Какие питательные среды используются для выращивания стрептококков

Изобретение предназначено для накопления биомассы стрептококков. Среда содержит компоненты в следующем соотношении, г на 1 л дистиллированной воды: лимонная кислота 4,9-5,0, фосфорнокислый калий двухзамещенный 4,9-5,0, хлористый натрий 1,9-2,0 сернокислый магний 4,9-5,0, сернокислое железо 0,04-0,05, аспарагин 0,9-1,0, гликокол 0,9-1,0 и глицерин 30,0-31,0 мл. Среда обеспечивает хороший и бурный рост стрептококков с первого дня инкубирования и позволяет при 4-5-кратном пассировании и плотности посева 90-100 млн. микробных клеток (м.к.) в 1 мл среды стабилизировать и обеспечить максимальное накопление биомассы до 10-12 млрд. м.к. в 1 мл культуральной жидкости.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к разработке питательной среды для выращивания стрептококков.

Известно использование бульона Хоттингера и питательной среды для выращивания энтерококков, содержащей панкреатический гидролизат серопротеина или альбумина, полученных из отходов глобулинового производства (Бошьян Е.Г с соавт. А.С. N 1412283 и N 1418284, 1986 г.).

Недостатком является сложность технологического процесса приготовления питательной среды, трудности в ее стандартизации.

За прототип взята среда N 2 Курской биофабрики, используемая в биологической промышленности для выращивания микобактерий туберкулеза и состоящая из следующих компонентов в граммах на 1 литр дистиллированной воды: лимонная кислота - 10,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный - 5,0; лимоннокислый аммоний - 5,0; хлористый натрий - 0,5; сернокислый магний - 0,5; сернокислое железо - 0,05; сернокислый цинк - 0,1; хлористый кобальт - 0,002; глицерин - 50; аспарагин - 1,0; гликокол - 1,0.

Среда представляет собой солевые питательные растворы, отличающиеся высокими питательными свойствами для микроорганизмов.

Попытки использовать для выращивания стрептококков данную синтетическую среду не имели положительного результата. Пересеянная с мясо-пептонного бульона (МПБ) на жидкую синтетическую среду культура стрептококков не обеспечивала надлежащий рост микроорганизмов. В отдельных пробирках, флаконах, колбах рост биомассы стрептококков составлял не более 1 - 2 млрд. микробных тел в 1 мл, что неэффективно.

Цель предлагаемого изобретения - разработка среды для выращивания стрептококков с большим содержанием микробных тел в 1 мл культуральной жидкости, пригодной для промышленного культивирования стрептококков при производстве стрептококковых антигенов и вакцинных препаратов.

Разработанная среда содержит компоненты в следующем соотношении на 1 литр дистиллированной воды: лимонная кислота - 4,9 - 5,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный - 4,9 - 5,0; хлористый натрий - 1,9 - 2,0; сернокислый магний - 4,9 - 5,0; сернокислое железо - 0,04 - 0,05; аспарагин - 0,9 - 1,0; гликокол - 0,9 - 1,0 и глицерин 30,0 - 31,0 мл.

Результаты исследований показали, что при увеличении содержания в питательной среде хлористого натрия с 0,5 до 1,5; 2,0; 2,5 г обеспечивалось последовательное накопление биомассы стрептококков соответственно 2 - 2,5; 3 - 3,5; 3,5 - 4,0; 3,5 - 4,0 млрд. микробных тел в 1 мл культуральной жидкости. Дальнейшее, начиная с 2 - 2,5 г/л, увеличение содержания в питательной среде хлористого натрия не сопровождалось увеличением биомассы стрептококков.

Лучшие результаты по накоплению биомассы стрептококков, до 8 - 9 млрд. микробных тел в 1 мл культуральной жидкости были получены на вариантах сред при уменьшении количества лимонной кислоты с 10 г до 5 г. Дальнейшее уменьшение количества лимонной кислоты в питательной среде до 4,8 - 4,5 г/л не сопровождалось увеличением биомассы стрептококков.

Увеличение содержания в питательной среде сернокислого магния с 0,5 г до 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 5,5 г/л обеспечивало последовательное накопление биомассы стрептококков 4 - 4,5; 5 - 6; 6 - 7; 7,5 - 8; 8,5 - 9; 8,5 - 9 млрд. микробных тел в 1 мл культуральной жидкости. Дальнейшее, начиная с 5 - 5,5 г/л, увеличение содержания в питательной среде сернокислого магния не сопровождалось увеличением биомассы стрептококков.

Снижение в питательной среде глицерина с 50 до 30 мл не влияло ни на увеличение, ни на снижение интенсивности роста и накопления биомассы стрептококков. В то же время дальнейшее уменьшение содержания в питательной среде глицерина, начиная с 30 до 25 мл, сопровождалось снижением накопления биомассы стрептококков. Таким образом установлено, что оптимальное количество содержания глицерина в питательной среде определено в пределах 30 - 31 мл.

Следует отметить, что в ходе поисковых опытов нами не отмечено влияние на рост стрептококков хлористого кобальта, лимоннокислого аммония и сернокислого цинка, в связи с чем они были исключены из компонентов нового варианта среды.

Таким образом, использование данного варианта жидкой солевой синтетической питательной среды обеспечивало хороший и бурный рост стрептококков с первого дня инкубирования и позволяло при 4-5-кратном пассировании на ней микробов, при плотности посева до 90 - 100 млрд. микробных тел на 1 мл среды, стабилизировать и обеспечить максимальное накопление биомассы до 10 - 12 млрд. микробных тел в 1 мл культуральной жидкости.

По данным Панина А. Н. (Автореф. дис. д.в.н., Стрептококкозы свиней, 1992, 27 с. ), для приготовления вакцинного препарата накопление биомассы стрептококков не должно быть менее 4 млрд./см 3 . Следовательно, данный вариант солевой синтетической питательной среды вполне пригоден для использования в биологической промышленности при производстве стрептококковых антигенов.

Среду готовят путем последовательного растворения или предварительно смешанных компонентов в дистиллированной воде с последующей нейтрализацией аммиаком до pH 7,0 - 7,1 перед автоклавированием.

Среда для выращивания стрептококков, содержащая лимонную кислоту, фосфорнокислый калий двузамещенный, хлористый натрий, сернокислый магний, сернокислое железо, аспарагин, гликокол и глицерин, отличающаяся тем, что среда содержит компоненты в следующем соотношении, г на 1 л дистиллированной воды: Лимонная кислота - 4,9 - 5,0 Фосфорнокислый калий двузамещенный - 4,9 - 5,0 Хлористый натрий - 1,9 - 2,0 Сернокислый магний - 4,9 - 5,0 Сернокислое железо - 0,04 - 0,05 Аспарагин - 0,9 - 1,0 Гликокол - 0,9 - 1,0 Глицерин - 30,0 - 31,0 мл

Владельцы патента RU 2323969:

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, наиболее эффективно может быть использовано для диагностики стрептококков. Питательная среда содержит панкреатический гидролизат казеина, пептон ферментативный, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, экстракт хлебных дрожжей, лактозу, бромкрезоловый пурпуровый, глюкозу, L-цистин, сульфит натрия, цитрат натрия, азид натрия, кристаллический фиолетовый, агар микробиологический, дистиллированную воду. Изобретение позволяет повысить ростовые свойства питательной среды, придать питательной среде дифференцирующие свойства, снизить стоимость препарата. 1 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано для диагностики стрептококковых инфекций.

Постановка достоверного этиологического диагноза стрептококковых глоточных и кожных инфекций во всех случаях, кроме скарлатины, требует проведения микробиологических исследований, предусматривающих выделение и видовую идентификацию стрептококков.

За рубежом разработаны питательные среды для выделения стрептококков, в которых в качестве селективного агента используется азид натрия [8, 13, 14]. Но не каждая практическая лаборатория в состоянии купить их в силу высоких цен, отсутствие же коммерческого выпуска ограничивает их применение для расшифровки стрептококкозов.

По своей направленности и совокупности признаков наиболее близкой к заявляемому изобретению является Streptosel agar, содержащий в качестве источников азотистого питания панкреатический гидролизат казеина, папаиновый гидролизат соевой муки, источника углеводного питания - глюкозу, в качестве ингибиторов грамположительной и грамотрицательной микрофлоры - азид натрия, цитрат натрия, сульфит натрия, кристаллический фиолетовый, а также L-цистин, хлорид натрия, агар [13]. Недостатками данной среды, принятой за прототип, являются следующие: Streptosel agar является зарубежной средой, дорог и недоступен для многих лабораторий страны; во-вторых, Методическими рекомендациями по микробиологической диагностике стрептококковых инфекций выделена (п.7) необходимость дифференциации гемолитических и зеленящих стрептококков с энтерококками [10]. Причиной, препятствующей достижению вышеуказанного технического результата при использовании этой среды, принятой нами за прототип, является то, что она не обладает дифференцирующими свойствами и предполагает дальнейшую идентификацию выделенных культур стрептококков по дополнительным тестам. Последнее удлиняет сроки постановки диагноза.

Задача предлагаемого изобретения - повышение ростовых и придание дифференцирующих свойств среде.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в качестве стимуляторов роста стрептококков она дополнительно содержит пептон ферментативный, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, экстракт хлебных дрожжей [9, 11, 12]. Для придания дифференцирующих свойств в состав препарата дополнительно введена индикаторная система, состоящая из лактозы и красителя бромкрезолового пурпурового. Среда содержит также панкреатический гидролизат казеина (триптон) [9], глюкозу, цитрат натрия, сульфит натрия, L-цистин, азид натрия, кристаллический фиолетовый, агар при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:

панкреатический гидролизат казеина	29,0-31,0
пептон ферментативный	19,0-21,0
глюкоза	2,4-2,6
лактоза	9,0-10,1
экстракт хлебных дрожжей	4,9-5,2
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов	9,0-10,1
цитрат натрия	0,9-1,1
L-цистин	0,19-0,21
сульфит натрия	0,19-0,21
азид натрия	0,19-0,21
кристаллический фиолетовый	0,0019-0,0022
бромкрезоловый пурпуровый	0,15-0,17
агар микробиологический	11,0-12,5

Предлагаемая пропись отличается от прописи прототипа по следующим принципам.

1. Введена индикаторная система, включающая лактозу и индикатор бромкрезоловый пурпуровый. Методические рекомендации предлагают расширенную схему дифференциации гемолитических и зеленящих стрептококков с энтерококками, занимающую 3 и более дней и необходимость наличия нескольких питательных сред и тест-систем для последующей видовой идентификации стрептококков. Предлагаемая среда для выделения стрептококков (Стрептококк-азид-агар) благодаря введенному в состав углеводу и красителю обеспечивает четкие дифференцирующие свойства и в результате этого позволяет идентифицировать по крайней мере 3 вида стрептококков. На малинового цвета агаровой пластинке сконструированной среды наблюдается уже через 18-36 часов инкубации рост серых блестящих полупрозрачных колоний пиогенного стрептококка. Колонии зеленящего стрептококка - голубые, с влажным блеском; колонии фекального стрептококка - крупные, плотные, серо-желтого цвета. Таким образом среда для выделения стрептококков сокращает сроки выделения чистой культуры и определение ее видовой принадлежности, что ускоряет постановку диагноза.

2. В составе препарата сбалансированная питательная базовая основа среды, состоящая из комбинации панкреатического гидролизата казеина, пептона ферментативного и обогащенная стимуляторами роста (стимулятор роста гемофильных микроорганизмов и экстракт хлебных дрожжей).

В отличие от "классических" питательных сред для выделения стрептококков, требующих введения крови или сыворотки [1], питательная базовая основа способствует оптимальному росту стрептококков, увеличивая размеры колоний, улучшая морфологию и, следовательно, дифференцирующие свойства, без добавления биологических жидкостей. Все составные части рецептуры - гостированные ингредиенты отечественного производства.

Среду получают следующим образом.

Пример 1. В 1 л дистиллированной воды вносят 29,0 г панкреатического гидролизата казеина, 19,0 г пептона ферментативного, 2,4 г глюкозы, 9,0 г лактозы, 4,9 г экстракта хлебных дрожжей, 9,0 г стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, 0,9 г цитрата натрия, 0,19 г L-цистина, 0,19 г сульфита натрия, 0,19 г азида натрия, 0,0019 г кристаллического фиолетового, 11,0 г агара микробиологического, 0,15 г бромкрезолового пурпурового. Тщательно перемешивают, полученную суспензию доводят до кипения и кипятят до полного расплавления агара. рН среды 7,4±0,2. Среду охлаждают до температуры 45-50°С и разливают в стерильные чашки Петри слоем 4,0-5,0 мм, оставляют до застывания. Перед посевом чашки со средой подсушивают в термостате в течение 40-60 минут при температуре 37°С. Отбор клинических проб, подготовку их к исследованию и посеву на среду проводят в соответствии с рекомендациями, изложенными в "Микробиологической диагностике стрептококковых инфекций" (М., 1996). Инкубацию проводят в "свечном" сосуде в атмосфере, содержащей углекислый газ. Результат учитывают через 24-48 часов инкубации.

Пример 2. В 1 л дистиллированной воды вносят 30,0 г панкреатического гидролизата казеина, 20,0 г пептона ферментативного, 2,5 г глюкозы, 10,0 г лактозы, 5,0 г экстракта хлебных дрожжей, 10,0 г стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, 0,2 г L-цистина, 1,0 г цитрата натрия, 0,2 г сульфита натрия, 0,2 г азида натрия, 0,002 г кристаллического фиолетового, 0,16 г бромкрезолового пурпурового, 11,75 г агара микробиологического. Далее согласно примеру 1.

Пример 3. В 1 л дистиллированной воды вносят 31,0 г панкреатического гидролизата казеина, 21,0 г пептона ферментативного, 2,6 г глюкозы, 10,1 г лактозы, 5,2 г экстракта хлебных дрожжей, 10,1 стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, 0,21 г L-цистина, 1,1 г цитрата натрия, 0,21 г сульфита натрия, 0,21 г азида натрия, 0,0022 г кристаллического фиолетового, 0,17 г бромкрезолового пурпурового, 12,5 г агара микробиологического. Далее согласно примеру 1.

Биологические показатели среды для выделения стрептококков (Стрептококк-азид-агар) и прототипа представлены в таблице.

Из таблицы видно, что предлагаемая среда имеет преимущество по сравнению с прототипной средой. На предлагаемой среде колонии стрептококков более крупные, что немаловажно для визуальной видовой индикации колоний стрептококков, имеющих на нашей среде разную окраску. На прототипной среде колонии стрептококков мельче, белые, дифференциация отсутствует.

Таблица
Культуры	Предлагаемая среда (Стрептококк-азид-агар)	Среда-прототип (Streptosel-agar)
морфология колоний	дифференциация	морфология колоний	дифференциация
S.pyogenes	блестящие, полупрозрачные, диаметр - 2,5-3 мм	колонии серого цвета	полупрозрачные, блестящие, диаметр - 1-1,5 мм	колонии белого цвета
S.viridans	слизистые, непрозрачные, диаметр- 2-2,5 мм	колонии голубого цвета	полупрозрачные, диаметр - 1,5-2 мм	колонии белого цвета
S.faecalis	крупные, плотные, диаметр - 3-5 мм	колонии серо-желтого цвета	плотные, диаметр - 2,5 мм	колонии белого цвета

1. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М.: Медицина, 1982, с.255-256.

2. Брико Н.И. Болезни, вызываемые стрептококками группы А в начале 21 века: проблемы и перспективы профилактики. Вестник АМН, 2001, №2.

3. Брико Н.И., Ещина А.С., Ряпис Л.А. Лабораторная диагностика стрептококковых инфекций. Пособие для врачей и научных работников. М.: Хризосом, 2000, с.26.

4. Зациорская С.Л. Оценка различных питательных сред при выделении стрептококков группы В из клинических материалов. Лабораторное дело, 1989, №3, с.15-17.

5. Игонина Ю.А., Шевчук М.С., Бочков И.А., Османов С.К. Подбор питательных сред для лабораторной диагностики стрептококков группы В. Журн. микробиол., эпидемиол. и инфекц. бол., 1983, №9, с.21-24.

6. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. М., 1980.

7. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней. Под ред. Матвеева К.И. и Соколова М.И., М., 1964, с.452.

8. Руководство по применению продукции фирмы Himedia в лабораторной практике. 2003, с.75.

9. Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней. Под ред. Жукова-Вережникова Н.Н., т.1, М., 1962, с.347-348, 354-355.

11. Телишевская Л.Я. Белковые гидролизаты. М., 2000, с.246-247.

12. Физико-химические методы контроля ингредиентов питательных сред и биопрепаратов. Под ред. Колесова С.Г. М., 1970, с.63-65.

13. Manual of BBL. Products and laboratory procedures. Sixth Edition. Cat. №5200, 1988, p.254.

14. Microbiology Manual Merck. Darmstadt, 1990, p.192.

Питательная среда для селективного выделения стрептококков, содержащая питательную основу, глюкозу, L-цистин, сульфит натрия, цитрат натрия, азид натрия, кристаллический фиолетовый, агар микробиологический, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что дополнительно в качестве источника азотистого питания она содержит пептон ферментативный, в качестве стимуляторов роста - стимулятор роста гемофильных микроорганизмов и экстракт хлебных дрожжей, а в качестве индикаторной системы - лактозу и бромкрезоловый пурпуровый при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:

Стрептококковые инфекции продолжают оставаться в числе наиболее острых проблем здравоохранения во всех странах мира. Бактерии рода Streptococcus классифицируют по антигенным свойствам (на основании имеющихся полисахаридов), выделяя серогруппы, изучают биохимические и гемолитические свойства. Наиболее патогенным для человека является Streptococcus pyogenes группы А, вызывающий у человека гнойно-воспалительные и инфекционно-аллергические заболевания. Диагностика стрептококковых инфекций включает использование бактериоскопического метода, определение стрептококковых антигенов в патологическом материале с помощью ИФА или латекс-агглютинации, бактериологического метода идентификации возбудителей инфекции и серологического метода по определению антител к стрептококкам группы А. В последнее время широко распространен метод ПЦР, позволяющий установить диагноз заболевания в 3 раза чаще по сравнению с классическими бактериологическими методами исследований [1, 2, 4]. Эти данные свидетельствуют о необходимости совершенствования микробиологической диагностики стрептококковых инфекций. Стрептококки колонизируют кожные покровы, слизистые оболочки, носоглотку, желудочно-кишечный тракт и влагалище [5]. Для возбудителей инфекции характерна множественность механизмов и факторов передачи, но наиболее характерен воздушно-капельный механизм передачи. У школьников в холодный сезон года носительство стрептококков в носоглотке достигает 25% [6].

В большинстве случаев возникновение стрептококковых инфекций связано с оказанием медицинской помощи (ИСМП). Причинами роста заболеваемости гнойно-воспалительными стрептококковыми инфекциями являются селекция и формирование госпитальных штаммов, обладающих высокой вирулентностью и множественной лекарственной устойчивостью, что требует совершенствования систем надзора и контроля за ИСМП [7].

Описан общепринятый способ получения чистой культуры стрептококков [6], который имеет следующие недостатки: изолированные колонии можно получить только на 3-й день микробиологического исследования, в процессе культивирования бактерий не удаляется посторонняя сопутствующая микрофлора слизистых оболочек зева и миндалин, на 2-й день пересева материала на кровяной мясопептонный агар (МПА) не всегда удается определить микробы, подозрительные на стрептококк, и поэтому приходится делать пересев на кровяной МПА бактерий, не относящихся к стрептококкам, что требует большего расхода питательных сред для выделения изолированной колонии стрептококков. Известно также, что гемолитические свойства стрептококков не являются диагностическим тестом для выявления патогенных стрептококков. Патогенные стрептококки под влиянием антибиотиков и факторов внешней среды могут утратить гемолитическую активность, что существенно затрудняет выделение стрептококков из исследуемого материала.

А.С. Лабинская [3] предложила способ получения изолированных колоний стрептококков по результатам выделения возбудителя со слизистых оболочек носоглотки при посеве на чашки Петри с 3% кровяным МПА с последующим изучением культуральных свойств и морфологических признаков стрептококков. Исследуемый материал вносили на чашки Петри с 3% кровяным МПА методом отпечатков, а затем шпателем распределяли микробные клетки по всей поверхности питательной среды. Через 18-20 часов роста в условиях термостата при температуре 37°С учитывали рост колоний. Идентифицировали штаммы стрептококков серологической группы А, образующие колонии трех видов: мукоидные, шероховатые и гладкие. Предложенный способ не обеспечивает 100% выделение стрептококков из исследуемого материала, так как методом отпечатков тампоном удается произвести посев лишь небольшого количества бактерий, находящихся на поверхности слизистых оболочек носоглотки; не удаляется выделенная со слизистых оболочках носоглотки сопутствующая микрофлора, обладающая антагонистическими свойствами, а также удается идентифицировать только штаммы стрептококков серологической группы А, а патогенные для человека штаммы стрептококков серогруппы С и G не определяются. Использование предложенных питательных сред и культивирование в аэробных условиях не позволяет выделять стрептококки с анаэробным типом дыхания.

Итак, сложность лабораторной диагностики и эпидемиологические предпосылки циркуляции стрептококков в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ) дают основания для совершенствования методов лабораторной диагностики стрептококковых инфекций.

Цель исследования - повышение эффективности выделения возбудителей стрептококковых инфекций из исследуемого материала при возникновении ИСМП.

Задача исследования. На основании изу­чения антибиотикограмм сопутствующей микрофлоры стрептококковым инфекциям выявить антибиотик, обладающий бактерицидным действием на сопутствующую микрофлору, но не влияющим на снижение репродуктивной активности стрептококков. Добавление данного антибиотика в питательную среду для роста стрептококков позволит разработать способ получения изолированных колоний стрептококков.

Материал и методы исследования

В период с 1997 по 2011 г. обследовано 5300 больных. В содержимом из зева выделена сопутствующая микрофлора стрептококковой инфекции. Для определения чувствительности выделенной сопутствующей микрофлоры к антибиотикам использовали диско-диффузионный метод. В опытах использовано 16-20 часовых культур бактерий. Концентрацию бактерий доводили по стандарту мутности до 0,5 ед. по McFarland на физиологическом растворе хлорида натрия (рН 7,2-7,4). Приготовленную взвесь вносили на чашки Петри с 5% кровяным МПА в количестве 0,2 мл и равномерно распределяли на поверхности питательной среды. Через 15 минут на поверхность питательной среды наносили диски с антибиотиками. Посевы инкубировали при 37°С в течение 24 часов с последующим определением задержки роста бактерий вокруг дисков с антибиотиками. Использовали следующие диски с антибиотиками: стрептомицин, эритромицин, гентамицин, амикацин, линкомицин, бензилпенициллин, олеандомицин, цефаклор, цефуроксим, цефатоксим, цефалексин.

Для выделения стрептококков, обладающих анаэробными свойствами, проводили посев исследуемого материала на печеночный бульон Китта-Тароцци. Через 18‒20 часов роста бактерий при 37°С проводили пересев взвеси бактерий со среды Китта-Тароцци на 5% кровяной МПА. На поверхность кровяного МПА вносили 0,1 мл взвеси бактерий и шпателем равномерно распределяли их по поверхности плотной питательной среды. На поверхность посевов помещали диски с гентамицином в количестве 8-9 штук на чашку Петри и распределяли их на равном расстоянии друг от друга. Через 18-20 часов роста бактерий при температуре 37°С вокруг дисков с гентамицином отмечался рост изолированных колоний стрептококков, обладающих анаэробными свойствами.

Предложенный способ получения изолированных колоний стрептококков поясняется графическим материалом. На рисунке представлена схема получения изолированных колоний стрептококков.

Схема получения изолированных колоний стрептококков. Обозначения: 1 - сбор исследуемого материала от больного (слизь из зева и с миндалин), 2-5% кровяной МПА, 3 - среда Кита-Тароцци для выращивания бактерий с анаэробным типом дыхания, 4 - диски с гентамицином, 5 - выросшие изолированные колонии стрептококков на кровяном МПА, обладающих аэробными и анаэробными свойствами

Результаты исследований и их обсуждение

Результаты исследований показали, что в мазках из зева сопутствующая микрофлора была чувствительна к гентамицину в 90-96% случаев, а выделенные культуры стрептококков были резистентны к гентамицину. На основании результатов анализа антибиотикограмм сопутствующей микрофлоры стрептококковой инфекции предложен способ выделения изолированных колоний стрептококков из смешанных микробных популяций. Способ заключается в следующем: с помощью тампона берут налет, слизь с миндалин и слизистых оболочек зева, затем методом штриха проводят посев исследуемого материала на 5% кровяной МПА, равномерно распределяя бактерии по поверхности питательной среды. На поверхность кровяного МПА с посевом исследуемого материала наносили диски с гентамицином в количестве 8-9 штук, равномерно распределяя их на поверхности питательной среды. Через 18-20 часов роста бактерий при температуре 37°С на поверхности кровяного МПА вокруг дисков с гентамицином наблюдался рост изолированных колоний стрептококков. Для выделения стрептококков, обладающих анаэробными свойствами, предварительно делали посев исследуемого материала на печеночный бульон Китта-Тароцци, а затем через 18-20 часов роста бактерий при 37°С проводили пересев взвеси бактерий со среды Китта-Тароцци на 3% кровяной МПА. На поверхность кровяного МПА вносили 0,1 мл взвеси бактерий, равномерно распределяя их на поверхности плотной питательной среды. На посевы с микробной взвесью помещали диски с гентамицином в количестве 8-9 штук. Через 18-20 часов роста бактерий при температуре 37°С вокруг дисков с гентамицином отмечался рост изолированных колоний стрептококков, обладающих анаэробными свойствами. С помощью предложенного метода выделено 34 культуры стрептококков.

По сравнению с традиционными методами микробиологической диагностики стрептококковых инфекций предложенный способ позволяет уменьшить расход питательных сред, повысить процент выделения стрептококков из исследуемого материала, что позволяет своевременно и в более полном объеме проводить противоэпидемическое расследование и осуществлять мероприятия, направленные на предупреждение возникновения ИСМП стрептококковой этиологии.

Следует отметить, что сложность и низкая эффективность выделения стрептококков из исследуемого материала при диагностике инфекционных заболеваний связана с тем, что сопутствующая микрофлора по сравнению со стрептококками более устойчива во внешней среде, неприхотлива к питательным средам, как правило, обладает антагонистическими свойствами и поэтому при инфекционных заболеваниях выделенную микрофлору от больных часто выделяют и идентифицируют преимущественно из группы условно-патогенной сопутствующей микрофлоры. При обследовании ожоговых больных в популяциях сопутствующей микрофлоры наиболее часто определялся эпидермальный стафилококк.

Итак, стрептококки, в отличие от условно-патогенной микрофлоры и стафилококков, менее устойчивы во внешней среде, часто обладали анаэробными свойствами и медленнее размножались на питательных средах. Поэтому не всегда удается выделять чистую культуру стрептококков традиционными микробиологическими методами.

Предложенный способ позволил повысить процент выделения стрептококков из исследуемого материала, сократить время проведения микробиологических исследований по выделению изолированных колоний стрептококков, уменьшить количество ложноотрицательных результатов исследований и снизить расход питательных сред в процессе лабораторной диагностики стрептококковых инфекций. Сокращение сроков проведения лабораторных исследований позволяет в ранние сроки и в более полном объеме проводить противоэпидемические мероприятия при возникновении ИСМП, вызываемых стрептококками.

Глава 15. Стрептококки

К роду Streptococcus относятся: Streptococcus pyogenes (гемолитический) и Streptococcus pneumoniae (пневмококк). Впервые стрептококки были обнаружены Бильротом (1874), Л. Пастером (1879). Изучены они были Э. Розенбахом (1884).

Морфология. Стрептококки - это кокки, имеющие шаровидную форму. Диаметр каждого кокка в среднем 0,6-1 мкм, однако для них характерен полиморфизм: встречаются мелкие и крупные кокки, строго шаровидные и овальные. Стрептококки располагаются цепочкой, что является результатом деления их в одной плоскости. Длина цепочек разная. На плотной питательной среде цепочки обычно короткие, на жидких - длинные. Стрептококки неподвижны, не имеют спор (см. рис. 4) Свежевыделенные культуры иногда образуют капсулу. На ультратонких срезах видна микрокапсула, под ней расположена трехслойная клеточная стенка и трехслойная цитоплазматическая мембрана. Грамположительны.

Культивирование. Стрептококки - факультативные анаэробы. Растут при температуре 37° С и рН среды 7,6-7,8. Оптимальными средами для их выращивания являются среды, содержащие кровь или сыворотку крови. На плотных питательных средах колонии стрептококков мелкие, плоские, мутные, сероватого цвета. На агаре с кровью некоторые разновидности стрептококков образуют гемолиз. β-Гемолитические стрептококки образуют четкую зону гемолиза, α-гемолитические стрептококки образуют небольшую зеленоватую зону (результат перехода гемоглобина в метгемоглобин). Встречаются стрептококки, не дающие гемолиза.

На сахарном бульоне стрептококки растут с образованием пристеночного и придонного мелкозернистого осадка, бульон при этом остается прозрачным.

Ферментативные свойства. Стрептококки обладают сахаролитическими свойствами. Они расщепляют глюкозу, лактозу, сахарозу, маннит (не всегда) и мальтозу с образованием кислоты. Протеолитические свойства у них слабо выражены. Они свертывают молоко, желатин не разжижают.

Токсинообразование. Стрептококки образуют ряд экзотоксинов: 1) стрептолизины - разрушают эритроциты (О-стрептолизин обладает кардиотоксическим действием); 2) лейкоцидин - разрушает лейкоциты (образуется высоковирулентными штаммами); 3) эритрогенный (скарлатинозный) токсин - обусловливает клиническую картину скарлатины - интоксикацию, сосудистые реакции, сыпь и пр. Синтез эритрогенного токсина детерминирован профагом; 4) цитотоксины - обладают способностью вызывать гломерулонефрит.

Антигенная структура и классификация. У стрептококков обнаружены различные антигены. В цитоплазме клетки содержится видовой нуклеопротеидной природы антиген - единый для всех стрептококков. На поверхности клеточной стенки расположены протеиновые типовые антигены. В клеточной стенке стрептококков обнаружен полисахаридный групповой антиген.

По составу полисахаридной группоспецифической фракции антигена все стрептококки делятся на группы, обозначаемые большими латинскими буквами А, В, С, D и т. д. до S. Кроме групп, стрептококки разделены на серологические типы, которые обозначаются арабскими цифрами.

Группа А включает 70 типов. В эту группу входит большинство стрептококков, вызывающих различные заболевания у человека. Группа В включает в основном условно-патогенные для человека стрептококки. Группа С включает патогенные для человека и животных стрептококки. Группа D состоит из непатогенных для человека стрептококков, однако в эту группу входят энтерококки, которые являются обитателями кишечного тракта человека и животных. Попадая в другие органы, они обусловливают воспалительные процессы: холециститы, пиелиты и др. Таким образом, их можно отнести к условно-патогенным микробам.

Принадлежность выделенных культур к одной из серологических групп определяют с помощью реакции преципитации с групповыми сыворотками. Для определения серологических типов используют реакцию агглютинации с типоспецифическими сыворотками.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Стрептококки довольно устойчивы в окружающей среде. При температуре 60° С погибают через 30 мин.

В высушенном гное и мокроте они сохраняются месяцами. Обычные концентрации дезинфицирующих веществ губят их через 15-20 мин. Энтерококки значительно устойчивее, дезинфицирующие растворы убивают их только через 50-60 мин.

Восприимчивость животных. К патогенным стрептококкам чувствителен рогатый скот, лошади, собаки, птицы. Из лабораторных животных чувствительны кролики и белые мыши. Однако стрептококки, патогенные для человека, не всегда патогенны для экспериментальных животных.

Источники инфекции. Люди (больные и носители), реже животные или инфицированные продукты.

Пути передачи. Воздушно-капельный и воздушно-пылевой, иногда пищевой, возможен контактно-бытовой.

Заболевания могут возникать в результате экзогенного заражения, а также эндогенно - при активации условно-патогенных стрептококков, обитающих на слизистых оболочках зева, носоглотки, влагалища. Снижение сопротивляемости организма (охлаждение, голодание, переутомление и пр.) может привести к возникновению аутоинфекций.

Большое значение в патогенезе стрептококковых инфекций имеет предварительная сенсибилизация - как следствие ранее перенесенного заболевания стрептококковой этиологии.

При проникновении в кровяное русло стрептококки обусловливают тяжело протекающий септический процесс.

Заболевания у человека чаще вызывают β-гемолитические стрептококки серологической группы А. Они продуцируют ферменты патогенности: гиалуронидазу, фибринолизин (стрептокиназу), дезоксирибонуклеазу и др. Кроме того, у стрептококков обнаруживают капсулу, М-протеин, обладающие антифагоцитарными свойствами.

Стрептококки вызывают у человека различные острые и хронически протекающие инфекции, как с образованием гноя, так и не нагноительные, различающиеся по клинической картине и патогенезу. Нагноительные - флегмоны, абсцессы, раневые инфекции, ненагноительные - острые инфекции верхних дыхательных путей, рожистое воспаление, скарлатина, ревматизм и др.

Стрептококки часто вызывают вторичные инфекции при гриппе, кори, коклюше и других заболеваниях и нередко осложняют раневые инфекции.

Иммунитет. По характеру иммунитет - антитоксический и антибактериальный. Постинфекционный антимикробный иммунитет малонапряженный. Это объясняется слабой иммуногенностью стрептококков и большим количеством сероваров, не дающих перекрестного иммунитета. Кроме этого, при стрептококковых заболеваниях наблюдается аллергизация организма, чем объясняют склонность к рецидивам.

Профилактика. Сводится к санитарно-гигиеническим мероприятиям, укреплению общей резистентности организма. Специфическая профилактика не разработана.

Лечение. Применяют антибиотики. Чаще используют пенициллин, к которому стрептококки не приобрели устойчивости, а также эритромицин и тетрациклин.

Значение стрептококка в этиологии ревмокардита. Патогенез ревмокардитов изучен недостаточно. Но в пользу роли стрептококка в развитии этого заболевания говорит ряд фактов:

1. У больных ревмокардитом из зева высевают В-гемолитический стрептококк.

2. Ревматизм часто возникает после перенесенной ангины, тонзиллитов, фарингитов, сенсибилизирующих организм.

3. В сыворотке крови больных обнаруживают антистрептолизин, антистрептогиалуронидазу - антитела к стрептококковым ферментам, токсинам.

4. Косвенным подтверждением роли стрептококка является успешное лечение пенициллином.

В последнее время в возникновении хронических форм ревмокардита придают значение L-формам стрептококка.

Профилактика обострений ревмокардита сводится к предупреждению стрептококковых заболеваний (например, весной и осенью проводят профилактический курс введения пенициллина). Лечение сводится к применению антибактериальных препаратов - пенициллина.

Значение стрептококка в этиологии скарлатины. Г. Н. Габричевский (1902) впервые высказал предположение о том, что гемолитический стрептококк является возбудителем скарлатины. Но так как стрептококки, выделяемые при других заболеваниях, не отличались от возбудителей скарлатины, то это мнение не всеми разделялось. В настоящее время установлено, что скарлатину вызывают стрептококки группы А, вырабатывающие эритрогенный токсин.

У переболевших возникает иммунитет - стойкий, антитоксический. Его напряженность определяют постановкой реакции Дика - внутрикожным введением эритрогенного токсина. У не болевших вокруг места введения возникают гиперемия и отек, что характеризуется как положительная реакция (отсутствие антитоксина в сыворотке крови). У переболевших такая реакция отсутствует, так как образовавшийся у них антитоксин нейтрализует эритрогенный токсин.

Профилактика. Изоляция, госпитализация. Контактным, ослабленным детям вводят гамма-глобулин. Специфическая профилактика не разработана.

Лечение. Используют пенициллин, тетрациклин. В тяжелых случаях вводят антитоксическую сыворотку.

Цель исследования: выявление стрептококка и определение его серовара.

1. Слизь из зева (ангина, скарлатина).

2. Соскоб с пораженного участка кожи (рожа, стрептодермия).

5. Кровь (подозрение на сепсис; эндокардит).

Способы сбора материала