Экспресс тест на лептоспироз

Код	Наименование услуг	Цена, руб.	Доступность экспресс	Ед. измер.	Материалы	Заказать
017	Лептоспироз (ПЦР real time)	600 p (Время исполнения до 72 часов)	1 исслед.	P U C

Цель исследования: выявление РНК патогенных спирохет Leptospira interrogans,L.alexanderi L.borgpetersenii, L.kirschneri, L.noguchii, L.santarosai. L. Weiliiв в патологическом материале методом полимеразной цепной реакции

Предназначено для диагностики у:
- собак
- кошек
- лошадей
- МРС, КРС
- свиней

Опасность для человеческого здоровья:
Зооноз. Зараженные собаки являются резервуаром инфекции и выделяют их в окружающую среду. Заражение может происходить при несоблюдении правил гигиены через инфицированную воду, мочу

Спецификация .
Лептоспироз(Leptospirosis) – инфекционная природноочаговая болезнь многих видов животных (болеют свиньи, крупный и мелкий рогатый скот, лошади, собаки, верблюды, пушные звери, мелкие дикие млекопитающие, человек), характеризующаяся кратковременной лихорадкой, анемией, желтухой, гемоглобинурией, некрозами слизистых оболочек и кожи, атонией желудочно-кишечного тракта, абортами, рождением нежизнеспособного потомсства. Инкубационный период от 3-х до 7-ми дней в зависимости от серовара и особенностей специфического иммунитета. Обнаружение лептоспир по крови возможно только в первые 5-7 дней после появления клинических признаков. Выделение лептоспир с мочой начинается на 7-10 день после проявления клинических симптомов и продолжается месяцами. Лептоспиры могут вызывать у собак хроническое поражение почек спустя месяцы и годы после острого повреждения почек.

Механизмы патогенеза лептоспироза у собак:
Лептоспиры проникают в организм собаки через слизистую оболочку или поврежденную кожу. В воротах инфекции обычно не развивается специфических поражений. Из них возбудитель в последующие 4-11дн проникает в кровь, вызывая септицемию. Клинически лептоспиремия проявляется лихорадкой, кратковременной гемолитической анемией, лейкоцитозом, гемоглобинурией и альбуминурией.
Продолжительность бактериемии благодаря усиливающемуся иммунному ответу обычно составляет 4-5 дн. Элиминация бактерий из крови сопровождается прекращением лихорадки. Во время септицемии ЛС разносятся кровью по всему организму, проявляя при этом (в зависимости от серовара) более или менее выраженный тропизм к печени, почкам, плаценте и плодам.
Благодаря высокой подвижности и небольшой толщине они избегают фагоцитоза ретикулоэндотелиальными клетками печени и проникают через эндотелиальную выстилку синусоидов, достигая пространства между клетками паренхимы (70). В печени эти сприрохеты активно размножаются, вызывая паренхиматозное воспаление с последующим включением основных патогенетических механизмов гепатита, в т.ч. характерной для этой формы лептоспироза желтухи. Поражения печени вызваны механическим повреждением гепатоцитов ЛС, а также действием их токсинов. Помимо нарушения динамики оттока из воспаленной печени желчи определенную роль в патогенезе желтухи играет диссеминированный геморрагический процесс, происходящий в результате воздействия на эритроциты гемолизинов возбудителя.
Пути заражения
Заражение собак происходит в основном горизонтальным путем - через пищеварительный тракт при приеме корма и воды, контаминированных ЛС, аэрозольно и, реже половым путем. Возможно также и вертикальное распространение инфекции от инфицированной суки - через плаценту плодам и через молоко подсосным щенкам. ЛС могут проникать в организм не только через слизистые оболочки, но и через поврежденную кожу.
ептоспироз собак может протекать безсимптомно или проявляться клинически в желтушной или безжелтушной формах. Их тяжесть зависит от возраста и иммунного статуса инфицированного животного, вирулентности вызвашего инфекцию серовара ЛС, заражающей дозы и пути заражения.
Симптомы
При типичном течении лептоспироз имеет 2-фазный характер: вначале развивается симптоматика, связанная с бактериемией, а на второй фазе на первый план выступают клинические признаки поражения определенных органов.
В подострых случаях собака может переболевать без появления характерной симптоматики. При таком течении инфекции у заболевшей собаки снижается аппетит, развивается субфебрильная температурная реакция (38,5-40 C), появляются мышечные боли, слабость, угнетение, иногда конъюнктивит, признаки анемии, а также клинические признаки описанных ниже желтушной или безжелтушной форм лептоспироза, но в стертом виде.
При обеих формах болезни у щенных сук инфекция может вызвать аборт.
При лептоспирозе у собак выявляют ряд гематологических изменений: анемию средней тяжести, лейкопению (на лептоспиремийной стадии инфекции), которая сменяется лейкоцитозом со сдвигом влево, тромбоцитопению, гипербиллирубинемию (3-50 мг/дцл), гиперазотемию, гиперкреатинемию (3-20 мг/дцл), гиперфосфатемию, а также повышение концентрации амилазы и липазы. Увеличение активности в сыворотке крови печеночных ферментов (аланинтрансферазы и аспартаттрансферазы ), а также при тяжелом поражении почек и/или печени - повышение концентрации в крови азота мочевины и креатинина свыше 25 и 2 мг/дцл.
Вакцина от лептоспироза относится к необязательным вакцинациям. Кратность ревакцинации 1 год.

Лептоспироз у кошек:
Явная клиническая картина клинического лептоспироза у кошек встречаются РЕДКО.
В организм кошки лептоспиры проникают с грязной водой, пищей, грызунами. Именно грызуны являются очень частыми переносчиками этого заболевания в природе. Основной мерой профилактики лептоспироза у кошек, это борьба с грызунами.
Скрытый период заболевания у кошек длится от двух до десяти суток. Заболевание может проходить в острой, подострой и хронической форме. Под действием возбудителя нарушается работа почек, органов пищеварения, сердца и сосудов. В первые дни заболевания у животного резко увеличивается температура тела, кошка лежит, отказывается от еды, может наблюдаться рвота, лапы подрагивают. Далее на слизистой оболочке рта образуются покраснения, перерастающие в язвы, из ротовой полости исходит неприятный запах, язвы часто кровоточат. Кошка теряет массу, слабеет, у нее хуже работает сердце. Если заболевание протекает не в острой форме, то все симптомы заболевания появляются постепенно, кожные покровы чаще всего не затрагиваются. Изменения в работе органов пищеварения наблюдаются время от времени. Если у домашней кошки появляются симптомы, напоминающие лептоспироз, ее следует обязательно показать ветеринару. Следует всячески предотвращать контакт домашней кошки с животными, зараженными данным заболеванием.

Требования к пробе: - Для исследования используют: 1. моча, после 7-10 дней от начала проявления клинических симптомов возможно исследование мочи на лептоспироз методом ПЦР. 2. паренхиматозные органы с очагами поражения (мозг, легкие, почки (обе)), 3. абортированный плод. 4. Кровь с К3ЭДТА В первые 5-7 дней заболевания на фоне лихорадки берется Кровь животного с К3ЭДТА. В остальных случаях, при настоянии и ответственности врача или владельца, с внесением соответствующей записи в комментарии заявки. После 5-7 дней заболевания Кровь животного с К3ЭДТА настоятельно рекомендуется исследовать методом ИФА на наличие АТ к лептоспирозу. - кровь с гепарином не подходит для исследований методом ПЦР! - смешанные пробы запрещены в связи с особенностями технологии проведения анализа! Хранение образцов: Материал для анализов доставляется в лабораторию в день взятия или на следующий день, сохраняя их при +2-+8⁰С. Допускается хранение секционного материала (ткани органов) или мочи в течение 1 мес при температуре не выше -16⁰С.

ВАЖНО! 1. Вакцинация инактивированными вакцинами клинически здоровых собак не приводит, как правило, к ложноположительным реакциям. 2. Субклинически инфицированные собаки могут выделять с мочой лептоспиры, значение положительного результата в этиологии заболевания в этом случае определяет ветеринарный врач. ВАЖНО! 1. Чтобы избежать ложноположительных результатов необходимо выдержать 2-3 недели после лечения перед сдачей анализа. 2. Положительный результат при отсутствии клинической картины заболевания может означать бактерио-/вирусоносительство.

16FK40 Набор для определения антител IgG/IgM к лептоспире (Standard Diagnostics), общий вид

16FK40 Набор для определения антител IgG/IgM к лептоспире (Standard Diagnostics), тестовые устройства

16FK40 Набор для определения антител IgG/IgM к лептоспире (Standard Diagnostics), пипетки

16FK40 Набор для определения антител IgG/IgM к лептоспире (Standard Diagnostics), буфер для разбавления

Введение

Лептоспироз – это заболевание бактериальной этиологии, поражающее человека и животных. Возбудители — бактерии рода Leptospira. У человека заболевание может сопровождаться множеством различных симптомов, но в некоторых случаях заболевание может протекать бессимптомно. К симптомам лептоспироза относятся высокая температура, головная боль, озноб, мышечные боли, рвота. Также возможна желтуха, покраснение глаз, абдоминальные боли, диарея и сыпь. Если заболевших не лечить, то возможно возникновение таких осложнений, как: поражение почек и печени, менингиты, нарушения работы дыхательной системы. В редких случаях возможен летальный исход. Большинство перечисленных симптомов может быть ошибочно отнесено к другим заболеваниям. Диагноз лептоспироза подтверждается клиническим анализом крови или мочи. Лептоспироз распространен во всем мире, но чаще встречается в условиях тропического климата. Наибольшую опасность заболевание представляет для людей, работающих вне помещений или с животными, имеющих контакт с водоемами (фермеры, ветеринары, рыбаки и др.). Существует рекреационная угроза для туристов и людей, занимающихся спортом на открытом воздухе (плаванье, переправа вброд, рафтинг) в зараженных озерах и реках. Однако лептоспироз часто встречается и среди детей в условиях города.

Назначение

Тест SD BIOLINE Leptospira IgG/IgM является одностадийным иммунохроматографическим тестом для качественного определения IgG и/или IgM антител к Leptospira interrogans в сыворотке или плазме крови человека. Предназначен для профессионального использования в целях клинической лабораторной диагностики для обследования пациентов, имеющих симптомы, относящиеся к лептоспирозу. Результаты теста дают только первичную информацию. Поэтому для подтверждения диагноза необходимо использовать другие референсные методы диагностики лептоспироза (ИФА, РПГА).

Принцип метода

Тест SD BIOLINE Leptospira IgG/IgM — мембранный стрип, на который нанесены 3 полосы: “G” (тестовая полоса Leptospira interrogans IgG), “M” (тестовая полоса Leptospira interrogans IgM) и “C” (контрольная полоса) Эти полосы не видны до внесения образца. Контрольная полоса используется для контроля правильности проведения анализа. Она должна проявляться всегда, если процедура выполнена правильно и если реагенты пригодны для анализа. Проявление фиолетовой полосы “G” или “M” в результате анализа свидетельствует о наличии в образце специфических IgG или IgM антител к Leptospira interrogans. Если в процессе анализа полосы “G” или “M” в тестовой зоне не проявляются, значит специфические IgG или IgM антитела к Leptospira interrogans в образце отсутствуют.

Инструкция

(За версией инструкции для конкретного лота диагностического набора/реагента обращайтесь в отдел продукции ЗАО " Аналитика ")

Тест-системы для экспресс-диагностики без использования приборов - обзорный буклет ( наборы экспресс-тестов Human, R-Biopharm, Standard Diagnostics, Veda.Lab )

Регистрационное удостоверение

Наборы реагентов in vitro для бесприборной экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (ФСЗ 2009/05702 от 27.02.2014)

Лептоспироз Лептоспирозы – группа природноочаговых нетрансмиссивных зоонозов, сходных по этиологии и клиническим проявлениям. Возбудителями лептоспироза являются микроорганизмы рода Leptospira, семейства Leptospiracea, порядка Spirohaetales. Род Leptospira объединяет патогенные и сапрофитные виды лептоспир. В основу систематики как патогенных, так и сапрофитных лептоспир положены антигенные различия. Основным таксоном у лептоспир является серовар, серовары с родственной антигенной структурой объединены в серогруппы. В этиологической структуре лептоспирозов человека преобладают возбудители серогрупп Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Canicola, Pomona, Sejroe.

В России лептоспироз регистрируется во всех федеральных округах, наиболее высокая заболеваемость приходится на Центральный федеральный округ (Москва и Московская область, Смоленская, Тульская области), Северо-западный ФО (Вологодская область, Санкт-Петербург), Южный ФО (Краснодарский край), Приволжский ФО (Республика Мордовия, Республика Удмуртия, Кировская область, Пермский край). Резервуарными хозяевами лептоспир в природных очагах являются грызуны: серые крысы, обыкновенные полевки, полевые и домовые мыши и насекомоядные: ежи и землеройки. В антропургических очагах лептоспиры циркулируют среди свиней, крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, собак, в популяциях крыс и домовых мышей.

Заражение человека может происходить через воду пресных естественных и искусственных водоемов (при купании, рыбной ловле, питье воды и т.д.), при употреблении инфицированных лептоспирами пищевых продуктов, прямом контакте с больными животными. Для лептоспироза свойственна осенне-летняя сезонность, но от домашних животных-лептоспироносителей можно заразиться в любое время года. Регистрируется как спорадическая заболеваемость, так и эпидемические вспышки.

Инкубационный период длится от 7 до 20 дней, во время которого развивается кратковременная бессимптомная лептоспиремия, вслед за ней происходит паренхиматозная диффузия лептоспир в печень, почки, надпочечники, селезенку, легкие, возможно проникновение в ткани мозга. Вторая фаза, или начальный период заболевания, длящийся, как правило, 3–7 дней, заключается в развитии клинической картины заболевания: высокая лихорадка, головная боль, тошнота, то есть проявлений интоксикации организма, вызванной эндотоксинами лептоспир при повторном выходе лептоспир в кровь; вторая фаза заканчивается повторной паренхиматозной диффузией. В разгар заболевания отмечается максимальный уровень токсемии и поражения внутренних органов: печени, почек, легких, эндокарда; заболевание может осложниться геморрагическими явлениями различной степени выраженности (геморрагическая сыпь на коже и слизистых оболочках, мелкие диапедезные органные кровоизлияния, внутренние и наружные кровотечения), развитием инфекционно-токсического шока, острой почечной или острой печеночно-почечной недостаточности. Через месяц остается возможным развитие осложнений со стороны почек, сердца, ЦНС; через 1,5 месяца, как, правило, наступает стадия реконвалесценции и формирование длительного серогруппспецифического иммунитета.

Дифференциальная диагностика

Инфекционные заболевания: ГЛПС, геморрагические лихорадки, вирусные гепатиты, иерсиниозы, менингококковая инфекция, инфекционный мононуклеоз, клещевой энцефалит, боррелиоз, острые кишечные инфекции, пневмонии и серозные менингиты иной этиологии;
соматические заболевания: пиелонефрит, панкреатит, почечная колика, заболевания крови;
отравления.

Показания к обследованию

Лихорадка с общеинтоксикационным синдромом у лиц, находившихся в последние 1,5 месяца на территории, эндемичной по лептоспирозу, особенно при наличии симптомов: острое начало болезни, высокая лихорадка, боли в икроножных мышцах, гиперемия лица, инъекция склер и гиперемия конъюнктивы, экзантема, множественные геморрагические высыпания на различных участках тела, боли в пояснице, микро- и макрогематурия, олиго- или анурия, увеличение размеров печени, развитие желтухи.

Материал для исследований

Кровь, СМЖ, моча – обнаружение ДНК, культуральные исследования;
сыворотка крови – определение АТ;
кровь – микроскопические исследования.

Этиологическая лабораторная диагностика включает визуальное выявление лептоспир с использованием микроскопии, изоляцию микроорганизма методом посева на специальных средах, обнаружение ДНК лептоспир, определение АТ IgM и IgG или суммарных АТ к АГ лептоспир.

Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики

Диагностическая чувствительность выявление ДНК лептоспир методом ПЦР в крови пациентов, взятой на первой неделе заболевания, составляет 55–90%, на второй неделе заболевания – 30–40%, на третьей неделе заболевания ДНК лептоспир в крови обнаруживается у 15–25% больных. Специфические АТ при использовании методов микроагглютинации (РМА) или реакции макроагглютинации на стекле (слайд-агглютинация) на первой неделе заболевания выявляются у 18–30% заболевших, на второй-третьей неделе заболевания – у 70–80%, на 4-й неделе – у 90%. При использовании метода ИФА АТ IgM и IgА можно определить на первой неделе болезни, максимальных значений эти АТ достигают к третьей неделе. Начало обнаружения АТ IgG – 5–6 дни болезни, их максимальная концентрация наблюдается на 5-й неделе заболевания. При тяжелом течении лептоспироза отмечается подавление иммуногенеза, следствием чего является замедление первичного появления АТ или их отсутствие.

При использовании для лабораторного подтверждения лептоспироза результатов определения АТ необходимо исследовать образцы крови, взятые с интервалом в 7–10 дней (парные сыворотки). При применении РМА с использованием панели лептоспир различных серогрупп, актуальных для территории, где произошло заражение больного, возможно определение серогрупповой принадлежности выявленных АТ, что важно для последующего эпидобследования очага.

Для визуального обнаружения лептоспир методом микроскопии и их изоляции с использованием культуральных методов, пробы крови рекомендуется исследовать на 1-й неделе заболевания, СМЖ (при развитии серозных менингитов) – на 2-й, мочу – на 3-й неделе.

Обнаружение лептоспир в пробах биологического материала при использовании микроскопии является достаточно простым методом раннего подтверждения лептоспирозной этиологии заболевания. Использование микроскопических исследований ограничивает низкая аналитическая чувствительность: 106 клеток/мл. Ограничение на использование данного метода накладывает также короткий период выживания лептоспир в моче: при температуре 20–25°С материал должен быть исследован в течение 6–8 часов с момента взятия пробы.

Особенности интерпретации результатов лабораторных исследований

Клинический диагноз лептоспироз считают подтвержденным при выделении инфекционного агента, идентифицированного как патогенный для человека вид лептоспиры; при выявлении методом ИФА АТ IgM или IgA и роста титров IgG при исследовании образцов крови, взятых в динамике; при выявлении методами РМА, слайд-агглютинации нарастания титров АТ в образцах крови, взятых в динамике. Обнаружение ДНК лептоспир в крови и СМЖ пациента является основанием для предварительной постановки диагноза.

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

! Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Если Вашему питомцу нездоровится, ему потребуется помощь ветеринарного врача.

Правильно и своевременно поставленный диагноз — основа успешного лечения всех заболеваний. И огромную роль здесь играют лабораторные исследования.

Наша лаборатория полностью автоматизирована, что позволяет в любое время суток быстро и качественно проводить широкий спектр различных исследований.

Клинический общий анализ крови дает представление об общем состоянии здоровья питомца и способен выявить ранние стадии заболевания. Также по его результатам можно отслеживать динамику болезни.
Биохимический анализ крови определяет функциональность внутренних органов, позволяет обнаружить нарушения их работы или патологические изменения. С помощью биохимического анализа определяется количество ферментов, отвечающих за обменный процесс.

Опираясь на полученные данные, ветеринар выбирает направление лечения, его интенсивность, назначает необходимые препараты.

Наша лаборатория оснащена современным оборудованием,

с помощью которого можно оперативно получать результаты следующих исследований:

Общий и биохимический анализы крови
Общий анализ мочи
Копрологическое исследование кала (в том числе и на наличие скрытой крови)
Гельминтовоскопия
Паразитологическое исследование крови (пироплазмоз, дирофиляриоз)
Коагулограмма
Спермограмма
Цитологическое исследование влагалищных мазков
Исследование выпотов
Исследование соскобов кожи
Цитологическое исследование материала
Посев на дерматофитозы и др.

Ветеринарные тесты

Наличие большого набора ветеринарных тестов позволяет оперативно диагностировать различные вирусные (и иные) заболевания:

У кошек: короновирус, панлейкопения, герпес, калицивироз, вирус иммунодифицита, лейкемия, панкреатическая липаза

У собак: гепатит, парвовироз, чума, лептоспироз, анаплазмоз, болезнь Лайма, эрлихиоз, специфическая панкреатическая липаза

С помощью специальных тестов также можно обнаружить токсоплазмоз, хламидиоз, лямблиоз, дирофиляриоз, Ig E, определить групповой фактор крови (как у кошек, так и у собак) и др.

Рекомендации по подготовке к сдачи крови на Гормоны (ТТГ, Т4, Кортизол, Прогестерон):

Перед взятием крови необходимо исключить физические нагрузки. Желательно, чтобы животное находилось в спокойном состоянии.
Лучше сдавать кровь перед введением лекарственных препаратов и проведением инфузионной терапии.

- утром, с 8 до 11 часов
- натощак, желательно перед сбором анализа крови не кормить животное 8-10 часов, вода не исключается.

Кровь на прогестерон исследуют в рекомендованный лечащим врачом день цикла.
Перед сдачей крови на кортизол необходимо, чтобы животное находилось в спокойном состоянии, взятие крови в состоянии сильного стресса бесполезно.

Рекомендации по сбору мочи для общего клинического анализа:

Накануне исследования рекомендуется не использовать:

- мочегонные препараты
- продукты, изменяющие цвет мочи (свёкла, морковь).

Для анализа желательно собирать утреннюю порцию мочи
Собрать в чистую сухую посуду с плотно закрывающейся крышкой в количестве не менее 7 мл.
Остатки моющих средств могут оказать существенное влияние на результат анализа, поэтому лучше использовать стерильные пластиковые контейнеры (или специальные пробирки для сбора мочи).
Доставить в лабораторию в течение 2-х часов, т.к. более длительное хранение мочи приводит к изменению ее физико-химических свойств, к размножению бактерий и к разрушению элементов осадка.
Очень важно не допускать в зимний период замораживание мочи, а в летний – чрезмерное перегревание её.

Для лечения животных диагностические исследования приобретают особо важное значение, поскольку наши питомцы не могут поведать врачу о своем недуге словами.

Владельцы патента RU 2680094:

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у животных. Описан тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных, включающий буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для возбудителя лептоспироза Leptospira spp. и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образец. Для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10 3 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл. Для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp. Lpts) и фрагмент генома бактериофага Т4, взятых в объемном соотношении 1:1. Технический результат - уменьшение трудозатрат, времени и расходного материала при проведении полимеразной цепной реакции. 2 ил., 4 табл., 1 пр.

Также известно использование ПЦР для диагностики лептоспироза у сельскохозяйственных животных для этого проводили две амплификации: первая - с внешней парой праймеров (LepF и LepR), вторая - с внутренней (16LNF и 16LNR). Использовали универсальные праймеры, позволяющие определять участок генома, кодирующий 16S рРНК. Выявление продуктов реакции проводили методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. Гели анализировали, используя ультрафиолетовый трансиллюминатор (
- 254 нм).

Недостатком известного технического решения является не достаточная чувствительность из-за проведения ПЦР в агарозном геле.

Недостатком является увеличение трудозатрат, времени и использование дополнительных реагентов для процесса выделения РНК для получения кДНК.

Техническим результатом является уменьшение трудозатрат, времени и расходного материала при проведении ПЦР.

Технический результат достигается тем, что в тест-системе для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных, включающем буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образец, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10 3 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp. Lpts) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:

прямой праймер

обратный праймер

зонд

зонд.

Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для уменьшения трудозатрат, времени и расходного материала при проведении ПЦР выделяют ДНК из биологического материала от инфицированных животных и используют для внутреннего и положительного контрольных образцов различные формы материала бактериофага Т4: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом. Такая постановка ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где представлены скриншоты графиков, на фиг. 1 - представлен канал FAM/Green - для тестирования сигнала от внутреннего контрольного образца - ВКО; на фиг. 2 канал JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp. Lpts) Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных используется следующим образом.

Выделяют ДНК из биологического материала от инфицированных животных. В качестве биологического материала используют по выбору: цельную кровь (от животных с острой формой инфекции), фрагменты тканей и органов от павших животных (мозг, легкие, почки) и мочу. Для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10 3 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp. Lpts) и фрагмент генома бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:

прямой праймер

обратный праймер

зонд

зонд.

Осуществляют постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением не более 40 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей и контрольных образцов в виде внутреннего и положительного, измеряют по каналу JOE(HEX)/Yellow (фиг. 2) накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.), а по каналу FAM/Green - накопление сигнала внутреннего контрольного образца (фиг. 1), проведят интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) присутствует и результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) отсутствует и результат реакции - отрицательный.

Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.

Для исследования используют следующий биологический материал:

- Цельная кровь (от животных с острой формой инфекции). Кровь забирается в пробирку с 3-6% ЭДТА из расчета 50 мкл раствора ЭДТА на 1 мл крови, закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают.

- Фрагменты тканей и органов от павших животных (мозг, легкие, почки) отбирают в стерильный контейнер.

- Мочу отбирают в количестве 15-25 мл в специальный сухой стерильный флакон или контейнер. Если нет возможности исследовать материал в течение суток вносят глицерин до 10% от объема, перемешивают и хранят при температуре не выше 16°С.

Подготовка исследуемого биологического материала:

Кровь. Пробирку с кровью аккуратно несколько раз переворачивают для равномерного перемешивания. Затем готовят плазму центрифугированием в течение 6-10 мин при 1000 g. Отбирают плазму в пробирки по 1 мл и центрифугируют на микроцентрифуге при 13 тыс об/мин в течение 10 мин для концентрирования бактериальных клеток. Удаляют 900 мкл надосадочной плазмы, оставшиеся 100 мкл надосадка используют для экстракции ДНК.

Мочу после сбора отстаивают в течение 1 часа, затем осторожно сливают, оставляя придонную часть - около 10 мл. Центрифугируют остаток при 5000-6000 g 10 мин, удаляют надосадочную жидкость (не полностью), осадок с 100 мкл надосадочной жидкости переносят в пробирку объемом 1,5 мл и используют для экстракции ДНК.

Проведение анализа, который состоит из трех этапов:

- проведение ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;

- учет результатов анализа.

Для экстракции (выделения) НК из биологического материала отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательного контрольного образца (ОКО), по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) LEPTO.

Вносят исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы вносят ОКО (пробирку обозначить как ВК-).

Выделяют НК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.

Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С.

Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительный контрольный образец (ПКО) LEPTO, ВКО LEPTO и ДНК буфера, где для внутреннего контрольного образца (ВКО) используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10 3 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца (ПКО) используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) и фрагмент генома бактериофага T4 взятых в объемном соотношении 1:1.

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию ПЦР:

5 мкл ПЦР СМЕСЬ LEPTO

10 мкл смеси ПЦР БУФЕР LEPTO

0,5 мкл TAQ POLYMERASE

Перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием.

Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.

Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:

а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;

б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую вносят по 10 мкл ДНК соответствующей пробы;

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- (на канале JOE(HEX)/Yellow) и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Образцы, для которых по каналу FAM/Green (фиг. 1) значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом по каналу JOE(HEX)/Yellow отсутствует значение Ct) требуют повторного проведения исследования с этапа ПЦР. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале FAM/Green указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции ДНК.

Образец считается положительным (ДНК бактерий рода Leptospira присутствует) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE(HEX)/Yellow (фиг 2), при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл. 4). Если для исследуемого образца по каналу JOE(HEX)/Yellow значение Ct определяется позднее 35 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения ДНК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале JOE(HEX)/Yellow более 35), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики. В случае получения значения Ct на канале JOE(HEX)/Yellow менее 35 при исследовании повторно взятого от животного материала - образец считать положительным.

Эффективность заявляемого технического решения по сравнению с прототипом подтверждается сравнительным анализом по части расходного материала, трудозатрат и времени. В прототипе необходимо использовать набор реагентов в 4 формах комплектации, а в заявляемом же всего 2 формы комплектов. Что касается сокращения трудозатрат и времени, то исключение выделения РНК из биологического материал и проведения реакции обратной транскрипции, уже влечет за собой сокращение трудозатрат и времени.

1. Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза Leptospira spp. у сельскохозяйственных животных, включающий буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для возбудителя лептоспироза Leptospira spp. и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующими активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образец, отличающийся тем, что для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага Т4 с концентрацией 5×10 3 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя лептоспироза Leptospira spp. Lpts и фрагмент генома бактериофага T4, взятых в объемном соотношении 1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:

Lpts F CCCGCGTCCGATTAG прямой праймер

Lpts R TCCATTGTGGCCGRACAC обратный праймер

Lpts Р [R6G]CTCACCAAGGCGACGATCGGTAGC[BHQ1]зонд

Читайте также: