Как берут анализ на лепру у женщин

Основные факты

  • Лепра — это хроническая болезнь, вызываемая бациллой Mycobacterium leprae.
  • M. leprae размножается медленно, и инкубационный период болезни длится около 5 лет.
  • В некоторых случаях симптомы могут развиться в течение одного года, а в других случаях до их появления может пройти 20 лет.
  • Болезнь поражает, в основном, кожу, периферические нервы, слизистую оболочку верхних дыхательных путей и глаза.
  • Лепра излечима с помощью комбинированной лекарственной терапии (КЛТ).
  • Лепра передается через капли, выделяемые из носа и рта и при частых контактах с инфицированными людьми, не получающими лечения.
  • Без лечения лепра может приводить к прогрессирующим и стойким поражениям кожи, нервов, конечностей и глаз.
  • По официальным данным из 159 стран шести регионов ВОЗ, число зарегистрированных случаев заболевания лепрой составляет 211 009.
  • Принимая во внимание тот факт, что по состоянию на конец 2017 г. число случаев составило 193 118, показатель выявления случаев лепры равен 0,3/10 000.

Введение

Лепра — это хроническая инфекционная болезнь, вызываемая Mycobacterium leprae, кислотоустойчивой палочковидной бациллой. Болезнь поражает, в основном, кожу, периферические нервы, слизистую оболочку верхних дыхательных путей и глаза. Лепра излечима, и лечение, проведенное на ранних стадиях болезни, позволяет предотвратить инвалидность.

Краткая история — болезнь и лечение

Лепра известна с давних пор и упоминается в письменных источниках древних цивилизаций. На протяжении всей истории больные лепрой часто подвергались остракизму со стороны своих сообществ и семей.

В прошлом лепру лечили разными способами, но первый настоящий прорыв в лечении произошел в 1940-х годах, когда был разработан дапсон — препарат, останавливающий развитие болезни. Но лечение было многолетним, даже пожизненным, что затрудняло его для пациентов. В 1960-х гг. стала развиваться устойчивость M. leprae к дапсону — единственному противолепрозному препарату, известному в то время в мире. В начале 1960-х годов были открыты рифампицин и клофазимин, которые были включены в схему лечения, названную позднее комбинированной лекарственной терапией (КЛТ).

В 1981 г. ВОЗ рекомендовала КЛТ. В настоящее время рекомендуемый курс КЛТ включает следующие препараты: дапсон, рифампицин и клофазимин. Курс лечения продолжается шесть месяцев в случае олигобациллярной лепры и 12 месяцев при ее мультибациллярной форме. КЛТ убивает патогенный микроорганизм и приводит к излечению пациента.

С 1995 г. ВОЗ бесплатно предоставляет КЛТ всем пациентам с лепрой в мире. Первоначально бесплатную КЛТ финансировал Фонд Ниппона, а с 2000 г. бесплатные поставки КЛТ осуществляются в рамках соглашения с компанией Новартис, которая недавно обязалась продлить их, как минимум, до 2020 года.

Задача по ликвидации лепры как проблемы общественного здравоохранения (т.е. сокращение ее распространенности до показателя менее 1 случая на 10 000 человек) была выполнена во всем мире в 2000 г. За последние 20 лет лечение КЛТ было предоставлено более 16 миллионам пациентов.

Деятельность ВОЗ

  • Обеспечить политическую приверженность и надлежащие ресурсы для программ по борьбе с лепрой.
  • Способствовать обеспечению всеобщего охвата услугами здравоохранения с уделением особого внимания детям, женщинам и обездоленным группам населения, включая мигрантов и перемещенных лиц.
  • Укреплять партнерства с государственными и негосударственными структурами и содействовать межсекторальному сотрудничеству и партнерствам на международном уровне и внутри стран.
  • Оказывать содействие и проводить фундаментальные и операционные исследования в отношении всех аспектов лепры и максимально расширить базу фактических данных для разработки политики, стратегий и мероприятий.
  • Усилить системы эпиднадзора и медико-санитарной информации для мониторинга и оценки программ (включая географические информационные системы).
  • Повысить осведомленность пациентов и сообществ в отношении лепры.
  • Способствовать раннему выявлению случаев заболевания путем активного поиска (например, проведение кампаний) в районах повышенной эндемичности и наблюдению за лицами, имевшими контакты с больными.
  • Обеспечить быстрое начало лечения и его соблюдение, включая работу по улучшению схем лечения.
  • Улучшить профилактику и ведение инвалидности.
  • Усилить эпиднадзор за устойчивостью к противомикробным препаратам, включая лабораторную сеть.
  • Способствовать применению инновационных подходов в отношении специальной подготовки, направления к специалистам и повышения квалификации в области лепры, таких как электронное здравоохранение.
  • Содействовать проведению мероприятий по профилактике инфекций и болезней.
  • Содействовать социальному включению путем принятия мер в отношении всех форм дискриминации и стигматизации.
  • Расширять права и возможности людей, пораженных лепрой, и усиливать их потенциал для активного участия в деятельности служб по лечению лепры.
  • Привлекать сообщества к деятельности, направленной на улучшение служб по лечению лепры.
  • Содействовать созданию коалиций среди людей, пораженных лепрой, и способствовать объединению этих коалиций и/или их членов с другими организациями на уровне отдельных сообществ.
  • Содействовать доступу к службам социальной и финансовой поддержки, например, способствовать получению доходов, для людей, пораженных лепрой, и их семей.
  • Поддерживать реабилитацию людей с инвалидностью, связанной с лепрой, на уровне отдельных сообществ.
  • Работать над отменой дискриминационных законов и способствовать проведению политики по социальному включению людей, пораженных лепрой.
  • среди новых пациентов-детей нет инвалидов;
  • инвалидность второй группы встречается менее чем у одного из миллиона человек;
  • ни в одной стране нет законодательства, позволяющего дискриминацию на основе лепры.

Мазок на заболевания урогенитальной сферы — один из самых распространенных и информативных методов анализа в современной медицине. С его помощью можно выявить не только банальные воспаления, но и предупредить развитие онкологических заболеваний. Несмотря на надежность и доступность метода, не все женщины осознают необходимость регулярного посещения гинеколога и сдачи анализов и нередко обращаются к врачу только в запущенных случаях.

Показания к назначению анализа мазка у женщин

Каждая женщина хоть раз в своей жизни, посещая гинеколога, сдавала мазок на микрофлору или скрытые инфекции. Мазок берется со стенок влагалища, цервикального канала и шейки матки. В лабораторных условиях проводится микроскопическое исследование клеток, содержащихся в биологическом материале. Такой анализ позволяет оценить состояние эпителиальных клеток матки и влагалища, выявить патогенные микроорганизмы и заболевания, передающиеся половым путем. Мазок желательно сдавать регулярно, раз в год, даже если у женщины нет видимых поводов для беспокойства, поскольку многие инфекции в течение длительного времени могут не вызывать никаких симптомов.

В обязательном порядке назначается мазок в тех случаях, когда женщина жалуется на зуд и жжение в области половых органов, необычные выделения из них, внезапную боль внизу живота. Как правило, эти признаки указывают на наличие какого-либо заболевания, диагностировать которое можно только с помощью анализа мазка. Кроме того, желательно провести исследование биоматериала в том случае, если у женщины произошел незащищенный контакт с малоизвестным ей партнером и есть риск заразиться инфекционным заболеванием, передающимся половым путем.

Также врач-гинеколог назначает обязательную сдачу анализа мазка женщинам, планирующим беременность, готовящимся к ЭКО или другим процедурам искусственного оплодотворения (ВРТ). Женщинам, ожидающим ребенка, анализ мазка проводится трижды на всем протяжении срока, поскольку инфекции способны передаваться от матери к ребенку, осложнять роды или вызывать выкидыш.

В гинекологии существует несколько типов анализа мазка в зависимости от вида исследования.

  1. Самым распространенным является мазок на флору или общий мазок , при помощи которого врач определяет так называемую чистоту влагалища у женщины. Что он показывает? Этим способом можно определить состояние клеток эпителия и выявить наличие заболеваний, вызванных патогенными микроорганизмами, таких как вагинит, кандидоз (молочница), вагиноз, цервицит.
    В результате проведения бактериоскопического исследования также диагностируются некоторые заболевания, передающиеся половым путем — гонорея, трихомониаз. В основе анализа лежит способность разных микроорганизмов окрашиваться в разные цвета в зависимости от степени устойчивости к воздействию антибиотиков. Эта способность была открыта датским ученым Г.К. Грамом. В результате окрашивания биоматериала выявляются грамположительные (грам+) микроорганизмы, имеющие большую чувствительность к антибиотикам, и грамотрицательные (грам—), отличающиеся более тонкой и сложной в строении оболочкой и низкой чувствительностью к препаратам. Грамотрицательные микроорганизмы способны вызвать различные заболевания женской половой сферы.
    Врач-лаборант в процессе проведения анализа под микроскопом подсчитывает количество по-разному окрашенных микроорганизмов, лейкоцитов, определяет форму бактерий, их размеры и расположение. В некоторых случаях исследуются неокрашенные (нативные) мазки, что позволяет обнаружить жгутиковые формы трихомонад. Кроме того, в рамках мазка на флору может проводиться так называемый посев на микрофлору. Он используется в тех случаях, когда возбудитель заболевания из-за его малой концентрации не может быть обнаружен под микроскопом и для определения рода и вида бактерий. В этом случае биоматериал, взятый из половых органов женщины, помещают в специальную питательную среду на основе желатина, и через определенное время изучают результат.

Появление на питательном субстрате колоний микроорганизмов говорит о наличии заболевания. Метод посева также используется для определения стратегии лечения, поскольку во время созревания колонии можно выяснить, к воздействию каких групп антибиотиков она особенно неустойчива.

  1. Мазок на скрытые инфекции . К скрытым инфекциям относят группу болезней, которые могут бессимптомно протекать на протяжении нескольких месяцев или даже лет, вызывая осложнения, а некоторых случаях — даже бесплодие. На сегодняшний день наиболее достоверным способом выявления скрытых инфекций является исследование мазка при помощи ПЦР (полимеразной цепной реакции). Этот метод используется для диагностики инфекций, не обнаруживаемых в общих мазках. Для проведения анализа берется секрет из шейки матки, влагалища или мочеиспускательного канала и производится многоэтапное повышение концентрации нуклеиновой кислоты и копирование отдельных фрагментов ДНК присутствующих в мазке микроорганизмов. В результате врач может установить видовую и родовую принадлежность всех патогенных бактерий и их способность вызывать развитие заболеваний. В большинстве случаев ПЦР-анализ применятся при подозрении на наличие заболеваний, передающихся половым путем и имеющих на ранних стадиях практически бессимптомное течение. Преимуществами метода являются:
  • высокая точность определения возбудителя инфекции;
  • возможность определения именно наличия вируса, а не продуктов его жизнедеятельности или распада;
  • возможность постановки точного диагноза на основе всего одной клетки микроорганизма.

  1. Мазок на онкоцитологию, или тест по Папаниколау (пап-тест) , позволяет выявить наличие онкологических заболеваний в шейке матки на ранних стадиях и вовремя начать терапию. Пап-тест определяет большинство воспалительных заболеваний, дисплазию эпителия и злокачественные образования. Сдавать этот мазок рекомендуется ежегодно всем женщинам в возрасте от 21 до 65 лет. В случае если у женщины наблюдаются нарушения менструального цикла, воспалительные процессы цервикального канала, бесплодие, врач назначит мазок на онкоцитологию в обязательном порядке. Также рекомендуется пройти пап-тест при диагностировании диабета, ожирения 2–3 степени, в период планирования беременности, при приеме гормоносодержщих препаратов и наличии в организме вирусов генитального герпеса и папилломы.
    При анализе мазка можно получить пять типов результата в зависимости от наличия и степени патологии. Первый тип — это отрицательный показатель, говорящий о том, что никаких отклонений от нормы в организме женщины нет, и она полностью здорова. При втором типе присутствует воспалительное заболевание, требующее лечения. Третий тип свидетельствует о наличии в эпителии единичных клеток с аномальным строением ядра. Четвертый тип — подозрение на злокачественное образование или эрозию шейки матки, генитальный герпес, папиллломовирусную инфекцию, паракератоз. Пятый тип — наличие онкологического заболевания, требующего незамедлительного лечения. Следует помнить, что мазок показывает только степень изменения клеток, но не причину, их вызвавшую. Для постановки диагноза необходимы результаты других анализов, включая биопсию, кольпоскопию и гистологическое исследование.
    Если в мазке будут найдены атипичные клетки, то в заключении будет об этом написано, а также будет указан тип изменений. Если в расшифровке мазка на цитологию нет особых примечаний, это говорит о том, что в ходе исследования никаких патологий обнаружено не было.

При выборе дня для взятия мазка нужно учитывать менструальный цикл. Желательно сдавать анализ перед началом менструации или через несколько дней после ее окончания (оптимальный срок — пятый день), чтобы избежать попадания крови в мазок. Хотя процедура взятия мазка и не слишком сложна, все же необходимо заранее принять некоторые дополнительные меры, чтобы обеспечить чистоту результата. Подготовка к мазку на инфекции у женщин заключается в следующем:

  1. Не использовать вагинальные свечи, тампоны, мази перед анализом.
  2. Отказаться от спринцевания.
  3. При наличии воспалительного заболевания, сопровождающегося обильным выделением секрета необходимо сначала провести лечение и только после полного выздоровления сдавать мазок.
  4. Воздержаться от половых контактов в течение одного-двух дней до сдачи анализа.
  5. Не использовать средства интимной гигиены накануне и в день процедуры.
  6. Воздержаться от опорожнения мочевого пузыря в ближайшее время перед сдачей мазка.

В остальном женщина может вести обычный образ жизни: не требуется ограничений ни по питанию, ни по физической активности.

Взятие у женщины мазка на флору, на скрытые инфекции и на онкоцитологию несколько различается. Во всех случаях перед процедурой женщина проходит общий гинекологический осмотр на кресле с помощью зеркала.

При мазке на флору после визуальной оценки стенок влагалища врач специальным стерильным шпателем осуществляет забор материала из трех участков — влагалища, шейки матки и наружного отверстия мочеиспускательного канала. В некоторых случаях забор производится только с двух первых участков. Взятый шпателем материал равномерно широким мазком распределяется по стерильному предметному стеклу. Нанесение материала каплей, толстым слоем или небольшим мазком считается неправильным, поскольку затрудняет работу врача-лаборанта. При этом материалы из разных участков должны наносится на стекло отдельно друг от друга. С обратной стороны стекла врач делает пометки о месте взятия мазка: U — мочеиспускательный канал, V — влагалище, С — шейка матки. После этого стекло высушивается и направляется в лабораторию на исследование.

При сдаче мазка у женщин на скрытые инфекции и на онкоцитологию забор материала производится специальной щеточкой или с помощью особых стерильных ватных тампонов. Перед взятием материала обязательно удаляют слизь, так как ее наличие может дать ложный результат. Поскольку большинство микроорганизмов являются внутриклеточными паразитами, точное обнаружение их возможно только при исследовании соскоба со стенок половых органов. При анализе на скрытые инфекции материал со щеточки помещают в физраствор, хранящийся в холодильнике. Мазок на онкоцитологию наносят на предметное стекло и высушивают.

Как правило, процедура забора мазка для женщины практически безболезненна. Неудобство может вызывать соприкосновение с гинекологическим зеркалом из-за разницы температур между телом и металлическим инструментом. При взятии материала тампоном или щеточкой с шейки матки может отмечаться незначительное болевое ощущение, которое проходит сразу после окончания манипуляции. Мазок на онкоцитологию иногда способен вызывать незначительные кровянистые выделения в течение двух-трех дней. Если возникают сильные кровотечения, повышение температуры, боли в животе, то необходимо срочно обратиться к гинекологу, поскольку такие симптомы при взятии мазка нормой не являются.

После проведения анализа мазка пациентка получает результаты, которые полностью зависят от типа, назначенного ей исследования.

При расшифровке анализа мазка на флору необходимо знать показатели нормы:

  1. Плоский эпителий (пл.эп) — у здоровой женщины этот показатель не должен превышать 15 клеток в поле зрения. Большее их количество говорит о воспалительном процессе, а меньшее — о наличии гормональных нарушений.
  2. Лейкоциты (L) . Нормальное количество во влагалище — не более 10-ти, а в шейке матки не более 30-ти единиц.
  3. Палочки Дедерлейна , обеспечивающие нормальную микрофлору женских половых органов. В мазке здоровой женщины они должны присутствовать в большом количестве, поскольку их недостаток свидетельствует о нарушенной микрофлоре влагалища.
  4. Слизь должна присутствовать в мазке в умеренном количестве. Обильные выделения слизи — признак воспаления или инфекции.
  5. Грибки рода кандида, гонококки, трихомонады в мазке выявляться не должны. Их наличие свидетельствует о заболевании.

Кроме этих показателей в анализе может быть указана одна из четырех степеней чистоты влагалища. Нормальными являются только первая и вторая степень, третья и четвертая являются признаком заболевания половых путей.

Результаты анализа мазка на скрытые инфекции можно получить через 1–2 суток после сдачи. В некоторых случаях они могут быть готовы прямо в день прохождения процедуры. При помощи мазка выявляются следующие инфекции:

  • герпес-вирус человека 1 и 2 типов;
  • вирус Эпштейна-Барр;
  • цитомегаловирус;
  • герпес-вирус человека;
  • вирус папилломы человека;
  • бледная трепонема;
  • мобилункус;
  • бактероиды;
  • гонококк;
  • гарднерелла;
  • микоплазма;
  • уреаплазма;
  • хламидии.

Мазок на инфекции в большинстве случаев является достаточно надежной диагностической процедурой. С его помощью можно выявить большинство серьезных заболеваний половой сферы, при этом стоимость анализа является вполне доступной даже в частных клиниках.

07.06.2017, 13:36 | 9 118


Особо опасные инфекционные заболевания всё еще существуют на территории Казахстана, но это знают врачи – инфекционисты. Обычные жители убеждены, что все они побеждены еще в 30-е годы хх века.


Картина В.Верещагина На улицах Самарканда

Во многом знании много печали. Про лепру мне кое-что известно из литературы. Сразу вспоминаются прочитанные ранее страшные рассказы о прокаженных, которых в Средние века, чтобы они не распространяли болезнь, изгоняли из селений, ссылали на необитаемые острова, сжигали или закапывали в землю живьем. Самые милосердные власти разрешали несчастным побираться с надетыми на головы мешками — капюшонами с прикрепленными к ним колокольчиками или трещотками, чтобы встречные слышали их издалека. Лепру (проказу) считают одной из древнейших болезней. В Средневековой Европе она наносила урон, сопоставимый с эпидемиями чумы. Но это же было так давно и далеко от нас! Где-то в Южной Европе, в Индии или в Африке да еще в Средние века! А сейчас… Какие могут быть прокаженные и лепрозории в наше время с лучшей в мире медициной?!

Но вот что случилось не в средние века и даже не в прошлом веке, а лет 10 назад. Тогда одного из скандальных политиков в одной из стран СНГ объявили сначала отравленным диоксином. Якобы от этого у него выступили на лице жутковатые бугры и шрамы размером от спичечной головки до фасолины. Тогда отравителей как ни искали, так не нашли даже с помощью иностранных разведок. Но один известный в СНГ врач — инфекционист высказал предположение, что у политика проказа, она же лепра, а бугорки на его лице – тысячи бактерий. Надо только взять их содержимое и кровь на анализ, и картина станет ясной.


Доктор медицинских наук, специалист по особо опасным инфекциям, он смолоду не раз работал в природных очагах заболеваний в разных странах, в том числе, на лепре в Индии, у нас и в Средней Азии.


У меня свой информатор по местным проблемам – всезнающая соседка Ишанкуль-апа. Она всю жизнь прожила в Приаралье и на себе испытала последствия превращения огромного Синего моря в соленую лужу. Спрашиваю, что за болезнь такая жуткая водится в пустынях Приаралья, от которой человек становится похожим на льва?

Выясняю подробности у коллег: доля истины, и большая, в рассказах соседки есть. Действительно, когда море отступило от Аральска на сотни километров, поселки рыбаков оказались далеко от воды, а их дома — засыпанными песком. Не стало работы у людей, которые всегда были моряками и рыбаками. Экологическая катастрофа – так определили ученые происходящие в Приаралье изменения, климата, погоды, что сказывается на здоровье жителей. Сейчас кто-то сам уехал в дальние страны или на свою историческую родину, кого-то власти, часто целыми поселками, переселили в местные более благополучные хозяйства, да и сейчас переселяют из пустынь поближе к цивилизации. Совсем недавно в Кызылорде построили для них 60-квартирный дом. И уже не первый.

Напрашиваюсь в командировку в единственный в Казахстане республиканский лепрозорий. Он находится в поселке Талдыарал, в получасе езды на автобусе от областного центра. Когда-то это местечко действительно было островом, но не на море, а на изменчивой реке Сырдарье, вернее, на ее ответвлении – Жанадарье.

Сначала лепрозорий открыли в 1929 году в пригородном ауле Тасбогет. Но частые вылазки его пациентов в город, на центральный базар, заставили перенести лечебное заведение подальше от города, за естественной преградой. Но река поменяла русло – и больничный городок оказался на суше. Теперь он стоит, на пригорке, заросшем колючим кустарником.


Прокаженный с трещоткой

Это была невообразимо тяжелая работа эпидемиологов. За первые пять лет существования лепрозория в южном регионе было обследовано и пролечено 19 тысяч жителей. Хотя лепрозорий в поселке Талдыарал был рассчитан всего на 110 мест, в первые годы в нем на лечении и под наблюдением ежегодно находилось до тысячи пациентов. Практически многие больные здесь находились пожизненно. Многие здесь же и умирали. Только в 60-70-е годы, когда появились сульфоновые препараты, лепра отступила. В незапущенных стадиях врачи могли добиваться даже полного излечения. Но на это могло уйти от 2 до 8 лет. К тому же в стране уже было много переболевших.

Их часто выявляли в дальних аулах, уже изувеченных тяжелых инвалидов. Оставлять их дома было опасно не только для контактных, но и для них самих. При отсутствии лечения больные погибали через 5–10 лет после заражения. Поэтому лепрозорий никогда не закрывался вот уже более 80 лет, хотя в нем давно нет такого количества пациентов, как в первые годы существования. Многие пролеченные пациенты постепенно вернулись домой, чтобы жить в родных семьях, но под постоянным контролем специалистов лепрозория или противочумных станций, которые сейчас есть в девяти крупных и малых городах Казахстана. Но некоторые из тех, кто скрывался в дальних аулах или вовремя не заметил опасных симптомов болезни и запустил ее и оказался изувеченным, навсегда остаются в лепрозории. Многие так привыкают к своей больнице, что возвращаются в нее после того, как уезжали домой. И среди них обычно тоже есть тяжелые инвалиды, которым нужна постоянная помощь. Они стесняются своих изувеченных лиц и рук, с трудом ходят на больных ногах. В лепрозории среди товарищей по несчастью им спокойнее. Пролеченные больные живут даже дольше, чем средние жители страны. Они находятся под постоянным наблюдением врачей, обеспечены, не испытывают тех треволнений, которые типичны для обычных жителей. Даже умирают пациенты лепрозория обычно не от лепры, а от тех же болезней, что и все другие люди.

Читайте также:

Подробнее об истории города читайте в нашем проекте Исторический Петропавловск

Способ используется в медицине, а именно в лепрологии, в частности, для диагностики лепры. У пациента берут кровь из пальца и исследуют отстоявшуюся сыворотку с помощью иммуноферментного анализа. Для обнаружения антител к антигенам M. Leprae в сыворотках крови больных лепрой в иммуноферментном анализе в качестве тест-антигена используют культивируемые микобактерии Mycobacterium lufu . Способ прост в исполнении, при этом повышается точность диагностики лепры. 3 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть использовано, в частности, для диагностики лепры.

Из практики медицины известен способ обнаружения антител к M. leprae в сыворотке крови больных лепрой с применением иммуноферментного метода, где в качестве тест-антигена используются водорастворимые белки из лепром человека (Alonso S. M., Mangiaterra M.L., Szarfman A. La reaccion de immunoperoxidasias indirecta aplicata a la lepra humana // Medicina (Argent).-1978.-Vol. 38.- N 63.- P.541-544.). Способ позволяет проводить серологическую диагностику лепры, а также осуществлять исследования с целью прогнозирования заболевания. Недостатком способа является травматичность метода получения антигенного материала: необходимость взятия биоптатов из кожных поражений больных лепрой людей. Способ невозможно внедрить в клиническую практику, поскольку даже при распространенных процессах количества M.leprae в кожных лепромах больных лепроматозной лепрой недостаточно для получения диагностикума.

Известен также способ обнаружения антител к антигенам M.leprae в сыворотке крови больных лепрой на основе иммуноферментного анализа, где в качестве тест-антигена используются препараты из М.leprae, полученные из тканей экспериментально зараженных девятипоясных броненосцев (Stanford J.L., Rook G. A.W., Samuel N., Madlener F., Khamenei A.A., Nemati Т., Modabber F., Rees R.J.W. // Preliminary immunological studies in search of correlates of protective immunity carried out on some Iranian leprosy patients and their families.- Lepr. Rev.- 1980.- Vol.51.- N 4.- P.303-314.). Способ позволяет выявлять специфические антитела к М.leprae в сыворотке крови у больных лепрой, а также у лиц, находящихся в тесном семейном контакте с больными лепрой. К недостаткам способа относится необходимость воспроизведения на броненосцах экспериментальной лепрозной инфекции, которая развивается в течение 2-5 лег. Броненосцы имеют ограниченный ареал обитания (Южная Америка), не размножаются в неволе и требуют особых условий содержания. Выделение М.leprae из тканей броненосца предусматривает использование многоэтапного метода очистки, что в свою очередь повышает стоимость и усложняет процесс получения антигенного диагностикума.

Наиболее близким способом к предлагаемому является способ обнаружения антител к M.leprae в сыворотке крови человека и броненосца при лепре, где в качестве специфического тест-антигена использованы препараты из M.leprae, пассируемые на мышах и крысах (Дячина М.Н., Сухенко Л.Т., Ющенко А.А., Ермолин Г. А. Диагностические тест-системы на основе иммуноферментного метода при лепре // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол.-1985,- N 1.- С.64-68). Использование известного способа позволяет выявлять антитела к M.leprae в сыворотке крови больных лепрой людей и броненосцев с экспериментальной лепрозной инфекцией, причем уровни антител коррелируют со степенью активности лепрозного процесса. Способ также позволяет прогнозировать сроки развития экспериментальной лепрозной инфекции у броненосцев.

Недостатки способа в длительности и многоэтапности его осуществления: - моделирование инфекционного процесса на экспериментальных животных с целью накопления бактериальной массы занимает в среднем 1,5-2 года; - получение очищенных M.leprae связано с многоэтапным процессом выделения возбудителя из тканей животных с экспериментальной лепрозной инфекцией.

Известный способ принят авторами в качестве прототипа.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение способа диагностики лепры.

Поставленная цель в изобретении достигается тем, что в иммуноферментном анализе в качестве тест-антигена используют культивируемые микобактерии - Mycobacterium lufu.

Отличительной особенностью осуществления способа является использование в иммуноферментном анализе (ИФА) в качестве антигеннного диагностикума препаратов из M.lufu, ранее не используемых для этих целей. Известно, что M. lufu пригодны как тест-штамм для первичного скрининга противолепрозных препаратов in vitro.

Проведенный анализ патентной и научной литературы показал, что в известных способах диагностики лепры M.lufu не применялись.

Отсутствие воспроизводимых методов культивирования M.leprae на питательных средах является серьезным препятствием на пути создания диагностических тест-систем. Лабораторные животные (мыши, крысы, броненосцы), в организме которых размножаются M.leprae, до настоящего времени являются единственным источником бактериальной массы, используемой для создания диагностических препаратов. Получение этих препаратов осложняется еще и тем, что M. leprae, полученные в результате пассажа на лабораторных животных, необходимо выделить из инфицированных тканей организма-хозяина. Очистка возбудителя лепры от тканей экспериментальных животных представляет собой сложный, трудоемкий, многоэтапный процесс, требующий участия квалифицированного персонала, специального оборудования и реагентов, что в свою очередь также затрудняет задачу получения диагностикума.

M. lufu, выделенные из почвы в Заире (Portaels, 1980), являются сапрофитными кислотоустойчивыми микобактериями, способными расти на питательных средах. Авторами предлагается M.lufu в качестве источника бактериальной массы для получения антигенного диагностикума вместо используемых в настоящее время некультивируемых in vitro M.leprae. Предлагаемый способ позволяет сократить сроки получения тест-антигена на 1,5-2 года, т.е. ограничить сроки до 1-2 недель.

Использование культивируемых M.lufu для получения тест-антигена является существенным отличием в подходе к диагностике лепры, и именно это отличие позволило получить положительный эффект в виде упрощения способа. Предлагаемый способ позволяет отказаться от использования M.leprae, не способных расти на искусственных питательных средах, в качестве материала для получения антигенного диагностикума.

Предлагаемый способ осуществляли следующим образом: кровь из пальца в количестве 0,1 мл собирали в пробирку и помещали на 1 час в термостат (+37 o C), а затем в холодильник (+4 o C) на 1 час для ретракции сгустка. Отстоявшуюся сыворотку исследовали с помощью иммуноферментного метода. Для длительного хранения сыворотку замораживали при -20 o C.

Использовали два водорастворимых антигенных препарата: - антиген из M.leprae, разрушенных ультразвуком; - антиген из M.lufu, разрушенных ультразвуком.

Бактериальную массу M.leprae накапливали путем пассирования на мышах и крысах в течение 2-х лет. M.leprae выделяли из инфицированных тканей крыс с экспериментальной лепрой по методу Draper (Draper P. Problems related to purification of M.leprae from armadillos tissues and standartization of M. leprae preparations // Report on the Enlarged S.C.Mutina.- Geneva, 1979.- W. H. O. Document. - Annex I, prot. 1/79.- P.4-4,), включающего в себя дифференциальное центрифугирование тканевых гомогенатов в гредиенте плотности сахарозы. Отделение от тканевых частиц проводили в двухфазной полимерной системе, состоящей из 7% декстрана Т-500 (фирмы Pharmacia) и 5% полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6 кДа (фирмы BDH). Очищенные M.leprae подвергали ультразвуковому разрушению на аппарате MSE-100 (Англия) в физиологическом растворе в течение 7 мин при 18 кГц. Эффект разрушения контролировали микроскопически. Суспензию разрушенных M.leprae центрифугировали (10000 об./мин), надосадок использовали в качестве нативного водорастворимого антигена (УЗД-М.leprae).

M. lufu культивировали на среде Левенштейна-Йенсена в течение 7 дней. Антигены получали из синхронизированной холодом (при 4 o C в течение 72 ч) культуры M.lufu. Клеточные культуры подвергали ультразвуковому разрушению на аппарате MSE-100 (Англия) в физиологическом растворе в течение 7 мин при 18 кГц. Эффект разрушения контролировали микроскопически. Суспензию разрушенных микобактерий центрифугировали (10000 об/мин), надосадок использовали в качестве нативного антигена (УЗД-M.lufu).

Постановку ИФА осуществляли на полистироловых планшетах для иммунологических реакций однократного применения (производственное объединение "Ленмедполимер" ТУ 64-2-278-79). Одновременно сенсибилизировали два планшета: 1-й - антигенами из M.leprae (УЗД-М.leprae), 2-ой - антигенами из М.lufu (УЗД-М.lufu).

Первый планшет сенсибилизировали УЗД-М.leprae в карбонат-бикарбонатном буфере pH 9,0-9,5 (1,18 г Na2CO3 3,47 г NaHCO3 и 0,2 г NaN3 растворяли в 1 л дистиллированной воды) из расчета 27 мкг антигена на 1 мл буфера в объеме 0,1 мл на 1 лунку (18 ч при +4 o C). Затем планшет отмывали 3 раза в забуференном физиологическом растворе (34 г NaCI на 4 л воды, доводя 2M Na2PO4 pH до 7,4) с добавлением 0,05% твина-20, после чего в лунки планшета заливали по 0,01 мл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в 0,02 М фосфатно-солевом буфере (pH 7,4) и выдерживали 1 ч при +37 o C. Затем вновь производили промывку лунок вышеуказанным способом и заливали лунки исследуемыми сыворотками больных лепрой, разведенными (1:400) фосфатно-солевым буфером (pH 7,3 - 7,4), содержащим 1% сыворотки крупного рогатого скота в объеме 0,1 мл. На планшете ставили также положительный контроль (сыворотки больных с активными проявлениями лепрозного процесса) и отрицательный контроль (донорские сыворотки) в том же разведении (1:400). Каждый образец сывороток заливали в 2 лунки (дубликат). Планшет инкубировали при +37 o C 1 ч, после чего снова повторяли процесс отмывки. Затем в каждую лунку добавляли по 0,1 мл конъюгата (кроличьи антитела к общим иммуноглобулинам человека, меченые пероксидазой) в разведении 1: 1000 и инкубировали 1 ч при +37 o C. После отмывки добавляли субстратную смесь - 5-аминосалициловая кислота с 0,05% перекисью водорода (к 100 мл подогретой до 70 o C дистиллированной воды добавляли 80 мг 5- аминосалициловой кислоты, раствор охлаждали до комнатной температуры и устанавливали pH 5,5 - 6,0. К 18 мл полученного раствора добавляли 2 мл 0,05% раствора перекиси водорода). Планшет выдерживали при комнатной температуре 60 мин. При наличии в сыворотке антител к УЗД-M.leprae субстратная смесь окрашивалась в темно-коричневый цвет (положительная реакция), а контрольные лунки оставались бесцветными или слегка желтоватыми (отрицательная реакция). Результаты реакции оценивали инструментально на фотометре (Minireader MR 590, США), при длине волны 450 нм по интенсивности окраски исследуемого образца и выражали в единицах оптической плотности (ОП). Положительными считали образцы, показатели ОП которых в 2 и более раз превышали показатели в отрицательном контроле. ОП отрицательного контроля не превышала 0,2.

Одновременно осуществляли сенсибилизацию второго планшета. Антигены из M. lufu (УЗД-M.lufu) разводили в карбонат-бикарбонатном буфере pH 9,0-9,5 из расчета 33 мкг антигена на 1 мл буфера в объеме 0,1 мл на 1 лунку (1,18 Na2CO3, 3,74 NaHCO3 и 0,2 NaN3 растворяют в 1 л дистиллированной воды) и оставляют на 18 ч при +37 o C). Затем планшет отмывали 3 раза в забуференном физиологическом растворе (34 г NaCl на 4 л воды, доводя 2М Na2PO4 pH до 7,4) с добавлением 0,05% твин-20. После промывки в лунки планшета заливали по 0,1 мл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в 0,02 М фосфатно-солевом буфере (pH 7,3-7,4) и выдерживали 1 ч при +37 o C. Затем вновь производили промывку вышеуказанным способом и заливали в лунки исследуемые сыворотки больных лепрой (в объеме 0,1 мл), разведенные 1:400 фосфатно-солевым буфером pH 7,4 (0,584 г NaCI, 12,8 г Na2HPO4, 2,62 г NaHPO4), содержащим 1% сыворотки крупного рогатого скота. Таким же образом разводили сыворотки от больных с активной лепрой (положительный контроль) и сыворотки доноров (отрицательный контроль). Планшет инкубировали 1 ч при +37 o C, после чего снова отмывали. Затем в каждую лунку добавляли по 0,1 мл конъюгата (кроличьи антитела к общим иммуноглобулинам человека, меченые пероксидазой) в разведении 1:1000 и выдерживали 1 ч при +37 o C. После отмывки добавляли субстрат - 5-аминосалициловая кислота с 0,05% перекисью водорода. Планшет выдерживали при комнатной температуре 40-60 мин. При наличии в сыворотке антител к УЗД-M.lufu субстратная смесь окрашивалась в темно-коричневый цвет (положительная реакция), а контрольные лунки оставались бесцветными или слегка желтоватыми (отрицательная реакция). Результаты реакции оценивали на фотометре (Minireader MR 590, США), при длине волны 450 нм по интенсивности окраски исследуемого образца и выражали в единицах ОП. Положительными считали образцы, показатели ОП которых в 2 и более раз превышали показатели в отрицательном контроле. ОП отрицательного контроля не превышала 0,3.

Изложенная сущность изобретения поясняется табл. 1, где представлены результаты иммуноферментного анализа сывороток крови больных лепрой и контрольных групп при использовании различных антигенов.

Таким образом, из данных табл.1 следует, что показатели уровня антител во всех исследуемых группах, полученные в тест-системе с использованием антигенов из М.leprae, полностью сопоставимы с показателями, полученными в ИФА, где тест-антигеном являются препараты из M.lufu.

Результаты ИФА сывороток больных лепрой с использованием антигенов из М. leprae и из M.lufu представлены в табл.2.

Авторами проведена оценка чувствительности, специфичности и эффективности иммуноферментного анализа. За диагностическую чувствительность ИФА принимали процентное выражение частоты истинно положительных результатов ИФА у больных с активными проявлениями лепрозного процесса.

За диагностическую специфичность ИФА принимали процентное выражение частоты истинно отрицательных результатов ИФА у лиц, не имеющих лепры.

С использованием приведенных формул проводили сравнительную оценку диагностических тест-систем на основе ИФД с антигенами из M.leprae и из M.lufu (табл.З)
Таким образом, из данных табл. 3 видно, что при 100% чувствительности тест-система, в которой в качестве антигена использовали УЗД - M.lufu, обладает сопоставимой специфичностью и эффективностью с тест-системой, где в качестве антигена применяли УЗД- М.leprae.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в НИИ по изучению лепры Минздравмедпрома РФ в 1994-1995 годах.

Ниже приводятся результаты апробации способа.

Пример 1. Больная А (и/б N 3844) впервые поступила в НИИ по изучению лепры 29.05.93 г. При поступлении: лепрозный процесс распространенный. Брови, ресницы разрежены, отмечается глубокая диффузная инфильтрация кожного покрова лица, ушных раковин и мочек ушей, большое количество дермальных и гиподермальных лепром. Локтевые, малоберцовые нервы утолщены, болезненны при пальпации. Анестезия по стволовому типу до верхней трети плеч, бедер. Бактериоскопический индекс (БИН) = 1,83+. Гистологическое исследование биоптата кожи: активно формирующаяся гранулема лепроматозной структуры (лепрома) на фоне лепрозной узловатой эритемы. Диагноз: лепроматозный тип лепры.

Читайте также:

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.