Питательные среды для культивирования бруцеллеза
Для выделения и поддержания культур бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон, печеночно-глюкозо-глицериновый бульон, картофельный агар, мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар, печеночно-глюкозо-глицериновый агар, сывороточно-декстрозный агар, эритрит-агар, агар Альбими и другие среды. При выделении бруцелл из загрязненного материала в среды добавляют генцианвиолет 1:100-250 тыс., малахитовый зеленый — 1:500 тыс., кристаллвиолет — 1:100 тыс.
Мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ). К 610 мл мясной воды добавляют 305 мл печеночного настоя, 10 г пептона, 5 г натрия хлорида. Кипятят 60 минут, водой доводят объем до первоначального. Фильтруют, разливают в пробирки (колбы), стерилизуют при 110°С 30 минут.
Печеночно-глюкозо-глицериновый агар. К 900 мл печеночного настоя добавляют 9 г пептона, 5 г натрия хлорида, 25 г агар-агара. Варят в автоклаве 60 минут при 100-110°С. Фильтруют, устанавливают рН 7-7,2. Добавляют 20 г глюкозы и 25 мл глицерина. Разливают в пробирки, стерилизуют при 110°С 30 минут.
Печеночно-глюкозо-глицериновый бульон готовят так же, как и предыдущую среду, но агар не добавляют.
Печеночно-сывороточный и печеночно-аминопептидный агар. К 1 л печеночного настоя добавляют 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара, 17 мл 10%-ного раствора натрия двууглекислого. Автоклавируют при 115°С 20 минут. Фильтруют, устанавливают рН 7-7,2. Добавляют 10 г глюкозы и 20 мл глицерина. Разливают по сосудам, стерилизуют при 110°С 20 минут. Перед использованием в расплавленную и охлажденную до 45°С среду вносят 10-20% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота или 10-15% аминопептида Среду разливают в пробирки или бактериологические чашки.
Полужидкий печеночно-сывороточный и печеночно-аминопептидный агар. К 500 мл мясной воды добавляют 500 мл печеночного настоя, 10 г пептона, 5 г натрия хлорида и 2 г агар-агара. Кипятят до расплавления агара. Устанавливают рН 7-7,2. Разливают по сосудам и стерилизуют при 115°С 30 минут. Перед использованием в подогретый до 45°С агар добавляют 10% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота или барана или аминопептида.
Сывороточно-декстрозный агар. К 835 мл дистиллированной воды добавляют 20 г агар-агара, 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 165 мл мясной воды. Кипятят до расплавления агара. Фильтруют, устанавливают рН 7,4. Разливают в колбы и стерилизуют 15 минут при 115°С. Перед использованием в расплавленный и охлажденный до 45°С агар вносят 10% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота или лошади, 1% декстрозы.
Картофельный агар. В 1 л дистиллированной воды 15 минут варят 500 г очищенного и мелко нарезанного картофеля. Отвар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят объем водой до 1 л. Добавляют 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 25 г агар-агара, кипятят до расплавления агара. Устанавливают рН 7,2. Агар оставляют для застывания; прозрачную верхнюю часть отрезают, расплавляют, фильтруют через ватный фильтр. Корректируют рН до 7,2. Добавляют 10 г глюкозы и 30 мл глицерина. Разливают по колбам или пробиркам. Стерилизуют при 115°С 20 минут. Готовая смесь должна иметь рН 6,8.
Среда Альбими. В 1 л дистиллированной воды растворяют 2 г пептона, 1 г декстрозы, 5 г натрия хлорида, 0,1 г натрия бисульфата. Добавляют 2 мл дрожжевого аутолизата. При изготовлении плотной среды добавляют 2-2,5% промытого агар-агара. Стерилизуют при 115°С 30 минут.
Заменитель среды Альбими. К 1 л дистиллированной воды добавляют 20 г пептона Дифко, 20 мл дрожжевой воды, 5 г натрия хлорида, 20 г промытого агар-агара или агара Дифко. Устанавливают рН 7,3, Нагревают до расплавления агара, фильтруют через ватный фильтр. В горячую среду добавляют 1 г глюкозы и 0,1 г натрия бисульфата. Корректируют рН до 7,2—7,3. Разливают в колбы или пробирки, стерилизуют 20 минут при 110°С.
Для приготовления дрожжевой воды в 1 л дистиллированной воды суспендируют 1 кг пекарских (хлебных) дрожжей, кипятят 5-10 минут, фильтруют через плотный фильтр. Хранят в темном месте под хлороформом не более 2 недель.
Селективные среды для выделения бруцелл из молока и других материалов (рецепты фирмы Oxoid). К расплавленным и охлажденным до 55-60°С агаровым средам (сывороточно-декстрозный или кровяной агары с 5% лошадиной сыворотки и 1% декстрозы) добавляют следующие антибиотики (из расчета на 1 л среды): полимиксин В — 500 ИЕ, бацитрацин – 25 000 ИЕ, циклогексимид — 100 мг, налидиксовая кислота — 5 мг, нистатин — 100 000 ИЕ и ванкомицин — 20 мг. Антибиотики суспендируют в 10 мл метанола. Вносят суспензию в среду и тщательно перемешивают.
Среда с красителями для дифференциации видов бруцелл. В предварительном опыте с использованием эталонных культур бруцелл разных видов определяют необходимую концентрацию красителей в среде, позволяющую дифференцировать виды.
В 20 мл этанола растирают 0,1 г тионина и отдельно — основного фуксина. Доводят объем красок до 100 мл дистиллированной водой. Полученные разведения красителей 1:10 000 добавляют в расплавленный и охлажденный до 45-60°С сывороточно-декстрозный агар, перемешивают и разливают в чашки Петри. Готовят суспензию из 48-часовой агаровой культуры исследуемого штамма бруцелл на 0,8%-ном растворе натрия хлорида концентрацией 10 10 бактериальных клеток в 1 мл. Одну каплю суспензии засевают штрихом на агар с красителем (отдельно с тионином и фуксином). Одновременно эту суспензию засевают на агар без красителя. Инкубируют до появления роста культуры на агаре без красителей. Учитывают результат по наличию роста на агаре с красителями.
Дифференциация S- и R-колоний бруцелл по Уайту-Вильсону. На подсушенный в течение 24 ч агар Альбими в чашке Петри засевают исследуемую культуру бруцелл и инкубируют при 37°С до появления колоний. Затем на колонии наливают водный раствор кристаллвиолета и выдерживают 15 с. Раствор краски сливают в чашку с дезинфицирующим раствором, а колонии рассматривают под лупой (или при малом увеличении микроскопа). Колонии S-формы светлого, а R-формы — фиолетового цвета.
Печеночный настой. К 1л водопроводной воды добавляют 500 г фарша из свежей печени крупного рогатого скота. Настаивают 3 ч при 25-30°С или 6-10 ч при 4°С. Кипятят, помешивая, 1-2 ч, доливают водой до первоначального объема. Осевший фарш удаляют. Настой фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в колбы и стерилизуют при 115°С 20 минут.
Мясная вода. К 1л водопроводной воды добавляют 500 г фарша из свежего мяса крупного рогатого скота. Настаивают при 4°С 15-18 ч. Фарш удаляют. Настой кипятят 30-40 минут, доливают водой до первоначального объема. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в колбы. Стерилизуют при 120°С 20 минут.
Качество питательных сред и условия культивирования для получения бруцелл в первой генерации имеют очень важное значение не только для количества результативных исследований, но и для выделения возбудителя болезни с наименьшими признаками диссоциации.
Стабильность последующих генераций также зависит от условий культивирования и состава питательных сред. Поэтому хотя изготовление питательных сред производится строго по рецептам, все же необходимо в диагностических лабораториях отрабатывать методику приготовления и контроля питательных сред. Требуется испытывать их качество на референтных штаммах бруцелл. Это особенно важно при использовании нестандартных ингредиентов среды.
В 5-м докладе Комитета экспертов по бруцеллезу ФАО/ВОЗ предлагается испытать основные питательные среды (в которые не добавляются ингибиторы) на рост клеток 2-го биотипа Br. abortus при незначительном их содержании (5 -10 клеток) о засеваемом материале.
Наиболее популярной средой, рекомендованной указанным Комитетом, является селективный сывороточно-декстрозный агар, на котором Br. abortus, Br. melitensis и Br. suis и их биотипы растут лучше, чем на других средах. Эта среда содержит 5% сыворотки крови и следующие антибиотики: бацитроцин, полимиксин В и циклогексимид. Кроме того, амфотериксин может заменить циклогексимид или может быть добавлен к нему.
Считается, что добавление красок может частично препятствовать росту биотипов основных видов бруцелл, но краски все же рекомендуются.
Ниже приводится методика изготовления питательных сред, использующихся в нашей стране.
Плотный печеночно-глюкозно-глицериновый агар (ППГГА). Эту среду применяют для исследования и культивирования Br. abortus, Br. melitensis и Br. suis.
Берут 400 г свежей говяжьей печени, освобождают ее от жора и пленок, измельчают на куски по 5—8 г, добавляют 0,5 л водопроводной воды и кипятят в течение 1 ч (при большом объеме мечет, загружают в кипящую воду). Затем фильтруют через нейлоновый или ватный фильтр.
Этот печеночный отвар разводят пополам водопроводной водой, добавляют 1% пептона, 0,5% химически чистого хлорида натрия, 2,5% агара и 17 мл на 1 л 10%-ного раствора гидрокарбоната натрия.
Затем среду автоклавируют при 115° С в течение 20 мин, отстаивают в автоклаве 3—4 ч до осаждения грубых частиц и фильтруют в горячем виде через ватный или нейлоновый фильтр, устанавливают pH 7—7,2. В этот печеночный агар добавляют 1 % виноградного сахара и 2—3% глицерина. Среду разливают в пробирки или посевные колбы и стерилизуют однократно при температуре 110° С в течение 20— 25 мин.
На этой свежей (до 3-суточной давности) среде без ингибиторов при первичном посеве хорошо растут бруцеллы из свежих или замороженных абортированных плодов и отдельных органов животных, убиваемых с диагностической целью, содержимого полостей, абсцессов. Длительные пересевы музейных штаммов не вызывают большой их изменчивости. Эту же среду применяют при бактериостатическом методе дифференциации бруцелл.
Полужидкий сывороточный агар. Данную среду готовят по следующей прописи. Берут печеночного отвара (см. выше) и мясного настоя по 25%, водопроводной воды — 50%, добавляют пептона 1%, хлорида натрия — 0,5%, агара — 0,15—0,2%, устанавливают pH 7—7,2. Смесь разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве при 115° С в течение 20—25 мин. Хранят среду при 0—4° С. Перед употреблением к среде добавляют 10% стерильной овечьей или бычьей сыворотки и разливают в пробирки,
Сывороточно-декстрозный агар. К 835 мл дистиллированной воды добавляют 15 г агара, 10 г пептона, 5 г химически чистого хлорида натрия и 165 мл мясной воды. После смешивания содержимое колбы обрабатывают текущим паром в течение 1 ч. Устанавливают pH 7,8. Затем среду автоклавируют в течение 30 мин при 127° С (0,2 М/Па) для осаждения фосфора. После автоклавирования среду фильтруют через бумажный фильтр, регулируют pH до 7,4, разливают смесь в мерную посуду, стерилизуют при 116 С в течение 15 мин. Перед употреблением среду расплавляют, остуживают до 50 С, после чего к ней добавляют нормальную лошадиную или бычью сыворотку и раствор декстрозы. Эту смесь предварительно фильтруют через фильтр Зейтца. Окончательная концентрация сыворотки в среде должна быть 5%, декстрозы— 1%.
Печеночный агар Хеддлесона. Вначале готовят печеночный отвар. К 500 г свежего фарша из говяжей печени (без жира и пленок) добавляют 500 мл воды, затем кипятят в течение 1 ч при помешивании, фильтруют через ватно-марлевый или нейлоновый фильтр и стерилизуют в автоклаве.
Для изготовления агаровой среды берут 500 мл воды, 10 г пептона, 5 г хлорида натрия, 20 г агара и автоклавируют в течение 30 мин, затем добавляют к среде 500 мл печеночного отвара, охлаждают до 60° С, устанавливают pH 7. К 1 л среды добавляют один яичный белок, автоклавируют в течение 30 мин при 120° С, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают pH 7, разливают и стерилизуют в автоклаве при 115° С в течение 30 мин.
Среда Первушина для выделения гемокультур. Мясо-пептонный бульон (МПБ), содержащий 1% глюкозы и 4% глицерина, разливают в колбы по 100 мл. Затем вводят в них по 0,5 г гигроскопической стерильной ваты. Стерилизуют и используют для посева крови.
Полужидкий агар (ПЖА) и МПБ с добавлением 1 % глюкозы и 2—3% глицерина без введения в колбы комков ваты могут быть использованы для выращивания бруцелл из крови животных и других материалов, пробы которых в стерильном состоянии.
Картофельный агар Корнеевой. Берут хорошо очищенный картофель в количестве 500 г, нарезают ломтиками, варят в 1 л водопроводной воды. Затем отвар фильтруют через слой гигроскопической ваты и доливают водой до 1 л. На 1 л фильтрата добавляют следующие ингредиенты: хлорида натрия — 5 г, пептона — 10 г, глицерина — 30 г, глюкозы—10 г, ангара — 20 г для пробирок и 30 г для колб. Смесь варят до расплавления агара, затем ее отстаивают в теплом месте. В остывшем агаре нижний слой с осадком срезают, а прозрачную часть агара режут кусочками и расплавляют. Расплавленный агар фильтруют через ватный фильтр, устанавливают pH 7. Стерилизуют при 115° С в течение 20—30 мин и устанавливают pH 6,8.
Среда Кроля. Указанную среду применяют при выделении культур бруцелл из молока. К печеночному агару Хеддлесона добавляют насыщенный раствор генцианвиолета в соотношении 1 : 100000. Выращивают первые 15 ч в обычных условиях, а затем при наличии в сосуде 10% СO2.
Среда Moore и др. Эту среду применяют для выделения культуры Br. canis из крови собак. В колбе вместимостью 100 мл готовят скошенный триптозный агар (коммерческий). Затем в эту же колбу вводят 15 мл бульона, приготовленного из мозга и мышцы сердца крупного рогатого скота. Затем берут по 2 мл крови в асептических условиях из яремной вены собак и тут же добавляют ее в среду, тщательно смешивают и инкубируют 3 нед, придав колбам наклонное положение, чтобы часть плотной среды была открыта.
Наиболее целесообразными являются посевы на плотные среды свежевзятого материала. На плотных средах растут изолированные колонии, что обеспечивает меньшую их диссоциацию по сравнению с жидкими средами. Отсев на плотную среду с жидких сред следует производить через 2—3-е сут. При выращивании культуры бруцелл на жидкой среде, в которой находились одновременно посторонние микроорганизмы, чаще обнаруживаются измененные варианты.
Из загрязненного посторонней микрофлорой материала, например, несвоевременно доставленные абортированные плоды (направленные в незамороженном и неохлажденном виде через сутки после выкидыша), куски плаценты, отдельные органы животных или плодов, моча, содержимое полостей трупов и др., лучше производить параллельно биопробу на морских свинках или белых мышах.
Посевы следует делать на ППГГА с содержанием в нем генцианвиолета или кристаллвиолета, которые в виде насыщенного, водного раствора вводят в среду в соотношении 1 : 200000.
При посевах крови в комбинированных условиях (косяк ППГГА + жидкая среда) СO2 может быть введен в колбу через резиновую нетолстую пробку, под давлением, через иглу со шлангом, соединенным с источником СO2.
Посевы на куриные эмбрионы и жировые (неоплодотворенные) яйца кур лучше производить только материалом, взятым в стерильных условиях.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии именно к разработке питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования возбудителя бруцеллеза.
Известна питательная среда мясопептонный агар для выращивания бруцеллезного микроба, основой которой является г/л: мясная вода 1000,0 мл, 10 г сухого пептона, 5 г химически чистого натрия хлористого и 25 г агар-агара, промытого водопроводной водой и хорошо отжатого, рН среды устанавливают 7,8. Затем среду варят до полного расплавления агара и разливают в необходимую посуду (по 1-2 л). В дальнейшем среду автоклавируют при 115°С в течение 20 минут, отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, предварительно смоченный теплой водой и вновь устанавливают рН 7,1-7,2. Среду разливают в необходимую посуду и стерилизуют при 115°С в течение 20 минут (Профилактика инфекционных болезней инфекции, общие для человека и животных. Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей. Методические указания МУ 3.1.7.1189-03. С. 53).
Недостатком данной среды является недостаточная эффективность, ввиду позднего роста возбудителя.
Наиболее близкой к заявляемому изобретению является питательная среда для культивирования бруцелл содержащая г/л: к 500,0 мл пептона Мартена, добавляют 500,0 мл мясной воды, и 5 г химически чистого хлористого натрия, 5,0 г натрия уксуснокислого и агар-агар 15,0-20,0. Смесь кипятят, устанавливают рН - 7,3±0,2, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют 20 мин при 120°С (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СП6. - 2008. - С. 65-66).
Недостатком данной среды является низкая питательная ценность для бруцеллезного микроба.
Целью изобретения является разработка рецептуры питательной среды плотной для культивирования возбудителя бруцеллеза, обеспечивающей достаточное количество колоний максимально в ранние сроки через 48 ч, а через 72 ч отмечается увеличение колоний.
Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что в качестве основного источника азотистого питания в предлагаемой среде используется мясная вода, пептон ферментативный и сыворотка крови лошади нормальная для культивирования микоплазм на питательных средах жидкая, для поддержания изотоничности среды и окислительно-восстановительного потенциала натрий хлористый, в качестве стимулирующих добавок - глюкоза, глицерин, натрия метабисульфит, а также агар микробиологический, при следующем соотношении ингредиентов г/л:
|
|
|
В качестве исходного сырья используют мясную воду, являющуюся основой для многих питательных сред, обычно для приготовления мясной воды служит говядина или конина. Конина отличается большим содержанием углеводов (гликоген). Из мяса молодых хорошо упитанных животных (телят) обычно получают мясную воду лучшего качества (питательные свойства, прозрачность). Азотистые вещества от 12,7 до 21,71%, жиры от 1,4 до 15,5%. Минеральные вещества мяса состоят из солей натрия, калия, кальция, фосфора и железа, общее количество их достигает 1%. Мясо свежее содержит также витамины, экстрактивные вещества в большем количестве чем в замороженном (Ю.А. Козлов. Питательные среды в медицинской микробиологии. Медгиз - 1950 г. С. 46-48).
Сыворотка крови лошади нормальная для культивирования микоплазм на питательных средах жидкая. Дата выпуска 27.05.2016. Серия Л-16-04. Срок годности 2 года. Производитель ООО БиолоТ. С-Петербург.
Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 партия 24. Производитель г. Барнаул. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке.
Глицерин ГОСТ 6259-75, партия 21/2015. Дата выпуска 04.2015. Срок годности 3 года. С внесением в питательную среду глицерина в концентрации 2% - улучшается ее ростовые свойства. Производитель Польша.
Натрия метабисульфит ГОСТ 11683-76 в средах переходит в гидросульфит натрия, при нагревании происходит термическое разложение с выделением двуокиси серы (SO2), что способствует нейтрализации продуктов жизнедеятельности культивируемых микроорганизмов.
Приготовление мясной воды двойной концентрации
Способ приготовления питательной основы для культивирования возбудителя бруцеллеза: 1 кг мясного фарша заливают 1 л дистиллированной воды и ставят на один сутки при температуре 6-8°С. Через сутки смесь фарша с водой кипятят в течение часа. Небольшие количества - до 5 литров можно кипятить на открытом огне, часто помешивая, чтобы не произошло пригорания частичек мяса. После кипячения мясную воду отжимают от фарша, доливают до первоначального объема дистиллированную воду, фильтруют и стерилизуют 30 минут при температуре 120°С. Хранят мясную воду двойной концентрации в стерильном виде.
Приготовление питательной среды плотной
Питательную среду на основе мясной воды двойной концентрации для культивирования возбудителя бруцеллеза готовят следующим способом: соединяют мясную воду - 1000,0; пептон ферментативный - 10,0; натрий хлористый - 5,0; агар микробиологический - 18,0. Среду кипятят до полого растворения ингредиентов, устанавливают рН 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси добавляют глюкозу - 10,0; глицерина - 20,0; натрий метабисульфит - 0, 3; тщательно перемешивают разливают по 330 мл питательной среды в градуированные флаконы объемом 450 мл, перекрывают ватно-марлевыми пробками и бумагой крафт, фиксируют резиновым кольцом, стерилизуют при 1 атм. в течение 20 мин. После стерилизации, охлаждают до 56°С, стерильно над факелом добавляют в каждый флакон по 40,0 мл сыворотки крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкой (т.е 120,0 мл на 880,0 мл среды), затем разливают на чашки Петри по 35-40 мл приготовленной питательной среды. Подсушенные чашки помещают в термостат на 48 ч при 37°С, проверяют на стерильность.
Сочетанное применение выше описанных ингредиентов, обеспечивает существенное усиление ростовых качеств при культивирования возбудителя бруцеллезного микроба в значительно ранние сроки на 2-3 сутки на пластинках питательного агара. Готовую питательную среду плотную используют для культивирования возбудителя бруцеллеза Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M.
Испытуемые культуры выращивают в бактериологических пробирках на поверхности скошенного агара рН 7,2±0,1 при температуре 37°С в течение 48 ч. Из двухсуточных культур тест-штаммов бруцелл смывают с поверхности скошенного агара 0,9% раствором натрия хлорида, доводят концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-85 ФГБУ НЦЭСМП МЗ России, эквивалентную 1,7×10 9 бруцелл 1 мл. Полученную микробную взвесь культуры разводят сначала до концентрации 1×10 -9 м.к./мл затем серийными десятикратными разведениями до 1×10 6 и 1×10 7 м.к./мл. В процессе разведения перенос взвеси в следующую пробирку производят стерильной пипеткой объемом 1 мл, меняя пипетку для каждого разведения. По 0,1 мл каждой культуры: Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M из разведений 10 -6 (100 м.к.) и 10 -7 (10 м.к.) высевают на 3 чашки Петри с испытуемыми средами и равномерно распределяют покачиванием по всей поверхности. Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С.
Оценку ростовых свойств питательной среды плотной для культивирования возбудителя бруцеллеза Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M проводят путем подсчета количества выросших колоний бруцелл посуточно на пластинках агара с плотной питательной средой через каждые 24-48-72-120 ч. В качестве контроля использовали бруцеллагар.
Пример 1. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования возбудителя бруцеллезного микроба Brucella abortus 544, Brucella abortus 19B A, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M содержащей, г/л: мясную воду - 800,0 мл; пептон сухой ферментативный - 8,0; сыворотку крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую - 90,0; натрий хлористый - 4,0; глюкозу - 5,0; глицерин - 15,0; натрия метабисульфит - 0, 1; агар микробиологический - 14,0.
При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде колонии Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M начинали формироваться через 52 ч, отмечался интенсивный рост колоний через 72 ч (на 3 сутки) при посеве 0,1 мл из 10 -6 разведения вырастает 132; 36; 51; 99 колоний диаметром 1,5 мм соответственно, из 10 -7 разведения вырастает 12; 8; 3; 11 колонии соответственно типичных по морфологии бруцеллезному микробу, а на бруцеллагаре начинали формироваться колонии через 48 ч, отмечался интенсивный рост колоний через 72 ч (на 3 сутки) при посеве 0,1 мл из 10 -6 и 10 -7 разведений вырастало 151; 37; 68; 98 и 23; 8; 6; 15 колоний соответственно диаметром 1,5 мм. Контрольная среда бруцеллагар - питательная среда темно- коричневого цвета в микроскоп не просматривается морфология колоний.
Пример 2. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования возбудителя бруцеллезного микроба Brucella abortus 544, Brucella abortus 19B A. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M содержащей, г/л: мясную воду - 1000,0; пептон сухой ферментативный - 10,0; сыворотку крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую - 120,0; натрий хлористый - 5,0; глюкозу - 10,0; глицерин - 20,0; натрия метабисульфит - 0, 3; агар микробиологический - 18,0.
При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде колонии Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M начинали формироваться через 48 ч отмечался интенсивный рост колоний через 72 ч (на 3 сутки) при посеве 0,1 мл из 10 -6 разведения вырастает 184; 50; 86; 134 колоний диаметром 1,5 мм соответственно, из 10 -7 разведения вырастает 22; 12; 4; 18 колонии соответственно типичных по морфологии бруцеллезному микробу, а на бруцеллагаре начинали формироваться колонии через 48 ч, отмечался интенсивный рост колоний через 72 ч (на 3 сутки) при посеве 0,1 мл из 10 -6 и 10 -7 разведений вырастало 151; 37; 68; 98 и 23; 8; 6; 15 колоний соответственно диаметром 1,5 мм. Контрольная среда бруцеллагар - питательная среда темно- коричневого цвета в микроскоп не просматривается морфология колоний.
Пример 3. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования возбудителя бруцеллезного микроба Brucella abortus 544, Brucella abortus 19B A. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M содержащей, г/л: мясную воду - 1200,0; пептон сухой ферментативный - 12,0; сыворотку крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую - 150,0; натрий хлористый - 6,0; глюкозу -
При таком соотношении ингредиентов колонии Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M на испытуемой среде начинали формироваться через 67 ч, через 76 ч (на 3 сутки - 4 сутки) отмечался интенсивный рост колоний, при посеве 0,1 мл из разведения 10 -6 вырастало 102; 25; 39; 72 колоний указанных штаммов, соответственно, диаметром 1,5 мм. Из разведения 10 -7 вырастало 8; 7; 4; 8 типичных по морфологии колоний вышеуказанных штаммов, соответственно, а на бруцеллагаре начинали формироваться колонии через 48 ч, через 72 ч (на 3 сутки) отмечался интенсивный рост колоний, при посеве по 0,1 мл из разведений 10 -6 и 10 -7 вырастало 151; 37; 68; 98 и 23; 8; 6; 15 колоний указанных штаммов, соответственно, диаметром 1,5 мм. Контрольная среда бруцеллагар - питательная среда темно-коричневого цвета, морфология колоний в микроскоп не просматривается.
Таким образом, заявленная питательная среда плотная для культивирования возбудителя бруцеллеза (пример №2) является оптимальной по количеству подобранных ингредиентов, что позволяет получить достаточное количество колоний в максимально ранние сроки -через 48 ч, а через 72 ч отмечается увеличение колоний до 1,5 мм в диаметре.
Номер патента: 1806186
Текст
)5 С 12 й 1/ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ПАТЕНТУ следовательски ина и Г.А.Бело- исследовательвания в вете гропромизд Я ДИАГН ристый, хедицинска. ский ветеринарный институт(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА Изобретение относится к ветеринарной и медицинской микробиологии и может быть использовано для бактериологической диагностики бруцеллеза человека и животных,Целью изобретения является улучшение ростовых свойств питательной среды для бруцелл, удешевление состава среды и расширение сырьевой базы для приготовления основы питательной среды.Это достигается путем применения в качестве основы питательной среды ферментативного гидролизата из плацентарноэмбрионально-маточных тканей (отходов производства. мясокомбинатов) от убойного крупного рогатого скота и свиней или смеси гидролизатов этих тканей, которые составляют в общем объеме убойного скота мясокомбинатов от 80 до 90. В питательную среду для выращивания бруцелл в качестве(57) Использование: ветеринарная и медицинская микробиология, бактериологическая диагностика бруцеллеза. Сущность изобретения заключается в том, что в питательную среду в качестве белковой основы (источника аминного, общего азота) вводится ферментативный гидролизат из отходов производства мясокомбината - плацентарно-эмбрионально-маточных тканей от коров и свиней как в отдельности, так и в виде их смеси при следующем соотношении ингредиентов, мас, : гидролиэат плацентарноэмбрионально-маточных тканей (с сухим остатком 9 - 10) 1,2-1,6; натрий хлористый 0,4-0,6; глюкоза медицинская 0,9-1,1; глицерин 2,75-3,25, агар-агар 1,75-2,25; вода дистиллированная остальное. 4 табл. ковой основы вводится ГПЭМ - гидролиэат из плацентарно-эмбрионально-м ных тканей стельных коров и свине отдельностиили вместе взятых в ра объеме) при следующем оптимальном ношении ингредиентов, мас. ф;Гидролизат плацен- тарно-эмбриональноматочный (сухой остаток9 - 10) 1,4Натрий хло ч 0,5Гюкоза м . я 1,0Глицерин 3,0Агар-агар 2,0Вода дистиллированная Остальное Среду кипятят 5 - 10 мин, фильтруют, разливают в пробирки, колбы, стерилизуют, рН готовой среды составляет 7,2 - 7,3.Предлагаемый гидролизат, являясь продуктом глубокого расщепления белков, содержит широкий спектр аминокислот, играющих важную роль в метаболизме бруцелл,являющихся.аминогетеротрофными микроорганизмами, Кроме. того, указанный гидролиэат является источником стимулятора 5роста бактерий за счет содержания в своемсоставе биологически активных веществплацентарной ткани.П р и м е р 1, Гидролизат плацентарноэмбрионально-маточный готовят следующим образом: ткани плаценты, матки,мягких тканей эмбриона, полученные намясокомбинате после убоя животных (непозднее 2 - 3 часов) подвергают фермента тивному гидролизу, к 1 кг измельченной на 15мясорубке ткани добавляют 1,5 л кипящейводы, перемешивают, подщелачивают 20 ф раствором щелочи (едкий натр) до рН 8,0,подогревают до 70 С, В отстуженную до 40 -45 С смесь добавляют 150 г фарша поджелудочной железы или 20 г панкреатина сактивностью 45 ЕД, добавляют 22,5 мл хлороформа, емкость герметично закрывают иведут гидролиз при периодическом перемешивании 4 - 5 суток при Т=43 С, поддерживая рН смеси на уровне 7,4-7,6, Поокончании гидролиза гидролизат переливают в емкость из нержавеющей стали, кипятят 15 мин, при рН 5,0, отстаивают,фильтруют, стерилизуют, подвергают лиофильному высушиванию. В гидролизате определяют общий и аминный азот, уровеньпептидов,Готовый продукт должен соответствовать биохимическим показателям, отраженным в табл. 1, из которой видно, чтогидролизаты из плацентарно-эмбрионально-маточных тканей коров и свиней малоотличаются друг от друга, а по величинамобщего и аминного азота превосходят прототип - гидролизат кильки.П р и м е р 2. Для изучения ростовыхсвойств питательной среды для бруцелл наоснове гидролизата плацентарно-эмбрионально-маточного проводились опыты по 45титрации компонентов питательной среды взависимости от роста микроорганизмов -известных вирулентных тест-штаммов бруцелл (3 вида рода бруцелл, 7 биотипов), пол-ученных из ГИСК им. Тарасевича, типичных 50по морфологическим, культурально-биохимическим и серологическим свойствам: бруцелла абортус 544; бруцелла суис 1330;бруцелла мелитензис 25; (референтныештаммы) и бруцелла абортус штаммы 271- 552803; 276-720; 275-138; 280 - 381-К(полевые штаммы).Для приготовления микробных взвесейсуточные культуры тест-штаммов смывали0,9 раствором хлористого натрия, доводили взвесь до содержания 1 млрд/мл микробных клеток по оптическому стандарту мутности, затем серийными десятикратными разведениями довотдили до содержания 1 тыс, (10 ) и 100 (1 0 ) микробных клеток в 1 мл взвеси. Иэ разведения 10 и 10 взвеси каждого штамма культуры бруцелл высевали по 0,1 мл на чашки Петри с предлагаемой и известными средами. Учет результатов проводили через 72-96-144 часов инкубации посевов при 37 С.Результаты указанных исследований при разном соотношении компонентов питательной среды на основе ГПЭМ представлены в табл, 2, из которой следует, что при испытании 7 известных вирулентных штаммов бруцелл установлены граничные концентрации компонентов по составу предложенной среды. При этом по наибольшему количеству выросших колоний эа оптимальную концентрацию компонентов состава питательной среды авторами принято, мас.:Гйдролизат плацен- тарно-эмбриональноматочный (сухой остаток9 - 10;4) 1,4Натрий хлористый, х,ч, 0,5Глюкоза медицинская 1,0Глицерин 3,0Агар-агар 2,0Вода дистиллированная Остальное Граничные с ним минимальные концентрации составляют, мас. :Гидролизат плацен- тарно-эмбриональноматочный (сухой остаток9 - 10 ф,) 1,2Натрий хлористый, х.ч, 0,4Глюкоза медицинская 0,9, Глицерин 2,75Агар-агар 1,75Вода дистиллированная Остальное Граничные с ним максимальные концентрации составляют, мас, ф :Гидролизат плацен- тарно-эмбриональноматочный (сухой остаток9-10 о ) 1,6Натрий хлористый, х.ч. 0,6Глюкоза медицинская 1,1Глицерин 3,25Агар-агар 2,25Вода дистиллированная Остальное Предложенная питательная среда на основе гидролиэата плацентарно-эмбрионально-маточного по оптимальных концентрациях компонентов по своим ростовым свойствам не уступает составам питательных сред по прототипу.1806186ющем: 1) на питательной среде по изобретению в сравнении с прототипом ускоряется на 1 - 2 суток рост культур бруцелл; 2) повышается диагностическая эффективность по5 количеству выделенных колоний возбудителя бруцеллеза из патологического материала (на 7,0 - 10,7;); 3) расширяется сырьевая база непищевого белка для изготовления питательной основы сред с ис 10 пользованием отходов производствамясокомбинатов, годовой объем которых только на одном мясокомбинате (г, Казань) составляет 50 - 60 тонн; 4) в значительно меньшей стоимости сырья - плацентар 15 но-эмбрионально-маточного материала(в 3-7-9 раз) в сравнении с общепринятыми в микробиологической практике источниками белка (рыба - печень - мясо) и экономии дефицитных пищевых мясоры 20 бопродуктов,Все сказанное обусловливает возможность промышленного изготовления для нужд бактериологических лабораторий основы питательной среды для выделения25 бруцелл в лиофилизированном состоянии,Формула изобретения Питательная среда для диагностики30 бруцеллеза, содержащая питательную основу. агар-агар, натрий хлористый, глюкозу, глицерин и дистиллированную воду, о тл и ч а ю щ а я с я тем, что, с целью ускорения диагностики за счет повышения 35 ростовых свойств среды, в качестве пита. тельной основы она содержит ферментативный гидролизат плацентарно-эмбрионально-маточных тканей коров и/или свиней при следующем соотношении компо 40 нентов, мас, )ь:Гидролизат плацен- тарно-эмбриональноматочных тканей корови/или свиней 1,2-1,6 45 Натрий хлористый 0,4 - 0,6Глюкоза 0,9-1,1 Глицерин 2,75-3,25 Агар-агар 1,75 - 2,25 Вода дистиллированная Остальное1806186 Таблица 1 блицКоиовити итателььй среди иас.о ество колоний, еыросаих прм всавв 100 микробна пф пис оГлоко" зв Лиар"агар рй ре таиь бруцем вив целл дистиллиф"веммел 76.720 275-138280.881 К 4 128 Бруцеллсуис,1330 руцелборту44 бруцелламелттеизис,вт 25Ч1,81,2 5623 6 ьо 1,5 2,52 75 ь и1111 1,7530 2,0325 2253,5 25 71 сб 7627 51 тЗ 0,5 69 65+ 58+ 6 36 и 1,8 о+ итль 70 6724 65+5 25 6 пмтательиав среда по про у-агар Д юпвптомо глекпитательна рмиоаий аг зоРеда чвио 9-6 И.О. 592 О 2 вблица ктаристика капо Зест - етемии бруцепл еиросаих коолий еве 100 и,клеток Рост крлоиий езиер,колоний,ии, на е сутки разийхвиия Нзксииальнйсутки Ко лр б в г а б веовраитею атвиии вбортус 6925 БЫ 2-3 23 2"Э 2.3 2 8 Фора 8"Фариа 8"Фо-3 2и левке отани Бруцепла абортус,271-2808 Бр)вема вбортус, 276720 2-3 23 23 2-Э11 1161 2 3изата кильки 0 ь - агар Д ико ивчеии мальм-мвточех тканей коров из плзцентари" нове гидролиза в)ф свиней (Г 18 агариа основе спеси гидролизатов Гпзн коров и свиней (111) 1 1, Брук5442 бруц1 ЭЗ3 Боузис зат пле.цемтармЬвибриониат.(суест.9 188)от воров 566 624 59 Ь 707 7126 70 5 49.4 5623 53(4 6215 6767 6836 5924 6704.7327 646 5 о 23 5425 6224 6024 5323 6127 6534, 71 6 6723 6336% выделения Эффективность предложенной сеы,Выделенокультур Бр.абортус Кол-во исследуемыхживотных Патоматериал от исследуемых животныхМатериал от крупного рогатогоскота, экспериментально зара-.женных бруцеллезом- на питательной среде по изобретению- на питательной среде по прототипуМатериал от крупного рогатогоскота из неблагополучного по бруцеллезу хозяйству- на питательной среде по изобретению- на питательной среде по прототип 52,7 158 10,7 300 42,0 300 126 29,0 100 29 7,0 100 22 Составитель Н, МамлеваТехред М,Моргентал Корректор М. Керецман Редактор Производственно-иэдательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 965 Тираж Подписное ВНИЙПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5
Заявка
ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ
МАМЛЕЕВА НАЗИБА КАСИМОВНА, ТОРБИНА МАРИЯ ПАВЛОВНА, БЕЛОЗЕРОВА ГАЛИНА АЛЕКСАНДРОВНА
Читайте также:
