТ антибиотиков, вазоактивных препаратов, антикоагулянтов и диуретиков.

Однако, применение лекарственных средств, приводящих к массивному выбросу цитокинов, может вызвать увеличение уровня ПКТ, несвязанное с инфекционным заболеванием.

Концентрация PCT у новорожденных :

Концентрация ПКТ физиологически меняется в течение первых двух дней жизни ( у здоровых новорожденных - максимальное значение 20 нг/мл). На третий день после рождения у здоровых новорожденных этот показатель достигает значений нормы взрослого человека ( 20 нг/мл)и на третий день после рождения продолжает превышать значение нормы. Следовательно, Экспресс тест ПКТ-Q может эффективно использоваться для диагностики сепсиса новорожденных.

ПКТ-Q тест (экспресс-метод) ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА :

ДОСТОВЕРНОСТЬ И ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ

Данный тест показывает высокую степень достоверности и воспроизводимости при определении концентрации ПКТ в сыворотке/плазме. Диапазон концентраций, полученный при использовании полуколичественного ПКТ-Q теста, хорошо коррелирует с данными количественного ПКТ-Lumitest.

ПКТ-Q-тест достигает 90-92% диагностической чувствительности и 92-98% диагностической специфичности по сравнению с клиническим применением ПКТ-Lumitest.

Для количественного определения концентрации ПКТ, например, в целях мониторинга, доступны другие (количественные) методики, такие как ПКТ-Lumitest.

Прокальцитонин (ПКТ) - это предшественник гормона кальцитонин (КТ). Совершенно случайно было открыто, что при бактериальной инфекции повышается концентрация ПКТ в крови. Этот факт способствовал тому, что ПКТ стали использовать в качестве маркера бактериальных инфекций. К концу 80-х было установлено, что при раке щитовидной железы и некоторых формах рака легких, наряду с повышением КТ, также повышается уровень ПКТ. В 1992 году исследованием Cafe и др. было продемонстрировано постоянное присутствие КТ и ПКТ в крови у пациентов с ожогами. Причем, у некоторых больных с септицемией выявлены высокие уровни ПКТ, тогда как значения КТ оставались нормальными. Концентрация циркулирующего в крови ПКТ чрезвычайно низкая. У здоровых и доноров она определяется на уровне 0,01 нг/мл. При вирусных инфекциях и в составе воспалительного ответа уровень ПКТ повышается слабо, редко достигая 1 нг/мл. При тяжелых бактериальных инфекциях он может возрастать от 20 до 200 нг/мл. Такие высокие значения ПКТ делают особенно целесообразным его определение для диагностики и прогноза бактериальной инфекции.

Краткая характеристика ПКТ. ПКТ - полипептид с молекулярной массой 12 793 Да. Он образуется в нейроэндокринных клетках человека (С-клетки щитовидной железы, в легких и печени) и в обычных условиях подвергается последующему расщеплению на три молекулы: кальцитонина (32 аминокислотных остатков), катакальцин (21 аминокислотных остатков) и М-концевой пептид (57 аминокислотных остатков). В ходе инфекции нерасщепленная молекула ПКТ выделяется в кровоток, при этом уровень КТ не повышается. Циркулирующая в крови молекула, в отличие от внутриклеточного ПКТ, укорочена на 2 аминокислотных остатка и, в сущности, соответствует исходному участку молекулы от 2-го до 116-го аминокислотных остатков.

Продукция. Пациенты, перенесшие тиреоэктомию, тем не менее, продуцируют высокие уровни ПКТ при тяжелых бактериальных инфекциях. В моноцитах человека после стимуляции in vitro эндотоксином появляется иРНК, специфичная для ПКТ, но уровень продукции данной иРНК оказывается низким. Njsten и др. показали, что после стимуляции ФНО (фактор некроза опухолей) или ИЛ-6 (интерлейкин-6), печеночная ткань человека продуцируют ПКТ в большом количестве. Внутривенное введение эндотоксина здоровым добровольцам также вызывает быстрый синтез ПКТ. Причем, уровень ПКТ возрастает уже через 3 ч, после введения бактериального продукта, в то время как ЦРБ (С-реактивный белок) появляется позже, только через 12-18 часов. Введение ФНО или ИЛ-6 также приводило к появлению ПКТ в кровотоке.

Прокальцитонин и воспаление . На атаку любого агента организм отвечает общей приспособительной реакцией в интересах целостного организма. Для тяжелого воспаления, в том числе и инфекционного, характерно изменение многих биологических показателей, в частности, содержание белков в крови и появление так называемых острофазных белков. При обострении системной красной волчанки, других болезнях соединительной ткани, ревматизме или при воспалительных заболеваниях органы пищеварения значения ПКТ остаются все время низкими в отличие от других маркеров воспаления (СОЭ, ЦРБ, ИЛ-6). По данным Eberhard и др., у этих больных повышение уровня ПКТ происходило только в случае присоединения бактериальной инфекции. Таким образом, ПКТ позволяет дифференцировать обострение основного заболевания и наличие суперинфекции.

Трансплантации. В многочисленных исследованиях по пересадке сердца, легких или печени продемонстрирована высокая достоверность ПКТ маркера для дифференциации реакции отторжения и суперинфекции.

Прокальцитонин и вирусная инфекция. При вирусной инфекции, как и в случае воспалительных заболеваний соединительной ткани, ПКТ не повышается, если не присоединилась суперинфекция. Это преимущество принципиально отличает ПКТ от других диагностических маркеров воспаления. В случае вирусных менингитов у взрослых и детей в плазме содержание ПКТ менее 1 нг/мл.
По данным Gendrel и др. при обследовании 240 детей, госпитализированных с лихорадкой в отделение неотложной помощи, у которых выявлены вирусы как единственная причина заболевания, только 5% детей имели ПКТ более 1 нг/мл и 0,8% детей более 2 нг/мл. Самые высокие концентрации ПКТ не превышали 5 нг/мл и были отмечены только у пациентов, которые имели активированные макрофаги, т.е. в тех случаях, когда провоспалительные цитокины продуцируются в избытке. В этих исследованиях ПКТ оказался более чувствительным и специфичным для подтверждения вирусной природы инфекции, чем ЦРБ, ИЛ-6 или ИФ-альфа. Для неотложной педиатрии быстрая диагностика вирусной инфекции позволяет предупреждать необоснованное назначение антибиотиков. Так, по данным Joey и др., Vuori и др., Hatherill и др., в случаях, когда вирусные инфекции дают тяжелую клиническую картину, напоминающую бактериальный шок, только ПКТ способствует корректной диагностике и назначению правильной терапии.

Менингиты. Определение ПКТ в сыворотке крови - наиболее чувствительный метод для дифференциации вирусных и бактериальных менингитов у взрослых и детей. Наблюдение за поведением показателей ПКТ в процессе лечения бактериального менингита показало его быстрое снижение и, по мнению Assicot и др., Gendrel и др., определение ПКТ можно использовать как тест, подтверждающий эффективность лечения больных. ПКТ не продуцируется в СМЖ, и при бактериальном менингите уровни ПКТ в ней остаются низкими.

Септицемия и бактериемия. При септицемии уровень ПКТ повышен, обычно выше 2 нг/мл. В исследовании бактериальных менингитов у детей Gendrel и др. сообщают о 2-х случаях из 46, при которых зарегистрированы низкие уровни ПКТ, но это были случаи лечения антибиотиками с положительным клиническим результатом. Возможно, что транзиторные случаи бактериемии у детей могут не сопровождаться значительным повышением ПКТ. Высокие уровни ПКТ при бактериемии всегда предсказывают тяжелое течение и прогноз. Пороговое значение для ПКТ в случае бактериемии у детей, не леченных антибиотиками, по данным Gendrel и др. и Hatherill и др., составляет 2 нг/мл. На основании изучения взрослых, госпитализированных по экстренным показаниям, Bossink и др. считает, что концентрация ПКТ в 1,6 нг/мл является пороговой для разделения лихорадок бактериальной и небактериальной природы. Для больных с нейтропениями этот порог ниже: между 0,5 и 1 нг/мл. Генерализация инфекции при кандидозах и аспиргилезах сопровождается повышением уровней ПКТ. Для диагностирования бактериемии у детей с лихорадкой предложены пороговые показатели ПКТ: 1 нг/мл (94% -специфичность), 2 нг/мл (99% - специфичность). Уровни ПКТ выше 5 нг/мл, в т.ч. у больных с иммунодефицитом или СПИДом, всегда указывают на генерализацию инфекции и бактериемию. Исследования показали целесообразность повторных исследований ПКТ с интервалом в 12-24 ч для оценки динамики инфекционного процесса в тяжелых клинических случаях. Очень высокие значения ПКТ выявлены при тяжелых тропических инфекциях (мелиоидозе), при этом высокие показатели ПКТ имеют неблагоприятный прогноз для жизни больного. Так, по данным Smith и др., из 19 больных с мелиоидозом, имевших уровень ПКТ в крови более 100 нг/мл, умерло 16, тогда как из 16 больных с уровнем ПКТ меньше 100 нг/мл умерло только двое.

Малярия. Концентрация ПКТ при малярии повышена, но механизмы повышения здесь другие, чем при бактериальной инфекции. Концентрация ПКТ может достигать 20 нг/мл, даже при простом обострении и без неврологических осложнений. ПКТ, а не ИЛ-6, оказался лучшим маркером начальной фазы и эффективности лечения тяжелой малярии. По данным исследований Richard-Lenoble и др. в Габоне высокие показатели ПКТ при малярии имеют неблагоприятный прогноз, для жизни: больные, имевшие концентрацию ПКТ более 100 нг/мл, умерли от церебральных осложнений малярии.

Постнатальный период. ПКТ в крови новорожденных проявляется через 12 ч после родов и продолжает возрастать до 24-36 ч (возраста) до уровня 10 нг/мл, затем к 5-м суткам снижается до 1 нг/мл. Механизм феномена не известен, выдвинута гипотеза, что это ответ на микробное заселение пищеварительного тракта. Рекомендуется проводить повторно определения ПКТ (через 12-24 ч) для исключения возможной генерализованной бактериальной инфекции.

Пациенты, находящиеся в палате интенсивной терапии. Определение ПКТ сразу завоевало одобрение врачей в работе интенсивной терапии для быстрой дифференциации бактериальных и прочих воспалительных реакций, а также для оценки эффективности лечения.

Наблюдение за послеоперационными больными. Много исследований было сфокусировано на оценке ПКТ, на сравнении с другими маркерами у послеоперационных больных. Разнородность пациентов, систематическое применение антибиотиков и трудности распознавания инфекционных осложнений затрудняют интерпретацию результатов определения ПКТ. Meisner и др. показали умеренное повышение уровня ПКТ у каждого 3-го пациента после асептической операции, сопровождавшейся небольшим повреждением коллатерального кровообращения, и у каждого второго - после кардиохирургических и торокальных вмешательств. Однако, именно ПКТ, а не ИЛ-6 и ЦРБ, является лучшим маркером в случае инфекционных осложнений после больших хирургических вмешательств. Многочисленные исследования продемонстрировали диагностические возможности определения ПКТ: быстрое повышение или отсутствие снижения через 12-24 ч при тяжелых клинических случаях. По данным Schroder и др., ПКТ является не только надежным диагностическим показателем септического шока, но и ценным прогностическим параметром для жизни хирургического больного: ПКТ снижался только у выживших больных, в отличие от ИЛ-6 и ЦРБ.

Шок и острый респираторный дистресс. Многие исследования показали, что ПКТ является принципиальным маркером для дифференциальной диагностики септического шока. По данным Werra и др., именно ПКТ, а не ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО и растворимые рецепторы к цитокинам, позволил дифференцировать кардиогенный и септический шок. При остром респираторном дистресс синдроме, как отмечают Bmnkhorst и др., ПКТ был повышен только в случае инфекционного генеза. Высокие уровни ПКТ отмечены при пневмококковой пневмонии у детей, особенно в случае бактериемии и низкие уровни при вирусных пневмониях, даже в случаях с тяжелой гипоксией. Чувствительность метода определения ПКТ при бактериальных инфекциях у больных, находящихся в палате интенсивной терапии, сходна с ЦРБ или несколько выше, но, при этом, определение ПКТ - более специфично. У пациентов с неопределенными состояниями мониторинг с помощью ПКТ поможет сформировать более адекватную терапию и предупредить прогрессирование инфекции. Отсутствие снижения ПКТ при этом является индикатором плохого прогноза.

Острый панкреатит. В развернутом наблюдении Rau и др. за больными с острым панкреатитом продемонстрировано, что низкие уровни ПКТ определялись при отечном или токсическом панкреатите, а высокие - при инфицированном панкреатите. Это особенно ценно для мониторирования за подобными больными, например, выявление очага вторичного инфицирования, который требует хирургического вмешательства.

Локализованные бактериальные инфекции . При всех ограниченных воспалениях уровень ПКТ редко повышается выше порога, но у взрослых больных в терминальном состоянии с выявленным инфекционным очагом он может повышаться. Нами показано, что при очаговых инфекциях, в том числе у больных со средним отитом и инфекциях нижних дыхательных путей, уровни ПКТ остаются низкими, ниже, чем при генерализованных формах, и составляют в среднем 0,5-2 нг/мл. Однако, уровни ПКТ могут повышаться, если инфекция начинает распространяться на соседние ткани, а также при замкнутых воспалительных очагах – артритах.

Заключение
ПКТ является хорошим показателем, дополняющим клинические и биологические исследования в патологии. В отличие от всех известных маркеров воспаления, метод определения ПКТ более чувствителен и высокоспецифичен для тяжелой бактериальной инфекции. К достоинству теста относится его пригодность для экстренных клинических ситуаций (у постели больного), при мониторировании больных в палатах интенсивной терапии и в качестве прогностического маркера при прогрессировании инфекционного процесса. Тест отличается высокой точностью измерения в диапазоне низких значений от 0,1 до 5 нг/мл, что особенно важно при очаговых инфекциях без признаков бактериемии. Несмотря на то, что точная функция ПКТ в воспалительной реакции и цитокиновом каскаде остается неизвестной, его использование в клинике уже сейчас оценивается чрезвычайно высоко. Отмечается стабильность этого белка, его устойчивость при комнатной температуре и к замораживанию, постоянство присутствия в плазме в течение 24ч, простота его определения. Отмечается быстрота выполнения теста, что важно в условиях экстренной медицинской помощи. В последнее время тест ПКТ все шире входит в клиническую практику, имея очевидные преимущества перед обычно применяемыми тестами.

УДК: 615.012:577.175.446]-097
Год издания: 2016

Получение вариантов рекомбинантного прокальцитонина человека и изучение их иммуногенных свойств

Цель - осуществить сборку гена прокальцитонина (ПКТ) методом перекрывающейся полимеразной цепной реакции (ПЦР), получить штаммы-продуценты рекомбинантного ПКТ, наработать, очистить и охарактеризовать полученные варианты ПКТ, проиммунизировать лабораторных животных и оценить эффективность разработанных схем иммунизации.

Несмотря на значительный прогресс в медицине по-прежнему наблюдается рост числа тяжелых инфекционных заболеваний с сохранением высокой летальности даже в развитых странах. Сепсис - одна из наиболее частых причин смертности в США: около 100 случаев на 100 000 населения с ежегодным приростом 8,7%. Смертность при сепсисе составляет, по разным источникам, от 30 до 60%, а затраты на каждого пациента достигают 22 000 долларов. Успех терапии напрямую зависит от ранней диагностики и своевременного начала лечения.

Прокальцитонин - это предшественник гормона кальцитонина, состоящий из 116 аминокислот. При наличии инфекции и/или развитии сепсиса провоспалительные цитокины и бактериальные липополисахариды индуцируют образование прокальцитонина не только в специализированных С-клетках щитовидной железы, где он продуцируется в норме, но и паренхимальных клетках печени, почек, легких, мышечной ткани, в адипоцитах, которые в отличие от С-клеток не имеют специфических ферментов для расщепления ПКТ, что приводит к повышению его концентрации в крови. Показано, что у пациентов с вирусной инфекцией или воспалительными заболеваниями содержание маркера остается постоянно низким, что делает целесообразным определение ПКТ для диагностики и прогноза течения бактериальной инфекции. При целом ряде воспалительных заболеваний небактериальной этиологии значения ПКТ остаются все время низкими в отличие от других маркеров воспаления (скорость оседания эритроцитов, концентрация С-реактивного белка, интерлейкина-6). Повышение уровня ПКТ происходит только в случае присоединения бактериальной инфекции, что позволяет дифференцировать обострение основного заболевания и наличие инфекции.

В США количественное определение уровня ПКТ предложено в качестве основного теста при принятии решения о назначении и/или отмене антибиотиков у пациентов с сепсисом или инфекциями дыхательных путей. При использовании алгоритмов, основанных на определении уровня ПКТ, было отмечено сокращение частоты назначения антибиотиков (на 11-74% по данным разных исследований), а также уменьшение продолжительности их применения (на 15-55%). При этом не выявлено ухудшения исходов лечения в исследуемой группе относительно группы сравнения: общая частота летальных исходов составила 7,7 и 8,3% соответственно. Очень важно проводить диагностику бактериальных инфекций и мониторинг антибиотикотерапии, имея надежный тест для количественного определения ПКТ. Наиболее чувствительным, специфичным и доступным методом определения белков острой фазы, цитокинов и других диагностически значимых факторов стал метод иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием антител.

Разработка отечественного теста для количественного определения прокальцитонина методом ИФА неразрывно связана с получением рекомбинантного ПКТ человека, пригодного для иммунизации животных, что является целью настоящей работы.

Методы исследования. В качестве матрицы для дизайна олигонуклеотидов для синтеза гена была использована аминокислотная последовательность препрокальцитонина (genbank, GI:4502545). Поскольку кодонный состав человека и Esherichia coli существенно различается, была проведена оптимизация кодонной последовательности для экспрессии целевого белка в E. coli. Для оптимизации использовали программное обеспечение Genedesign (DNA2.0, США). Ген собирали из олигонуклеотидов методом перекрывающейся ПЦР. Олигонуклеотиды подбирали с применением программного TmPrime ( , дата обращения 13.02.2014).

Полученный в результате сборки линейный фрагмент с размером 360 п.о., содержащий на 5 ‘ - и 3 ‘ -концах сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз BamH I и Xho I, обрабатывали соответствующими эндонуклеазами рестрикции и клонировали в составе вектора pET 28a (Novagen, США) в клетках E. coli BL21(DE3) с получением штамма E. coli PKT1, продуцирующего белок fusion 1. Данный белок идентичен по аминокислотной последовательности нативному ПКТ и дополнительно содержит остатки из 6 гистидинов как на С, так и N-конце. Переклонирование гена ПКТ, обеспечивающего экспрессию прокальцитонина с нативными N- и С-концами, проводили в вектор pTXB1 с применением перекрывающейся продолженной полимеразной цепной реакции. Данная конструкция позволяет получать белок, который после очистки на хитин-связывающей сефарозе может подвергаться аутопротеолизу при наличии в среде 1 М ДДТ, с получением молекулы с нативными C- и N-концами.

Клетки E. coli выращивали на термостатированных биологических качалках с частотой колебания платформы 170-190 об/мин при +25° С на среде (0,5 л) следующего состава: триптон - 1%, дрожжевой экстракт - 0,5%, глюкоза - 0,5%, NaCl - 1%. В среду дополнительно вносили канамицин до 50 мкг/мл. Клетки выращивали до оптической плотности 1,5 (λ=600 нм), затем проводили индукцию синтеза белка путем внесения изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) до концентрации 0,1 ммоль, продолжая культивирование в течение 4 ч. По окончании культивирования клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 5000хg. Осадок клеток ресуспендировали в 50 мл лизирующего буфера, содержащего 50 ммоль NaH₂P0₄, 400 ммоль NaCl и 20 ммоль имидазола (рН 8,0). Ультразвуковую дезинтеграцию клеток осуществляли на приборе Branson Sonifier 450 при мощности 40-50 Вт (360 импульсов по 0,5 с).

Иммуноферментный анализ проводили с иммобилизованным на твердой фазе антигеном с последующей инкубацией с первичными специфическими антителами и вторичными антивидовыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена.

Результаты исследований. Собран ген, кодирующий прокальцитонин человека. Полученный ген клонирован в составе вектора pET28a+ в клетках E. coli BL21 (DE3).

Оптимизированы условия экспрессии целевого белка в созданном штамме-продуценте: внесение индуктора (ИПТГ) при достижении клетками оптической плотности 1,5 (λ=600 нм), температура культивирования - 30°C, длительность индукции - 4 ч после внесения индуктора, концентрация индуктора - 0,1 ммоль. Подобранные условия экспрессии рекомбинантного модифицированного ПКТ (fusion 1) позволили увеличить выход белка с 1 л культуры в 1,5 раза с 16 до 24 мг белка.

Разработана схема очистки белка fusion 1 с использованием одноэтапной металлоаффинной хроматографии.

Наработан рекомбинантный модифицированный ПКТ fusion 1 в количестве 7 мг с чистотой более 90% и выходом целевого белка 60%.

Переклонирование гена ПКТ, обеспечивающего экспрессию прокальцитонина с нативными N- и С-концами, проводили в вектор pTXB1 с применением перекрывающейся продолженной полимеразной цепной реакции. В результате ген ПКТ был слит с интейном, содержащим хитин-связывающий домен. Данная конструкция позволяет получать белок, названный fusion 2, который после очистки на хитин-связывающей сефарозе может подвергаться аутопротеолизу при наличии в среде 1 М ДТТ с получением молекулы с нативными C- и N-концами. Наработан рекомбинантный нативный ПКТ в количестве 1 мг.

Для оценки иммуногенных свойств полученных белков ПКТ проведена иммунизация мышей линии BALB/с в присутствии полного или неполного адъюванта Фрейнда при первой и последующих иммунизациях соответственно. Забор крови для исследования проводили из хвостовой вены на 10-е сут после иммунизации. Специфические антитела в плазме крови иммунизированного животного определяли методом ИФА. Установлено, что все мыши, иммунизированные нативным рекомбинантным ПКТ, погибали после 2-3 иммунизации, что возможно, связано с высокой гомологией (77%) молекул ПКТ мыши и человека, а также выявлено пролонгированное с помощью адъювантов действие ПКТ. В то же время рекомбинантный белок fusion 1 способен индуцировать образование специфических антител, титр которых растет с увеличением количества иммунизаций (рис. 2), и не приводит к гибели животных. Важно отметить, что при иммунизации рекомбинантным модифицированным белком fusion 1 около 60-70% специфических антител наряду с использованным нами иммуногеном распознавали и рекомбинантный ПКТ человека.

Рисунок 1 — Характеристика антигенной активности молекул ПКТ и fusion 1 методом ИФА

Рисунок 2 - Увеличение количества специфических антител в плазме крови иммунизированных мышей

Представлены средние значения оптической плотности дуплета, полученные в ИФА с иммобилизованным на твердой фазе ПКТ, fusion 1 и БСА (бычьим сывороточным альбумином) в концентрации 0,25 мкг/мл и плазмой крови мыши (номер 1, 2) в разведении 1:500. К- - плазма крови контрольной неиммунизированной мыши.

Таким образом, показано, что для формирования иммунного ответа на ПКТ и получения высоких титров специфических антител необходимо использовать модифицированную молекулу ПКТ, чтобы увеличить ее чужеродность для мыши и усилить антигенные свойства. Создан штамм-продуцент, экспрессирующий рекомбинантный модифицированный прокальцитонин человека. Наработан препарат белка fusion 1 (чистота более 90%), который по антигенным свойствам не отличается от коммерчески доступного рекомбинантного ПКТ и обладает достаточной иммуногенностью, чтобы быть использованным для иммунизации животных с целью получения специфических антител.

Вид патентной защиты: отсутствует, планируется подача заявки.

Область применения: лабораторная диагностика.
Рекомендации по использованию: рекомендуется использовать для создания отечественной диагностической иммуноферментной тест-системы для количественного определения уровня прокальцитонина в биологических жидкостях человека.
Предложения по сотрудничеству: совместные исследования по указанной тематике.