Как выделить чистую культуру сибирской язвы

Цель занятия: изучить методы диагностики сибирской язвы. Материалы и оборудование: световой микроскоп, вакцина против сибирской язвы.

Место проведения занятия: лаборатория кафедры эпизоотологии.

Сибирская язва — остропротекающая болезнь сельскохозяйственных животных многих видов. Болеет и человек. Возбудитель — Bacillus anthracis.

При постановке диагноза на сибирскую язву используют весь комплекс диагностических методов — эпизоотологический анализ, клинические, патологоанатомические и лабораторные исследования.

Общий принцип эпизоотологического анализа, или обследовав ния, хозяйства изложен в занятии 6. Возбудитель сибирской язвы может распространяться через секреты и экскреты больных животных, продукты убоя, трупы, а также посредством кровососущих насекомых. Особенно опасны места захоронения трупов животных и стоячие водоемы.

Если болезнь возникла в период стойлового содержания животных, выясняют условия их кормления и происхождение кормов (споры сибирской язвы могут быть занесены с корнеплодами, сеном и мясокостной мукой); если в пастбищный период — обследуют участки, где паслись животные. Необходимо выяснить, велись ли вблизи фермы или пастбищ земляные работы, и собрать сведения за предельно большой срок о случаях появления сибирской язвы в данной местности.

Клиническое обследование животных начинают с измерения температуры тела (при сибирской язве она повышена). Болезнь выражается также отказом от корма, резким припуханием лимфатических узлов, отеком подчелюстного пространства, у дойных коров — Маститом. У свиней обнаруживают разлитую отечность тестоватой Консистенции в подчелюстном пространстве.

При патологоанатомическом исследовании отмечают характерные для сибирской язвы признаки: отсутствие трупного окоченения, сильное вздутие трупа, отеки в подкожной клетчатке, пенисто-кровянистые истечения из естественных отверстий, синюшную окраску видимых слизистых оболочек и кровоизлияния на них. Однако следует иметь в виду, что весь комплекс указанных изменений наблюдают не всегда, поэтому окончательный диагноз устанавливают только после лабораторного исследования.

Лабораторная диагностика при сибирской язве включает в себя микроскопию мазков из исходного патологического материала, выделение чистой культуры посевом на питательные среды, биопробу. При необходимости ставят реакцию преципитации, идентифицируют выделенные культуры культурально-биохимическими методами.

Для исследования на сибирскую язву в лабораторию направляют ухо, перевязанное у основания, или мазок крови, взятой из надреза уха; от трупов свиней — участки отечной соединительной ткани и заглоточные, а также другие лимфатические узлы с характерными патологоанатомическими изменениями. Если подозрение на сибирскую язву возникло при вскрытии трупа животного (кроме трупов свиней), вскрытие прекращают и на исследование направляют часть селезенки.

Мазки микроскопируют немедленно, результаты срочно сообщают в хозяйство, направившее материал. Мазки фиксируют этиловым спиртом с добавлением 3 % пероксида водорода, окрашивают по Граму, на капсулы — по методу Ребигера, Михина, Ольта или Романовского— Гимзы и на споры — по методу Пешкова, Ауески, Трихинелье и Златогорова. Если в лаборатории есть люминесцирующие сыворотки, используют метод флюоресцирующих антител.

Посевы из исходного материала делают в МПБ и на МПА или в бульон и на агар Хоттингера. Посевы инкубируют 18…24 ч при температуре 37 °С, при отсутствии роста выдерживают при той же температуре еще 48 ч.

После суточного роста сибиреязвенных бактерий МПБ остается прозрачным, на дне образуется рыхлый осадок, напоминающий комок ваты. При встряхивании пробирки бульон не мутнеет, осадок разбивается на мелкие хлопья. Мазки из бульонной культуры окрашивают по Граму и исследуют под микроскопом. В мазках обнаруживают цепочки, состоящие из сибиреязвенных палочек.

На плотных питательных средах возбудитель сибирской язвы образует плоские матово-серые шероховатые колонии. Центр колоний затемнен, периферия бахромчатая, с локонообразными отростками.

Для биопробы используют лабораторных животных, восприимчивых к сибирской язве: белых мышей, кроликов, морских свинок. Исследуемый материал суспендируют в небольшом объеме 0,9%-го раствора хлорида натрия, вводят двум белым мышам в дозе 0,2…0,5 мл под кожу спины ближе к корню хвоста или 0,5…1,0 мл двум морским свинкам подкожно в область живота. За животными, зараженными суспензией из исходного материала или культурой возбудителя, наблюдают в течение 10 сут. Зараженные животные гибнут через 1…3 сут, иногда позже. Трупы вскрывают, делают мазки и посевы на питательные среды из крови сердца, селезенки, печени, а также инфильтрата, образовавшегося на месте инъекции исследуемого материала.

Сроки исследований: микроскопического — в день поступления материала, бактериологического—до 3 сут, биологического (биопроба) — 10 сут.

Кожевенное сырье на сибирскую язву исследуют в реакции преципитации (РП). Перед ее постановкой свежий патологический материал предварительно выдерживают в термостате в течение 18…20 ч, несвежий сразу экстрагируют горячим или холодным способом. При этом следует учитывать, что в экстрактах, полученных горячим способом, меньше преципитиногенов.

При горячем способе экстрагирования кусочки исследуемого материала (1…2г) помещают в пробирку или колбу, заливают 0,9%-м раствором хлорида натрия в соотношении 1 : 10 и кипятят 30…40 мин на водяной бане. При холодном кусочки материала (1…2г) растирают в ступке с песком, переносят в колбу или баночку, заливают 0,9%-м фенолизированным раствором хлорида натрия в соотношении 1 : 10 и оставляют на 16…18 ч при температуре 20 ± 2 °С.

Полученные экстракты фильтруют через асбестовую вату до ‘ прозрачности, при этом первые капли фильтрата удаляют.

РП ставят методом наслаивания или подслаивания.

При наслаивании в уленгутовскую пробирку наливают 0,2…0,3 мл прозрачной преципитирующей сибиреязвенной сыворотки, затем осторожно наслаивают равное количество экстракта так, чтобы между. Компонентами образовалась ясно выраженная граница (тонкая прямая линия). При подслаивании в уленгутовскую пробирку сначала вносят 0,2…0,3 мл экстракта, затем под него осторожно пастеровской пипеткой подслаивают равное количество преципитирующей сыворотки.

Если при соединении компонентов резко выраженная граница между ними отсутствует, опыт повторяют. Одновременно ставят контроль преципитируюшей сибиреязвенной сыворотки со стандартным сибиреязвенным антигеном: при положительной реакции в течение 1…2 мин после соединения компонентов появляется характерное кольцо.

РП считают положительной, если через 1…2 мин и не позже чем через 15 мин на границе между компонентами появилось тонкое беловатое кольцо.

При отрицательном результате РП с экстрактом, полученным горячим способом, опыт повторяют с экстрактом, полученным холодным способом.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Приготовить мазки из вакцинного штамма и промикроскопировать их.

2. Разработать схему дифференциальной диагностики сибирской язвы от коликов, тимпании, отравления.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в лабораторной практике для выделения чистой культуры возбудителя сибирской язвы. Цель изобретения - упрощение способа выделения возбудителя сибирской язвы. Способ . заключается в ингибиции роста-посторонней микрофлоры путем обработки исследуемого материала раствором дихлоро-М-(5-нитро-2- фурфурилиден)-4-амино-1,2,4-тризол цинк в концентрации 1-2 г/л. 2 табл.

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 Q 1/04

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4828261/13 (22) 24.05,90 (46) 30.03,92, Бюл, ¹ 12 (71) Киевский государственный медицинский институт и Молдавский государственный университет им. В. И. Ленина (72) В. В. Гылка, T. А. Бурденко, В. И, Цапков и Н. М, Самусь (53) 576,8.093(088.8) (56) Инструкция и методическое указание по лабораторной, клинической диагностике и лечению сибирской язвы у людей. М., 1980, Химико-фармакологический журнал, 1989, N9,,с,,1098 — 1101.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в лабораторной практике для выделения чистой культуры возбудителя сибирской язвы.

Выделение чистой культуры сибиреязвенного возбудителя из исследуемого материала часто сопряжено с большими трудностями из-за массивного обсеменения

его другими микроорганизмами.

Известен способ выделения сибиреязвенного возбудителя из загрязненного материала по Дольду, заключающийся в насыщении суспензии кристаллами мочевины с последующим прогреванием на водяной бане при 37 С в течение 5-10 мин.

Недостатком этого способа является громоздкость исследования, необходимость использования стерильной посуды, водяной бани, термометра, источника тепла. Часть оставшихся нерастворенными кристаллов мочевины при посеве исследуемого материала на питательную среду способствует угнетению роста сибиреязвенного возбудителя.!

„„5U „„1723130 А1 (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ

СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ (57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в лабораторной практике для выделения чистой культуры возбудителя сибирской язвы. Цель изобретения — упрощение способа выделе ния возбудителя сибирской язвы, Способ . заключается в ингибиции роста-посторонней микрофлоры путем обработки исследуемо о материала растворомдихлоро-N-((5-нитро-2фурфурилиден)-4-эмино- 1.2,4-тризол)цинк в концентрации 1-2 г/л. 2 табл, Кроме того, дополнительные манипуляции с бактериологически загрязненным материалом повышают степень риска для исследователя, а вместе с прогреванием удлиняют время исследования.

Цель изобретения — упрощение выделения возбудителя сибирской язвы.

Поставленная цель достигается тем, что исследуемый материал обрабатывают рас- (л) твором дихлоро-N-((5-нитро-2-фурфурили- — а ден)-4-амино-1,2,4-триазол) цинк e () концентрации 1-2 г/л, Указанное вещество использовалось ранее для синтеза координационных соединений, и

Способ осуществляют, следующим образом.

Нэвеску дихлоро-N-((5-нитро-2-фурфурилиден)-4-амино-1,2,4-триазол цинк растворяют в диметилсульфоксиде иэ расчета

0,5 г на 1 мл и доводят водой или иэотоническим раствором хлорида натрия до концентрации 1 г/л, полученным раствором

1723130 заливают исследуемый материал в соотношении 5:1, время экспозиции от нескольких секунд до 2 м, Раствор может быть использован в течение 2 — 3 мес. Посев производят пипеткой 0,2 мл на чашку Петри с агаром

Хоттингера. Инкубация при 37 С в течение

12 — 24 ч, При наличии в исследуемом материале наряду со спорами бациллы сибирской язвы вегетативных форм других микроорганизмов рост последних ингибируется и растет только В. anthracis.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить чистую культуру В.

anthracis из материала, загрязненного другими микроорганизмами.

Пример 1. Готовят раздельные взвеси микробов в концентрации 10 млрд/мл (кишечная палочка, стафилококк, протей, сальмонелла) и взвесь сибиреязвенных спор в концентрации 1 млрд/мл. Берут по 1 мл каждой взвеси и смешивают. Добавляют 5кратный объем раствора дихлоро-N-((5-нитро-2-фурфурил иден)-4-амино-1,2,4-триа зол) цинк в концентрации 0,1 г/л; Посев производят в чашки Петри на агар, приготовленный на переваре Хоттингера, по 0,2 мл на каждую чашку. Исследование посевов ripoизводят через 12-24 ч после инкубации их в термостате при 37 С. Растут колонии всех вышеперечисленных микроорганизмов, Пример 2, Взвесь готовят по схеме, описанной в примере 1, добавляют 5-кратный объем раствора дихлоро-N-((5-нитро-2фурфурил иден)-4-а ми но-1,2,4-три а зол) цинк, но в концентрации 1 г/л. При посеве смеси культур и инкубации в течение 12 — 24 ч при 37 С растет только сибиреязвенный возбудитель.

Пример 3. Взвесь готовят по схеме, описанной в примере 1, добавляют 5-крат. ный объем раствора дихлоро-N-((5-нитро-2фурфурилиден)-4-амино-1,2,4-триазол) цинк, но в концентрации 2 г/л. При посеве культур и инкубации в течение 12-24 ч при

37 С растет только сибиреязвенный возбудитель.

Пример 4, Взвесь готовят по схеме, описанной в примере 1, добавляют 5-крат5

50 ный обьем раствора дихлоро-N-((5-нитро-2фурфурилиден)-4-амино-1,2,4-триазол) цинк, но в концентрации 10 г/л. При посеве смеси культур и инкубации в течение 24 ч при 37 С растет только сибиреязвенный возбудитель, но в виде отдельных колоний (в 5 — 10 раз меньше, чем в примере 3).

Пример 5. Взвесь готовят по схеме, описанной в примере 1, но добавляют 5кратный объем раствора дихлоро-N-((5-нитро-2-фурфурилиден)-4-амино-1,2,4-триазол) цинк, но в концентрации 100 г/л. При посеве смеси культур и инкубации в течение 24 ч при 37 С роста микроорганизмов нет.

Как видно иэ приведенных примеров и таблиц 1 и 2 отсутствие роста и гибель вегетативных форм микробов происходит при обработке субстрата 5-кратным объемом раствора дихл оро-N-((5-н итра-2-фурфурил иден)-4-амина-1,2,4-триаэол) цинк в концентрации 1 — 2 г/л. Более высокая. концентрация

10 — 1000 -/л ведет к прекращению роста и гибели как вегетативных форм микробов, так и споровых форм сибиреязвенного возбудителя.

Раствор, содержащий 0,1 г/л дихлороN-((5-н итро-2-фурфурил иден)-4-а мино-1,2,4

-триазол) цинк, не приводит к уничтожению вегетативных форм микробов.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет получить чистую культуру сибиреязвенного возбудителя; сократить время исследования, количество манипуляций с предлагаемым заразным материалом и расход лабораторной посуды в

2-3; исключает необходимость источника тепла; уменьшает риск заражения персонала; все зто значительно упрощает осуществляемость способа выделения сибиреязвенного возбудителя.

Способ выделения возбудителя сибирской язвы путем обработки исследуемого материала химическим соединением, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа, исследуемый материал обрабатывают раствором дихлоро-N-((5-нитро-2-фурфурилиден)-4-амино-1,2,4-триазол)цинк в концентрации 1 — 2 г/л.

Eschrichia coli М-17

Концентрация исследуемого вещества, г/л

Составитель В. Гылка

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор М.Шароши

Заказ 1043 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101

Escherchia colli И-17

Концентрация культур млрд/мл

Концентрация культур млрд/мл

Концентрация исследуемого вещества, г/л

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в лабораторной практике для выделения чистой культуры возбудителя сибирской язвы

Роберт Кох — немецкий микробиолог, один из основоположников современной бактериологии и эпидемиологии. Впервые выделил чистую культуру возбудителя сибирской язвы, доказал ее способность к спорообразованию. Предложил способы дезинфекции. Сформулировал критерии этиологической связи инфекционного заболевания с микроорганизмом (триада Коха).

Роберт Кох родился 11 декабря 1843 года в крохотном немецком городке Краустале. В детстве он очень любил ломать, а затем чинить свои игрушки. За этим занятием он проводил долгие часы. Когда он подрос и пошел в гимназию, то, как и положено ребенку его возраста, стал мечтать о далеких странах и великих открытиях. Он хотел стать судовым врачом и проплыть вокруг земного шара. Но по окончании в 1866 году медицинского факультета Геттингенского университета его ждала скромная должность младшего врача в доме умалишенных в Гамбурге. Лечение лишенных разума людей энтузиазма у Коха не вызывало. Казалось, что в перспективе его ждет только скучная рутинная врачебная практика. Он переезжал с места на место и наконец оказался в роли уездного врача в Вольштейне (Восточная Пруссия). Кох быстро завоевал уважение сельских жителей, и врачебная практика стала приносить ему ощутимый доход. В то же время мысли о романтических путешествиях и свершениях Коха не покидали.

Невеста его, девушка милая, простая, согласилась выйти за него замуж при одном условии: никаких джунглей, фрегатов: дом, семья, тихая, всеми уважаемая профессия сельского лекаря. Он смирился. Не смирился его дух. В день 28‑летия Коха Эмми Фраац, его жена, на радостях подарила ему микроскоп. Она и подумать, конечно же, не могла, что этот прибор поможет мужу завоевать мировую славу. Микроскоп, купленный как игрушка, стал вскоре причиной супружеских разногласий. Коху стоило большого труда оторваться от любимого инструмента. Насколько он был теперь увлечен занятиями микробиологией, настолько потерял интерес к врачебной практике. Он не любил врачевать, он любил исследовать.

Опыты Луи Пастера, утверждавшего, что все болезни вызываются бактериями, будоражили воображение молодого доктора. И Кох организовал примитивную домашнюю лабораторию и провел свои первые микробиологические исследования. Он ничего не знал еще о дрожжевом бульоне, придуманном Пастером, и его опыты отличались такой же примитивной оригинальностью, как попытки первого пещерного человека получить огонь. Бесстрашный исследователь невидимого мира убийц мог легко заразиться смертельной болезнью. Предохраняться было нечем: не было ни инструмента, ни индивидуальных средств защиты.

Благодаря микроскопу и красителям Коху открылся удивительный мир невероятно маленьких живых существ — микробов. Пользуясь разработанным им методом культивирования бактерий, открытых ранее в крови больных сибирской язвой, Кох доказал, что они являются возбудителями сибирской язвы и способны к образованию устойчивых спор. Это открытие врача объяснило пути распространения болезни. Когда он разобрался с сибирской язвой, ему и в голову не приходило что-то об этом опубликовать, кому-то доложить. В 1876 году, по настоянию своего профессора Кона, Кох отправился из своего медвежьего угла в Бреславль, чтобы объявить миру о том, что микробы действительно являются причиной болезни. Тогда в это мало кто верил. Собравшиеся светила науки в течение трех дней, затаив дыхание, сидели и слушали никому неизвестного врача. Это была победа! Профессор Конгейм, один из самых талантливых в Европе патологов, не мог больше сдерживаться. Он выскочил из зала как ошпаренный и бросился в лабораторию проверять, прав ли этот безвестный доктор.

Доктор Кох вернулся в Вольштейн, где, начиная с 1878 по 1880 год, добился новых больших успехов, открыв и изучив особый вид маленьких негодников, вызывающих смертельное нагноение ран у людей и животных. В работе, посвященной раневым инфекциям, Кох выдвинул известных три требования (триада Коха), на основании которых можно установить связь заболевания с определенным микробом: 1) обязательное выявление микроба во всех случаях данной болезни; 2) число и распределение микробов должно объяснить все явления болезни; 3) в каждой отдельной инфекции должен быть определен свой возбудитель в виде хорошо морфологически охарактеризованного микроорганизма. Для выполнения этих требований (впоследствии во многом переработанных и измененных) Кох создал ряд новых методов приготовления препаратов, окрашивания и др., которые прочно вошли в медицинскую практику.

Далее Кох горячо взялся за поиски бактерий туберкулёза — болезни, которая уносила, да и сейчас еще уносит, множество человеческих жизней. Начал Кох с микроскопического исследования внутренних органов тридцатишестилетнего рабочего, погибшего от скоротечной чахотки — туберкулёза легких. Но никаких микробов разглядеть не удалось. Вот тогда его и осенило использовать окраску препаратов. Это произошло в 1877 году, который стал историческим для медицины. Сделав мазок легочной ткани больного на предметном стекле, Кох высушил его и поместил в раствор красителя. Рассматривая под микроскопом препарат, окрашенный в синий цвет, он отчетливо увидел между легочной тканью многочисленные тоненькие палочки…

Подобное решение было принято и в Германии. Правительство назначило Коха главой комиссии, которая 24 августа прибыла в Александрию. Местом работы был выбран греческий госпиталь. Еще за год до этого Кох наблюдал в присланной ему из Индии части кишки умершего от холеры большое количество бактерий. Он, однако, не придал этому особого значения, так как в кишках всегда находится множество бактерий.

В 1885—1891 годах Кох был профессором Берлинского университета. С 1891 года он возглавлял Институт инфекционных болезней больницы Шаритэ, а с 1901 года — Институт инфекционных болезней в Берлине, впоследствии названный именем Коха.

В 1904 году Кох отказался от должности директора Института инфекционных болезней, чтобы заняться только исследовательской деятельностью. Через год ему одновременно с Адольфом Байером, выдающимся исследователем красителей, была присуждена Нобелевская премия, а еще через пять лет, 27 мая 1910 года, Роберт Кох умер. Он ушел из жизни так же тихо и скромно, как и жил.

Ученики Коха немало потрудились. Страшная болезнь, дифтерит, уносила каждый день сотни, тысячи детских жизней. Лечили от удушья трахеотомией (вскрытием дыхательного горла). Некоторые бесстрашные врачи, рискуя умереть от смертельного яда, жертвовали собой и высасывали ложные перепонки, находящиеся в только что открытом дыхательном горле. Так погиб врач-писатель М.А. Булгаков. И вот в 1884 году Фридрих Лёфлер (1852—1915) открыл возбудителя дифтерии и описал этиологию дифтерита, что дало возможность Э. Берингу и Э. Ру приготовить антитоксическую сыворотку. Георг Гафки (1850—1918), с 1904 года директор Института инфекционных болезней в Берлине, описал этиологию брюшного тифа, впервые выделил чистые культуры брюшнотифозной палочки и дал в 1884 году подробное ее описание. Особенно заметным был Рихард Пфейфер (Pfeiffer), автор большого числа работ по различным вопросам микробиологии и иммунитета. В 1890 году описал возбудителя инфлюэнцы в мазках, а в 1892 году получил чистую культуру микроба, считавшегося возбудителем гриппа; в 1894 году одновременно с русским врачом В.И. Исаевым открыл и изучил бактериолиз холерных вибрионов; в 1896 году открыл эндотоксины возбудителя брюшного тифа. В объяснении механизма иммунитета пытался противопоставить явления бактериолиза фагоцитозу. Пфейфер внес много нового в изучение малярии, чумы, холеры и других инфекционных болезней.