Сколько по времени делается анализ на африканскую чуму свиней

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

Отбор проб для вирусологических исследований. Для обнаружения вируса африканской чумы свиней, антигена или генома от павших или убитых с диагностической целью свиней отбирают массой 5-10 г - селезёнку (1/3 часть), портальные, желудочные и подчелюстные (или мезентериальные) лимфоузлы (целиком), лёгкое (5х5 см) и почку (1/3 часть), 3-5 мл крови (или сгусток). Кроме того, рекомендуется в случае аутолизиса трупа отбирать грудинную или трубчатую кость.

Отбор проб для серологических исследований. Минимальное количество проб, которые должны быть отобраны для серологических исследований, рассчитывают с учётом 10%-ой серопревалентности заболевших с 95%ой достоверностью для обследования каждого помещения.

Пробы крови отбирают их полой вены не менее 10 мл от каждой свиньи [3].

Для лабораторных исследований применяют следующие методы: реакцию гемадсорбции (РГАд) в культурах клеток, реакцию прямой иммунофлюоресценции (РПИФ), полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в формате электофорезной детекции, ПЦР в формате реального времени, применяют твёрдофазный иммуноферментный анализ (ТФ – ИФА) (сэндвич-вариант). В сомнительных случаях окончательный диагноз устанавливают заражением подозрительным материалом (кровь, суспензия селезенки и лимфатических узлов) свиней, вакцинированных против классической чумы. Заражение свиней (биопроба) проводят в специализированной лаборатории с соблюдением особых мер предосторожности. Серологические типы вируса определяют в реакции преципитации (РП), реакции связывания комплемента (РСК), реакции задержки геамадсорбции (РЗГАд) и другими методами. [2]

Реакция прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) ставят в вирусологических лабораториях для прямого обнаружения вирусного антигена в клетках органов свиней, подозреваемых в заражении вирусом африканской чумы свиней. Внутриклеточный антиген обнаруживают люминесцентной микроскопией препаратов мазков-отпечатков, окрашенных ФИТЦ-иммуноглобулинами (специфические антитела к вирусу африканской чумы свиней, меченные флуоресцеинизотиацианатом). Лучшими органами для РПИФ являются селезёнка и лимфоузлы. Исследование может быть выполнено в течение 2-4 час [2].

Оценку результатов микроскопии проводят по условной четырех крестовой шкале при окуляре 10х20-объективе 10. В положительных случаях наблюдают сверкающую, желто-зеленого цвета флуоресценцию клеток с включениями или очаговыми флуоресцирующими комплексами диффузного и гранулярного антигена, в одном из 10-50 полей зрения.

При визуальном учёте реакцию считают положительной при окрашивании хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали исследуемые и специфический антиген в сине-зеленый цвет и отсутствии окрашивания субстрата в лунках, в которых предварительно инкубировали нормальный антиген.

Анализ по выявлению вируса АЧС включает выделение ДНК и амплификации специфического фрагмента в полимеразной цепной реакции и электрофорез в агарозном геле [3].

Реакция считается положительной, если полоса в соответствующем треке располагается в геле точно на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля амплификации. Размер апликонов после проведения ПЦР- 485 п.н.

Реакция считается отрицательной, если в соответствующих треках полос не обнаружено или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе (т. е. располагаются на другом расстоянии от старта) [4].

Для обнаружения антигена вируса африканской чумы свиней применяют ПЦР в формате реального времени. Реакции заключается в использовании специфического флюоресцентно-меченного зонда, сайт гибридизации которого лежит между сайтами связывания основных диагностических праймеров. В случае присутствия в исследуемом образце генома возбудителя, зонд будет связываться с его ДНК и прибор регистрирует накопление флуоресцентного сигнала в ходе реакции. Регистрация сигнала происходит через стенки пробирки в режиме реального времени [1].

Учёт результатов проводят по анализу кривых накопления флуоресцентного сигнала по каналу FAM с помощью программного обеспечения используемого прибора.

Положительными считают результаты реакции при значениях Ct, не превышающих 35.

Образцы, для которых не определено значение Ct (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию) – результаты считают отрицательными [4].

Белоусова Л.В., Троценко Н.И., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. М.: КолосС, 2006. — 248 с [Текст] с.131-140.

Госманов Р.Г., Колычев Н.М. Ветеринарная вирусология М.: KoлoсC, 2006. — З04 c. [Текст] с.151-153.

Инфекционные болезни животных / Б.Ф. Бессарабов, А.А., Е.С. Воронин и др.; Под ред. А.А. Сидорчука. - М.: Колосс, 2007.-671с [Текст] с.206-275.

Шевченко А.А., Шевченко Л.В., Черных О.Ю., Шевкопляс В.Н. Лабораторная диагностика инфекционных болезней животных. Учебное пособие. Краснодар. – 2009. – 575 С. [Текст] с.340-402

Цибезов В.В., Терехова Ю.О., Баландина М.В., Латышев О. Е.,
Гребенникова Т. В., Верховский О.А. АНО "Научно-исследовательский
институт диагностики и профилактики болезней человека и животных"
Клипер Т.Н. "НПОНАРВАК"
Шевкопляс В.Н. Кубанский госагроуниверситет

Африканская чума свиней (АЧС) - вирусная болезнь свиней, характеризующаяся высокой контагиозностью. Возбудителем заболевания является ДНК-содержащий вирус семейства Asfarviridae с размером вириона 175—215 нм [8]. В естественных условиях к АЧС восприимчивы домашние и дикие свиньи всех возрастов. Скорость распространения и степень патогенности вируса АЧС таковы, что эта инфекция способна в короткие сроки (3-5 месяцев) привести к огромным экономическим потерям или даже полной утрате поголовья свиней [1, 6].

Эпизоотологическая особенность АЧС заключается в чрезвычайно быстром изменении форм течения инфекции среди домашних свиней от острого со 100%-ной летальностью до хронического и бессимптомного носительства и непредсказуемого распространения.

Для эффективного использования различных методов диагностики АЧС. направленных на выявление возбудителя или специфических антител, следует учитывать особенности протекания болезни и ее формы. При сверхострой и острой формах выявление вирусоспецифических антител возможно только в пробах селезенки, так как специфические антителопродуцирующие клетки и. следовательно, антитела появляются там на 2-3 сутки после инфицирования, в то время как животные гибнут уже на 3-7 сутки [5]. При подостром и хроническом течении болезни виру-соспецифические антитела в крови появляются на 7-10 сутки, до этого времени целесообразно проводить выявление вирусного антигена или генома в крови, так как данный период течения АЧС характеризуется виремией [7] .

В более поздний срок прижизненная идентификация вирусного антигена возможны только при наличии устойчивой ви-ремии. которая характерна для циркуляции высокопатогенных штаммов и изолятов. Вирус умеренно вирулентных изолятов вызывает перемежающуюся виремию. невысокий уровень смертности при высоком уровне заболеваемости, поэтому в этом случае диагностика АЧС. в основном, базируется на обнаружении антител в сыворотке крови [5. 7]. Таким образом, для эффективной диагностики АЧС необходимы методы специфического определения, как возбудителя, так и антител, образующихся после заражения вирусом.

Одним из перспективных методов определения вирусных антигенов и антител к ним является иммуноферментный анализ (ИФА). Преимущества ИФА заключаются в высокой специфичности, скорости и простоте постановки реакции, сравнительна невысокой стоимости и универсальности применяемого оборудования, возможности автоматизации процедуры анализа. За последнее десятилетие произошли значительные изменения в технологии производства ИФА-наборов. обусловленные результатами научно-практических разработок, связанных с применением моноклональных антител (МкА). которые практически полностью вытеснили поликлональные не только в "сэндвич"-вариантах ИФА. предназначенных для обнаружения антигена, но и в большинстве тест-систем, направленных на выявление антител, где они используются либо в качестве конъюгатов или для адсорбции антигена [9. 10]. Помимо этого, в качестве компонентов ИФА эффективно используются рекомбинантные антигены, обладающие иммунохимическими свойствами нативных белков и представляющие собой хорошо охарактеризованные и стандартизированные препараты [2. 3. 4].

Целью настоящей работы являлась разработка современных иммуноферментных тест-систем для выявления как антител к вирусу АЧС. так и самого вируса АЧС в биологическом материале.

Материалы и методы исследования. Для создания высокоспецифичных иммуноферментных тест-систем необходимо было разработать методику синтеза рекомбинантного белка vp73 вируса АЧС. а также, используя в качестве антигена полученный рекомбинантный белок, получить и охарактеризовать специфические моноклональные антитела к вирусу АЧС. Часть работы была проведена в сотрудничестве с сотрудниками фирмы INGENASA (Испания).

Получение рекомбинантного белка vp73. Для получения рекомбинантного белка фрагмент гена B646L размером 485 п.о., кодирующий конформационный эпитоп белка vp73. был амплифицирован с рекомбинантной плазмидной ДНК pSG72a, несущей полную последовательность этого гена. Экспрессию рекомбинантного белка проводили в клетках E.coli штамма BL21(DE3)pLysS (Novagen). Белок очищали из микробной массы Е. coli BL21(DE3)pLysS на NI-NTA агарозе (Qiagen. USA).

Идентификацию и степень чистоты полученного препарата проверяли методом SDS- электрофореза в 12% полиакриламид-ном геле, его активность и специфичность - в непрямом ИФА и иммуноблоттинге с использованием МкА и референтных положительных и отрицательных сывороток крови свиней.

Получение МкА к рекомбинантному белку vp73. Для получения МкА мышей линии BALB/c 3 раза иммунизировали ре-комбинантным белком vp73 (200 мкг/мышь) с двухнедельным интервалом между иммунизациями. Бустерную дозу (200 мкг/ мышь) вводили за 3 дня до выделения селезенки.

Гибридомные клеточные линии получали путем слияния спленоцитов с перевиваемой клеточной линией миеломы Sp2/0.

Скрининг и оценку иммунологической активности МкА в сыворотке крови или культуральной жидкости проводили методом непрямого ИФА. Позитивные гибридомы реклонировали и наращивали в культуральных флаконах, увеличивая объем (Greiner. Германия). Асцитные жидкости, содержащие МкА, получали после введения гибридомных клеток в брюшную полость праймированных пристаном мышей линии BALB/c. Очистку МкА из асцитных жидкостей осуществляли методом аффинной хроматографии с использованием Белок-А-агарозы (Sigma. США).

Конъюгаты МкА с пероксидазой хрена получали периодатным методом.

Иммуноферментный метод выявления антител к вирусу АЧС в формате конкурентного ИФА. Очищенный рекомбинантный белок vp73 сорбировали в лунках микропланшета в 0.1 М карбонатном буфере. рН=9.5 (концентрация 5 мкг/мл) по 100 мкл в лунку в течение ночи при 4°С. После 4-кратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки. Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл пероксидазного конъюгата МКА. Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После промывания планшета вносили по 0.1 мл субстратного раствора с тетраметилбензидином (МДЛ. Россия). Инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте и добавляли 0.1 мл 1 М H2S04 для остановки реакции. Оптическую плотность при 450 нм (А450) измеряли на спектрофотометре с вертикальным лучом Multiscan EX (Thermo, США).

Иммуноферментный метод выявления антигена вируса АЧС в формате "сэндвич"-ИФА. Для "сэндвич"-ИФА очищенные МкА сорбировали в лунках микропланшета в 0.1 М карбонатном буфере. рН=9.5 (концентрация 10 мкг/мл) по 100 мкл в лунку в течение ночи при 4°С. После 4-кратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл очищенного рекомбинантного vp73 в серийных разведениях (от 5 нг/мл до 320 нг/мл) или подготовленные образцы биоматериала. Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После 4-кратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл пероксидазного конъюгата детектирующих МкА в рабочих разведениях на ФСБТ. Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После промывания планшета вносили по 0.1 мл субстратного раствора с тетраметилбензидином и определяли оптическую плотность как описано выше.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени для выявления ДНК вируса АЧС. Выделение ДНК вируса АЧС из биологических образцов проводили с использованием набора для выделения ДНК на колонках ("Ветбиохим". Россия).

ПЦР в реальном времени проводили на приборе ДТ-96 ("ДНК-Технология". Россия) в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл ДНК. 10 пмоль каждого прайме-ра. 5 пмоль зонда. 0.25 мМ каждого dNTP. 1.25 ед. Taq-полиме-разы, 10 мМ Tris-HCI (рН=9.0). 50 мМ KCI. 0.1% Triton Х-100. 1.5 мМ MgCI2.

Результаты и обсуждение. Рекомбинантный фрагмент конформационного эпитопа белка vp73 вируса АЧС был охарактеризован биохимическими и иммунохимическими методами (электрофорез, иммуноблоттинг. ИФА). Показано, что полученный продукт обладает электрофоретической гомогенностью и детектируется АЧС-специфическими сыворотками. Неспецифические сыворотки не взаимодействуют с полученным продуктом. Рекомбинантный белок был использован в качестве антигена для получения МкА.

После проведения гибридизации было получено 523 гибридных клеточных линий, устойчивых к селективной среде HAT. При первичном тестировании культуральных жидкостей было отобрано 67 клонов реагировавших с рекомбинантным белком vp73.

После повторного клонирования были отобраны 2 клона, обладающих максимальной активностью по отношению к vp73 в непрямом ИФА. Полученные МкА были использованы в дальнейшей работе.

При разработке тест-системы для выявления антител к вирусу АЧС был использован принцип конкурентного ИФА. применяемый в наборе для определения антител к вирусу АЧС INGEZIM РРА СОМРАС (INGENASA. Испания). INGEZIM РРА СОМРАС на основе белка vp73 вируса АЧС обладает 100% чувствительностью и специфичностью и используется в Европе в качестве основного для первичного исследования сывороток при диагностике АЧС. Набор INGEZIM РРА СОМРАС успешно применялся в Испании в рамках национальной программы по искоренению АЧС.

В результате проведенных исследований с использованием полученных рекомбинантного белка vp73 и МкА была разработана тест-система для определения антител к вирусу АЧС "АЧС-CEPOTECT/INGEZIM РРА СОМРАС". Оценка диагностической чувствительности и специфичности тест-системы проводилась в компании INGENASA на широкой панели референтных сывороток крови сывороток крови, полученных от экспериментально зараженных животных и сывороток крови свиней, охарактеризованных референтными методами в соответствии со стандартами OIE (иммуноблоттинг. реакция непрямой иммунофлуорес-ценции. РИФ) [10] .

При исследовании в системе "АЧС-CEPOTECT/INGEZIM РРА СОМРАС" 120 сывороток, показавших негативный результат методами непрямого ИФА и иммуноблоттинга. АЧС-позитивных 21 сывороток не выявлено, т.е. специфичность тест-системы составила 100%.

23 сыворотки, положительные в непрямом ИФА, но отрицательные в иммуноблоттинге были определены как отрицательные. Поскольку иммуноблоттинг является официальным референтным методом по рекомендации OIE. специфичность системы "АЧС-CEPOTECT/INGEZIM РРА СОМРАС" в данном случае также составляет 100%.

30 сильноположительных в непрямом ИФА и иммуноблоттинге сывороток и 5 слабоположительных в непрямом ИФА и сильноположительных в иммуноблоттинге сывороток определены как положительные, т.е. чувствительность системы составила 100%.

Тест-система не выявила перекрестных реакций с антителами к вирусам болезни Ауески. болезни Тешена. КЧС и РРСС.

Диагностическая чувствительность системы была определена при исследовании сывороток свиней, экспериментально зараженных вирулентным штаммом вируса АЧС Ug03H (табл. 1) и слабовирулентными штаммами Е75 и Е70 (табл. 2).

Таблица 1. Результаты анализа сывороток крови свиней после экспериментального зараже­ния штаммом Ug03H в системе "АЧС-CEPOTECT/INGEZIM РРА СОМРАС

Со старшим сыном Олегом я иду по пустой ферме. Холодный ветер гуляет среди голых столбов. Все выгородки, все подстилки сожгли вместе с комбикормом, сеном и сотней свиней. А бетон трижды обработали антисептиками.

Захворала свиноматка сразу после опороса. По словам Олега, отравилась. Вызвали своего частного ветеринара. А тот сообщил районному. Приехала комиссия. Свинью зарезали за фермой. Взяли потроха в мусорный пакет и увезли на анализ под Владимир. А на третий день приехала целая бригада с милицией. Выставили пост, и началось истребление. Отец семейства Валерий Мицай тяжело болел. У него было плохо с сердцем, да еще онкологию обнаружили. Схватил он охотничье ружье и хотел было защищать свою собственность. Но Ирина не дала ему сделать непоправимое.

- Конечно, эти переживания ускорили его уход. Летом жгли наших свинок. А к Новому году мужа не стало, - вспоминает вдова. - Ведь могли устроить карантин. Понаблюдать за свинками. Я уверена, что чумы у нас не было, а анализы не делались вовсе. Ведь когда чума, все гибнут за три дня. А ветеринар наш районный перестраховался. Спасибо скажите, говорит, что саму ферму не сожгли.

- Мы только-только стали развиваться, - вспоминает старшая дочь Оксана. - Нашли своего потребителя. Ездили по ярмаркам. И в Тверь мясо возили. Открыли палатку на рынке. На наше мясо записывались. Ведь у нас ни гормонов, ни антибиотиков. Появился стабильный доход. Взяли кредиты на корма. В следующем месяце последний взнос отдадим. А за пустую ферму платим налог по 60 тысяч. Продать не можем - кому она нужна? Свиноводством никто заниматься не хочет. Оказалось, нам компенсация не полагается. Посчитали убытки. Три миллиона. Судились. Проиграли. С нас еще госпошлину за суд хотели взять - 24 тысячи. И вот странное дело. Как только в Кимрском районе частных свиней пожгли, тут же построили два крупных свинокомплекса. Совпадение?

Большая фермерская семья, про которую писали местные газеты, ставили в пример и вручали грамоты, разъехалась. Кто на заработки, кто на учебу. Веранда опустела. Оксану выбрали главой Красновского сельского поселения. Олег помогает дачникам строить сараи. Ирина сидит с внуками.

- Олег, ведь есть же программы помощи фермерам. Почему не воспользоваться? Коровок разводить, например?

- У нас в Тверской области это называется гранты. Мне предлагали 2,5 миллиона. Я стал считать. Выяснилось, что там условий больше, чем рублей. Я обязан взять 10 работников. Отчислять в Пенсионный фонд за них. Получается, что все эти миллионы за год уйдут на зарплату и выплаты. А на что жить? Я с сельским хозяйством завязал. Беззащитные мы. И против чумы, и против начальства. Я больше не фермер.

Африканская чума свиней (АЧС) празднует свой скорбный юбилей в России. 10 лет она безжалостно выкашивает хрюшек в Черноземье и Нечерноземье, перешагнула Волгу и бушует даже в Омске. Вакцина будет создана не раньше чем через 10 лет.

Осенью 2007 года АЧС попала на территорию Северной Осетии из Грузии. Эффект был страшным. Чума перекинулась на тучный в смысле сельского хозяйства Краснодарский край. А потом пошла гулять по среднему Черноземью. Губернаторы объявляли карантины. Свинушек в радиусе 20 км от вспышки усыпляли, а потом обкладывали покрышками и сжигали. Сколько свиней сгорело в этом жертвенном костре, лишь бы остановить чуму! А она шествовала дальше, на запад: через Белоруссию в Польшу и Прибалтику. На востоке была надежда, что дикие кабаны не переплывут Волгу, но чума достигла Сибири. За 10 лет в России сожгли два миллиона свиней. Только прямые убытки исчисляются пятью миллиардами рублей. А косвенные - далеко за 50. Но это все цифры. А сколько сломанных судеб, несбывшихся надежд и человеческих трагедий!

Пострадавшим от чумы вроде полагается компенсация. От 40 до 100 рублей за килограмм живого веса. Все зависит от региона. Ведь выплаты идут из местного бюджета, если они, конечно, идут. Тут есть нюансы. В случае если вспышка произошла в вашем хозяйстве, то вам ничего не положено. Другое дело, вы попали под программу "зачистки". Но на практике местные службы всеми правдами и неправдами оберегают местный же бюджет. Легче зафиксировать болезнь, чем выплачивать деньги.

. Как попала зараза во Владимирскую область, до сих пор спорят. Еще в июне в охотхозяйстве "Синжанское" Меленковского района егеря обнаружили семь зачумленных трупов диких кабанов. Установлено, что, несмотря ни на какие заслоны, чума распространяется со скоростью 300 километров в год.

. В Родионово Владимирской области пахло горелым шашлычком. Вдоль дороги прямо к стволам приколочены красные таблички: "Внимание! Африканская чума свиней. В лесу ограничены охота, сбор грибов и ягод". Стало не по себе. Бывший свинокомплекс "Борисовское" был похож на покинутую крепость. Кирпичные трехметровые стены с колючкой по периметру. Раньше она защищала от несунов. От чумы спасти не смогла. Гипсовые хрюшки явно с советских времен украшали мертвый замок. Железные ворота и мертвые витрины фирменного магазина. В щелку я увидел груды теперь уже ненужных железных фирменных прилавков.

Поехал я в Городищи. Там тоже вспышка. Но маленькая. Четыре свинки всего. Глава администрации Ирина Юферева отрапортовала, что на территории ее поселения африканская чума свиней полностью искоренена. За неимением свиней. На прилавках свинина от тамбовских фермеров по цене 340 рублей за шею.

В департаменте ветеринарии Владимирской области на меня посмотрели как на зачумленного. И.о. руководителя, оказалось, срочно вызван в правительство, и вообще с прессой они предпочитают общаться с помощью писем. Увы, я эпистолярному жанру предпочитаю репортаж. На общение с прессой у них, наверное, карантин.

- Пошел типичный сельский житель на охоту, - рассказывает мне президент ассоциации "Ветбезопасность" Лилия Сургучева. - Наступил сапогом своим в кабаний навоз. Принес все домой. Пошел свиньям дать, а переобуваться не стал. Вот и вспышка! Или бывает еще хуже. Найдет такой мужик мертвого кабана в лесу и вместо того, чтобы сообщить нам, тащит домой собакам. Чего мясу пропадать? Или фермер, когда видит, что свинка "заскучала", режет ее и везет на базар. Да еще в соседнюю область. Каково? У нас сейчас провал в законах. Вот уже два года любой гражданин может перевозить своих свинок без ветпаспортов на личном транспорте или даже на автобусе или ж/д вагоне в любую точку страны. А потом мы удивляемся, почему чума перешла Волгу. Надо ввести ответственность каждого свиновода. Ветврача с проверкой даже на порог не пускают! И ведь все это законно. И хоть люди от АЧС не гибнут, урон колоссальный.

Есть у нас Национальный союз свиноводов. Руководит им лауреат Государственной премии, доктор технических наук Юрий Ковалев. Человек знает о свиньях все. Пришел к нему за правдой. Неужели чума - это повод избавиться от конкуренции?

- Чума - это повод задуматься, как нам жить дальше. Вы даже не представляете, какая это опасность! Ящур у коров или птичий грипп у кур - это просто ОРЗ по сравнению с двусторонней пневмонией. Бубонную чуму человека победили, а африканскую свиней - нет и не предвидится в обозримом будущем. Вы что, вправду считаете, что это преднамеренно? За год правительство собиралось шесть раз именно по поводу АЧС. Все очень серьезно. Давайте посмотрим. В советское время 85 процентов свинины давали колхозы и совхозы. Потом, в смутные 90-е, хозяйства развалились. И до 50% выдавал частный сектор. Частники спасали Россию от голода. А сейчас все возвращается на круги своя. Частный сектор теперь 14%. Но АЧС сокращает этот показатель. Потому что современные свинокомплексы на 20-50 тысяч голов оборудованы наиумнейшими средствами биозащиты. В Испании в начале 70-х чума пошла косить свиней. Производство хамона было в опасности. Европейское экономическое сообщество пригрозило закрыть границы для испанской свинины. Король издал несколько указов. Мелким хозяйствам было запрещено производить свинину. За 10 лет испанцы победили чуму. Сейчас там одни гиганты. Но и хамон жив. На очереди Германия с рульками. Там уже понимают, что лучше самим перепрофилировать мелкие хозяйства, чем вылететь из обоймы производителей европейской свинины.

Юрий Иванович показывает графики. Производство свинины, несмотря на АЧС, растет, как в годы первых пятилеток производство чугуна. Мы практически отказались от импорта свинины! Только 7% все еще ввозится из Бразилии. Но это вопрос ближайшего времени. Теперь пора подумать об экспорте. А вот тут наши партнеры из Евросоюза говорят: стоп, машина. Дело даже не в санкциях. Просто страна с АЧС берется на карандаш не только в ЕС. И при прочих равных какой-нибудь Парагвай "сделает" нас. Вот почему победить чуму - это не только экономический резон.

- Юрий Иванович, а если чума посетит такой комплекс-гигант? Это же атомный взрыв! Невозможно жить, как на подлодке, высчитывая каждый вирус.

- У комплексов есть уровни системы биологической безопасности. С первого по четвертый. Их называют "компартмент". Современные свинокомплексы начинаются от третьего. Специальные шлюзы для персонала, отпугиватели птиц, москитные сетки, автономия, все на мировом уровне. Поэтому, когда бушует эпидемия вокруг, им ничего не страшно. Но ради справедливости стоит сказать: один мой коллега, крупный промышленник свинины, получил вспышку, несмотря на современнейшие меры безопасности. 20 тысяч свиней сжег. И после дезинфекции опять заселил фабрику. И опять вспышка. И никаких компенсаций от государства. Человеческий фактор - вот что представляет опасность. А это уже рулетка. Свиней в любых хозяйствах надо чипировать и наблюдать. И централизовать систему ветконтроля, как это было раньше. Сейчас она подчиняется губернаторам. А африканская чума - нет!

В Союзе свиноводов твердо убеждены, что после того, как вирус АЧС попал на территорию России, выращивать свиней у нас в стране возможно только в хозяйствах, имеющих уровень защиты не ниже 3-4 компартмента. Это является абсолютно необходимым фактором, чтобы в перспективе победить чуму и свободно выходить на экспортные рынки.

Когда 10 лет назад чума накрыла Краснодарский край, там действовала программа переориентации фермерских хозяйств на другое производство. Предлагалось, что половину трат на покупку молодняка крупного рогатого скота берет на себя государство. На месте свиноферм появились коровники. Занятость населения осталась прежней. Почему бы не распространить этот опыт на другие пострадавшие регионы?

Если Россия пойдет по испанскому сценарию, то фермер-свиновод точно умрет как класс и в его крепкий дом въедет дачник, который отбивные покупает в супермаркете. Где же семье Мицай взять деньги на электронные душевые кабины и отпугиватели птиц? Ведь любой кредит делает недешевую фермерскую свинину еще дороже. Гиганты выживают. Одиночки - нет.

Не существует методов лечения и профилактики АЧС, поэтому быстрая диагностика, строгий контроль состояния здоровья животных и противоэпизоотические мероприятия являются основой борьбы против АЧС.

Прогресс в области диагностики, связан с развитием высоко чувствительных методов, позволяющих надежно диагностировать острую, хроническую и инапарантную форму болезни в течение нескольких часов.

Существует множество методов обнаружения вируса и специфических антител. Наиболее часто используемыми в настоящее время методами диагностики АЧС являются: ПЦР (стандартная и в режиме реального времени) для обнаружения вируса; ИФА и имммуноблотинг для исследования сывороток. Дальнейшая схема показывает методы и их применение наиболее часто используемые в референтных лабораториях.

Требования к образцам направляемым в лабораторию

Для подтверждения/исключения АЧС в лабораторию направляют образцы селезенки, почек, лимфатические узлы. Также могут быть направлены образцы крови с антикоагулянтом (ЭДТА) от животных с повышенной температурой. Сыворотку от животных используют в серологических реакциях.

К направляемым образцам должна прилагаться сопроводительная документация с описанием клинического состояния животного.

Сопроводительная документация должна содержать:

• Имя и адрес владельца.
• Подозреваемую болезнь.
• Вид животного и время его нахождения на ферме (в хозяйстве). Это очень важно для обнаружения новых больных животных в хозяйстве.
• Дата обнаружения первых признаков болезни.
• Распространение болезни на ферме.
• Количество павших и животных с признаками болезни.
• Тип содержания и система производства.
• Лечебные мероприятия и вакцинации, проведенные в последние несколько дней.
• Перечень направляемых образцов.

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА

Наиболее часто используемыми методами являются реакция гемадсорбции, реакция прямой иммунофлюоресценции и ПЦР.

Вирус АЧС выделяют с использованием первичной культуры клеток свиных макрофагов. В организме животного вирус инфицирует и реплицируется в лейкоцитах периферической крови, где вызывает развитие цитопатического эффекта в зараженных макрофагах. До наступления лизиса клеток вызванного вируса можно отметить феномен гемадсорбции. Микроскопические наблюдения показывают образование морул и розет из эритроцитов вокруг лейкоцитов.

Цитопатический эффект: цитопатический эффект можно наблюдать начиная с 12 после заражения клеток. Он выражается в группировании клеток, вауолизацией эндоплазматической сети и увеличением лизосомальных структур в клетке, приводящие в итоге к лизису клетки. Изменения в ядре клетки характеризуются конденсацией хроматина и появлением фибриллярных структур.

Гемадсорбция: Гемадсорбция представляет собой адсорбцию красных клеток крови вокруг инфицированных вирусом макрофагов. Не все штаммы вируса АЧС вызывают гемадсорбцию.

Некоторые штаммы АЧС являются не гемадсорбирующими. В этих случаях, должны быть проведены дополнительные исследования осадка клеток методами ПЦР и РПИФ, чтобы подтвердить наличие вируса.

Отсутствие гемадсорбции: Если цитопатический эффект в инфицированной культуре клеток проявляется без феномена гемадсорбции, это может быть связано с наличием негемадсорбирующего штамма АЧС, присутствием других вирусов (например при болезни Ауески) или даже от токсического эффекта от заражающего материала. В связи с этим, чтобы подтвердить наличие вируса АЧС, другие методы такие как ПЦР и РПИФ должны быть использованы.

Реакция гемадсобции является наиболее специфичным и чувствительным методом идентификации, поскольку ни один из вирусов поражающих свиней не вызывает развитие феномена гемадсорбции. Она является референтной методикой несмотря на трудности в постановке и продолжительности выполнения (5-10 дней). Обычно используется только в референтных лабораториях.

РПИФ рекомендуется использовать при отсутствии возможности проведения ПЦР. Данный метод лучше использовать совместно с другими серологическими тестами (ИФА и иммуноблотинг), что бы исключить ложноотрицательные результаты, вызванные блокировкой антителами.

РПИФ основана на обнаружении вирусных антигенов в срезах тканей или мазках-отпечатках при взаимодействии с флюоресцентным конъюгатом. Это очень быстрый, простой и чувствительный метод, который также может быть использован при исследовании зараженных культур клеток. Микроскопические наблюдения показывают интенсивную флюоресценцию цитоплазматических включений в инфицированных клетках. При активном развитии инфекции флюоресценция может иметь зернистый вид.

В регионах где АЧС является эндемичной, и подострая и хронические формы болезни являются предоминантными, чувствительность данного метода уменьшается и составляет всего 40% при исследовании срезов органов и мазков-отпечатков.

Уменьшение чувствительности: при подострой и хронической формах болезни связано с наличием высокого уровня специфических антител. Они в свою очередь блокируют вирусные антигены и предотвращают специфическое связывание антивирусного флюоресцентного конъюгата.

Совместное использование РПИФ и РИФ или ИФА позволяет обнаруживать от 85% до 95% от всех случаев болезни (даже при наличии антител) менее чем за 1 час 15 минут. Не существует коммерческих наборов для данного метода.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) наиболее часто используемая техника для обнаружения вируса. Она требует профессиональных навыков и достаточного опыта для постановки реакции, чтобы исключить контаминацию образцов и ложноположительные результаты. ПЦР является очень чувствительной и специфичной техникой обнаружения вируса , путем амплификации вирусной ДНК из исследуемого образца. В настоящее время широко используется референтными лабораториям для диагностики и подтверждения АЧС. ПЦР используется при исследовании образцов тканей и сывороток от животных с клиническими признаками болезни. Вирус припомощи ПЦР удается обнаруживать в крови больных животных начиная со 2 дня после заражения и в течение нескольких недель.

Референтные лаборатории:
Dr J.M. Sánchez-Vizcaíno
Facultad de Veterinaria, Laboratorio de Vigilancia Sanitaria (VISAVET), HCV Planta sótano, Universidad Complutense
Avda. Puerta de Hierro s/n, 28040 Madrid
ESPAÑA
Tel: (34.91) 394.40.82 Fax: (34.91) 394.39.08
Email: jmvizcaino@visavet.ucm.es

Dr Chris Oura
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory
Ash Road, Pirbright, Woking, Surrey GU24 ONF
REINO UNIDO
Tel: (44.1483) 23.24.41 Fax: (44.1483) 23.24.48
Email: chris.oura@bbsrc.ac.uk

Dr Baratang Alison Lubisi
Onderstepoort Veterinary Institute, Agricultural Research Council
Private Bag X5, Onderstepoort 0110
SUDÁFRICA
Tel: (27.12) 529.92.33 Fax: (27.12) 529.94.18
Email: Lubisia@arc.agric.za

Данный метод основан на применение праймеров комплементарных консервативному участку генома АЧС и позволяет обнаруживать широкий диапозон известных изолятов вируса АЧС, включая как гемадсорбирующие так и не гемадсорбирующие штаммы.

ПЦР может быть использована для исследования образцов плохого качества и малопригодных для исследований другими методами. При помощи ПЦР результаты могут быть получены в течение 5-6 часов.

Существует два различных метода ПЦР-диагностики вируса АЧС. Для обоих из них необходимым является этап пробоподготовки и выделения ДНК перед непосредственным проведением ПЦР (смотри видео):

Стандартная ПЦР (смотри видео) (протокол): продукты реакции, полученные в результате амплификации вирусной ДНК, анализируются при помощи электрофореза в агарозном геле и УФ света.

ПЦР в режиме реального времени (смотри видео) (протокол): Для данного метода необходимо использование специального оборудования для детекции флюоресцентного сигнала. ПЦР в режиме реального времени имеет несколько преимуществ: анализ результатов в ходе реакции (реальном времени), возможность количественного определения вирусной ДНК, не требует постановки электрофореза.

Дальнейшее секвенирование ПЦР продуктов позволяет подтвердить положительные результаты реакции, и также определить генотип вируса при амплификации некотрых фрагментов генома вируса (ген p72, ген p54, центральный вариабельный регион -CVR).

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВИРУСА АЧС.

Ввиду отсутствия вакцин против АЧС, наличие специфических антител к вирусу показывает наличие болезни.

Специфические антитела: антитела к вирусу АЧС обнаруживаются с 7 дня после заражения, и циркулируют месяцы даже годы. Данный факт очень полезен при диагностике подострой и хронической форм инфекции, а также для контроля и ликвидации болезни.

Большое количество серологических методов диагностики АЧС было разработано в последние годы, включая методы позволяющие выполнять диагностику в полевых условиях. В настоящее время наиболее используемыми являются реакция непрямой флюоресценции (РИФ), непрямой вариант ИФА и иммуноблотинг (ИБ).

Серологические методы являются основой лабораторной диагностики АЧС и используются в программах контроля и ликвидации болезни, благодаря их высокой чувствительности и специфичности.

Данный метод является достаточно быстрым и обладает хорошей чувствительностью и специфичностью. Специфические к вирусу антитела находящиеся в сыворотке или экссудатах взаимодействуют с клетками инфицированными вирусом АЧС. В настоящее время практически не используется ввиду отсутствия коммерческих наборов для постановки реакции. Время постановки реакции занимает около 2 часов.

В случае положительного образца на клеточном монослое наблюдают флюоресценцию перинуклеарной области клеток, где расположен центр репликации вируса.

Этот метод используется для проведения широкомасштабного эпизоотического мониторинга и исследований при программах контроля болезни. Метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, простотой и быстротой выполнения и экономичностью. Хорошей воспроизводимостью результатов и легкостью интерпретации.

Недавно разработаны новые варианты ИФА, содержащие неинфекционные реагенты на основе рекомбинантных белков вируса p32, p54 и pp62. Они имеют большую чувствительность и специфичность при исследовании сывороток плохого качества.

Разработаны два варианта ИФА для обнаружения специфических к вирусу АЧС антител:

-Hепрямой вариант ИФА-OIE: данный метод разработан в лаборатории CISA-INIA и является официальным методом диагностики одобренным OIE: (смотри видео) (протокол)

Настоящий метод ИФА основан на применение растворимого вирусного антигена содержащего большинство вирусных белков.

Рекомбинантные белки: Белки p32 и p54 являются высокоиммуногенными структурными белками вируса; полипротеин pp62 эксперссируется позднее и продуцирует два структурных белка p35 and p15. Перечисленные белки были получены методами генной инженерии путем клонирования кодирующих их генов в бакуловирусной системе.

- Коммерческие наборы ИФА (INGENASA): (смотри видео) (протокол)

Это конкурентный вариант ИФА для обнаружения антител к белку vp73 вируса АЧС ( структурного компонента с высокой антигенной силой).

В данном ИФА наборе, на плашках иммобилизован белок vp73. После добавления исследуемой сыворотки, добавляются моноклональные анти-vp73 антитела, меченые пероксидазой. Моноклональные анти-vp73 антитела сорбируются на свободной от специфических антител поверхности плашки. Интерпретация результатов реакция прямо противоположна предыдущему варианту ИФА. Более интенсивная окраска лунки свидетельствует о меньшем количестве антител в сыворотке и наоборот.

Является иммунофрементным методом основанном на применении нитроцеллюлозных фильтров, несущих предварительно сорбированные на них вирусные белки. Специфические к вирусу антитела взаимодействуют с иммобилизованными вирусными белками и получившийся комплекс выявляется при помощи меченого пероксидазой протеина А.

Вирусные белки: Белки используемые в ИБ для диагностики АЧС имеют молекулярную массу между 23.5 and 35 кДа, продуцируются клетками инфицированными вирусом. Именно эти белки первыми реагируют в ИБ на 7 день после заражения животного и обеспечивают постоянство антител у всех больных животных.

Иммуноблотинг позволяет определить реактивность антител против различных белков индуцируемых вирусом АЧС в сыворотках свиней. Таким образом, наряду с высокой чувствительностью и объективностью получаемых результатов, иммуноблотинг является идеальным методом для подтверждения африканской чумы свиней.

Этот метод выскочувствительный, легко выполним и не требует использования специального оборудования, но также не существует коммерческих наборов. Время постановки реакции занимает около 3 часов.

Другим преимуществом данного метода является возможность хранения стрипов, содержащих антиген, при комнатной температуре, без потери активности в течении более чем одного года, что означает безопасную возможность транспортировки реагентов.